Toxicologie (hors obligations réglementaires)

576 jeunes poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mesurer l'effet de polluants sonores et chimiques sur leur comportement et leur cognition. Les alevins sont exposés quatre semaines à du bruit ou à des contaminants avant une batterie de tests. Sur les procédures infligées, le RNT se limite à mentionner une "manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress", sans préciser davantage. Après anesthésie et mise à mort, cerveau et corps sont prélevés pour analyse.

Objectifs

Les animaux évoluent dans des environnements riches en signaux sensoriels d’origine abiotiques (lumière, température, courants, vibrations, champs géomagnétiques) et biotiques (signaux visuels, acoustiques, chimiques, tactiles ou électriques). La capacité à distinguer les informations pertinentes de celles qui ne le sont pas est essentielle à leur survie et à leur reproduction. Toutefois, l’intensification des activités humaines introduit de nouveaux signaux anthropiques, tels que les polluants chimiques et le bruit, qui peuvent masquer ou perturber les signaux biologiquement importants et provoquer des réponses de stress affectant la croissance, la reproduction, le comportement et la survie des organismes. La majorité de ces travaux portent sur des périodes courtes (stress aigü) et sur les individus adultes. Les effets chroniques de ces pollutions acoustique et/ ou chimique durant les jeunes stades de vie ou du développment restent encore peu étudiés. Pour aborder cette question, nous développons au sein du laboratoire une approche expérimentale et pluridisciplinaire sur une espèce de poisson Cichlidé (Maylandia zebra) endémique du lac Malawi, mêlant neurophysiologie et éthologie. Cette espèce, étudiée depuis plusieurs années au sein du laboratoire, utilise plusieurs canaux sensoriels pour communiquer, dont les canaux acoustique et olfactif, et possède des comportements très stéréotypés dans différents contextes comme par exemple la défense du territoire . De plus, l’incubation des oeufs, jusqu’au stade alevin, est réalisée dans la bouche de la mère pendant 21 jours, ce qui permet, en laboratoire, outre un contrôle des naissances, de suivre très précisémenent le développement et le devenir des couvées en environnement contrôlé. L’objectif du projet présenté ici, est d’évaluer les capacités cognitives et de mémorisation de jeunes alevins de poissons cichlidés soumis ou non à des polluants chimique et/ou sonore. Le niveau d'activité, le comportement exploratoire, les interactions sociales, les traits comportementaux ainsi que les capacités d’apprentissage et de mémorisation des animaux seront estimés à l’aide de tests éthologiques classiques ainsi que des tests de conditionnement.

Bénéfices attendus

Ces dernières années les études sur la pollution sonore se sont largement développées et nous savons qu'il existe des effets sur les comportements, la communication, la physiologie des populations aquatiques (poisson, invertébrés..). Toutefois, les études plus fines au niveau de l'individu et notamment au niveau des capacités cognitives ou de mémorisation des poissons sont rares et commencent à émerger. Ce projet vise également à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination durant premiers stades de vie. Enfin, très peu d’études aujourd’hui concerne l’impact couplé de deux facteurs polluants anthropogéniques, c’est-à-dire liés à l’activité humaine.

Procédures

Manipulation des animaux pour les tests comportementaux pouvant engendrer un stress

Impact sur les animaux

L’environnement bruité ou le conditionnement pavlovien pourraient engendrer un stress pour l'animal : le comportement des animaux sera suivi (et enregistré) pendant toute la durée de l'expérimentation. Si un comportement anormal est observé l'expérience sera immédiatement stoppée. Un comportement anormal peut être: arrêt total de la nage (le poisson reste prostré dans un coin); nage en surface bouche ouverte; nage saccadée.... Concernant l’impact sur les poissons aux stades embryo-larvaires, compte tenu du peu de connaissance, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité a été observée.

