Recherche fondamentale

300 souris subissent une chirurgie unique sous anesthésie provoquant un accident vasculaire cérébral, ischémique ou hémorragique selon le groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite observées six ou vingt-quatre heures, avec deux prélèvements de sang et deux évaluations neurologiques, puis tuées pour doser des biomarqueurs et mesurer le volume de la lésion cérébrale. Le porteur reconnaît que certaines présentent après l'opération une fatigue, une perte de mobilité ou des difficultés à se nourrir pouvant durer jusqu'à la fin de la période d'observation. Il écrit que, malgré plus de vingt ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible n'explique l'évolution de ces marqueurs, et conclut que le recours à la souris est "indispensable".

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une urgence médicale majeure et constitue l’une des principales causes de décès et de handicap dans le monde. Parmi les AVC, ceux causés par un caillot qui bloque une grosse artère dans le cerveau (appelés AVC ischémiques) peuvent bénéficier de traitements efficaces. Cependant, même avec une prise en charge rapide, plus d’un patient sur deux reste dépendant trois mois après l’AVC. Le facteur le plus important pour améliorer les chances de récupération est le temps : chaque demi-heure de retard augmente considérablement le risque de décès ou de séquelles. Or, avant d’initier un traitement, les médecins doivent réaliser une imagerie (scanner ou IRM) pour vérifier s’il s’agit d’un AVC ischémique (avec occlusion d’une artère) ou hémorragique (avec saignement d’une artère), car les traitements sont opposés selon le type. Ce délai d’attente est donc un obstacle majeur. Des travaux récents ont identifié des molécules présentes dans le sang (biomarqueurs) qui pourraient permettre de reconnaître rapidement le type d’AVC. Mais ces biomarqueurs n’ont pas encore été testés dans des conditions permettant leur utilisation fiable en pratique. En particulier, on ne connaît pas leur évolution dans le temps ni leur réponse spécifique selon le type d’AVC. Ce projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, l’évolution de ces biomarqueurs dans des modèles expérimentaux d’AVC ischémique et hémorragique. Grâce à un environnement contrôlé, il sera possible de mieux comprendre leur comportement dans le temps et d’identifier ceux qui permettent de différencier rapidement les types d’AVC. À terme, ces résultats pourraient contribuer au développement d’un test sanguin rapide chez l’humain, utilisable dès les premiers instants, pour orienter plus vite les patients vers le bon traitement, et ainsi diminuer la mortalité et le risque de séquelles neurologiques sévères après un AVC.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet cherche à repérer des marqueurs biologiques dans le sang qui réagissent très tôt après un accident vasculaire cérébral (AVC). L’objectif est de mieux comprendre ce qui se passe dans le corps dès les premières heures, et de voir si certains marqueurs sanguins permettent de faire rapidement la différence entre les deux grands types d’AVC : l’AVC ischémique (lié à un caillot) et l’AVC hémorragique (lié à une rupture de vaisseau). Cette phase permettra de faire progresser les connaissances sur les mécanismes de l’AVC et d’identifier des éléments utiles pour améliorer le diagnostic dans les services d’urgence. À long terme, ces découvertes permettront de créer un outil de diagnostic simple et rapide, basé sur un test biologique réalisable dès la première prise en charge du patient. Cet outil pourra : •Accélérer la mise en route du bon traitement, ce qui est essentiel car chaque minute compte. Un gain d’une heure pourrait réduire d’environ 20 % les risques de décès ou de handicap. •Orienter le patient directement vers le service le plus adapté à sa situation (urgences classiques, service spécialisé, salle d’imagerie interventionnelle), en évitant les pertes de temps liées à des transferts inutiles. À plus long terme, ce système pourrait aussi être intégré dans les études cliniques testant de nouveaux traitements, pour pouvoir les administrer plus tôt et de façon plus ciblée. En résumé, ce projet a pour but d’améliorer la rapidité et la précision du diagnostic des AVC, ce qui bénéficiera directement aux patients en augmentant leurs chances de survie et de récupération. Il contribuera aussi à une meilleure organisation des soins d’urgence et à une avancée importante dans le domaine des maladies neurologiques.

Procédures

Le projet sera mené sur 300 souris, réparties en quatre groupes correspondant à différents modèles d’accident vasculaire cérébral (AVC). Chaque souris sera observée et suivie selon une organisation identique comprenant une période d’acclimatation à l’animalerie de 7 jours, un examen de base avant l’intervention durant 5 minutes et une prise de sang de très faible volume. Chaque souris sera utilisée pour une unique intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie durant moins de 20 minutes. Ensuite elle sera observée pour une durée de 6h ou de 24h où elle subira deux prélèvements veineux durant moins de 10 secondes et deux évaluations cliniques durant moins de 5 minutes sans aucune contention prolongée.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, certaines interventions peuvent entraîner un inconfort ou des effets secondaires chez les souris, mais toutes les procédures sont encadrées et réalisées dans le respect du bien-être animal. Les tests neurologiques réalisés après l’intervention peuvent provoquer un léger stress, mais celui-ci est de très courte durée. Les prélèvements de sang effectués sur des animaux éveillés peuvent entraîner un bref inconfort, comparable à une piqûre, mais ils sont très courts et les volumes prélevés sont minimes. De même, les injections (sous la peau ou dans l’abdomen) peuvent provoquer un léger inconfort au moment de l’acte, mais la douleur est passagère. Concernant les chirurgies pratiquées dans ce projet, une douleur modérée et transitoire est possible au niveau de la zone opérée. Après la chirurgie, certains animaux peuvent présenter une gêne neurologique : fatigue, perte de mobilité ou difficultés à se nourrir. Ces effets sont surveillés et pris en charge, mais peuvent durer jusqu’à la fin de la période d’observation. Dans tous les cas, des traitements antidouleur adaptés sont administrés, et des critères précis sont mis en place pour limiter toute souffrance inutile. Les animaux sont étroitement surveillés tout au long de l’étude, et toute détresse conduit à une intervention immédiate.

Devenir

A l’issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort à un temps défini dans le cadre d’un recueil d’organes et de tissus (sang, cerveau) nécessaires aux objectifs scientifiques du projet. La mise à mort est indispensable pour l’analyse biologique (dosage de biomarqueurs), histologique (analyse du volume lésionnel) et immuno-histochimique (étude de l’expression et de la localisation tissulaire des protéines d’intérêt).

