Maladies animales

Entraînés au préalable à traverser un tunnel et à marcher sur une plateforme de mesure de force, 40 chats reçoivent onze administrations orales au maximum, puis une solution injectée dans un membre postérieur sous une heure d'anesthésie générale, qui provoque une inflammation et une boiterie d'environ cinq jours. Ils sont hébergés seuls de l'induction jusqu'à sept jours après, subissent une prise de sang par jour, et repassent dans le tunnel jusqu'à cinq fois par mesure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trente et un jours de repos, le protocole entier est recommencé sur les mêmes chats, tous gardés en vie à l'issue. Le porteur précise que le groupe recevant le comprimé placebo est le plus exposé à ce protocole, et que la justification du nombre de chats est demandée au donneur d'ordre, le projet servant à évaluer un candidat médicament vétérinaire félin à trois doses.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer puis de comparer l'efficacité d'un élément d'essai administré à trois doses différentes. L'objectif est de pouvoir démontrer les propriétées anti-inflammatoire et analgésique du produit testé sur un modèle inflammatoire chez le chat. Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (un comprimé placebo). Ce modèle permet de créer une boiterie en induisant réponse inflammatoire au niveau du membre induit. Grâce au modèle boiterie, les propriétées anti-inflammatoire et analgésique des produits testés pourront être évaluées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations orales pour le produit test (sous forme de comprimés), le contrôle négatif (sous forme de comprimé) et le contrôle positif (sous forme orale) . Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 11 administrations seront réalisées. Les administrations commenceront 4 jours avant l'induction de l'inflammation et se poursuivront 6 jours après. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution au niveau du membre sous anesthésie générale. La durée d'induction est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés en deux occasions: juste avant la première administration puis juste avant l'induction puis une fois par jour à jour 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 8 après l'induction. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux passeront de leur plein gré sans laisse ni harnais dans un tunnel pour verifier le temps mis à le traverser puis passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Un harnais et une laisse peuvent être utilisés si besoin pour le passage à la force plate. Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation. Ce protocole expérimental sera réalisé en deux occasions avec une période de repos de 31 jours entre chaque induction.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré , à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Le groupe contrôle négatif sont les animaux les plus exposés à ce modèle. Les effets indésirables liés au modèle lui même sont des gonflements au niveau du membres induit, de la chaleur, parfois rougeur.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

40 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 5 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis trois groupes auront l' élément test à trois doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée au donneur d'ordre. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Ces études ont mis en avant qu'il était necessaire d'avoir des groupes de 6 à 8 animaux. Vu la variabilité du modèle, il ne faut pas déséquilibre les groupes pour avoir des résultats exploitables. Ce projet sera fait en "Cross over" cela signifie que chaque animal recevra en 2 occasions ce protocole expérimental avec une période de repos minimale de 31 jours. Cela permet de réduire la variabilité inter individuelle, d'obtenir la même puissance statistique avec moins d'animaux.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux auront une phase d'entrainement pour le passage dans le tunnel et une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate . Les animaux sont préalablement entraînés à ces exercices à l'aide de renforcement positif. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'induction jusqu'à 7 jours après, temps correspondant à la disparition de la gêne ou boiterie occasionnée. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une douleur ou une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

Une truite est mise à mort dès qu'un seul critère de la grille atteint son point limite individuel, qu'il s'agisse du comportement de nage, de la réaction à l'épuisette, des furoncles, de l'exophtalmie ou de la respiration. 264 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ce poisson étant selon le porteur le plus élevé en France. Elles sont infectées par quatre souches d'Aeromonas salmonicida en conditions contrôlées, et le porteur indique que les manifestations cliniques peuvent entraîner de la souffrance, notamment par l'apparition de furoncles sur la partie externe du corps. Aucune ne pourra être relâchée ni réutilisée pour des raisons sanitaires, et la finalité déclarée est d'améliorer vaccins et diagnostic dans une filière où la furonculose provoque des pertes économiques importantes.

Objectifs

La furonculose est une maladie bactérienne des Salmonidés causée par la bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Elle entraîne des pertes économiques importantes en raison de sa forte mortalité lors des formes suraiguës et des lésions cutanées qu’elle provoque dans les cas aigues à chroniques. La maladie est saisonnière et se déclare pour toutes les classes d’âges des poissons particulièrement en période estivale. La virulence peut varier entre les souches, soulignant l’importance de mieux la comprendre pour aboutir à des vaccins protégeant contre les formes les plus mortelles. L’objectif est d’étudier ces différences de virulence in vivo entre souches bactériennes afin de proposer dde nouveaux outils de prévention et de diagnostic de la maladie.

Bénéfices attendus

La compréhension du pouvoir pathogène d’A. salmonicida salmonicida permettra de proposer de nouvelles approches diagnostic pour distinguer la virulence des souches isolées en élevages piscicoles et adapter le recours à un traitement mais aussi de contribuer à optimiser les vaccins sur le terrain en sélectionnant des souches possédant des antigènes pertinents pour améliorer la protection des truites.

Procédures

Les animaux seront soumis à une infection expérimentale en condition contrôlée. Les animaux seront suivis quotidiennement. Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale ne seront effectués sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation, les animaux seront mis à mort Le suivi des animaux sera réalisée par des personnes expérimentées, en possession du niveau "concepteur" ou de niveau "applicateur" de la formation expérimentation animale", et formées à l’observation clinique des animaux et aux points limites.

