Toxicologie (hors obligations réglementaires)

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.

Objectifs

Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.

Procédures

Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.

Devenir

Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.

Raffinement

Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.

Choix des espèces

Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.

354 souris BALB/c vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et une partie d'entre elles passe jusqu'à 90 minutes par séance immobilisée dans un tube de contention, après trois jours d'habituation de 30, 60 puis 90 minutes. Les souris reçoivent des substances sensibilisantes sur les flancs tondus et derrière les oreilles, ou les respirent par le nez et la bouche, au risque d'irritations de la peau ou des voies respiratoires et de signes d'asthme, puis sont mises à mort à différents jours, jusqu'à J13, pour l'analyse de leurs ganglions. Le but affiché est d'identifier des marqueurs qui permettront plus tard de développer une méthode de culture cellulaire capable de repérer les substances qui déclenchent des allergies respiratoires. Les lots décrits dans les procédures totalisent au moins 368 souris, pour 354 déclarées.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13. Les ganglions lymphatiques auriculaires seront collectés puis analysés par cytométrie en flux. Cette méthode permet d’analyser l’expression de protéines d’intérêt par marquage fluorescent. Trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. Deux lots de 36 souris seront exposés de façon vigile à 2 sensibilisants allergiques de référence et au solvant approprié par exposition oro-nasale, une fois par jour pendant 90 min maximum à J0 et J5 puis à J10, J11 et J12 pendant 25min au maximum. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13 puis les ganglions lymphatiques mandibulaires seront collectés et analysés par cytométrie en flux. Sept lots de 20 souris vigiles seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée, par exposition oro-nasale. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux puis différents tissus seront collectés. La fonction respiratoire des animaux sera évaluée à J0, J10 et J12 de façon non invasive. Un lot de 10 souris seront utilisées pendant 2 semaines pour mettre au point l’ajustement du matériel utilisé pour l’exposition oro-nasale et la mesure de la fonction respiratoire. Ces animaux seront réutilisés dans la procédure d'exposition oro-nasale : ils seront inclus dans la phase de phénotypage.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par inhalation pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures d'exposition cutanée et oro-nasale, les animaux seront mis à mort. Les animaux utilisés pour la mise au point de l'exposition oro-nasale pourront être inclus dans la procédure d'exposition oro-nasale si leur état n’a pas nécessité de mise à mort.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite. Les animaux exposés par inhalation oro-nasale seront habitués aux tubes de contention pendant plusieurs jours et suivant un temps de contention croissant avant d’être exposés aux substances chimiques. Nous proposons d’habituer les animaux comme suit: Jour 1 : habituation de 30 min Jour 2 : habituation de 60 min Jour 3 : habituation de 90 min Jour 4 : exposition de 90 min

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

5 440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées puis une injection intracérébrale sous anesthésie, avant d'être mis à mort par décapitation, y compris des nouveau-nés décapités à la guillotine ou après refroidissement, pour tester ex vivo des molécules candidates de laboratoires clients. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer stress, inflammations, infections et blessures de l'œsophage. Il décrit une activité de prestation pour l'industrie pharmaceutique et affirme que ces enregistrements sur tissu vivant constituent la "meilleure approche".