Remplacement

À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative permettant de répondre à la question scientifique posée sans recourir à l’expérimentation animale. Malgré plus de 20 ans de recherches et de nombreuses études humaines, aucune donnée disponible ne permet d’expliquer de manière précise et fiable comment évoluent certains marqueurs biologiques après un accident vasculaire cérébral (AVC). Les modèles développés en laboratoire (sur cellules, dits "in vitro") ne permettent pas non plus de reproduire l’ensemble des mécanismes complexes qui se déclenchent lors d’un AVC, comme les réactions inflammatoires, la coagulation, les atteintes des vaisseaux sanguins ou encore la souffrance neuronale. Les modèles animaux, en particulier chez la souris, sont aujourd’hui les seuls à permettre une reproduction fidèle de ce qui se passe dans le corps humain lors d’un AVC, que ce soit par obstruction d’un vaisseau ou hémorragique (saignement cérébral). Ces modèles sont déjà largement utilisés pour comprendre la maladie et tester de nouvelles approches thérapeutiques. En l’absence d’alternative fiable chez l’humain ou en laboratoire, l’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour répondre à la question posée dans ce projet de recherche, dans le but de mieux comprendre la maladie et d’améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs stratégies ont été mises en place. Les marqueurs étudiés ont été directement sélectionnés à partir de données humaines déjà disponibles, issues de grandes bases cliniques, d’analyses de la littérature scientifique et de tests réalisés sur du sang de patients. Ensuite, chaque souris incluse dans le protocole permettra d’obtenir plusieurs prélèvements de sang à différents moments, ce qui évite d’utiliser un animal par point de mesure. Grâce aux progrès des techniques de laboratoire, de très faibles volumes de sang (quelques microlitres) suffisent désormais pour analyser les marqueurs recherchés. Ces prélèvements sont réalisés selon les recommandations internationales, sans dépasser les seuils autorisés. Enfin, un calcul précis du nombre de souris nécessaires a été réalisé avant le début du projet grâce à une évaluation statistique, pour s’assurer que chaque animal utilisé est indispensable. Grâce à l’organisation choisie, ce protocole permet de réduire d’environ deux à trois fois le nombre de souris qui aurait été nécessaire avec une approche classique. L’ensemble de ces mesures permet de respecter les principes éthiques de la recherche animale et de limiter son impact tout en garantissant des résultats fiables.

Raffinement

Avant toute procédure susceptible d’induire une douleur modérée, une analgésie préventive sera administrée. Une crème ou un spray anesthésique local sera également appliqué afin d’engourdir la zone traitée et de limiter l’inconfort au réveil. Les souris seront ensuite installées dans une chambre chauffée pour favoriser un réveil confortable. Les animaux auront un accès permanent à l’eau et à une alimentation adaptée, notamment sous forme gélifiée après l’intervention pour favoriser leur récupération. L’état de santé sera surveillé de manière rigoureuse grâce à des grilles d’évaluation précises, permettant de détecter toute douleur ou signe de détresse. Ces évaluations porteront à la fois sur le comportement de l’animal et sur ses capacités motrices. En cas de douleur mal soulagée ou de signes de souffrance importants, l’application de points limites stricts et spécifiques au projet sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Pour classer six peptides selon qu'ils freinent ou stimulent le système immunitaire, 160 souris subissent une réaction allergique provoquée sur l'oreille, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole tient en huit jours : rasage de l'abdomen sous anesthésie, dépôt d'un produit allergisant sur la peau, deux injections des peptides à tester, puis application du même produit sur l'oreille droite pour déclencher un gonflement, mesuré à l'épaisseur. Toutes sont tuées le lendemain de la dernière mesure pour prélever leurs oreilles. Le porteur affirme que l'étude chez l'animal est "indispensable" pour valider ces molécules, après un tri de plus de cinquante peptides sur cellules en culture, et indique qu'aucune des plus de 200 souris déjà utilisées dans ce modèle n'a nécessité de mise à mort anticipée.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'efficacité de nouvelles molécules (appelées peptides) capables de réguler le système immunitaire, c'est-à-dire notre système de défense contre les infections et les maladies. Notre système immunitaire possède des mécanismes de contrôle comparables aux freins et accélérateurs d'une voiture. Parfois, ces mécanismes sont déréglés : le système immunitaire peut être trop actif (causant des maladies auto-immunes comme la polyarthrite ou des allergies) ou pas assez actif (permettant aux cancers de se développer). Nous testerons six molécules différentes : - Quatre molécules « freins » qui pourraient calmer un système immunitaire trop actif - Deux molécules « accélérateurs » qui pourraient stimuler un système immunitaire insuffisant Pour évaluer ces molécules, nous utiliserons un modèle de réaction allergique cutanée chez la souris. Ce modèle reproduit ce qui se passe lors d'un eczéma de contact chez l'homme : la peau devient rouge et gonflée au contact d'une substance à laquelle l'organisme a été préalablement sensibilisé. En mesurant l'intensité de cette réaction inflammatoire, nous pourrons déterminer si nos molécules sont capables de la diminuer (pour les « freins ») ou de l'augmenter (pour les « accélérateurs »), et ainsi identifier les candidats les plus prometteurs pour le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Bénéfices scientifiques : Cette étude permettra de mieux comprendre comment réguler le système immunitaire avec de nouvelles molécules, ouvrant des pistes pour traiter des maladies actuellement difficiles à soigner. Bénéfices médicaux potentiels : Pour les molécules « freins » : elles pourraient aider à traiter des maladies où le système immunitaire attaque l'organisme par erreur (maladies auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le lupus, la sclérose en plaques) ou pour prévenir le rejet après une greffe d'organe. Pour les molécules « accélérateurs » : elles pourraient renforcer les traitements contre le cancer (immunothérapie) ou améliorer la réponse aux vaccins chez les personnes dont le système immunitaire est affaibli. Avantages de ces nouvelles molécules par rapport aux traitements existants : - Coût de fabrication plus faible - Administration plus simple (injection sous la peau plutôt que perfusion à l'hôpital) - Meilleure diffusion dans les tissus.