Devenir

Après anesthésie et mise à mort des prélèvements tissulaires seront effectués pour histologie

Remplacement

L’évaluation de l’impact des facteurs polluants sur les capacités cognitives et de mémorisation reposent sur des techniques d'apprentissage suivi de l'observation de séquences comportementales : l'animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances et des modèles linéaires à effets mixtes. De plus, nous souhaitons avoir des données comportementales indépendantes (et non pas des mesures répétées) afin d’avoir des données plus facilement exploitables statistiquement et d’améliorer le bien-être des poissons : un individu donné ne sera soumis qu’à un seul test comportemental. Pour ce faire nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux testés (12 par test comportemental). A partir d’un individu, plusieurs tissus seront prélevés (cerveau, corps) afin de réaliser l’analyse transcriptomique et la mesure du stress oxydatif.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être des animaux, les aquariums seront enrichis avec du sable et des abris adaptés (utilisation de galets). Les densités utilisées dans les aquariums respecteront les règles sanitaires (soit 6 juveniles de 1,5cm dans un aquarium de 10 litres). Enfin, les conditions de température, lumière, pH et Nitrates seront contrôlées et se rapprocheront au mieux de l'environnement dans le milieu naturel garantissant la qualité de l'habitat et le suivi des animaux (présence de filtration, chauffage, oxygénation, fréquence et type de nourriture adaptée aux jeunes poissons). Si une de ces conditions devient inadaptée des changement d'eau seront envisagés. D'autre part ltous les animaux seront anesthésiés avant la mise à mort et les points limites stricts et spécifiques du projet seront appliqués.

Choix des espèces

Notre modèle est un poisson cichlidé social, grégaire présentant une forte hiérachie. En contexte de défense du territoire et de parade nuptiale, ce poisson communique via les canaux visuels, acoustique et olfactif, ce qui en fait un modèle de choix pour l'étude des interactions sociales et de lacommunication multimodale. De plus, l'incubation des oeufs se fait dans la bouche de la femelle, ce qui facilite l'étude de l'effet de paramètres environnementaux au cours du développement embryonnaire. Il est étudié au laboratoire depuis plus de 15 ans : les comportements de ce poisson, dans différents contextes, sont bien connus de l'équipe : toute modification comportementale liée à l'envoi de stimuli sonores (bruits de bateaux) ou chimiques sera donc facilement identifiable. L'objectif de cette étude est de mesurer l'impact de la pollution sonore et/ou chimique sur le comportement, les capacités cognitives et de mémorisation chez les poissons pendant les premiers stades de vie. Après la sortie de l’incubation buccale de la mère, les juvéniles seront soumis pendant 4 semaines à une pollution sonore et/ou chimique. Ensuite les juvéniles âgés de 1 mois (ils mesurent alors environ 2cm de long) seront soumis à des tests comportementaux.

2 688 chiens vont être utilisés pour des études réglementaires de toxicologie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit un candidat médicament de façon unique ou répétée, subit des prélèvements de sang, parfois la pose de cathéters ou d'implants enregistrant ses paramètres physiologiques, et des effets toxiques légers à modérés sont attendus. La plupart seront tués pour l'examen de leurs organes exigé par la réglementation, 200 réutilisés dans d'autres études, une dizaine renvoyés à l'élevage et une vingtaine placés. Ces essais sur le chien sont présentés comme une obligation réglementaire avant tout passage à l'humain.

Objectifs

La réalisation d’études de toxicologie (générale, de reproduction, juvénile, de pharmacologie de sécurité) est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques avec un médicament à visée humaine ou pour obtenir une Autorisation de Mise sur le Marché pour les dispositifs médicaux, médicament vétérinaire ou produit chimique. Ces études consistent à administrer le candidat médicament de manière unique ou répétée, puis de réaliser des observations régulières des animaux incluant des pesées corporelles, un suivi des paramètres sanguins ou urinaires, une évaluation des fonctions respiratoires, musculaires et cardiovasculaires. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit, mais aussi de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et les protocoles d’études réglementaires avant les essais chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie dans lesquelles un candidat médicament est évalué, sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales. Elles représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (d’abord sur des volontaires sains, puis sur des patients à moyen et long terme) ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique). Pour les médicaments (humains et vétérinaires) et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Elles visent à définir la toxicité ou la tolérabilité des produits à tester et donc de rendre les essais cliniques plus sûres pour les patients ou volontaires participants à l'essai. Les résultats récoltés permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal (dans le cadre de médicament vétérinaire). Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. Ce projet permettra également d’évaluer la sécurité des molécules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices Européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’évaluation de la sécurité des produits chimiques.