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleure prédictibilité d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phases précliniques réglementaires, il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grandes quantités d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le développement de modèle rongeur génétiquement modifié. Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules nerveuses de système nerveux central de rongeurs, traités par des molécules directement dans ce système nerveux central, permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur considéré. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique, le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec circuit imprimé d’électrodes et le Patch = un enregistrement à l'échelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécules.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, injectés directement dans le cerveau constitue la meilleure approche car elle permet : - de franchir la barrière hémato-encéphalique ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons) ; - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux seront administrés deux fois par jour avec une manipulation de 5 minutes maximum par animal, soit 10minutes da manipulation au total par jour. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne trois semaines au cours de nos études. Ces multiples manipulations et peuvent souffrir d’inflammation ou de blessure à l’œsophage en fonction des sites d’injections choisis. Tous les animaux subiront l’injection intracérébrale, durant 30-45 minutes sous anesthésie générale et analgésie. Les nuisances pouvant apparaitre sont des inflammations aigues, des infections et, en conséquence indirecte, un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus entre 0 et 21 jours post naissance (c’est-à-dire non sevrés). Les temps de mise à mort varient en fonction du moyen utilisé mais n’excèdent pas dix minutes sous anesthésie et analgésie quand cela est nécessaire. Pour les Rats et Souris < P5 sont anesthésiés sur un bloc froid réfrigérant, sans contact direct, jusqu’à perte des réflexes au pincement d’une patte postérieure, puis décapités avec une paire de ciseaux adaptés, il temps entre l’anesthésie et la mise à mort est de 7 min ; Pour lesP5 < Rats et Souris P10 : les animaux seront anesthésiés par induction gazeuse à l’isoflurane (3.5% rat et 2.5% souris) puis décapités grâce à une guillotine adaptée, pour un temps de manipulation de maximum 7min. Si les animaux sont mis à mort par exsanguination, la totalité de l’intervention est de 12 minutes et passe par une anesthésie gazeuse, puis une analgésie sous masque anesthésique, 5 minutes d’attente et enfin exsanguination.

Impact sur les animaux

Nous avons une procédure qui peut amener à des effets indésirables. La procédure peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress ; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection comme des inflammations, des infections, de blessure de l’œsophage ; *- la mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important ; *-la nature des animaux génétiquement modifiés, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper ; *-l’injection intra-cérébrale peut induire des problèmes de type opératoire et post-opératoire, comme des inflammations aigues, des infections et une conséquence indirecte : un défaut de reconnaissance et de soin de la part des mères pour les individus opérés entre 0 et 21 jours post naissance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Ces mises à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégénératives et à la maîtrise des protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé un nombre suffisant d’animaux nous permettant de valider nos enregistrements. Compte tenu des variations du taux de réussite attendu lors de l’injection intracérébrale au cours des études utilisant cette procédure, nous adapterons ce nombre grâce à une étude pilote qui sera réalisée avant d’introduire plusieurs conditions de test. Cette étude pilote ne sera pas réalisée si les données de notre client sont suffisantes pour garantir une significativité. Les enregistrements validés sont rassemblés par condition pour l’analyse. Nos analyses statistiques des résultats permettrons de déterminer l’efficacité du test. Lors de l’étude pilote, nous pourrons évaluer la significativité statistique et si elle n’est pas atteignable, l’étude sera suspendue. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en poursuivant par 4 conditions différentes au maximum.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils bénéficient d’enrichissement adaptés, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. .Les animaux préalablement administrés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera effectué. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération. Les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique. Ces animaux seront asymptomatiques. L’injection intracérébrale sera précédée d’une prémédication et suivi par des soins antalgiques et enfin d’une couverture antalgique et de suivi clinique deux fois par jours. Les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse et analgésique pour assurer l’enregistrement des activités neuronales.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

135 flets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés en estuaire par pêche électrique, ils sont exposés un mois à un cocktail de pesticides par balnéation, puis tués pour prélever leur foie. Le projet vise à valider des biomarqueurs de la qualité des eaux estuariennes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des poissons vivants et qu'il n'a "pas d'autre alternative".

Objectifs

Le projet présenté vise à évaluer l’impact d’un mélange de pesticides sur le flet un poisson plat communément trouvé dans les estuaires. Le poisson sera exposé pendant un mois à des doses sublétales de pesticides reflétant les concentrations classiquement retrouvées dans un estuaire dont le bassin-versant est soumis à une forte pression agricole. La procédure expérimentale développée, incluant deux niveaux d’exposition et un groupe témoin non exposé, permettra d’isoler les effets des pesticides des différents stress naturellement subis par le poisson dans la nature. L’objectif est d’identifier les modifications métaboliques du flet en réponse à cette exposition aux pesticides. Les résultats obtenus permettront de valider des biomarqueurs dont la dérégulation, chez des poissons prélevés dans la nature, est le signe de la présence de pesticides. Ce projet permettra donc, à terme, d’améliorer les procédures d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes.