Impact sur les animaux

L’étude du pouvoir pathogène des différentes populations bactériennes nécessite d’infecter des poissons. Les manifestations cliniques liées à ce challenge infectieux peuvent entrainer de la souffrance chez les animaux notamment par l’apparition de furoncles sur la partie externe de l’animal

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaires (impossibilité de relâcher ou de réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L’objectif du projet étant de comparer le pouvoir pathogène de différentes souches d’A. salmonicida salmonicida, cela ne peut se faire uniquement sur animaux vivants. Bien que des modèles cellulaires de truites existent, ils ne permettent pas de valider l’apparition de signes cliniques tels que les furoncles ni d’évaluer le taux de mortalité.

Réduction

L’expérimentation contiendra 4 groupes test (1 groupe d'animaux par souche) et 1 groupe contrôle. Chacun contiendra 24 animaux en duplicat, soit 48 animaux par groupe au total. De plus, 24 poissons (10%) surnuméraires sont prévus pour obtenir 5 lots homogènes en poids.

Raffinement

Une observation quotidienne des poissons est assurée. Lors des procédures de challenge infectieux, les poissons font l’objet d’une observation au moins deux fois par jour, tous les jours. • Seuils d’alarme liés aux paramètres d’ambiance. Température de l’eau : si >20°C et non rectifiable, arrêt de l’expérimentation. Oxygène dissous : si

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est un hôte naturel d'Aeromonas salmonicida salmonicida. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est essentiel de mieux comprendre le processus infectieux pour améliorer le diagnostic, la thérapeutique et les approches vaccinales. Les truites utilisées seront de 120g ± 10g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, truites portions = 200-250g et grosse truite > 1kg)

Les porcelets qui présenteront des signes cliniques graves seront tués par anesthésie profonde suivie d'une saignée. 34 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant dix-sept prises de sang à l'état vigile, tous tués à l'issue pour chercher des lésions et quantifier le virus dans leurs tissus. Vingt-quatre sont vaccinés, et le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin est inoculé par le nez à trente porcelets selon la description des procédures, alors que le total déclaré est de trente-quatre, ce qui doit provoquer selon le porteur deux à trois jours de fièvre, de baisse d'activité et d'appétit. L'objet est de savoir si un complément alimentaire, des glycérides d'acide laurique, améliore la réponse au vaccin, contre une maladie que le porteur présente d'abord par son "fort impact économique pour la filière porcine".

Objectifs

Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des porcins, à fort impact économique pour la filière porcine. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes et des problèmes respiratoires et retards de croissance chez les porcelets. En raison de son caractère immunodépresseur, ce virus favorise les infections avec d'autres virus et bactéries au niveau respiratoire chez les porcs en croissance, ce qui se traduit par une augmentation de l'utilisation des antibiotiques dommageable à la santé des animaux et des humains. Le SDRP est une maladie à distribution mondiale qui est particulièrement présente dans les zones à forte densité de production porcine. Ainsi, cette infection est présente dans plus de 60% des élevages de porcs en Bretagne. La vaccination à l’aide de vaccins vivants atténués (MLV) est un outil fréquemment utilisé en élevage pour lutter contre le SDRP. Cependant ces vaccins présentent une efficacité partielle qu’il convient d’améliorer. L'acide laurique est un acide gras à chaîne moyenne dont on a démontré qu'il possédait des propriétés antimicrobiennes et antivirales. Certains composés issus de cette molécule, dont les glycérides d'acide laurique ou GLA, ont la particularité de renforcer son activité biologique. Ainsi, une supplémentation de l’aliment avec des GLA a montré un effet immuno-stimulant lors de la vaccination contre la maladie du Gumboro (bursite infectieuse, maladie immunosuppressive) chez le poulet. Par ailleurs des études récentes ont montré que les GLA ont également un effet antiviral et immuno-stimulant chez les porcs infectés par le virus du SDRP. Dans ce contexte l’objectif de ce projet est d’évaluer si une supplémentation en GLA chez le porcelet peut permettre d’améliorer la réponse immunitaire, l’efficacité vaccinale et le contrôle du virus du SDRP.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre d’améliorer l’efficacité de la vaccination et le contrôle du SDRP en élevage de porcs grâce à une supplémentation en glycérides d’acide laurique. De façon plus globale, ce projet permettra de mieux comprendre l’effet d’une supplémentation en GLA sur le système immunitaire des porcs et sur leur réponse à une vaccination ainsi qu’à une épreuve virale.

Procédures

Les animaux des groupes vaccinés (n=24) seront immunisés à J0 par voie intramusculaire. Cette vaccination prend moins de 30 secondes par animal. Tous les animaux de l’étude (n=30) recevront à J28 du virus du SDRP par voie intranasale ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Les animaux des groupes vaccinés (n=24 puis n=20 à partir de J28) et non vaccinés (n=10) seront soumis à 17 prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques dizaines de secondes.