Procédures

Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, sous-cutanée ou intraveineuse en bolus. Les administrations peuvent être faite avec échoguidage si nécéssaire. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude. A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés pour examen macroscopique, pesée des organes et collecte des organes/tissus pour analyse microscopique.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Stress, ou inconfort lié à à l'enregistrement de certains paramètres physiologiques (ECG, BP par exemple) ou certaines administrations nécessitant le placement en hamac ou le port d’un gilet contenant une pompe ou des dispositifs d’enregistrement, ou la mise en place d'électrodes ou de brassards. Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) doivent se faire pendant la période nocturne - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16 h pour recueil d’urines/fèces - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie).

Devenir

En accord avec le plan d’étude, les animaux pourront être : 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examen et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retournent en zone d’hébergement hors étude suite après avis vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude qui sera conditionnée par un examen vétérinaire favorable.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux permettant de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. Il est nécessaire d’avoir accès à un modèle expérimental, tel que le chien, pouvant mimer au mieux les interactions biologiques et physiologiques complexes observés chez l’Homme. L'utilisation du chien répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Le choix du chien est fait en fonction des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles ainsi qu’en fonction des similitudes entre l’homme et l’animal. Pour les produits à usage vétérinaire administré chez le chien, on choisira et utilisera cette espèce cible. De plus, dans ces études, un relevé des signes cliniques et un suivi des paramètres sanguins et une observation microscopiques des organes post-mortem sont requis ce qui serait impossible à faire via des méthodes alternatives. Il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son intégralité pour évaluer les effets du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables. Ce nombre est adapté selon le nombre de produits testés, le nombre de doses testées et de la présence ou non d’une période de réversibilité (effet à long terme). Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est réduit au minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits. Le nombre d’animaux est revu par le Directeur d’étude et est mentionné dans le plan d’étude.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les chiens seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les chiens seront hébergés dans des boxes équipés de planchette de repos et ont à disposition des jouets (dont le renouvellement est effectué régulièrement). Pour se défouler, les chiens bénéficient d’un temps d’activité/exercice dans une zone dédiée plusieurs fois par semaine. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (fréquence et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux seront observés au moins 1 fois par jour (incluant les week ends et jours fériés) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques par un personnel d’étude formé et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur. En cas de signes cliniques ayant un impact sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple, euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le chien est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond à des critères scientifiques précis telles que des données de pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamiques disponibles mais aussi en fonction des similitudes entre l’Homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude, de la population visée (ou animaux visés si médicament vétérinaire), l’âge le plus adéquat sera choisi.

Le protocole dépend des molécules qu'un développeur veut faire avancer: 1 155 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour analyses de sang et d'organes. Chaque animal reçoit un candidat médicament par voie orale ou injection, subit jusqu'à six prélèvements sanguins sur 24 heures et un passage en cage à métabolisme avec restriction d'eau. Ces études caractérisent le devenir des molécules dans l'organisme pour préparer les dossiers réglementaires de futurs médicaments. Le porteur retient le rat comme l'espèce "la plus prédictive" en toxicologie.