Procédures

Le protocole s'étend sur 8 jours. Par convention, le jour du challenge (application sur l'oreille) est désigné Jour 0. Les étapes préalables de sensibilisation sont numérotées en jours négatifs (J-7, J-6, J-2, J-1), indiquant le nombre de jours avant le challenge. Les souris subiront les interventions suivantes sur une durée totale de 8 jours : 1. Rasage de l'abdomen (Jour -7, durée : 5 min) : réalisé sous anesthésie gazeuse brève (2-3 min) pour éviter le stress de contention. Récupération complète en moins de 5 minutes. 2. Sensibilisation cutanée (Jour -6, durée : 30 sec) : application d'une goutte de produit allergisant sur l'abdomen rasé. Ce geste est réalisé sur animal éveillé avec contention manuelle douce. Cette étape prépare le système immunitaire à réagir au produit. 3. Injections sous la peau (Jours -2 et -1, durée : 20 sec par injection) : deux injections des molécules à tester dans le haut du dos. Ces gestes sont réalisés sur animal éveillé avec contention manuelle douce. 4. Application sur l'oreille (Jour 0, durée : 30 sec) : application du même produit allergisant sur l'oreille droite pour déclencher la réaction allergique localisée. Ce geste est réalisé sur animal éveillé. 5. Mesures (Jours 0 et +1, durée : 2 min par souris) : mesure de l'épaisseur de l'oreille avec un instrument de précision pour quantifier l'inflammation. Ces mesures sont réalisées sur animal éveillé. À l'issue des mesures (Jour +1), les animaux sont euthanasiés et les oreilles sont prélevées pour des analyses au microscope.

Impact sur les animaux

Effets attendus : Rasage (Jour -7) : stress bref lié à l'anesthésie (quelques minutes), récupération rapide. Sensibilisation cutanée (Jour -6) : possibilité d'une légère rougeur temporaire sur l'abdomen, sans gêne notable pour l'animal. Injections (Jours -2 et -1) : stress bref lié à la contention (moins de 20 secondes). Possibilité d'une petite bosse sous la peau au point d'injection, disparaissant en 1-2 jours. Réaction allergique sur l'oreille (Jour 0 à Jour +1) : c'est la phase où les effets sont les plus visibles : - Gonflement de l'oreille traitée (augmentation d'épaisseur de 0,1 à 0,3 mm) - Rougeur et légère chaleur de l'oreille - Ces effets restent strictement localisés à l'oreille traitée État général : les souris conservent un comportement normal (alimentation, déplacements, interactions avec leurs congénères). Pas de perte de poids significative attendue. Signes pouvant nécessiter une euthanasie anticipée (observés chez moins de 2% des animaux selon notre expérience) : - Perte de poids importante - Extension des lésions cutanées au-delà de la zone traitée - Grattage excessif ou automutilation - Prostration ou isolement du groupe - Signes de douleur non contrôlée. Sur plus de 200 souris utilisées dans ce modèle dans notre laboratoire, aucun animal n'a nécessité d'euthanasie anticipée.

Devenir

Aucun animal ne sera maintenu en vie à l'issue de la procédure. Tous les animaux (160 souris) seront euthanasiés à la fin de l'étude, le protocole nécessitant le prélèvement des oreilles pour analyses microscopiques.

Remplacement

Avant de recourir à l'expérimentation animale, des tests sur cellules en culture ont été réalisés pour sélectionner les candidats les plus prometteurs parmi plus de 50 peptides. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet du système immunitaire : elles ne peuvent pas évaluer le devenir des peptides dans l'organisme, les interactions entre les différents types de cellules immunitaires, ni le recrutement de ces cellules vers le site d'inflammation. L'étude chez l'animal est donc indispensable pour valider l'efficacité de ces molécules avant tout développement thérapeutique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Sur plus de 50 molécules conçues initialement, seules les 6 plus prometteuses — présélectionnées par des tests en laboratoire — sont testées chez l'animal. Chaque souris fournit plusieurs mesures (épaisseur de l'oreille, poids de la biopsie, analyses microscopiques), ce qui maximise les informations obtenues par animal. Les résultats seront publiés et rendus accessibles à la communauté scientifique afin d'éviter toute duplication inutile de ces expériences.

Raffinement

De nombreuses mesures sont prises pour assurer le bien-être des animaux et minimiser leur inconfort : Hébergement adapté : - Souris hébergées en groupe (4-5 par cage) pour préserver les contacts sociaux - Cages enrichies avec matériel de nidification (papier, coton), abris et litière abondante - Conditions de température, humidité et lumière contrôlées - Période d'acclimatation de 7 jours avant le début des manipulations Réduction du stress lors des manipulations : - Rasage réalisé sous anesthésie gazeuse brève - Manipulations douces et rapides - Surveillance et prise en charge de la douleur : - Observation quotidienne de tous les animaux, renforcée (2 fois par jour) pendant la phase de réaction allergique - Utilisation d'une grille d'évaluation standardisée avec des critères objectifs (poids, aspect du pelage, comportement, aspect des lésions) - Points limites définis : si un animal montre des signes de souffrance importante, il est immédiatement euthanasié - La surveillance est renforcée lors de la phase de réaction, et que l'euthanasie est immédiate en cas de signes de souffrance (score 3) Durée limitée : - Protocole de 8 jours seulement - Euthanasie réalisée à la fin de l'étude, avant que l'inflammation ne devienne inconfortable, sous anesthésie profonde (méthode rapide et sans douleur)

Choix des espèces

Choix de l'espèce : La souris a été choisie pour les raisons suivantes : 1. Modèle validé : le modèle d'allergie cutanée utilisé est un standard international pour évaluer des molécules modulant le système immunitaire. Il existe de nombreuses données publiées permettant de comparer nos résultats. 2. Sensibilité adaptée : la souche de souris choisie présente une bonne sensibilité aux réactions allergiques cutanées, ce qui permet de détecter efficacement l'effet de nos molécules. 3. Pertinence pour l'homme : les mécanismes immunitaires ciblés par nos molécules sont très similaires chez la souris et chez l'homme (plus de 70% de ressemblance), ce qui permet d'envisager une application future chez l'homme. 4. Disponibilité : ces souris sont facilement disponibles auprès de fournisseurs agréés, avec des caractéristiques génétiques standardisées garantissant la reproductibilité des expériences. Stade de développement : Les souris utilisées seront des adultes jeunes (7-9 semaines), car : 1. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature, garantissant des réponses représentatives. 2. C'est l'âge standard utilisé dans la littérature scientifique, facilitant la comparaison des résultats. 3. Les souris sont suffisamment développées pour bien tolérer les manipulations.