Impact sur les animaux

Lors de la vaccination (voie intramusculaire), les animaux subiront (i) un stress dû à la contention (ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère) et (ii) une douleur liée à l’injection vaccinale (cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée). Lors de l’inoculation intranasale par le virus du SDRP, les animaux subiront un stress dû à la contention. Ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère. Suite au challenge par le virus sauvage du SDRP (souche de faible virulence), les animaux développeront une maladie d’intensité légère (fièvre modérée, légère diminution d’activité et d’appétit) qui durera 2 à 3 jours. Lors des prélèvements sanguin, les animaux subiront (i) un stress dû à la contention (ce stress sera d’environ 30 secondes et son intensité est estimée comme légère) et (ii) une douleur liée au prélèvement (cette douleur sera d’intensité légère et de courte durée).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro ou bien ex vivo (cultures cellulaires par ex.) pour le virus du SDRP. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire post-vaccinale ou bien l’efficacité vaccinale. Ainsi le recours au modèle animal est indispensable et dans la mesure où seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le SDRPV, le modèle porc reste obligatoire.

Réduction

Tous les lots comporteront 10 à 12 animaux chacun de façon à avoir une puissance statistique suffisante. L'effectif par groupe a été déterminé par calcul statistique.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables (mordilles, boules en matière plastique, tourniquets et tubes à relever et à abaisser) qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort (par anesthésie profonde suivie d'une saignée) après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du SDRPV. Le virus étant spécifique de cette espèce, il n’est pas possible d’utiliser un autre modèle animal. En effet il n’existe pas d’autre modèle animal (ex : modèle murin) sur lequel le virus du SDRP a été adapté. A 3 semaines d’âge, les animaux seront sevrés et transférés dans nos installations. Les animaux du groupe VAC sup recevront la supplémentation en GLA pendant une dizaine de jours avant la vaccination qui aura lieu au début de leur 5ème semaine de vie ; âge auquel les porcelets sont habituellement vaccinés contre le SDRP en élevage.

Jusqu'à seize prélèvements sanguins d'environ un millilitre en sept jours, dont douze sur une seule journée : 150 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés en vie à l'issue et réutilisables dans d'autres projets. Certains subissent aussi une ponction d'urine dans la vessie, éveillés et maintenus sur le dos par contention manuelle, deux fois par vingt-quatre heures au maximum. L'objet du projet est de mesurer le devenir de molécules dans l'organisme du chat pour mettre au point des médicaments destinés à la médecine féline. Le porteur retient cette espèce parce qu'elle est celle à laquelle le médicament est destiné, et précise que les chats utilisés sont de jeunes adultes stérilisés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs et véhicules chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées, sa voie d'administration et sa concentration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution dans l'organisme, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce pour laquelle le médicament est prévu). L'objectif est de pouvoir générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des éléments tests pour pouvoir ensuite générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire principalement destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations uniques ou répétées de molécules tests selon les études (1 administration à 5 administrations espacées d'au moins 1 semaine). Pour cela les animaux seront vigiles et auront une contention manuelle. Cette contention est facilitée par les entrainements réguliers des animaux à tenir ces positions (par exemple: assis sur la table, ouverture de la cavité buccale, tête légèrement orientée vers le haut, allongés sur le dos pour des prélèvements de cystocentèse). La durée d'une administration est inférieure à la minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles. Pour une période de 7 jours, le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum (volume environ égale à 1 mL par temps) et engendrera une période de récupération de 7 jours minimum, la durée du prélèvement est inférieure à la minute. Sur cette période de 7 jours, un total de 12 prélèvements sanguins maximum peuvent être réalisés sur 24h. Certains animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Dans ce cas, cela se fera soit par miction spontanée ne nécessitant pas de manipulation de l'animal. Les animaux sont pour cela mis en hébergement individuel comprenant des bacs à litière spécifique pour le recueil d'urine. La durée de la mise en individuel peut être de 24h, soit le prélèvement urinaire peut se faire par ponction d'urine dans la vessie sur un animal vigile avec une contention manuelle. La durée du prélèvement est de l'ordre de la minute, l'animal est alors allongé sur le dos. Un maximum de deux prélèvements d'urine dans la vessie sur 24h est accepté, espacées d'au moins 6h. Cela se fait sous échographie pour eviter tout risque de blessure.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Malgré un entraînement régulier, toute contention peut engendrer un stress ou un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entraîner un stress, un inconfort si c'est un prélèvement dans la vessie directement. Cela se pratiquera sous échographie pour éviter tout risque de blessure

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet et de chaque protocole en accord avec le vétérinaire responsable. Les animaux pourront être réutilisés dans le cadre d'autres projets.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. La possibilité de mettre en place ces techniques de remplacement seront évaluées avant la mise en place de chaque projet.

Réduction

150 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 2 ans. Cela représente en moyenne 75 animaux par an soit en moyenne 7 études par an comprenant une moyenne de 10 à 12 individus par protocole. Un délai minimum de 4 semaines sera respecté entre chaque étude. Si aucune approche statistique n'est réalisée par le Donneur d'Ordre, on calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus, un minimum de 3 animaux par produit est nécessaire pour une interprétation des résultats exploitables. Ce nombre peut être augmenté pour obtenir une meilleure fiabilité des résultats, palier à une grande variabilité inter-individuelle ou être homogène dans le sex-ratio des animaux.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 à 4 animaux par groupe, par sexe et par affinité dans le respect du plan d'hébergement et de la règlementation en vigueur. De l'enrichissement du milieu (exemple: griffoir, coussin,plateformes à différentes hauteurs, balles ou cordelettes) est présent dans chaque box. Un suivi quotidien est mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...). Une visite hebdomadaire par le vétérinaire désigné ou son suppléant est réalisée pour évaluer la stabilité et l'équilibre social de tous les groupes de chats.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires. Jeunes adultes stérilisés ayant atteint leur taille adulte et un système immunitaire et métabolique mature.