Objectifs

Ce projet vise à caractériser le profil ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme, Élimination) de candidats médicaments pouvant appartenir à toutes les aires thérapeutiques étudiées en interne chez le rat. Ces études, intervenant après les premières études de sécurité et d’efficacité et avant les études complètes de toxicologie, permettent de sélectionner les molécules aux propriétés les plus favorables en terme d’ADME, d'évaluer l'impact des formulations sur l'exposition plasmatique du produit et de définir les conditions optimales (doses et schémas) pour les futurs essais de sécurité et d'efficacité. Elles facilitent également l'interprétation des données en corrélant les concentrations sanguines du produit aux effets observés. Bien que l’étude sur organisme entier demeure indispensable, ce projet intervient après une sélection screening des molécules rigoureuse par des méthodes alternatives (in vitro et in silico). La stratégie s'appuie sur : • l’utilisation de protocoles peu contraignants et de doses uniques (déterminées par des études de dose maximale tolérée préalables) et définies pour ne pas présenter d’effets indésirables. • le recours à des effectifs restreints pour limiter, par une sélection précoce, le nombre de molécules et d'animaux utilisés dans les phases de développement ultérieures. Les études consistent en une administration, le plus souvent unique chez le rat, (espèce rongeur communément utilisée dans les études de sécurité non clinique) suivie de prélèvements de sang à différents temps. Des collectes d’urines et analyses sur les organes permettant d’obtenir des paramètres de cinétique d’élimination du candidat médicament testé et d’évaluer la biodistribution peuvent également être prévues. Ces études se déroulent sur une durée de 24h (cas standard) à 4 semaines.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, nous allons pouvoir déterminer les paramètres d’Administration/Distribution/Métabolisme/Elimination (ADME) des candidats médicaments. A court terme, ces paramètres permettront d’affiner le choix du design des études de sécurité non clinique intervenant juste après les études incluses dans ce projet comme la voie d’administration, le schéma expérimental et le choix de doses. A long terme, Il sera possible d’une part de connaitre le taux dans le sang des différents composés et d’autre part d’établir des relations pharmacocinétiques/ pharmacodynamie (PK/PD), le tout pour sélectionner le meilleur candidat et diminuer le nombre d’études ultérieures. En effet, les candidats médicaments qui présentent des paramètres ADME permettant d’être actifs (bonne absorption et/ou distribution sans être métabolisés ou excrétés trop rapidement) pourront continuer le développement et potentiellement servir dans le traitement de différentes pathologies.

Procédures

- Administration par voie orale ou par injections (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés à évaluer, contention de quelques secondes à 5 minutes maximum (incluant le passage dans une enceinte thermorégulée), administration de 10 secondes à 2 minutes maximum - Prélèvements de sang de faible volume : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum durant l’étude sur animal vigile, contention de 2 minutes maximum, durée du prélèvement de quelques secondes - Recueils urinaires d’une durée comprise entre 6h (cas standard-approximativement 90% des cas) et 16 heures (cas exceptionnel justifié scientifiquement si besoin d’un volume plus élevé d’urines pour le dosage d’un paramètre à de très faibles niveaux - approximativement 10% des cas) en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) avec diète hydrique d’une durée correspondant à celle du recueil (6h en standard et 16h maximum) - Prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir lors des : ⦁ administrations des composés à évaluer : administration unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) : selon les voies utilisées, -contention d’une durée de moins de 15 sec et administration du composé (moins de 10 sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 administrations par jour) : degré de sévérité léger à modéré selon la voie et le nombre d’administrations -passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) : degré de sévérité léger. ⦁ Prélèvements de sang : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité léger à modéré en fonction du volume total prélevé) ⦁ Recueil urinaire (cages à métabolisme) : le changement d’environnement et l’hébergement individuel de courte durée (6h en standard, et n’excédant pas 16h) peuvent générer un inconfort et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). ⦁ Administration sous-cutanée (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (degré de sévérité léger). ⦁ Induction de l’anesthésie gazeuse préalable à l’euthanasie : l’induction qui est rapide peut générer du stress. La molécule administrée peut induire en elle-même des effets indésirables (perte de poids par exemple)

Devenir

Des analyses sur le sang (nécessitant un prélèvement de volume important) et/ou tissus post mortem sont effectuées à l’issue des études incluses dans ce projet pour compléter les données collectées in vivo, ne permettant pas la réutilisation des animaux à l’issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Le développement d'un candidat médicament nécessite une approche multidisciplinaire pour évaluer ses propriétés pharmacocinétiques et métaboliques. Si les modélisations informatiques et les tests in vitro (perméabilité, stabilité microsomale, interactions enzymatiques) sont essentiels à la sélection initiale des molécules, ils restent insuffisants pour modéliser la complexité d'un organisme entier. Les études in vivo demeurent indispensables pour caractériser précisément le devenir du candidat médicament. En retour, ces données permettent d'optimiser le choix des modèles in vitro afin d'améliorer la corrélation et la prédictibilité des futurs essais.