Exposées in utero aux polluants, puis allaitées par des mères elles-mêmes exposées, certaines souris respirent ensuite la fumée de cigarette deux heures par jour pendant trois mois avant d'être tuées à six mois. 1 464 souris vont être utilisées au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent aussi un prélèvement de queue dans les dix jours suivant la naissance pour le génotypage, et pour une partie une chirurgie suivie de plusieurs heures d'imagerie pulmonaire sous anesthésie, sans réveil. Le porteur écrit que les souris peuvent apparaître prostrées pendant l'exposition quotidienne à la fumée mais retrouvent leur activité dès la sortie de l'enceinte, et qu'au-delà de cette prostration transitoire aucun signe de souffrance n'est attendu.

Objectifs

La présente demande d'autorisation de projet repose sur l'étude des conséquences respiratoires de l’exposition aux polluants aériens sur la maturation du système immunitaire pulmonaire précoce et les risques d’incidence de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) à plus long terme. L'une des premières prises de conscience des effets majeurs de la pollution atmosphérique sur la santé a eu lieu lors d'un épisode survenu à Londres pendant l'hiver 1952 : durant 4 jours, un épais brouillard s'est abattu sur la ville, et 4000 décès supplémentaires (par rapport à la même période les années précédentes) ont été enregistrés, plus de la moitié étant pour causes respiratoires. La pollution atmosphérique est maintenant reconnue comme étant la principale cause environnementale de maladies et de décès prématurés dans le monde selon l’organisation mondiale de la santé. L'hypothèse est ici que l’exposition aux polluants au cours de différentes phases de la vie (périnatale / adolescence / adulte) impacte durablement le système immunitaire pulmonaire générant une sensibilité accrue aux risques de développer une pathologie respiratoire à long terme comme la BPCO dont la cause principale est le tabagisme. Ainsi l'étude a pour objectif d'évaluer les effets de la pollution dans l’induction des maladies respiratoires chez l’animal au-delà de la BPCO. Le projet vise à répondre aux questions suivantes : 1/ Quel est l’impact de l’exposition aux polluants atmosphériques sur le compartiment immunitaire dans les poumons à court et long terme ; 2/ Quelles sont les populations immunitaires qui ont un rôle dans le développement des troubles respiratoires à plus long terme.

Bénéfices attendus

Nous nous intéressons à étudier le lien entre l’impact de l’exposition aux polluants sur la maturation et l’activation du système immunitaire pulmonaire et le risque d’incidence de pathologies chroniques respiratoires en particulier la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Cette pathologie correspond à une atteinte progressive et irréversible de la fonction respiratoire, présentent une variabilité très importante chez les patients atteints, et dont les déterminants notamment précoces restent largement méconnus à l'heure actuelle, alors même que cette variabilité impacte grandement la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients atteints. Bien que l'exposition tabagique soit le principal facteur de risque, il apparait que l’historique de l’exposition aux polluants représente aussi un facteur déterminant du risque de développer des maladies à plus long terme. Ce projet a pour objectif principal d'identifier les effets des polluants atmosphériques sur le système immunitaire, garant de l'intégrité tissulaire et du bon fonctionnement du système respiratoire. Ce domaine fait partie d'une problématique de santé publique très actuelle au-delà des effets du tabagisme et pour laquelle encore trop peu d'études sont mises en place. Ces études ont pour vocation de permettre une meilleure prise en charge thérapeutique des patients en ciblant la régulation du système immunitaire, et ainsi une amélioration certaine de leur qualité de vie.

Procédures

Prélèvement tissulaire (extremité de la queue) dans les 10 jours suivant leur naissance ou de sang en sous mandibulaire au sevrage après 1 mois d'âge, pour le génotypage procédure de 1 minute.- Exposition aux polluants atmosphériques pendant 7 jours directement dans leur cage d'origine.-Exposition quotidienne aux fumées de cigarette à raison de (2h/jour) pendant 3 mois à la fumée de cigarettes à l'aide d'une machine permettant là encore d'exposer les animaux sans les sortir de leur cage.-Injection retroorbitale sous anésthésie 1 minute par animal sans réveil-Procédure chirurgicale pour imagerie intravitale: 4h par animal : chirurgie 30 min et imagerie entre 2h et 3h30 (anesthésie générale max 4h).

Impact sur les animaux

Les prélèvements tissulaires pour génotypage engendrent des douleurs de courte durée et un stress chez l’animal. Les expositions aux polluants peuvent engendrer un stress chez l’animal de par le changement d'environnement, cependant aucun signe particulier n’a été observé lors des différentes campagnes d'exposition déjà réalisées au laboratoire. Pour l’exposition à la fumée de cigarettes, certaines souris peuvent apparaitre prostrées pendant la durée de l'exposition quotidienne, mais récupèrent leurs activités normales dès la sortie de l'enceinte d'exposition. Au-delà de la possible prostration transitoire, aucun signe de souffrance n’est attendu par ces approches. L’imagerie pulmonaire se fait sous anesthésie complète sans réveil de l’animal. D’expérience, le moindre signe de souffrance de l’animal sous anesthésie sera immédiatement détecté lors de la chirurgie (trouble respiratoire, sursaut musculaire, mobilité moustache) et pendant l'imagerie grâce au suivi continu de l'acquisition des images extrêmement sensible au moindre mouvement de l’animal (témoin de la moindre sensation de douleur). Au moindre cas, une adaptation du dosage en anesthésie sera réalisée en première intention, et sans amélioration dans les 5 minutes, une mise à mort anticipée sera pratiquée. Ainsi pour toutes ces procédures tous les gestes invasifs sont pratiqués sous anesthésie.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à la fin des procédures. L'ensemble de l'étude repose sur le prélèvement d'organe ne permettant pas le maintien en vie des animaux ou des approches d'imagerie trop invasives pour permettre un rétablissement sans souffrance de l'animal.