Bénéfices attendus

La procédure expérimentale proposée permettra de décrypter les mécanismes moléculaires de la réponse, et les réorientations métaboliques mises en place par les poissons face à une contamination à des pesticides, à des concentrations classiquement observées dans des estuaires présentant des bassins versants dominés par les activités agricoles. La connaissance fine de ces mécanismes permettra de mieux comprendre les impacts des pesticides sur les espèces vivant en estuaire, mais également de développer de nouveaux biomarqueurs qui, caractérisés dans des poissons prélevés in natura, permettront d'augmenter l'efficacité des procédures d’évaluation environnementales applicables à ces écosystèmes qui revêtent une importance sociétale, écologique et économique considérable.

Procédures

Les nuisances prévues au cours de cette procédure expérimentale sont : - une session de pêche électrique (narcose légère) de 2-3 heures pour capturer les poissons en milieu naturel, - le transport jusqu’au laboratoire (1h30 maximum) dans des bacs de 150L, - les biométries effectuées en début d’expérience sur les individus sédatés et anesthésiés (1h en tout), - l’exposition par balnéation d’un mois à 2 concentrations de mélange de pesticides, une faible et une forte. Les poissons seront placés dans des bacs de 20L d’eau de mer, avec un renouvèlement de l’eau et des pesticides tous les 2 jours pour la moitié du volume d’eau, soit 10L.

Impact sur les animaux

Les juvéniles de flets subiront un choc électrique afin de permettre leur capture en milieu naturel. Il s’agit d’une narcose légère, de faible intensité pendant une dizaine de seconde, qui permet d’attraper les poissons avec un haveneau sans causer de stress majeur chez les individus. De plus, les poissons subiront un léger stress lors de leur transport jusqu'au site expérimental, mais cela ne durera qu’au maximum 1h30. Enfin, les poissons seront soumis à un léger stress pendant 1 mois, dû à la contamination aux pesticides.

Devenir

A la fin de l’exposition aux pesticides, l’ensemble des poissons de la procédure (contaminés et témoins) seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires aux analyses pour mener à bien la présente étude.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’étudier les dérégulations métaboliques des poissons exposés à un mélange de pesticides qui s’approche des conditions naturelles. L’organe ciblé pour approfondir les réponses moléculaires du poisson par une approche de protéomique est le foie. Il est donc indispensable d’avoir recours à des animaux vivants, les poissons ne pouvant être remplacés par un modèle informatique, des invertébrés ou un tissu isolé. Par ailleurs cette procédure expérimentale au laboratoire sur poissons doit nous permettre d'affiner nos interprétations sur la réponse du poisson in natura aux stress environnementaux; nous n'avons donc pas d'autre alternative.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux prévu pour ce projet, le nombre de poissons utilisés et mis à mort pour cette procédure expérimentale est de 15 poissons par bacs, pour 9 bacs de 20L, soit 135 individus. Ainsi, la densité de poissons par bassin d’élevage sera inférieure à 10kg/m3 ce qui n’est pas considéré comme une densité génératrice de stress. De plus, cela correspond au minimum nécessaire à la robustesse des tests statistiques qui seront utilisés pour comparer les différentes conditions expérimentales et pour limiter la variabilité individuelle. En outre, le prélèvement en milieu naturel de 135 poissons constitue un nombre relativement faible d’individus, ce qui n’aura aucun impact sur la démographie de la population naturelle de flets de l’estuaire où seront échantillonnés les poissons.