Réduction

Pour ces études, en tenant compte des variabilités inter et intra individuelles et en fonction de la question posée, on utilise en standard 3 animaux/sexe, soit le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats scientifiques fiables et interprétables. Ce chiffre est basé sur l’expérience acquise en interne (reproductibilité des données, variabilité inter-individuelle inhérente au vivo) et sur les pratiques de la communauté scientifique. Exceptionnellement, jusqu’à 12 animaux/sexe par dose, voie d’administration ou formulation différentes peuvent être utilisés (cas d’un candidat médicament ayant une cinétique très compliquée à suivre, c’est-à-dire ayant une cinétique détectable à de très faibles niveaux, ou avec une variabilité inter-individuelle importante nécessitant un nombre de prélèvements importants). Ce nombre d’animaux, ne représentant que 5 à 10% des études intégrées dans ce projet, peut être anticipé grâce à des modélisations informatiques réalisées sur le candidat médicament. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisé et le nombre de prélèvements sanguins ou d’organes effectués, les responsables scientifiques utilisent des modèles informatiques basés sur des méthodes mathématiques pour analyser au mieux les données. Le nombre de rongeurs utilisé a également pu être considérablement réduit grâce à la méthode de prélèvement sanguin par microsampling. Cette méthode permet de ne prélever qu’un faible volume de sang et ainsi d’effectuer différents temps de prélèvement sur un même animal tout en respectant les volémies physiologiques pour le rat et en réduisant douleur/angoisse (moins de contention et réduction du temps du geste technique) chez l’animal.

Raffinement

Les doses de candidat médicament à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo (objet d’un autre projet) afin d’éviter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Même si les doses utilisées dans les études de ce projet ne doivent pas entraîner de toxicité, si des signes cliniques étaient observés, une décision rapide sera prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes, soins, arrêt de traitement, diminution de doses ou euthanasie seront réalisés. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat mise en place avant l’apparition des points limites. Les animaux sont manipulés quotidiennement et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (exemple : contention pour administration par injection). Tous les animaux sont hébergés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel ou phase de recueil urinaire par exemple), avec de l’enrichissement adapté (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les études d’une durée supérieure à 1 semaine, une puce électronique d’identification couplée à un capteur de température pourra permettre le suivi de la température corporelle de manière non invasive. Lorsque les prélèvements de sang n’excèdent pas 50µL par prélèvement, la technique du microsampling est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat. La durée du recueil urinaire est limitée, réalisée en journée sur une durée de 6h ou exceptionnellement en période nocturne

Choix des espèces

Le rat est l’espèce rongeur la plus utilisée dans toutes les études de sécurité non cliniques réalisées après les études incluses dans ce projet (études de sécurité réglementaires notamment), car considéré comme le plus prédictif en toxicologie, ce qui permet de mieux comprendre et caractériser la molécule dans un modèle pertinent sur le plan pharmacologique. Ici les rats utilisés sont de jeunes adultes et des adultes, d’âge équivalent aux études ultérieures à ce projet et conformément aux requis règlementaires. Exceptionnellement, des animaux juvéniles (post-sevrage) pourront être utilisés, lorsque le candidat médicament a pour visée le traitement de pathologie chez de jeunes patients.

1 090 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, 818 réutilisés dans d'autres protocoles et 272 mis à mort pour prélèvements. Les animaux reçoivent des produits de référence et des prises de sang répétées afin de tester des capteurs qui suivent en continu leur activité dans la cage. Le projet se présente comme une démarche de "raffinement" et de "réduction", tout en mobilisant plus d'un millier d'animaux et en leur administrant des composés qui peuvent dégrader leur état général. Le porteur admet que ces technologies servent d'abord de support aux autres projets autorisés de l'établissement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer et de déployer des technologies qui permettent un suivi automatisé de l’activité et des comportements des rongeurs (souris et rats) directement dans leur cage d’hébergement. Elles permettent de suivre divers paramètres comme l’activité locomotrice, la consommation hydrique, alimentaire, les actions de toilettage, les bagarres, la stéréotypie. Le suivi automatisé des rongeurs s’inscrit dans une démarche de raffinement et potentiellement de réduction. Il permet d’analyser les comportements normaux et anormaux des animaux en groupe, sans modifier leurs conditions d’hébergement, sans les manipuler, en continu (ce qui inclut la nuit, période où les rongeurs sont le plus actif). Le nombre d’études est estimé à 3 par an.