Remplacement

La question de l'impact des expositions aux polluants atmosphériques sur les risques de développer des pathologies pulmonaires a plus long terme rend les modèles animaux incontournables. La réponse in vivo du système immunitaire est au coeur de nos questions. Néanmoins nous utilisons des approches in vitro d'exposition aux polluants sur lignées de cellule qui permettent de cibler les facteurs polluants les plus importants et ainsi réduire les combinaisons à tester in vivo. La modélisation des atmosphères polluants repose aussi sur des analyses épidémiologiques. Nous développons aussi des approches par organoïdes pour ces questions.

Réduction

Le modèle animal généré nous permet d’utiliser les mêmes animaux pour plusieurs approches analytiques. Le regroupement dans le même animal de plusieurs transgènes est un outil majeur pour identifier les différentes populations de cellules en même temps et ainsi réduire le nombre d’animaux. Nous limiterons ainsi le projet aux seules expériences indispensables, tout en tenant compte des contraintes liées à l'utilisation de l'enceinte d'exposition. En effet, un seul type d'atmosphère ne peut être généré en même temps, ce qui implique la répétition des groupes "Air non pollué-référence" pour chaque lot expérimental. Au-delà de l’analyse des poumons nous étendrons notre analyse sur plusieurs autres organes pour anticiper les questions futures. Nous basons notre échantillonnage par groupe sur la variabilité possible des réponses et les besoins rigoureux de reproductibilité afin d’atteindre les différences statistiques minimales. En études longitudinales les tests statitistiques seront réalisés pour comparer dans le temps et entre les groupes et pour des comparaisons deux à deux. Enfin mâles et femelles sont utilisés indépendamment. Bien que l'uniformisation du sexe puisse améliorer l'homogénéité des lots, l'utilisation des deux sexes permet de réduire la génération d'animaux qui ne seraient jamais utilisés et en particulier dans le cas des expositions in utero. Le projet prévoit le recours à un nombre d'animaux aussi limité que possible : 1464 souris au total seront réalisées sur 5 ans

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour/nuit 12/12, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient plusieurs types d'enrichissements : du papier kraft, des carrés de coton et une maison en cellulose pour le confort des animaux leur permettant d’exprimer leurs besoins naturels de nidification. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. L’exposition aux polluants est une procédure légère sans aucun geste technique réalisé, au-delà du stress possible causé par les changements transitoires des conditions d’hébergement Néanmoins la surveillance des animaux dans ces différents contextes est maintenue et tout animal blessé ou montrant des situations d'inconfort sera mis à mort si aucun traitement n’est envisageable. Pour l’imagerie intravitale, les animaux bénéficient d'une anesthésie gazeuse et sont mis à mort avant le réveil ne nécessitant pas de soin post opératoire. Dans tous les cas la mise à mort se fera faite sous anésthésie.

Choix des espèces

La physiologie pulmonaire de la souris est suffissement proche de celle de l'homme et nous disposons de modèles transgéniques uniques pour cette étude. Les modèles d'exposition aux polluants sont validés pour ce modèle avec des données utiles déjà générées. L'exposition adulte aux polluants sera en partie réalisée sur des souris de 3 à 6 mois d’âge L'exposition in utero sera faite sur souris gestante L'exposition juvénile sera faite sur souris allaitantes et souriceaux entre 0 et 7 jours- Dans certains cas, les souriceaux seront utilisés à J14, J21 et J60 pour étudier les différents stades du développement pulmonaire. Dans d'autres cas, les souriceaux seront exposés à partir de 3 mois d’âge aux fumées de cigarette pendant 3 mois et mis à mort à 6 mois pour étudier les prémisses de la BPCO.

Deux chirurgies du crâne d'une heure chacune, une lésion du cortex moteur puis la pose d'un implant, attendent 90 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite trois IRM sous anesthésie et des épreuves motrices, avant d'être tués pour analyser leur tissu cérébral. Le porteur décrit une douleur aiguë liée à l'incision du cuir chevelu et à la trépanation, des risques de saignements intracrâniens, d'œdème cérébral et de crises d'épilepsie soudaines, ainsi qu'un inconfort prolongé pendant la cicatrisation. Il annonce des tests évaluant l'amplitude des mouvements, la force et la sensibilité des membres antérieurs sans préciser lesquels, et compte parmi les bénéfices du projet la réduction du nombre d'animaux que permet le suivi d'un même individu dans le temps.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU). L’AJOUT D’UNE PROCÉDURE VISANT À PERMETTRE UNE POSSIBLE RÉDUCTION DU NOMBRE TOTAL D’ANIMAUX UTILISÉS AINSI QU’UNE OPTIMISATION DES CONDITIONS EXPÉRIMENTALES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ AVEC AJOUT DE 6 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.

Devenir

La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.

Remplacement

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.

Réduction

L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.

Injectées dans le muscle de la patte avec une toxine, la notexine, pour forcer une régénération musculaire, ou avec un virus porteur d'un gène, 268 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par tatouage aux phalanges et génotypées par prélèvement de queue, puis certaines passent cinq séances de mesure de composition corporelle et de test de force entre la quatrième et la douzième semaine. Le porteur indique que ces souris peuvent développer une faiblesse musculaire importante, et affirme que l'injection du virus ne provoque pas d'effets nuisibles notables, en s'appuyant sur ses propres résultats publiés. Toutes sont tuées pour disséquer leurs muscles, analyses présentées comme "indispensables" pour comprendre la myopathie myotubulaire, et le porteur qualifie le modèle murin d'"irremplaçable".

Objectifs

La myopathie myotubulaire est une maladie génétique néonatale très grave caractérisée par une hypotonie et une atrophie musculaire sévère. C’est une maladie incurable qui conduit au décès des patients par détresse respiratoire dès le plus jeune âge. Le gène responsable de cette maladie code la Myotubularine. C'est une enzyme qui régule une classe de lipides appelée phosphoinositides (PIs). Ce projet a pour objectif de caractériser et d’étudier deux modèles de souris qui reproduisent la dérégulation des lipides contrôlés par la Myotubulaine. Notre but est d’identifier les processus cellulaires ciblés par ces lipides dans le tissu musculaire et comment leur dérégulation impacterait l’apparition et la progression de la maladie. Dans ce contexte, des résultats de l’équipe montrent que l’accumulation les lipides régulés par la Myotubularine régulent le systéme de dégradation des protéines. D’autre part, nos expériences dans des modèles cellulaires dépourvus de la Myotubularine montrent que ces cellules manifestent des défauts de différentiation musculaire. Nous proposons ainsi d’étudier les impactes de la dérégulation des lipides régulés par la myotubularine MTM1 dans le modèle murin (in vivo) spécifiquement dans le muscle squelettique. MODIFICATION L’AJOUT DE LA PROCEDURE 4 NECESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISE AVEC AJOUT DE 44 ANIMAUX.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de décortiquer dans un contexte intégré et physiologique les effets musculaires de la dérégulation des lipides régules par la Myotubularine et ainsi apportera une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans la myopathie myotubulaire liée à l’X. Il permettrait ainsi de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette maladie génétique incurable.