8 chevaux atteints d'asthme sévère, appartenant à des particuliers, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant trois mois, chacun reçoit d'abord des pellets de foin, puis du foin sec pendant douze jours, exposition dont le porteur attend une toux, un jetage ou une gêne respiratoire modérée, avant dix jours de corticoïdes qui peuvent entraîner une fourbure ou une surinfection respiratoire. Cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires sous sédation, environ 45 minutes par cheval et par série, servent à chercher des exosomes susceptibles de renseigner sur l'inflammation pulmonaire. Aucun cheval n'est tué, les huit retournent à leur lieu de vie d'origine à la fin du protocole.

Objectifs

L’asthme équin regroupe plusieurs maladies respiratoires inflammatoires non infectieuses, récurrentes ou chroniques, qui altèrent durablement le confort et les performances du cheval. Parmi elles, l’asthme équin sévère concerne une part importante de la population équine, en particulier les chevaux adultes et âgés. Aujourd’hui, son diagnostic repose principalement sur l’examen clinique et sur l’analyse du lavage bronchoalvéolaire, qui permet d’évaluer l’inflammation dans les voies respiratoires profondes. Cependant, cet examen de référence n’est pas toujours réalisable, notamment lorsque l’animal présente une crise respiratoire. En outre, il reste difficile de distinguer avec précision un cheval asthmatique en rémission d’un cheval atteint d’une forme modérée ou d’un cheval sain. Ce projet propose d’explorer une piste innovante : l’étude des exosomes, de très petites vésicules libérées par les cellules, présentes notamment dans le sang et dans les fluides respiratoires. Ces structures jouent un rôle majeur dans la communication cellulaire et pourraient refléter fidèlement les mécanismes à l’œuvre dans les poumons au cours de l’asthme. En analysant de manière large leur contenu biologique, le projet vise à mieux comprendre la physiopathologie de l’asthme équin sévère, à identifier de nouveaux biomarqueurs et, à plus long terme, à ouvrir la voie vers des outils diagnostiques plus simples et des approches thérapeutiques mieux ciblées. L’enjeu est important : mieux détecter, mieux suivre et, demain, mieux traiter cette affection respiratoire fréquente en médecine vétérinaire équine.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu est une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’asthme équin sévère. Cette avancée est essentielle, car une meilleure connaissance de la maladie constitue la base d’une prise en charge plus précise, plus précoce et plus adaptée aux chevaux atteints. En médecine vétérinaire équine, où les outils diagnostiques restent parfois limités, tout progrès dans la compréhension fine de la maladie peut avoir un impact direct sur la qualité du suivi clinique. Le projet doit également permettre d’établir un véritable “profil” des exosomes et de leur contenu selon deux paramètres majeurs : le type d’exposition étudié et la réponse au traitement par corticoïdes. Cette approche pourrait aider à identifier des signatures biologiques utiles pour mieux repérer les phases d’aggravation, objectiver l’amélioration sous traitement et, à terme, affiner le pronostic et le suivi des chevaux asthmatiques. Il s’agit donc d’une recherche à fort potentiel translationnel, c’est-à-dire susceptible de déboucher sur des applications concrètes pour la pratique vétérinaire. Enfin, le projet doit aussi préciser si l’alimentation à base de pellets de foin peut être considérée comme sûre sur le plan respiratoire chez les chevaux souffrant d’asthme. Cet aspect présente un intérêt très concret, car la gestion de l’environnement et de l’alimentation fait partie intégrante de la prise en charge de cette pathologie. Si leur innocuité est confirmée, ces aliments pourraient représenter une solution pratique et sécurisée pour limiter l’exposition à des facteurs aggravants, tout en facilitant la conduite quotidienne des chevaux asthmatiques.

Procédures

Sur une période de trois mois, huit chevaux atteints d’asthme équin sévère seront suivis au cours de plusieurs phases successives. Ils seront d’abord exposés à une alimentation sous forme de pellets, puis à du foin sec, chaque période durant douze jours, avant de recevoir un traitement corticoïde pendant dix jours. Au cours de cette étude, cinq prises de sang et des lavages bronchoalvéolaires de seront réalisés chez chaque cheval, après sédation, afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses. Chaque série de prélèvements (sang + LBA) durera environ 45 minutes par cheval.

Impact sur les animaux

L’exposition au foin sec pendant deux semaines peut entraîner chez certains chevaux une réaction clinique modérée et transitoire, avec apparition possible de toux, de jetage ou de gêne respiratoire modérée. Cette aggravation reste réversible et fera l’objet d’une surveillance attentive dans le cadre du protocole. Elle est précisément étudiée, car elle permet de mieux comprendre les facteurs susceptibles de déclencher ou d’entretenir l’asthme équin sévère. La réalisation des lavages bronchoalvéolaires peut provoquer une toux passagère lors du passage de l’endoscope, malgré l’ensemble des précautions prises. Les prises de sang et la sédation peuvent aussi s’accompagner d’effets secondaires limités, tels qu’un hématome local ou, de manière transitoire, une ataxie, une bradycardie ou une hypotension. Un risque d’hémorragie existe également lors du lavage bronchoalvéolaire si une zone fragile est touchée, mais ce risque reste limité par l’utilisation d’un endoscope. Dans les minutes suivant la sédation, un risque de fausse déglutition est aussi pris en compte. Enfin, l’administration de corticoïdes peut comporter un risque potentiel de fourbure ou de surinfection respiratoire. L’ensemble de ces effets indésirables est connu, anticipé et encadré par des mesures de prévention adaptées. Le protocole a donc été construit de manière à concilier l’intérêt scientifique du projet avec un niveau élevé de vigilance vis-à-vis du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux sont maintenus en vie à l'issue de la procédure, et pourront ainsi retourner à leur milieu de vie d'origine.