Bénéfices attendus

Les nouvelles technologies vont permettre d’évaluer certains critères en continu avec des méthodes non invasives et plus fines (précision, reproductibilité), jusque-là non évalués ou évalués différemment. Nous attendons de ces technologies une détection plus précoce de certains effets négatifs, ce qui permettra de limiter toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables inutiles pour ceux-ci dans le cadre des autres projets autorisés pour lesquels ce projet vient en support. Ex : si une bonne corrélation est mise en évidence entre des mesures réalisées avec les nouvelles technologies et des paramètres dosés à partir de prélèvements sanguins, les nouvelles technologies permettront de limiter le nombre de prélèvements sanguins nécessaires pour suivre les animaux et contribuer à la diminution des contraintes auxquelles ils sont exposés.

Procédures

Administrations réalisées sur animal vigile, environ 10 secondes, avec un maximum de 14 traitements en cas d’administrations répétées quotidiennes Prises de sang uniques ou répétées réalisées sur animal vigile, environ 15 secondes, ou sur animal anesthésié pour les volumes nécessitant un temps de prélèvement plus long, réalisées pour s’assurer des effets attendus d’un produit de référence.

Impact sur les animaux

L’administration de produits de référence peut provoquer une altération de l’état général des animaux, se traduisant par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, des modifications du comportement.

Devenir

La majorité des animaux est gardée en vie à la fin d’une procédure. Ils pourront – en accord avec le vétérinaire clinicien – être réutilisés pour une nouvelle procédure dans ce même projet ou dans un autre projet autorisé. Les animaux ayant atteint un point limite ou pour lesquels des prélèvements de sang (volume important) et/ou de tissus doivent être réalisés seront euthanasiés.

Remplacement

Il n’est pas possible de conduire ce projet sans animaux, puisqu’il s’agit de suivre de manière automatisée leur comportement et activité.

Réduction

Les technologies envisagées dans ce projet étant non invasives, les paramètres biologiques seront collectés autant que possible dans le cadre des autres projets afin de limiter le nombre d’animaux commandés pour ce projet dédié au développement de nouvelles technologies. Pour les études réalisées dans le cadre de ce projet, un biostatisticien est consulté pour optimiser les effectifs nécessaires. De plus la réutilisation envisagée permet au final de réduire la quantité d'animaux utilisée.

Raffinement

Les technologies envisagées sont compatibles avec les conditions d’hébergement standard, ce qui permet de récolter de nouvelles données sans ajouter de contraintes supplémentaires pour les animaux. De plus ces technologies sont évaluées pour leur potentiel de détection plus précis et/ou plus précoce de la moindre anomalie chez les animaux. Les points limites stricts et spécifiques sont appliqués. Des critères d’alarme et/ou d’interruption d’étude ainsi qu’un arbre décisionnel d’arrêt d’étude sont strictement appliqués en collaboration avec un le vétérinaire clinicien. La préhension des animaux est préférentiellement réalisée à l’aide du tunnel déjà présent dans la cage en tant qu’enrichissement.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont les espèces utilisées dans les autres projets autorisés pour lesquels ce projet vient en support. Il s’agira d’animaux adultes.

Pour choisir les doses de futures études réglementaires de toxicité, 12 000 rates gestantes vont être utilisées, toutes mises à mort, dans des procédures classées de souffrance légère à modérée. Chaque femelle est gavée quotidiennement pendant seize jours de gestation, avec jusqu'à six micro-prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Le porteur présente cette étude préliminaire comme un moyen d'écarter tôt les molécules toxiques et d'éviter des tests plus larges. Les rates sont mises à mort au vingt-et-unième jour de gestation et leurs fœtus tués, y compris viables, pour l'examen du squelette.