Procédures

Injection d'une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelle fibres musculaires: Nombre 72, Durée = 3J ou bien 12J ou bien 24J Post injection (en intramusculaire). Injection d'un viris (l'Adeno-associated virus) pour permettre l’acheminement de gène (non oncogène) dans un tissu afin d'étudier en détail la fonction de ce gène d’intérêt : Nombre 48, Durée 5 semaines post injection (en intramusculaire). Tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : 5 FOIS (SEMAINES 4-6-8-10-12), SUR ANIMAL VIGILE: -MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE : CONTENTION DANS L’APPAREIL DE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, 2 MINUTES -TEST DE FORCE:5 X 1 SECONDE, AVEC AU MOINS 1 MINUTE DE REPOS ENTRE 2 ESSAIS

Impact sur les animaux

Les souris concernées dans cette étude peuvent développer une faiblesse musculaire importante. Chez l’homme la pathologie liée à la perte de fonction des gènes étudiées dans ce projet induit une myopathie rare et sévère avec qui entraine le décès chez les nouveau-nés ou à l’enfance. De ce fait on suspecte que les protéines étudiées sont nécessaires au développement du muscle qui démarre pendant la vie fœtale. Afin d’étudier ce process et de s'affranchir de l’analyse des fœtus, on a choisi de reproduire la formation du muscle en injectant une toxine (Notexin) à faible dose qui induit la régénération du muscle et donc la formation de nouvelles fibres musculaires. Cette injection se fait d’une manière localisée (Tibialis de la souris) mais pourrait rarement provoquer une nuisance modérée (irritations et démangeaisons). La formation de nouvelles fibres musculaire dans le modèle murin se fait assez rapidement au bout d’une vingtaine de jours et le muscle retrouve sa fonction normale. De même, afin d'approfondir le lien entre nos gènes d’intérêt et la régénération musculaire, on propose d’utiliser un outil d’acheminement des gènes pour les exprimer dans un tissu : les Adénovirus associés. C’est une approche fréquemment employée dans le muscle et utilisée dans les thérapies géniques chez l’homme. L’injection de ces virus est localisée (Tibialis) et ne provoque pas d’effets nuisibles notables chez les souris (résultats antérieurs publiés par le porteur du projet). Enfin tous les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par un tatouage aux phalanges et sont génotypés suite à un prélèvement de queue inférieur à 0,5mm par le service de l’animalerie habilités pour ce geste. MODIFICATION : LA MESURE DE COMPOSITION CORPORELLE INDUIRA UN STRESS DU A LA CONTENTION DANS L’APPAREIL, QUI S’ARRETERA DONC DES LA FIN DE LA MESURE. LA MESURE DE FORCE POURRA INDUIRE UNE FATIGUE MUSCULAIRE LEGERE IMMEDIATEMENT A LA SUITE DU TEST.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3 (MODIFICATION: "ET PROCEDURE 4"), les animaux sont mis à mort et les muscles sont disséqués et analysés. Ces analyses sont indispensables pour comprendre comment l’altération des phosphoinositides impacte des processus importants de la proteostase musculaire dans le contexte de la myopathie myotubulaire.

Remplacement

En dépit de l’exitance de modèles cellulaires (cellules musculaires de souris dépourvus de l’expression de MTM1 et de Fbxw7) développés par le porteur du projet, ces modèles ne traduisent pas la physiopathologie de la maladie. En effet, cette myopathie apparait dès la naissance chez l’homme et s’aggrave progressivement en touchant spécifiquement le muscle (la fibre musculaire formée qui ne peut pas être reproduite en culture cellulaire). Cette particularité rend l’exploration des cellules musculaires en culture très limitante (restreint aux aspects moléculaires et cellulaire de la perte de l’expression de la protéine MTM1) pour étudier la physiologie de la maladie et envisager des solutions thérapeutiques. De même, il n’existe pas à ce jour des systèmes cellulaires plus intégré (type organoïde) pour étudier le muscle qui est un organe complexe soumis à l’innervation et la contraction. En ce qui concerne la régénération musculaire, c’est un processus complexe qui met en œuvre l’ensemble des cellules résidentes dans le muscle (fibres musculaires, cellules immunitaires, cellules de soutiens du stroma, cellules nerveuse…) et de ce fait impossible à reproduire dans un système in vitro/in cellulo ou ex vivo). Ainsi, le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est 8 animaux pour les lignées sans intervention et 6 animaux pour les mêmes lignées avec intervention. Deux animaux en plus par groupe seront inclus afin d’anticiper des pertes. Ainsi le nombre de souris/groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes statistiques dans les publications scientifiques, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre des analyses statistiques fiables. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité entre individus et entre groupe experimentaux.