Remplacement

L’étude de l’asthme équin sévère nécessite d’observer une maladie respiratoire complexe dans l’organisme entier, avec l’ensemble des interactions entre les voies respiratoires, le système immunitaire et les autres organes. À ce jour, cette réalité biologique ne peut pas être reproduite de manière complète par des modèles alternatifs seuls. C’est pourquoi l’utilisation de chevaux est nécessaire pour répondre de façon pertinente aux objectifs principaux du projet. Toutefois, les prélèvements réalisés ne serviront pas uniquement à l’analyse in vivo. Ils permettront aussi de mener des investigations ex vivo afin d’explorer plus finement le rôle potentiel des exosomes et les réponses cellulaires associées. Cette stratégie permet de tirer le meilleur parti possible des échantillons recueillis et de produire des connaissances qui pourront, à terme, préparer le développement de nouvelles approches diagnostiques ou thérapeutiques.

Réduction

Le projet prévoit l’étude de huit chevaux asthmatiques, sans ajout d’un groupe contrôle distinct. Ce choix permet de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour mettre en évidence des différences significatives sur les paramètres étudiés. Il s’appuie en outre sur des travaux antérieurs, qui ont déjà apporté des éléments concernant la tolérance respiratoire de l’alimentation administrée. Par ailleurs, chaque cheval représentera son propre contrôle lors des différentes étapes du protocole. Cette approche est particulièrement pertinente, car elle réduit la variabilité entre individus et permet d’obtenir des résultats robustes avec un effectif restreint. Elle contribue ainsi à répondre à une double exigence : produire des données scientifiques solides tout en limitant le recours aux animaux.

Raffinement

Afin de « limiter » l’impact d’une éventuelle dégradation clinique des chevaux asthmatiques sévères sur le déroulé du projet, l'ordre des phases d’exposition ne sera pas aléatoire. En effet, chaque cheval recevra initialement les pellets, et ne recevra le foin sec que lors de la phase suivante. Par ailleurs, les différents chevaux recevront systématiquement un traitement par corticoïdes à l’issue du projet. Également, le rassemblement des différents chevaux (appartenant à des particuliers volontaires pour participer à ce projet de recherche) se fera par étapes successives (espacées de 24 à 48h) afin de limiter le stress lors de la mise en lot. Ainsi, les 8 chevaux seront tous ensemble dans la pâture à partir de J-21 (début du maintien dans l'environnement "faible en poussière"). Celle-ci sera de dimension suffisante (10 hectares) et localisée au plus "proche" de leurs lieux respectifs de stationnement habituel. Une personne attitrée prendra soin et manipulera quotidiennement les différents chevaux tout au long de la procédure, afin de pouvoir mettre en place un climat de confiance auprès de chaque cheval. Une sédation est prévue préalablement à la réalisation des prélèvements, ainsi que l'utilisation d'un anesthésique local au préalable dans la trachée et les bronches principales afin de limiter l'inconfort et la réaction de toux lors du passage de l'endoscope. À lissue des prélèvements, les chevaux seront équipés d'un panier de jeûne et temporairement placés dans un paddock individuel, délimité dans la pâture proprement dite, et donc à proximité immédiate des différents congénères. Une surveillance visuelle sera mise en place pendant cette période, et le cheval ultérieurement libéré de son panier et relaché dans le pré une fois dissipés les effets de la sédation.

Choix des espèces

Les travaux menés ont pour espèce cible le cheval, et ses spécificités intrinsèques en termes de gestion alimentaire et environnementale. Critères d’inclusion des animaux dans le projet : chevaux adultes (> 6 ans ; > 400 kg) ; préalablement diagnostiqués comme asthmatiques sévère. Critère d’exclusion des animaux dans le projet : Présenter des signes cliniques (autres que respiratoires), ou toute anomalie aux examens complémentaires (prise de sang, endoscopie et prélèvements des voies respiratoires)

Choisies pour leur sensibilité accrue aux agents pathogènes, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont saignées à la joue, à la queue ou au sinus rétro-orbitaire, et le résumé présente ces prélèvements comme les seules procédures prévues, tout en annonçant par ailleurs des souris vaccinées puis inoculées avec des virus transmis par les moucherons culicoïdes. Toutes sont tuées au dernier jour expérimental, pour mesurer la quantité de virus et d'anticorps dans leurs organes et leur sang. Le porteur revendique un "immense avantage" à recourir à ces souris, celui de réduire l'utilisation de moutons, de bovins, de chèvres et d'équidés, et fixe l'effectif de 300 souris sur cinq ans d'après la moyenne des années précédentes.