Objectifs

L?objectif de ce projet est d??valuer le potentiel de toxicit? de substances chimiques sur le d?veloppement embryonnaire et f?tal au sein d'un organisme vivant complet. En d?tail ce projet a ainsi 2 objectifs. Le premier est d' Identifier et abandonner rapidement les mol?cules ? potentiel embryofoetaux toxique pour ?viter des tests inutiles ? plus grande ?chelle et ainsi s?lectionner les mol?cules les moins risqu?es. Le deuxi?me est de d?terminer les doses pr?cises qui permettront de r?aliser les ?tudes r?glementaires obligatoires sans causer de souffrance excessive (effets s?v?res) aux animaux et ainsi d?finir les doses de s?curit? pour les futures ?tudes r?glementaires.

Bénéfices attendus

Cette ?tude conduite avec un nombre restreint d?animaux permet de d?finir les doses qui seront utilis?es ult?rieurement dans l??tude r?glementaire de Toxicologie du D?veloppement demand?e par les autorit?s comprenant plus d?animaux. Cette ?tude tr?s pr?coce permet aussi de mettre en ?vidence le potentiel profil de toxicit? du produit sur l'embryo ou le foetus afin de pouvoir arr?ter le d?veloppement de mol?cules qui pourraient pr?senter des alertes importantes de toxicit? sur la reproduction et le d?veloppement et ainsi ?viter des ?tudes plus importantes avec plus d'animaux.

Procédures

Les femelles gestantes vigiles seront gav?es journali?rement ? l?aide d?une sonde souple adapt?e ? leur taille et ?ge, pendant maximum 16 jours (g?n?ralement du jour 6 au jour 20 ou 21 de la gestation). Cette proc?dure est r?alis?e en moins de 15 secondes. Durant la fin de la p?riode de gestation (entre GD17 et GD21), des pr?l?vements sanguins d?une dur?e inf?rieure ? 2 minutes, pourront ?tre r?alis?s sur animaux vigiles et/ou animaux anesth?si?s. Ce pr?l?vement peut ?tre unique ou r?p?t? en respectant les dur?es de la r?cup?ration physiologique. Chaque femelle pourra faire l?objet d?un maximum de six micro-pr?l?vements sanguins (50 ?L chacun) en 24h. Un pr?l?vement sanguin plus important, correspondant ? un volume maximal de 15 % du volume sanguin total, pourra ?tre r?alis? au jour 20 ou 21 de la gestation. Pour les pr?l?vements d?organes et de f?tus, les femelles sont mises ? mort (jour 21 de la gestation).

Impact sur les animaux

Un stress l?ger peut se produire lors de la manipulation ou de la contention des femelles gestantes. Le gavage effectu? ? l?aide d?une sonde souple peut induire un l?ger inconfort et tr?s rarement une irritation de l??sophage. Plusieurs ?chantillons de sang peuvent ?tre pr?lev?s au cours d'une p?riode de 24h pour l?analyse des concentrations de la substance ? tester sur animaux vigiles par ponction ? la veine saph?ne. Des pr?l?vements peuvent aussi ?tre faits en fin de gestation apr?s anesth?sie par ponction ? la veine submentale ou ? la veine sublinguale. Les pr?l?vements de sang peuvent induire une douleur l?g?re et de l?gers h?matomes au point de pr?l?vement. Les effets toxiques attendus sur les femelles gestantes sont mod?r?s car les mol?cules ont d?j? ?t? test?es sur des animaux dans l??tude de tol?rance. N?anmoins, des signes de toxicit? mod?r?s peuvent appara?tre en cours d'?tudes incluant des pertes de poids, une diminution de la consommation de nourriture ou des signes cliniques de type augmentation de salivation, augmentation ou diminution de la mobilit?, tremblements ou impact sur la temp?rature corporelle. Par la suite, les f?tus sont endormis puis ? mort pour les examens ult?rieurs.