Raffinement

Avant le début de la procédure, les flets seront maintenus une semaine dans des grands bacs de 300L pour acclimatation et traitements antibiotiques, si nécessaire. Les poissons seront ensuite placés dans les bacs expérimentaux de 20L, par lot de 15, pendant 1 semaine avant de lancer la procédure dans lesdits bacs. Ces bacs sont partiellement opaques et sont oxygénés en continu grâce à des pompes à air. Les poissons seront par la suite exposés aux pesticides par balnéation en introduisant directement les pesticides dans les bacs, à partir d’une solution mère liquide. Une surveillance quotidienne de l’état de santé sera également mise en place lors de l’expérience. Elle aura lieu le matin, lors du nourrissage des poissons, et en fin de journée. Les flets présentent des marqueurs de stress tels que le changement de couleur ou une altération du comportement pour la prise de nourriture, pouvant être utilisés comme points limites. Ainsi, si un individu présente de couleur sombre et des difficultés de nage, reste plaqué au fond du bac et ne s’alimente pas pendant 3 jours consécutifs, il sera considéré en état de souffrance, et de facto sorti du protocole expérimental et mis à mort. Cette décision sera prise en concertation avec le responsable du projet et la responsable(s) du bien-être des animaux. Une feuille de suivi des poissons sera complétée quotidiennement tout au long de la procédure. Cette fiche comportera un suivi des paramètres physico-chimiques (température, concentration en oxygène, pH, salinité) ainsi que l’état des poissons (problèmes de nage, position dans la colonne d’eau, prise alimentaire, changement de couleur, perte d’écaille, état des nageoires, lésions cutanées et parasites). Le nombre de poissons morts, moribonds, prélevés et restant dans les bacs d’exposition sera également relevé. Enfin, afin de limiter le plus possible le stress des poissons lors des manipulations, ils seront sédatés et anesthésiés un bac opaque avec couvercle prévu à cet effet et manipulés sur un linge humide pour protéger les écailles et la peau.

Choix des espèces

Le flet a été choisi pour cette procédure expérimentale car cette démarche s’intègre au sein d’un projet visant à optimiser des méthodes d’évaluation de la qualité des eaux estuariennes Le flet est une espèce sentinelle de la qualité des eaux estuariennes, particulièrement étudiée à l’échelle de l’Europe ; cette espèce est présente en abondance dans les estuaires de la côte Atlantique. Le flet est considéré comme un très bon enregistreur de son environnement, en milieu naturel comme au laboratoire.

231 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des substances de référence connues pour perturber la thyroïde, subissent des prélèvements sanguins répétés sans anesthésie puis une autopsie du foie, de la thyroïde et de l'hypophyse. Le porteur présente le projet comme relevant du remplacement et de la réduction, l'objectif affiché étant de valider des méthodes sans animaux (NAMs) par extrapolation des données in vitro. Il reconnaît que cette validation "nécessite" malgré tout des données obtenues chez le rat, un seul sexe étant testé pour limiter l'effectif.

Objectifs

Classiquement l’évaluation de la sécurité des produits chimiques implique le recours à des études animales pour ne soumettre à autorisation que des produits dont le profil toxicologique garantit l’absence d’effet néfaste sur la santé humaine. Or cette pratique de la toxicologie est remise en question par le développement de nouvelles approches méthodologiques (connues sous l’acronyme NAMs) qui, combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) et des modèles cellulaires (tests in vitro), limiteront ainsi le plus possible voir totalement le recours aux modèles animaux (études in vivo). Ce développement est encouragé par les autorités de mise sur le marché européenne (EFSA) ou américaine (EPA). Dans ce contexte, l’objectif est de développer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données in vitro aux données observées in vivo en se focalisant sur les baisses d'hormones thyroïdiennes induites par les interactions entre le foie et la thyroïde. En effet de nombreux produits chimiques y compris des substances ingérées au quotidien comme l'alcool, mais aussi médicamenteuses, sont métabolisées dans le foie et détoxifiées. L’induction d’enzymes de détoxification a comme effet collatéral une élimination plus rapide d’hormones thyroïdiennes, notamment chez le rat qui est connu pour être beaucoup plus réactif que l’homme. Cette connaissance est habituellement obtenue par des études de toxicologie sur l’animal. Mais aujourd’hui il est possible d’envisager d’étudier le potentiel d’activité d’un produit chimique pour cet Adverse Outcome Pathway (AOP) spécifique en utilisant des outils mathématiques et des données obtenues sur essais in vitro de foie et de thyroïde. C’est l’objectif de ce projet et plus spécifiquement de créer des modèles quantitatifs d’extrapolation des données obtenues in vitro aux effets observés in vivo. En accord avec le principe des 3Rs, ce projet a pour objectif de se passer à terme d'études chez l'animal quand un produit est identifié comme affectant la thyroïde in vitro.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la création d'un modèle mathématique capable de prédire les changements d'hormones thyroïdiennes chez le rat à partir des résultats d’essais in vitro sans avoir la nécessité de conduire une étude sur l'animal. Elle s'inscrit donc à la fois dans les R=Réduction et R=Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet contribue à la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) en lieu et place de méthodes utilisant des animaux vivants, en utilisant ici des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico) qui nous permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal.