Objectifs

Les nombreuses émergences et ré-émergences de virus transmis par les culicoides (moucherons) ces dernières années, touchant les animaux (maladie hémorragique épizootique, fièvre catarrhale ovine, …) ont été responsables d’une forte mortalité chez les ruminants et responsables de fortes pertes économiques. Dans le but de limiter les conséquences de ces émergences, la caractérisation des nouvelles souches virales circulantes et la vaccination des animaux est le meilleur moyen de protéger les animaux et de limiter la diffusion de ces maladies. De ce fait, il est nécessaire de bénéficier d’un modèle rongeur adapté pour tester des approches prophylactiques efficaces. De par leur sensibilité accrue à de nombreux agents pathogènes, les souris sensibles constituent un modèle de choix pour des études préalables à des essais sur l’espèce naturellement ciblée par ces agents pathogènes (mammifères de taille importante). Le but de ce projet est de caractériser la virulence de souche virale et d’évaluer la capacité des souris à produire des anticorps dirigés contre les virus d’intérêt. Un total de 300 souris pour 5 ans sera utilisé (ce qui correspond au nombre moyen d’animaux utilisés ces dernières années durant les différents projets).

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’infection de multiples virus émergents et ré-émergents. Ils pourraient permettre également le développement et la mise au point de nouveaux vaccins.

Procédures

Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles pratiqués à la joue (veine submandibulaire), ou à la queue ou en dernier recours au sinus rétro-orbitaire, après pose d’un collyre anesthésiant par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement ne dure que quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlées tous les jours.

Impact sur les animaux

Une surveillance quotidienne de tous les animaux vaccinés et / ou infectés sera réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée sera effectuée avant chaque inoculation de virus, puis quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance sera augmentée à deux observations quotidiennes, y compris les week-ends. L’adjuvant utilisé a fait l’objet de tests toxicologiques qui ont conclu à la non-toxicité et à la tolérance favorable.

Devenir

Les souris seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes et de sang, pour l’analyse de la quantité de virus et d’anticorps dans ces différents prélèvements.

Remplacement

Le modèle des souris s’avère particulièrement pertinent pour l’étude des virus et présente l’immense avantage de réduire l’utilisation de grands animaux (ovins, bovins, caprins, équidés…).

Réduction

Six souris par groupe permet d’avoir des résultats solides et statistiquement fiables. En moyenne, 2 souches virales et 2 essais d’efficacité de nouvelles molécules étant testées par année, 60 souris / an seront utilisées (soit 300 souris au maximum sur 5 ans).

Raffinement

Les souris seront plusieurs par cage avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton ...). Elles sont abreuvées et nourries ad libitum. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée est effectuée avant chaque inoculation d’une souche virale (infectieuse), puis une pesée quotidienne est ensuite effectuée. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance est augmentée à deux observations quotidiennes. Le score clinique de chaque souris est établi quotidiennement et permet de poursuivre ou non la procédure pour chaque souris. Un collyre anesthésiant sera appliqué pour les prélèvements de sang au niveau du sinus rétro-orbitaire. Les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté et formé et ne dure que quelques secondes par souris.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour les virus, de par sa grande sensibilité à l’infection virale. Elle développe généralement des signes cliniques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris utilisées seront âgées de 10 semaines minimum afin de disposer d’animaux adultes présentant un système immunitaire mature et permettant la réalisation des prélèvements dans de bonnes conditions expérimentales.

84 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes et de plumes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées à quatorze jours et tuées au plus tard à quarante-deux jours, elles subissent deux à cinq prises de sang et deux à quatre arrachages de plumes, dans des isolateurs où la compétition alimentaire dépend de la fréquence des nourrissages. Le porteur annonce que de rares animaux développeront la maladie de Marek, tout en décrivant une infection fatale à la majorité des oiseaux atteints, avec fièvre, paralysie, lymphome ou mort subite. L'objet du projet reste de mettre au point une contamination par les poussières d'élevage, présentée comme un moyen de diviser par deux le nombre d'animaux utilisés par expérience.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpesvirus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux en quelques semaines. Ce virus se transmet entre animaux par l'intermédiaire de poussières d'élevage contaminées. Les virions présents dans l'environnement sont excrétés à partir des follicules plumeux infectés, contaminant durablement l'environnement. En effet, l'infectiosité de ce virus dans l'environnement perdure pendant plusieurs mois, ce qui est une propriété inhabituelle pour un herpesvirus. L’objectif de ce projet est d’établir un protocole d’infection par voie aérienne, la voie naturelle d’infection des animaux, à partir de poussières d’élevage contaminées (issues d’un environnement ayant hébergé des animaux infectés), le matériel infectieux physiologique ou bien à partir de squames infectés produites in vitro. Dans ce cas, il s’agira de tester leur infectiosité et d’obtenir du matériel infectieux transmissible sans avoir recours à des animaux. Ce projet nous permettra de mieux caractériser la nature du matériel infectieux et d'approfondir nos connaissances sur les premières étapes de l’infection par voie respiratoire. Dans le cadre de ce projet, nous testerons différents dispositifs de nébulisation ou de préparation/formulation des squames. Si ce protocole est établi, il permettra à terme d’être utilisé pour tester la protection de l’infection par voie aérienne de candidats vaccins.