Devenir

En raison du but de l??tude qui est d??valuer les effets sur la gestation et le d?veloppement des f?tus, toutes les femelles gestantes sont mises ? mort pour pr?l?vements d?organes et de f?tus. Les f?tus vivants sont ?galement mis ? morts afin de r?aliser l?examen du squelette. Si l?examen du squelette n?est pas demand?, les f?tus seront ?galement mis ? mort car m?me s?ils sont viables ils ne pourraient pas survivre sans leur m?re.

Remplacement

Avant de r?aliser cette ?tude sur le mod?le animal, de nombreux essais in vitro (C. Elegans reprotox assay, Cell line compendium, devTox quick Predict assay, Reprotracker) ou in silico sont utilis?s pour pr?dire le potentiel embryo-foeto toxique d?une substance, mais ils ne permettent pas de reproduire la complexit? tissulaire ou la composition biologique compl?te d?un organisme entier, conduisant ou pas ? l?induction d?effets embryo-foeto-toxiques, ni la gravit? des effets induits par l'exposition au produit. Diff?rents param?tres doivent donc ?tre mesur?s chez l?animal. L??tude d?crite dans ce projet sert ? pr?parer la r?alisation de l??tude r?glementaire de toxicologie du d?veloppement, indispensable ? l?homologation de substances.

Réduction

Ce projet se fait dans le respect des 3Rs avec un nombre minimal d'animaux bas? sur l?exp?rience du laboratoire : 8 femelles accoupl?es par groupe, en comparaison plus de 20 femelles gestantes par groupe sont utilis?es dans l??tude r?glementaire. L?objectif reste ?galement de ne tester chez l?animal que des mol?cules s?lectionn?es comme non dangereuses par des m?thodes alternatives et donc de r?duire le nombre d?animaux utilis?s dans le processus de recherche et d?veloppement.

Raffinement

Les conditions d?h?bergement enrichies et adapt?es aux femelles rattes gestantes (mat?riel de nidification), le personnel form? ainsi que l?utilisation d?une manipulation douce des animaux permettent de r?duire le stress pr?-proc?dural au strict minimum. Les femelles gestantes sont h?berg?es en individuel pour ?valuer pr?cis?ment leur consommation alimentaire mais si des donn?es de consommation alimentaire existent (issues d?une ?tude pr?c?dente de tol?rance) elles seront h?berg?es 2 par cage afin de r?duire le stress li? ? l?isolement. Les femelles gestantes sont observ?es quotidiennement y compris les week-ends, avec une attention plus particuli?re pendant la phase de traitement (au moins 2 observations dans la journ?e). Elles sont pes?es ? intervalles r?guliers pendant la gestation pour v?rifier leur croissance et leur bien-?tre. La consommation de nourriture est ?galement mesur?e ? intervalles r?guliers. Des points limites suffisamment pr?dictifs et adapt?s aux femelles gestantes seront appliqu?s. Des micro-pr?l?vements sanguins seront privil?gi?s. Lors des prises de sang, l?usage d?un tapis chauffant pourra ?tre utilis? pour maintenir la temp?rature corporelle des animaux sous anesth?sie. Le jour pr?c?dent leur mise ? mort les femelles gestantes sont d?plac?es dans une salle proche de la salle de n?cropsie pour ?viter le stress du transfert le jour m?me. Les pr?l?vements de sang sont r?alis?s dans une salle s?par?e et diff?rente de celle utilis?e pour la mise ? mort.

Choix des espèces

Les mod?les rongeurs et notamment le rat sont recommand?s par la communaut? scientifique et les instances r?glementaires. Des donn?es historiques issues des ?tudes pr?c?demment conduites sont disponibles dans le laboratoire avec l?esp?ce et la souche choisie (Rat Wistar). Ces caract?ristiques permettent d'obtenir une grande quantit? d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. De jeunes rattes (8-12 semaines au d?but de l??tude) seront utilis?s dans ce projet comme dans les futures ?tudes de toxicologie du d?veloppement conform?ment aux recommandations des guidelines internationales (OECD 414). Ces ?tudes visent ? ?tudier le potentiel toxique d?une substance sur le d?veloppement et seront r?alis?es pendant la gestation puisque l?objet de l??tude porte sur le d?veloppement de l?embryon et du f?tus lors d?une exposition in utero.