Raffinement

L’effet de la réexpression de MTM1 et de Fbxw7 dans le muscle des deux modèles étudiés par l’outil AAV fera l’objet d’un suivi. Dans les deux cas, afin de restreindre la réexpression de MTM1 et Fbxw7 dans les cellules musculaires et minimiser au maximum des effets indésirables potentiels, les deux gènes seront sous contrôle d’un promoteur musculaire (expression restreinte au muscle squelettique). La procédure de suivi des animaux injectés par la Notexin ou des Adeno associated virus consistera à faire des observations quotidiennes. Tout effet indésirable peu importe son degré fera l'objet d'un suivie. Une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Le poids qui traduit entre autres la masse musculaire (atteinte musculaire suite à la délétion des gènes d’intérêt) sera mesuré dès la naissance et tous les 3 jours. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents, tunnel ou d'igloo). Pour les animaux qui développeront une faiblesse musculaire (myopathie), l'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité en plaçant des croquettes humidifiées et de l'hydrogel dans la cage. Des points d'alertes et des points limites sont fixées par le responsable afin d'entreprendre l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris parce que le modèle animal de la perte fonctionnelle de la Myotubularine reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine et permet ainsi de se rapprocher le plus de la physiopathologie de la maladie. Le modèle Fbxw7 n’est disponible que chez la souris. D’autre part, l’étude de la myogenèse in vivo après la régénération musculaire a été trés bien décrite chez la souris. C’est un processus conservé et de ce fait traduit ce qui se passe chez l’homme. Il n'existe pas de modèles alternatifs et accessibles pour induire et suivre la myogenèse au cours du temps. Les cultures primaires de cellules satellites isolées de souris de 2 semaines présentent l'avantage de reproduire la différenciation musculaire ex vivo et de complémenter les résultats acquis in vivo, permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les souris sans intervention seront utilisées entre 2 et 20 semaines selon le besoin (survie du phénotype). Un lot de souriceaux âgés de 2 semaines sera utilisé afin d’établir des cellules primaires et compléter l’étude in vivo après régénération (diminuer le nombre de souris). Cet âge est la meilleure fenêtre de prélèvement pour isoler les cellules souches du muscle (cellules satellites).

75 souris subissent chacune la totalité du protocole : perçage de l'oreille, douze pesées, deux passages en tube de contention, deux périodes de jeûne dont une de douze heures, une injection de sucre dans le ventre, un gavage d'huile, deux incisions de la queue et dix prélèvements de sang. Elles sont toutes tuées à l'issue, après une ponction cardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet est de comparer des croquettes formulées à l'huile de palme et à l'huile de colza gélifiée, pour fournir à l'industrie alimentaire des arguments sur de futures margarines et pâtes à tartiner. Le porteur écrit que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable à ce stade", après une étude pilote qui avait déjà servi à sélectionner les croquettes.

Objectifs

Les matières grasses sont essentielles pour assurer la texture de nombreux aliments mous. Cette texture est généralement obtenue par l’utilisation d’huiles riches en acides gras saturés, comme l’huile de palme, reconnues pour augmenter le risque de maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d’identifier des alternatives plus favorables à la santé tout en conservant les propriétés technologiques des produits alimentaires. Les oléogels constituent une alternative innovante permettant de structurer une huile végétale liquide, ici l’huile de colza, dont le profil lipidique est favorable en raison de sa richesse en acides gras oméga-3. Cette structuration repose sur l’utilisation de petites molécules oléogélatrices dérivées d’acides aminés ou d’endocannabinoïdes (messagers chimiques fabriqués par le corps lui-même). La nature de ces molécules nous permet de faire l’hypothèse, d’après ce qui est décrit dans la littérature, qu’elles pourraient exercer des effets bénéfiques, notamment en régulant la prise alimentaire et contrôlant l’inflammation. L’objectif de ce projet est de comparer les effets métaboliques de différentes croquettes formulées : • soit avec de l’huile de palme, naturellement solide; • soit avec de l’huile de colza structurée sous forme d’oléogel à l’aide de deux oléogélateurs distincts (X et Y). Les analyses porteront sur des paramètres circulants et tissulaires impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que l’inflammation. L’oléogélateur X sera testé à deux concentrations (2 % et 4 %), ses propriétés technologiques variant selon la concentration. L’oléogélateur Y sera testé uniquement à 4 %, la concentration à 2 % ne résistant pas aux conditions thermiques de fabrication des croquettes. Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à ce stade afin d’évaluer les effets physiologiques intégrés de ces nouvelles formulations. Une étude pilote préalable a confirmé la bonne consommation des croquettes et l’absence d’impact négatif sur le bien-être des souris.

Bénéfices attendus

À court terme, cette étude apportera des connaissances nouvelles sur les effets métaboliques des oléogels dans un modèle animal bien caractérisé. Elle permettra de mieux comprendre l’impact de la structuration d’huiles végétales sur la régulation de la prise alimentaire, le métabolisme lipidique et glucidique, ainsi que sur les réponses inflammatoires. Ces résultats constitueront une base scientifique solide pour évaluer la valeur nutritionnelle de ces oléogels. À long terme, ce projet contribuera au développement de formulations alimentaires plus favorables à la santé, en fournissant à l’industrie des éléments scientifiques pour remplacer les graisses saturées par des alternatives à base d’huiles végétales gélifiées. Ces innovations pourraient améliorer le profil nutritionnel de produits de consommation courante (margarines, pâtes à tartiner, produits de boulangerie), favoriser un meilleur apport en acides gras essentiels, notamment les oméga-3, et ainsi contribuer à la réduction du risque de maladies métaboliques et cardiovasculaires dans la population.

Procédures

Les 75 animaux subiront un petit perçage de l’oreille permettant leur identification (moins de 30 secondes avec contention). Les 75 animaux seront pesés une fois par semaine pendant 12 semaines, soit 12 pesées par animal (chaque pesée dure moins de 30 secondes). Parmi eux, 60 animaux recevront pendant 12 semaines une alimentation spécifique, constituée de croquettes enrichies en huiles végétales, associées ou non à des oléogélateurs. Les 75 animaux seront placés à deux reprises dans un tube cylindrique afin d’être introduits dans un appareil permettant la mesure de la composition corporelle (répartition de la masse grasse et de la masse musculaire). Chaque mesure dure moins de 2 minutes, et les deux séances seront espacées de 11 semaines. Les 75 animaux subiront deux périodes de jeûne nécessaires à la réalisation des tests métaboliques : – une période de jeûne de 6 heures (entre 7 h 30 et 13 h 30) ; – une période de jeûne nocturne (entre 20 h et 8 h). Ces deux périodes de jeûne seront espacées d’au moins une semaine. Les 75 animaux recevront une injection dans le ventre d’une solution de sucre afin de mesurer la tolérance au glucose (contention et injection : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront un gavage d’un bolus d’huile afin d’évaluer le métabolisme des graisses (contention et gavage : moins de 30 secondes). Les 75 animaux subiront deux petites incisions à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) afin de permettre les prélèvements sanguins au cours des tests métaboliques (une incision par test, sans contention, durée inférieure à 30 secondes, avec un intervalle d’au moins une semaine entre les deux tests). Dans le cadre du test de tolérance au sucre, les 75 animaux subiront six prélèvements d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue (moins de 30 secondes par prélèvement, sans contention). Dans le cadre du test de tolérance aux graisses, les 75 animaux subiront quatre prélèvements sanguins réalisés selon les mêmes modalités. En fin de protocole, les 75 animaux recevront une injection d’un mélange d’anesthésiques, permettant le prélèvement de sang au niveau du cœur, suivi de la mise à mort (contention et injection : moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