Procédures

Les animaux seront exposés aux produits administrés oralement par gavage. Ils seront maintenus en hébergement collectif pendant 7 jours. Des prélèvements sanguins seront pratiqués de manière répétée sur des volumes très réduits (moins de 100 µl) sans anesthésie. Une autopsie sera pratiquée en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus seront modérés et connus car on utilisera dans ce projet 3 substances de référence, connus pour agir directement ou indirectement sur la thyroïde en induisant une diminution de la concentration circulante en hormones thyroïdiennes. De plus on sélectionnera des doses suffisamment basses (3 niveaux de doses études) dont la plus haute soit suffisamment tolérée pour que l’étude soit valide.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et autopsiés en fin d'étude conformément aux études de toxicologie pour la réalisation de multiples analyses histopathologiques et moléculaires sur les tissus prélevés, notamment le foie, la thyroïde et l'hypophyse.

Remplacement

Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplaçement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (hépatocytes et thyrocytes) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles contribueront à mettre en place un modèle prédictif pour évaluer l’effet d'un produit sur les hormones thyroïdiennes en fonction de ses effets testés in vitro sur les enzymes hépatiques. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat d’où cette demande d’autorisation de projet.

Réduction

Le projet s’inscrit également dans le R de Réduction de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Le nombre d’animaux est réduit (231): pour le limiter au maximum, on ne testera le concept que sur un seul sexe (mâles) et rendre aussi la démonstration plus aisée en évitant l’influence des variations hormonales observées chez les femelles. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir que les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits nécessiteront d’être testé chez l’animal et avec de plus grande chance de donner des résultats favorables, ce qui réduira de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux. Dans ce projet, le nombre d'animaux est réduit au strict minimum par type d'étude afin d'avoir une puissance statistique suffisante dans chaque procédure, à savoir 5 par groupe dans l'étude de toxicocinétique et 12 dans les études de toxicodynamie.

Raffinement

Le projet s’inscrit également dans le R de Raffinement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires à comparer à ceux qui seront mesurés in vitro. Ces études sont réalisés avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo thyroidien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Les points limites ne doivent pas être atteints et si c'était le cas, ont été définis avec précision, notamment en lien avec l'état général ici (consommation alimentaire, poids de l'animal, comportement) observé tous les jours.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet rentre dans le cadre des efforts entrepris afin de remplacer les études chez l’animal utilisé comme modèle en toxicologie, à savoir le rat, par de nouvelles méthodes alternatives. Pour comparer les données générées in vitro aux observations obtenues in vivo, et ainsi valider la pertinence de nos tests in vitro, il est important d’utiliser la même espèce animale et donc utiliser le rat dans ce projet. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes adultes (à partir de 6 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une implantation de tumeur cérébrale par stéréotaxie, un suivi par IRM répété, des injections intraveineuses, sous-cutanées ou intracérébrales sur plusieurs cycles et des gavages, pour tester un peptide et des nanotechnologies portés par une société de biotechnologies. Le porteur décrit des effets possibles d'hyperpression intracrânienne, d'œdème et de perte de poids, et justifie l'effectif élevé par les 17 procédures prévues. Il qualifie le passage par un modèle animal d'"indispensable" et conclut que le glioblastome ne peut être reproduit in vitro, les bénéfices pour les patients restant conditionnés à des étapes réglementaires ultérieures.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une extraction chirurgicale de la tumeur suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux ont montré l’activité anticancéreuse du peptide NFL sur des cellules de GBM (rats, souris, humain) cultivées en laboratoire et sur des rats porteurs d'un GBM (après une simple administration directement dans la tumeur). Ce peptide tue également les cellules responsables de l'apparition du GBM. De plus, lorsque le peptide se trouve à la surface de nanotechnologies, ce peptide augmente leur entrée dans des cellules de GBM de souris comparativement aux nanotechnologies seules. Chez l'animal (souris), une seule injection des nanotechnologies couplées au peptide et chargées en un anticancéreux, directement dans la tumeur, diminue de manière plus efficace le volume de la tumeur comparativement aux nanotechnologies chargées en anticancéreux mais sans peptide à leur surface. Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations de ce peptide seul et combiné à des nanotechnologies pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le traitement du GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique. Le but de ce projet de recherche pré-clinique non réglementaire est d’étudier la tolérance et l’efficacité de ce peptide seul ou combiné à des nanotechnologies après administrations chez des souris saines ou porteuses de GBM humain en déterminant la voie d’administration la plus adaptée afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.