Bénéfices attendus

Disposer d’une méthode d’administration du virus par voie naturelle qui ne court-circuite pas l’infection par voie respiratoire, comme c’est le cas quand nous inoculons le virus par voie intra-musculaire (IM). Si nous pouvons reproduire l’entrée virale par voie respiratoire avec des cornéocytes produits in vitro, cela nous permettra à l’avenir de tester l’entrée de virus mutants chez la poule directement, sans avoir besoin d’inoculer des poules par voie IM et de les élever avec des poules contacts, découplant ainsi excrétion par les follicules plumeux et entrée virale par voie aérienne. Cela permettra de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés par expérience. Cela permettra aussi de synchroniser les infections des animaux par voie aérienne (ce qui n’est pas possible avec les animaux contacts) afin d’identifier les premières cellules infectées de l’appareil respiratoire dans les 48h post-infection, soit par imagerie sur animaux vivants, soit après sacrifice des animaux sur tissus explantés et analyse microscopique. Au travers de ce projet, nous espérons (i) établir un modèle d’infection MDV par voie aérienne, la voie naturelle d’infection des poules (ii) observer l’infection des animaux à partir de cornéocytes infectés produits dans le modèle d’équivalent de peau et ainsi démontrer que ce matériel et que le modèle des équivalents de peau est un modèle permettant de mimer l’excrétion du MDV au niveau du follicule plumeux. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux à court ou moyen terme : - Maladie de Marek : Capacité à infecter des animaux directement à partir de poussières infectieuses et donc avoir un modèle qui reproduit l’infection naturelle par voie respiratoire. Synchroniser les infections par voie respiratoire. Ouvrir la voie à une meilleure caractérisation de la maladie par une détection des cellules infectées précocement dans l’appareil respiratoire, cet aspect de la physiopathologie de la maladie restant très mal connu. - Virologie : Etude de la fonction des gènes du MDV et mise au point d’une méthode pour l'évaluation de l'infectiosité par voie aérienne de mutants MDV produits in vitro sur équivalents de peau en cornéocytes.

Procédures

Une inoculation de virus sur animaux vigiles + 2 à 5 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 2 à 4 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.

Impact sur les animaux

1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que de rares animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’inoculation par voie intra-trachéale peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle d’infection in vivo par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche très limitée de la maladie. Notamment, actuellement, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro l’infection à partir de poussières. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible à la maladie, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Dans ce projet, on s’attend à avoir 100% des animaux infectés, comme dans les conditions naturelles avec des animaux contacts. Le 1er objectif de ce projet est d’établir une méthode d’infection des poules par voie aérienne avec les poussières. Avec un virus fluorescent ayant un phénotype sauvage, on obtient 100% de transmission à 5 animaux contacts (animaux utilisés pour tester la transmission par voie aérienne, la voie naturelle/physiologique). Aussi si 100% des animaux ne sont pas infectés dans les expériences pilotes avec les poussières, la voie et/ou le matériel sera considéré comme déficient et sa préparation/administration devra être modifiée/optimisée (c’est l’objet des 3 expériences pilotes).

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupe dans des isolateurs adaptés en nombre et en taille, dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement social. Dans les isolateurs, des objets à picorer seront à disposition ainsi qu’un tapis grattoir. Une visite des animaux sera effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié. Les animaux présentant des symptômes graves seront euthanasiés après confirmation du diagnostic de la maladie de Marek. Les animaux présentant des symptômes légers seront surveillés plus attentivement pour détecter l'apparition de nouveaux symptômes. Les euthanasies seront réalisées par injection de pentobarbital. L'ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention sera effectuée en douceur et les prélèvements seront réalisés le plus rapidement possible. La contention pour les inoculations en intrachoanale ou en intratrachéale se fait à 2 personnes pour assurer un geste plus sûr et rapide. Les prélèvements de plumes et de sang seront réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements sera réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l'inoculation du virus par voie intra-trachéale, nous utiliserons des sondes adaptées à l’âge des animaux. L’inoculation par voie intra-choanale sera réalisée avec une pipette. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) ou sous isolateur de travail avant l'entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’inoculation intra-trachéale plus simple et moins stressante pour les animaux.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race White Leghorn permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront inoculés à l’âge de 14 jours (voire à 5 jrs). Ils seront euthanasiés à maximum 42 jours d’âge pour les expériences 0, 0bis, 1, 2, 3 et 4 et à 60 jours pour l’expérience 5. L’âge d’inoculation de 14 jours a été choisi pour 3 raisons : c’est l’âge décrit dans la seule publication relatant l’inoculation de poules par des poussières, cet âge permet d’envisager une administration intra-trachéale, et de réaliser des prélèvements sanguins suffisant dès le début de l’expérience, tout en restant sensible à la maladie.

Une injection dans le vitré, deux minutes par œil, abîme volontairement le nerf optique de 266 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles sont ensuite anesthésiées dix minutes pour mesurer l'activité de leur rétine, et testées éveillées cinq minutes devant des stimuli visuels contrastés. Le RNT qualifie ces tests d'indolores et couramment pratiqués en ophtalmologie humaine, tout en énumérant comme effets attendus une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation et un comportement anxieux. L'équipe affirme que ce modèle constitue le seul moyen d'explorer la maladie et de tester des traitements sur la rétine, alors qu'elle écarte ses propres souris génétiquement modifiées au motif que leur neuropathie apparaît trop tard.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique dans les neuropathies optiques. Le projet porte sur les neuropathies optiques, une maladie qui entraine une perte de la vision progressive due à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous proposons de générer un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduira fidèlement les symptômes retrouvés chez les patients. Il est important de noter que ce modèle représentera le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul modèle qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons un axe de recherche sur les animaux vivants, auxquels nous injecterons une protéine ayant une fonction de protection de la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme, ce projet permettra de proposer un traitement chez les patients atteints de perte de vision.