L’identification des animaux par poinçonnement de l’oreille peut entraîner une légère douleur transitoire, sans conséquence durable. La pesée hebdomadaire constitue une source de stress léger et temporaire. La consommation de croquettes riches en lipides va induire une prise de poids modérée, sans altération de la mobilité ou du comportement. Lors des mesures de composition corporelle, les souris seront placées brièvement (moins de 2 minutes) dans un tube cylindrique, ce qui peut générer un léger stress. Les tests métaboliques (tolérance au sucre et tolérance aux lipides) peuvent également provoquer un stress ponctuel : • les périodes de jeûne (6 heures pour le test du sucre et 12 heures pour le test des lipides) sont susceptibles d’engendrer un inconfort modéré • l’injection de sucre et le gavage d’huile sont associés à une douleur ou un stress transitoire • les prélèvements sanguins se font à partir d’une petite incision (< 1 mm) à l’extrémité de la queue, provoquant une légère douleur momentanée. Au total, six prélèvements de sang seront réalisés pendant le test de tolérance au sucre (une goutte à chaque fois) et quatre prélèvements pendant le test de tolérance aux lipides, sans contention, induisant un stress temporaire. • le placement en cage individuelle pendant les 2 heures suivant l’injection de sucre peut également être une source de stress. En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés par injection dans le ventre avant le prélèvement sanguin intracardiaque. Cette étape entraîne une brève douleur et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de collecter les tissus d’intérêt et de procéder aux analyses permettant de répondre à l’objectif du projet.

Remplacement

À ce stade, une étude chez l’Homme n’est pas possible, car les oléogélateurs X et Y n’ont pas encore reçu d’autorisation de mise sur le marché. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de la consommation d’huiles de colza rendues solides sur le fonctionnement du métabolisme, en particulier sur la prise alimentaire, la gestion des graisses et des sucres par l’organisme, ainsi que sur les phénomènes inflammatoires. Ces effets résultent de l’action conjointe de plusieurs organes (intestin, foie, tissu adipeux, muscle et cerveau). Ils ne peuvent pas être étudiés de manière satisfaisante à l’aide de cultures de cellules isolées ni de modèles informatiques. Le recours à un modèle animal complet est donc nécessaire pour évaluer l’effet global de ces formulations alimentaires sur l’organisme.

Réduction

La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’un calcul permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul a conduit à un effectif de 15 souris par groupe. Ce nombre correspond au minimum requis pour obtenir des résultats solides et interprétables, tout en limitant strictement le nombre d’animaux utilisés, conformément au principe de réduction. Le nombre de groupes expérimentaux a été limité aux conditions strictement nécessaires grâce à une étude pilote préalable, qui a permis de vérifier que les croquettes étaient bien consommées par les souris et n’entraînaient pas de modification du comportement alimentaire. Cette approche progressive a permis d’éviter l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Plusieurs précautions seront prises pour limiter au maximum stress, douleur et inconfort des animaux, tout en assurant la qualité des résultats. Les manipulations seront réalisées par deux personnes expérimentées (gestes rapides, cohérents et réalisés avec douceur, moins de stress). Les animaux seront surveillés trois fois par semaine. Leur consommation de nourriture sera vérifiée chaque semaine par cage, et leur poids sera mesuré individuellement une fois par semaine. Tout changement de comportement, d’apparence ou d’état général sera immédiatement pris en compte. Pour la mesure de la composition corporelle, un apprentissage préalable sera réalisé (une semaine avant) afin d’habituer les souris à entrer dans le tube de mesure. Cette étape vise à minimiser le stress et à éviter les mouvements brusques durant la procédure, qui dure moins de deux minutes. Pour les tests métaboliques, les quantités administrées (solution sucrée ou huile) sont limitées afin de réduire l’inconfort. Une seule incision de 1 mm sera réalisée à l’extrémité de la queue pour chaque test (pour les prélèvements suivants il suffit simplement de gratter la petite croûte avec une compresse). Les prélèvements sanguins se font sans contention. Les tests seront espacés d’une semaine pour laisser aux animaux le temps de récupérer. Lors du test du métabolisme des sucres, si la glycémie d’un animal ne revient pas à la normale dans les 90 minutes suivant l’injection, un suivi supplémentaire sera réalisé à 240 min, puis à 360 min si nécessaire. À la fin de l’étude, les animaux seront anesthésiés afin de permettre le prélèvement sanguin final. La mise à mort sera ensuite effectuée rapidement par dislocation cervicale. Des points limites prédictifs et adaptés à l’étude ont été établis afin de détecter précocement toute souffrance ou altération de l’état général.

Choix des espèces

La souris représente le modèle le plus approprié pour notre projet. La majorité des études publiées dans le domaine de la nutrition et du métabolisme utilisent cette espèce, ce qui permet la comparaison de nos résultats avec la littérature. Sur le plan physiologique, la souris présente un métabolisme des graisses proche de celui de l’Homme. Ces similitudes en font un modèle de référence pour l’étude des effets métaboliques de nouvelles formulations lipidiques. Par ailleurs, les souris présentent une réponse métabolique stable aux régimes riches en lipides, ce qui permet de limiter la variabilité et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Le recours à la souris est justifié pour évaluer les impacts physiologiques des huiles de colza gélifiées, dans des conditions contrôlées et scientifiquement transposables à l’Homme. Enfin, l’étude pilote permettant de sélectionner les différents types de croquettes testées ici a été réalisée chez la souris. L’administration des croquettes enrichies en différentes huiles et gélifiants débutera chez des souris âgées de 8 semaines, comme au cours de l’étude pilote. À cet âge, les animaux ont terminé leur période de sevrage et le changement de régime alimentaire est généralement bien toléré. Ce moment du développement est également optimal pour éviter que d’éventuelles variations physiologiques observées ne soient confondues avec des effets liés à la croissance (chez des animaux trop jeunes) ou au vieillissement (chez des animaux plus âgés).