Bénéfices attendus

La société de biotechnologies en santé qui travaille sur les formulations du peptide NFL seul et combiné à des nanotechnologies visent à en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques chez l'Homme. Le but de ce projet est de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non.

Procédures

Dans la mise au point du modèle, les animaux subiront 3 types d'intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (4 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours) et une injection intraveineuse. Dans l'étude de toxicité, les animaux subiront un type d'intervention : des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale. Dans l’étude de biodistribution et pharmacocinétique tissulaire, les animaux subiront jusqu'à 5 types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et une perfusion cardiaque. Dans l’étude de pharmacocinétique, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique intraveineuse ou sous-cutanée ou intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudal, de la veine jugulaire ou du sinus retro-orbital (3 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude d'efficacité, les animaux subiront quatre types d’intervention : l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure plusieurs minutes, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 à 6 IRM de suivi qui dureront environ une heure chacune et qui seront espacées de plusieurs jours), des injections intraveineuses ou sous-cutanées (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection intracérébrale qui durera plusieurs minutes et des gavages répétés (1 gavage par jour pendant 5 jours suivi de 2 jours de repos, sur 5 cycles maximum).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de chaque phase du projet. Les nanotechnologies pouvant être chargés d’anticancéreux (paclitaxel, etc.), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, oedème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements de sang et/ou d’organes.

Remplacement

L’utilisation des candidats médicaments étant à visée humaine, dans le domaine de la neuro-oncologie, il est nécessaire de réaliser des études précliniques pharmacologiques non-réglementaires, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant les études précliniques réglementaires et les essais cliniques chez l’Homme. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées ou sont en cours pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM humain avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer. Le développement de ce type de modèle (modèle CDX) dans ce projet ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques dans un microenvironnement particulier, notamment dans le cas du glioblastome, ne pouvant actuellement pas être reproduites in vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux.

Réduction

L'étude de toxicité permettra de raffiner la dose administrée, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 2, 3 et 4). Une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre de souris immunodéprimées pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les souris immunocompétentes. Pour finir, lors de l’étude d’efficacité, seuls les traitements ayant montré la meilleure biodistribution et pharmacocinétique tissulaires seront testés pour réduire le nombre d’animaux. Enfin, ce traitement étant destiné aux hommes et aux femmes, ces études seront d'abord effectuées sur un premier sexe, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux pour le deuxième sexe. Ce nombre n'est pas inclu dans cette saisine mais est estimé à 1526 comparativement à 4640 pour le premier sexe. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. L’effectif des souris utilisées (4640) est très important, toutefois il est justifié par le nombre de procédures (17) dont la logique de déroulement est clairement établie. Si certaines de ces procédures étaient un échec complet (peu probable et non souhaitable), cela pourrait entraîner un arrêt du projet tel qu’il est établi aujourd’hui et diminuerait le nombre de vies animales utilisées, afin d’éviter de recourir inutilement à des vies animales.

Raffinement

La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sera mis en place pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, un médicament contre la douleur serait administrée jusqu’à ce que ces signes disparaissent. L'atteinte d'un des points limites par un animal impliquera sa mise à mort. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet. Au fur et à mesure des études précédentes, nous avons pu affiner cette grille et la prise en compte de la douleur animale.

Choix des espèces

Des recherches bibliographiques montrent que la souris est l'espèce la plus utilisée et adaptée pour l’implantation de cellules de GBM, qu’elles soient issues de lignées immortalisés ou de patients. Il s'agit de l'espèce la mieux décrite dans la littérature. Les souris seront utilisées entre 6 et 8 semaines d’âge. Cet âge est majoritairement retrouvé dans les études bibliographiques in vivo sur modèle orthotopique de GBM chez la souris.