Procédures

266 animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes pour mesurer l’activité de la rétine. Ces animaux auront reçu dans leur vitré soit le composé induisant une atteinte de la vision, soit une solution contrôle. L’injection dure 2 minutes par œil. L’acuité visuelle sera mesurée sur ces animaux éveillés soumis à des stimuli visuels de différents contrastes. La mesure de l’acuité visuelle dure 5 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les tests pour mesurer la vision sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. L’injection dans le vitré peut induire une courte douleur (moins de 2 min). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. Les effets indésirables liés aux tests peuvent provoquer à court terme, une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation, un comportement anxieux.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem.

Remplacement

Nous réalisons déjà des expériences en laboratoire sur des cellules (issues de patients ou de modèles animaux), ce qui permet de répondre à certaines questions sans utiliser d’animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas d’étudier entièrement les maladies du nerf optique, car celles-ci impliquent le fonctionnement global de l’organisme, notamment les interactions entre l’œil et le cerveau. Par ailleurs, avant de pouvoir tester une nouvelle thérapie chez l’être humain, la réglementation impose de démontrer son efficacité et sa sécurité dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle de souris reproduisant les caractéristiques de la maladie observée chez les patients constitue aujourd’hui l’approche la plus adaptée. Elle permet d’évaluer de manière fiable les effets d’une thérapie, tout en tenant compte des contraintes scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient mâles ou femelles, car la maladie touche les 2 sexes. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant d’avoir un effet statistique significatif.

Raffinement

Toutes les mesures biologiques pour étudier la vision sont effectuées sur l’animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances, nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance pour y mettre fin.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris adulte, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une maladie sur l’organisme. Le stade adulte est utilisé pour s’assurer que la rétine est mature. Nous utilisons ce modèle car la neuropathie optique apparait rapidement permettant de tester plus efficacement des approches thérapeutiques alors que les modèles génétiquement modifiés que nous avons, développent une neuropathie optique légère ou très tardives. La souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements.

Opérés sous anesthésie générale pendant environ trente minutes pour recevoir un assemblage de quatre biomatériaux, 25 des 34 rats sont ensuite irradiés trois fois par semaine pendant quatre semaines, puis tous sont tués trois mois après la dernière intervention pour explanter le dispositif. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et exposent les rats à des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, une infection du site opératoire, une dermatite radio-induite et des troubles du comportement décrits comme anxiété, dépression ou agressivité. Le porteur revendique une démarche One Health, aucun modèle in vitro ne permettant selon lui d'évaluer la biocompatibilité de l'assemblage après irradiation. La réduction du nombre de rats est justifiée par la suite du programme, un essai clinique vétérinaire sur des chats et des chiens atteints de cancers de la bouche.

Objectifs

La présente demande couvre une sous partie du projet de recherche hospitalo-universitaire (RHU) , qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un lambeau osseux libre du patient - en proposant un dispositif médical (DM) idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du DM, et de la caractérisation des biomatériaux. Le DM final sera constitué par 4 DM distincts qui seront associés le jour de l’intervention: 1- Implant en céramique: substitut osseux. 2- Implant à base de Titane : Système de fixation utilisé en combinaison avec le substitut osseux . 3- Membrane d’albumine (Alb) : revêtement cicatrisant et biocompatible, avec des propriétés anti-inflammatoires. 4- Spray antimicrobien.. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. L’objectif primaire est d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. La tenue d’un tel dispositif post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. L'objectif secondaire vise à évaluer l'effet de l'albumine avec ou sans spray antibactérien sur la biocompatibilité du DM et sa capacité de néovascularisation comparée à celui du DM HA-Ti seul chez le rat irradié ou non irradié. La biocompatibilité du DM sera évaluée par analyse histopathologique dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health ». Le projet est réalisé dans 2 Etablissements Utilisateur (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le DM mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du DM suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.

Procédures

Les 34 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes réalisés dans l'EU 2/2. Les 2/3 des animaux (25 rats) seront ensuite irradiés 3 fois par semaine pendant 4 semaines (soit 12 séances d’une durée d'une minute maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation , cette étape est réalisée dans l'EU 1/2. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse, étape réalise dans l'EU 2/2

Impact sur les animaux

1. Douleurs post-opératoires dans les jours suivant l'implantation 2. Difficultés à l'alimentation dans les jours suivant l'implantation / les séances d'irradiation 3. Infection du site opératoire dans les jours suivant l'implantation 4. Mauvaise cicatrisation dans les jours suivant l'implantation 5. Dermatite radio induite dans les jours suivant les séances d'irradiation 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation vise à évaluer la faisabilité d’implantation d’un nouveau DM dans un contexte de tissu irrad L’utilisation des implants à base d’Hydroxyapatite et à base de Titane est déjà autorisée en reconstruction osseuse et a été largement documentée. Les deux autres éléments qui composeront le DM final, le spray antibactérien et la membrane d’albumine, ont déjà fait d’étude in vitro et in vivo mais dans le cadre de tests séparés. Cette étude sera la première à tester la biocompatibilité et la néovascularisation suite à l’implantation de l’assemblage des 4 DMs. Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation.

Réduction

Le projet s’inscrit dans la démarche One Health. En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettront de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participants à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus (avec un biostatisticien), ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le taux de succès sera estimé dans chaque groupe avec un intervalle de confiance de 95% . L’effet de l’irradiation sera évalué par un test statistique non paramétrique . Le protocole d’irradiation a été défini avec une spécialiste de radio-oncologie vétérinaire

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité..De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes