Recherche fondamentale
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Axe intestin-cerveau : rôle des cellules gliales dans le dimorphisme sexuel des comorbidités de l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
864 souris subissent une neurochirurgie de 45 minutes et 288 une chirurgie viscérale, sous anesthésie et analgésie. Au total 1 792 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever le cerveau ou d'autres tissus. Cinq cent douze d'entre elles passent quatre semaines seules en cage pour un conditionnement opérant, 544 subissent un jeûne de 24 heures, et le régime gras est censé faire grimper leur poids jusqu'à 200 % du poids initial sur vingt semaines. Le porteur annonce des tests comportementaux sur 656 souris, d'une durée de dix à cent vingt minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
L’obésité est problème majeur de santé publique. Cette maladie chronique touche presque 18% de la population française (quasiment la moitié des français.es si l’on compte aussi les personnes en surpoids). Elle s’accompagne de nombreuses comorbidités, notamment le diabète et les symptômes anxieux et dépressifs. On sait aussi que les bactéries de l'intestin (le microbiote) est déréglé dans l'obésité. Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour limiter les comorbidités associées à l’obésité, il est nécessaire de mieux comprendre comment le cerveau contrôle le poids corporel et les émotions, et comment l'intestin communique avec le cerveau. Nous voulons tester l'hypothèse selon laquelle certaines cellules du cerveau, appelées cellules gliales, sont sensibles à des molécules produites par le microbiote intestinal. Nous pensons que les animaux mâles et femelles ne répondront pas de la même façon à ces molécules.
Bénéfices attendus
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre la communication entre l’intestin et le cerveau, notamment le rôle de certaines cellules gliales dans les dérèglements métaboliques et cognitifs en réponse à un régime riche en calories. Ce projet a une véritable portée translationnelle dans la mesure où s’ils supportent notre hypothèse, l’utilisation de ces molécules produites par le microbiote (également retrouvés dans le sang humain) pourrait éventuellement être proposée pour traiter des personnes souffrant d’obésité avec présence de diabète ou de symptômes anxieux. De plus, si nos résultats diffèrent entre les deux sexes, cela permettra de cibler une population donnée, ce qui participe à la mise en place d’une médecine de précision.
Procédures
1) Analyse de la composition corporelle sur animaux vigiles : 5 min, entre 1 et 5 fois. Nombre d’animaux : 1492. 2) Chirurgie viscérale, sous anesthésie et antalgie, 20 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 288. 3) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, 1 fois. Nombre d’animaux : 864. 4) Test de tolérance au glucose et à l’insuline sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min. Nombre d’animaux : 560. 5) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : 16 jours en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 144. 6) Mise à jeun, 24h, entre 1 et 2 fois, espacée d’une semaine. Nombre d’animaux : 544 (1 fois), 48 (2 fois). 7) Tests comportementaux. Durée : entre 10 et 120 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de minimum 1 jour. Nombre d’animaux : 656. 8) CONDITIONNEMENT OPERANT. DUREE : 4 SEMAINES en HEBERGEMENT INDIVIDUEL. NOMBRE D’ANIMAUX : 512.
Impact sur les animaux
1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la mesure des apports et des dépenses énergétiques individuels (calorimétrie indirecte) ou une tâche d’apprentissage avec accès individuel contrôlé aux mangeoires (conditionnement opérant) sont nécessaires. Durée maximum : 4 semaines. Légère perte de poids initiale (5 %) sur les deux premiers jours avant reprise de la croissance normale (basée sur nos observations antérieures). 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD (sur 20 semaines maximum). La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeun (4h ou 24h). La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. La peau et soit le périoste, soit la paroi péritonéale devant être incisés, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins de 2h, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue). 7. Les complications chirurgicales (mauvaise cicatrisation, hémorragie) devraient rester bien en dessous du seuil de 20% du nombre total d’animaux (d’après nos études antérieures). 8. Stress induit par des prélèvements sanguins répétés (maximum 6 prélèvements consécutifs en 2h). 9. Stress métabolique suite à des variations importantes de la glycémie (hyper ou hypoglycémies pendant 2h maximum).
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.
Remplacement
Ce projet et notre hypothèse sont basés sur des résultats d’études cliniques chez l’Homme (variation de concentration sanguine des molécules du microbiote chez des populations obèses). Le but de ce projet est de comprendre le rôle de l’axe intestin-cerveau dans la mise en place des désordres métaboliques et cognitifs induits par l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (notamment l’intestin où réside le microbiote intestinal). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Les variables métaboliques (poids, composition corporelle, régulation de la glycémie) et le comportement intégré (anxiété) nécessite l’utilisation d’un modèle animal. En effet, des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés cités plus haut nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe pas encore de modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance statistique) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différents tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal décrites précisément dans les procédures. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec des mesures conservatoires prévues pour chaque critère.
Choix des espèces
LLes caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche. 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) possibilité d’obtenir des animaux génétiquement modifiés 5) comportement alimentaire et émotionnel depuis longtemps étudiés chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui permet l’utilisation d’une cartographie de référence du cerveau (atlas stéréotaxique) pour les neurochirurgies.
Suivi de la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Huit à douze injections du substrat luminescent et une imagerie quotidienne sous anesthésie pendant trois à quinze jours : 130 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour trente d'entre elles et modéré pour cent. Cent souris reçoivent les cellules tumorales dans la veine de la queue sans anesthésie, le porteur indiquant que cette voie est inaccessible sous anesthésie. La tumeur se disperse alors dans plusieurs organes, ce qui peut provoquer une souffrance. L'objet déclaré du projet est de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, un seuil qu'il s'agit d'établir en laissant les tumeurs croître.
Objectifs
Nous étudions des cellules du système immunitaire appelées cellules NK, dont le rôle est de détruire les cellules cancéreuses. Pour comprendre comment elles agissent, nous injectons des cellules tumorales à des souris et nous observons si les cellules NK arrivent à éliminer la tumeur. Quand on injecte les cellules tumorales sous la peau, elles forment une tumeur solide, facile à mesurer. Mais quand on les injecte dans le sang, elles se dispersent dans plusieurs organes et forment une tumeur diffuse, beaucoup plus difficile à suivre car elle n’a pas de forme visible. Pour mieux voir ces tumeurs diffuses, nous avons créé des cellules tumorales qui produisent de la lumière lorsqu'on les met en présence d'une molécule appelée substrat. Cette émission de lumière est appelée bioluminescence et peut-être mesurée par un appareil appelé bioimageur. Ainsi, on peut réaliser un suivi régulier de l’évolution de la tumeur par administration du substrat aux souris et mesure de la lumière émise sur l'animal entier dans le bioimageur. L’objectif de ce projet est donc de mesurer la vitesse de croissance de la tumeur et de définir la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser pour le confort de l'animal, grâce au bioimageur.
Bénéfices attendus
Nous ne disposons pas à l'heure actuelle d'outils de suivi de l'évolution des tumeurs diffuses étudiées dans notre équipe, ce qui est défavorable pour l’animal. Grâce à l’imagerie par bioluminescence, ce projet permettra de définir précisément la vitesse progression de ces tumeurs et d'identifier la quantité de tumeur maximale à ne pas dépasser, afin d’améliorer le bien-être des animaux. Elle permettra également de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour les suivis sur plusieurs jours, car elle évite d’avoir recours à la mise à mort pour réaliser des autopsies.
Procédures
Les animaux recevront : - une injection de cellules NK dans le sang, sous anesthésie gazeuse (30 secondes, 10 animaux) - une injection de cellules tumorale dans le sang (veine de la queue) sans anesthésie (1 minute, inaccessible avec anesthésie, 100 animaux). Entre 3 et 15 jours après l'injection des cellules tumorales, la croissance tumorale sera suivie quotidiennement. Pour cela, les souris recevront : une injection du substrat dans l'abdomen (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection sous la peau (15 secondes 8 à 12 injections) ou une injection via la circulation sanguine (15 secondes, 8 à 12 injections). La mesure de la lumière sera réalisée dans le bioimageur, sous anesthésie gazeuse (10 minutes), sur un plateau chauffé à 37°C.
Impact sur les animaux
Les injections sous la peau, dans le sang ou dans l'abdomen peuvent entrainer une douleur au niveau du point d'injection. La tumeur diffuse peut croitre dans divers organes, ce qui peut provoquer une souffrance pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
L'étude de la réponse du système immunitaire à une tumeur disséminée dans l'organisme est une phénomène complexe, impliquant des intéractions entre différents types cellulaires dans divers organes. Cette complexité ne peut pas être reproduite avec des cellules et ne peut être étudiée qu’à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été defini au minimum nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique des résultats (test ANOVA).
Raffinement
Les volumes d'injections ont été réduit au minimum pour faciliter le confort de l'animal. Les injections dans le sang (sauf via la veine de la queue) et sous la peau, sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Les injections dans le sang via la veine de la queue sont réalisées après application d'une crème anesthésiante. La mesure de la lumière emise dans le bioimageur est réalisée sous anesthésie gazeuse et sur un plateau chauffant. Les animaux sont suivis quotidiennement. Des points limites adaptés ont été définis (aspect général de l'animal, test d'aggripement, perte de poids).
Choix des espèces
Des souris mâles et femelles âgées de 7 à 12 semaines au démarrage de l'éxpérience seront utilisées. Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Par ailleurs, le système immunitaire de la souris est très similaire au système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes antitumoraux.
Création, maintien et évaluation du bien-être animal de lignées de poisson zèbre pour étudier le rôle de différents gènes impliqués dans un type de mémoire, l’habituation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à douze mois pour éviter, selon le porteur, l'apparition de signes de vieillissement, 7 200 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet consiste à créer et entretenir des lignées où douze gènes liés à l'habituation sont remplacés par une protéine fluorescente. Aucune intervention n'est déclarée sur les poissons de plus de cinq jours, la surveillance se limitant à cinq jours sur sept, avec pour points limites la scoliose, une nage anormale ou des femelles remplies d'œufs. Le tri des embryons de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire, réduit selon lui le nombre d'individus élevés, sans que le RNT indique combien sont écartés à ce stade.
Objectifs
Chez les patients atteints de schizophrénie ou d'autisme, le processus d'habituation, un type de mémoire, est impacté. Nous avons reproduit ce mécanisme d'habituation chez le poisson zèbre. Quand il est soumis à des éclairs ou des bruits, le poisson zèbre réagit en changeant de direction. Lorsqu'il est soumis de façon répétée à ces stimuli, cette réponse diminue, formant l’habituation. Suite à la recherche de gènes impliqués dans cette habituation, nous étudions 12 protéines. Dans ce projet, nous voulons générer des poissons zèbres avec des neurones où les gènes ciblés seront remplacés par de la fluorescence ce qui nous permettra d'étudier les effets des protéines invalidées sur l'habituation en évitant le génotypage par prélèvement de la nageoire.
Bénéfices attendus
Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'homme nous montrent l'importance de cette étude. En comparaison des lignées classiques invalidées pour ces gènes, la création de ces lignées nous permettra non seulement de comprendre où sont localisées les protéines, d'étudier leur rôle tout en évitant un génotypage par biopsie de la nageoire caudale.
Procédures
Aucune intervention ne sera réalisée sur les poissons âgès de plus de 5 jours.
Impact sur les animaux
Lors de la génération et l'élevage des individus mutant, aucun effet indésirable n'est attendu considérant nos résultats précédents avec des lignées similaires mais non fluorescentes. Toutefois, la création de ces lignées avec insertion d'une protéine fluorescente à la place du gène n'étant pas un simple knock-out, une surveillance 5 jours sur 7 sera réalisée par du personnel qualifié et l'expérimentateur avec pour points limites l’observation d’anomalies physiques du poisson (couleur de la peau anormale, hyperventilation, déformation morphologique du poisson, scoliose, siphose, blessure, femelles remplies d'oeufs), d’anomalies de son comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité), prostration au fond du bac à l'abri de la lumière.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à 12 mois pour éviter l'apparition de signes de vieillissement et donc d'impacter le bien-être des animaux.
Remplacement
L'étude de la mémoire et du comportement ne peut pas être réalisée in vitro (sur des cellules en culture) et implique obligatoirement l'utilisation de modèles animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre les adaptions du cerveau des vertébrés face à des stimuli extérieurs. De plus, le cerveau et le génome du poisson zèbre présente des similarités avec celui de l'Homme.
Réduction
Afin de minimiser le nombre de poissons à élever, un tri des embryons âgés de moins de 5 jours et présentant une fluorescence appropriée sera réalisé (non soumis à une DAP). Ceci permettra de réduire drastiquement le nombre d'individus élevés et de garder après 5 jours de développement uniquement les poissons pour le maintien de la lignée et obtenir des alevins nécessaires aux études de comportement. Pour le maintien des lignées, nous faisons une nouvelle génération tous les 8 mois ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Pour surveiller le bien-être animal, nous observerons les poissons qui seront utilisés ensuite pour créer les générations suivantes.
Raffinement
Les poissons-zèbres générés et conservés devraient tous être sans phénotype dommageable d'après notre expérience précédente. Tous les individus sont regroupés dans des bacs de 3.5l pour être au minimum 8 par bac et au maximum 20 par bac. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Choix des espèces
Les gènes de l'Homme et du poisson zèbre présentent de grandes similarités, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier le fonctionnement du système nerveux humain. La fertilisation externe, avec des pontes de plus de 100 oeufs, permet de générer rapidement de nombreux individus par rapport à d'autres modèles tels que la souris et ainsi obtenir des résultats statistiquement très robustes. Enfin, la transparence des larves permet un suivi non invasif en temps réel du système nerveux, ce qui nous permettra de relier les événements dans les neurones avec le comportement d'apprentissage de l'animal. Notre objectif est de maintenir des couples reproducteurs qui nous permettrons de générer des individus de moins de 5 jours pour les études de comportement (hors cadre). Ainsi, ces reproducteurs seront gardés jusqu'à 12 mois; avant l'apparition de signes de vieillesse.
Modèles nutritionnels pour l’induction de désordres métaboliques chez la souris, le rat et le hamster-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 500
Hamsters dorés : 1500
Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.
Objectifs
L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.
Impact sur les animaux
Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.
Etude du métabolisme des cellules souches musculaires au cours de la régénération après lésion physiologique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 200 souris subissent une électrostimulation sous anesthésie destinée à léser leur muscle, puis une mesure de force musculaire également sous anesthésie. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ce dispositif de "totalement non-invasif" alors qu'il sert à endommager le muscle, et affirme que l'interaction entre cellules ne peut être étudiée qu'in vivo. Les souris sont tuées pour prélever le tissu musculaire et analyser le métabolisme des cellules souches qu'il contient.
Objectifs
Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Cette régénération est notamment médiée par une population cellulaire spécifique, les cellules souches musculaires. De précédentes études ont démontré l’importance du métabolisme dans la fonction de ces cellules. Le projet vise à i) caractériser le comportement et le destin de cette population cellulaire au cours de la régénération, ii) identifier les régulations métaboliques sous-jacentes, iii) identifier des cibles biologiques qui permettraient d’influer sur la régénération musculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de caractériser les régulations métaboliques qui surviennent au cours de la régénération musculaire et d’identifier des cibles potentielles qui permettraient d’influer sur cette régénération. De plus, les analyses réalisées au cours de ce projet conduiront à la création d’une base de données importante sur le métabolisme des cellules souches lors de la régénération musculaire qui pourra alimenter des projets ultérieurs et être mise à disposition de la communauté scientifique. A terme, ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des atteintes musculaires associées à plusieurs situations physiopathologiques.
Procédures
Les souris sont soumises à un protocole d’exercice (sous anesthésie générale, durée 15 minutes maximum) et à une une mesure de force musculaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation, anesthésies). Le stress des animaux inclut : 1) l'anesthésie gazeuse lors de l'induction de la blessure musculaire (environ 15 minutes), 2) l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort (environ 1 minute).
Devenir
Les animaux sont mis à mort en vue de récupérer le tissu musculaire pour des analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Bien que l'analyse de la régénération musculaire puisse être en partie étudiée in vitro, ce processus repose notamment sur l’interaction entre différentes cellules qui ne peut être étudiée qu'in vivo, justifiant le recours à l'expérimentation animale.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectuées précédemment pour ces procédures. Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser un dommage musculaire induit par l’exercice et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. La procédure expérimentale utilisée inclut un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’exercice et de la mesure de la force musculaire.
Choix des espèces
Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme. Les animaux utilisés sont âgés de 8-12 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes.
Nouvelles molécules impliquées dans le dialogue entre intestin et son microbiote : rôle dans le maintien de la santé intestinale à long terme.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 600 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour collecter leurs organes. Les expérimentateurs leur provoquent une colite par traitement chimique, qui entraîne diarrhées et perte de poids, et leur administrent des microARN par gavage une fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne peut reproduire les interactions entre microbiote, système immunitaire, génétique et environnement, et renvoie les applications thérapeutiques contre les maladies inflammatoires de l'intestin à un usage futur. Dans un volet du projet, les expérimentateurs gavent chaque jour des souriceaux de sept à dix jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress supplémentaire liée à la contention de nouveau-nés.
Objectifs
Le côlon, comme l’ensemble du tube digestif, héberge une vaste communauté de micro-organismes appelée microbiote intestinal, qui joue un rôle essentiel dans la santé. Des études récentes ont montré que les conditions de colonisation de l’intestin juste après la naissance influencent fortement le développement futur de l’individu. Un déséquilibre précoce du microbiote, ou dysbiose, est ainsi associé à un risque accru de troubles intestinaux à l’âge adulte, notamment dans le cadre des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Les mécanismes par lesquels le microbiote agit à long terme sur la santé restent encore largement inconnus. Parmi les éléments impliqués, les microARN (miARN) — de petites molécules capables de modifier la lecture des gènes — jouent un rôle de plus en plus reconnu. Ils sont présents dans de nombreux compartiments biologiques, notamment les selles et le contenu intestinal, et sont associés à la régulation de fonctions clés de l’intestin. Plusieurs miARN ont été impliqués dans l’apparition de dysbiose et dans l’inflammation intestinale. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des miARN dans le fonctionnement de l’intestin, en particulier dans leur interaction avec le microbiote. Il consiste en particulier en l’étude des effets des miARN à l’âge adulte dans différents modèles de colite (soit une inflammation du colon) expérimentale, tout en ajoutant un nouvel axe centré sur la période néonatale, qui est une étape critique dans l’établissement du microbiote. Nous explorerons comment des interventions sur les miARN pendant cette phase précoce peuvent modifier durablement la santé intestinale, et si ces modifications ont des effets à long terme sur l’équilibre du microbiote et la santé intestinale. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins, dans lesquels des miARN spécifiques seront administrés par voie orale, à différentes étapes de la vie, notamment chez le nouveau-né. Les conséquences seront évaluées à court et long terme, en observant notamment les modifications du microbiote et les réponses intestinales associées. Le projet s’étalera sur 5 années et nécessitera 3600 souris, âgées de la naissance jusqu’à 16 semaines, issues d’un fournisseur agréé. Toutes les procédures seront réalisées dans le strict respect des normes réglementaires, avec une euthanasie programmée à la fin de chaque expérimentation.
Bénéfices attendus
Ces travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les miARN et le microbiote dialoguent et nous permettront de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les miARN, pour le traitement des maladies humaines associées à un problème d’inflammation chronique, comme c’est le cas des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI).
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou plusieurs de ces interventions ayant pour but soit de créer une inflammation du colon chez les souris soit de la traiter, ou alors de suivre l’évolution de la colite et du microbiote chez chaque animal : - Les selles seront récoltées en disposant les animaux dans des petites boîtes en plastique pendant 30 à 60 min. Après que les animaux aient fait naturellement leurs besoins, ils seront replacés dans leur cage d’origine. - Un ou des gavages (selon la procédure : de miARN, d’anti-miRNA) seront effectués à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur souris adultes éveillées, une fois par semaine pendant 12 semaines. Chaque gavage dure environ 10 secondes. - 1 gavage par jour sera effectué à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur des souriceaux de soit 7 à 10 jours, soit 14 à 21 jours. Chaque gavage dure environ 20 secondes. - Les prélèvements de sang seront réalisés uniquement sur des animaux anesthésiés soit 15 jours avant l’euthanasie soit juste avant d’être euthanasié soit un seul prélèvement par animal. Ce geste dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront générées chez les animaux soumis à un traitement chimique, qui induit la colite. Les effets de la colite chez la souris sont l’apparition de diarrhées et une perte de poids. Il est aussi reconnu que les gavages utilisés par ailleurs dans certaines procédures, peuvent induire un stress chez les animaux. Le gavage des souriceaux dans la procédure 2 est reconnu comme pouvant occasionner un stress supplémentaire aux souriceaux lié à la manipulation et la contention de nouveaux nés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de collecter les organes en post-mortem pour analyse ultérieure.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont des maladies très complexes. Elles sont influencées par plusieurs éléments : le système immunitaire, les bactéries qui vivent dans l’intestin (microbiote), la génétique et l’environnement. Elles touchent plusieurs organes et provoquent une inflammation à la fois dans l’intestin et dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement, le microbiote intestinal et le patrimoine génétique de l’animal interagissent, les souris de laboratoire sont le modèle le plus adapté. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules) capable de reproduire ces interactions complexes entre les différents organes et facteurs impliqués. L’objectif final de cette recherche est de comprendre comment certaines petites molécules appelées microARNs peuvent influencer l’inflammation intestinale. Ces connaissances pourraient un jour permettre de développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de MICI.
Réduction
Des expérimentations préliminaires, ont donc permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation d’un logiciel (Prism), a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours pendant toute la durée de l’étude, par du personnel formé. Si des signes de maladie apparaissent (comme une perte de poids, des selles anormales ou un changement de comportement), les soins apportés seront adaptés à leur état. Cela peut inclure la mise à disposition d’eau gélifiée pour éviter la déshydratation ou, si l’état de l’animal devient trop grave, l’arrêt de l’expérience et la mise à mort pour éviter toute souffrance inutile. L’apparition de la colite sera surveillée à l’aide d’un score standardisé prenant en compte le poids, l’aspect général, les signes cliniques visibles et le comportement. Ce score permet de détecter rapidement une aggravation et d’agir progressivement : Si le score dépasse un premier seuil, les observations seront faites plus souvent (deux fois par semaine, puis trois fois par semaine si le score continue d’augmenter). Si certains critères, comme la perte de poids ou la consistance des selles, atteignent un niveau critique, de l’eau gélifiée sera donnée aux animaux. Si l’état d’un animal dépasse le seuil défini comme « point limite », il sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Enfin, les cages seront enrichies (coton, abris, alternance jour/nuit) pour permettre aux souris d’exprimer des comportements naturels et améliorer leur bien-être.
Choix des espèces
Des souris qui présentent des colites ou des lésions similaires aux MICI humaines de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications de la maladie sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Notons que les miARNs sont les mêmes chez la souris et l'Homme et que des travaux antérieurs de la littérature scientifique ont validé l'utilisation de souris comme modèle animal pour l'étude de la colite, et l'inflammation. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Les souris utilisées pour les expériences (mâles et femelles) auront de 7 jours à 112 jours de vie. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la colite et a été décidé en fonction de travaux antérieurs utilisant des modèles de colite murine.
Etude de l’effet de molécules ciblant les cellules immunitaires et ou tumorales sur la modulation de la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Jusqu'à dix prélèvements sanguins par souris, échelonnés d'une heure à quatorze jours après l'injection, et une mesure de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine : 7 044 souris vont être utilisées, dont 5 988 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement de tissus. Les expérimentateurs leur injectent des cellules tumorales, parfois deux fois, puis des molécules candidates une à trois fois par semaine pendant sept semaines. Le porteur reconnaît que le développement des tumeurs peut engendrer un stress et des douleurs plus importants, et prévoit une surveillance clinique deux fois par semaine au minimum. L'objectif déclaré est de sélectionner les molécules qui passeront en essai clinique, la souris étant retenue pour la similitude de son système immunitaire avec celui de l'être humain.
Objectifs
Les thérapies ciblant le système immunitaire ont prouvé leur efficacité dans la lutte contre le cancer. Elles ont permis d’augmenter la survie de patients atteints de cancer. Cependant, certains patients restent résistants aux immunothérapies mises sur le marché nécessitant le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce projet est, suite au développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire, de tester leur efficacité anti-tumoral dans des modèles de souris porteuses de tumeurs. Ce projet permettra de sélectionner et valider les molécules finales qui seront amenées à être testées dans des essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice susceptible de découler de ce projet est : si l’injection des ces nouvelles thérapies dans des modèles de souris conduisent à une réduction de la taille tumorale, elles pouraient aller à l'étape de développement clinique pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Tous les gestes suivants ont une durée de 1 minute par souris. L’injection des biomolécules se réalise soit sur animal vigile soit sur animal endormi, 1 fois par expérience. L’injection peut également être réalisée sur animal vigile, 1 à 3 fois par semaine, sur 7 semaines. L’injection de cellules tumorales sera faite sur animal vigile, 1 à 2 fois par expérience si rechallenge. Elle peut être également réalisée sur animal endormi, 1 fois par expérience, durée de 30 min. Les prélèvements sanguins de petits volumes seront sur animal vigile, 9 fois par souris (30 minutes, 1h, 4h, 24h, 48h, 72h, 96h, 7 et 14 jours) ou 10 fois par souris (1h, 3h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h, 7 et 14 jours). Les prélèvement sanguins de plus gros volumes seront effectués sur animal endormi, 4 fois par souris par expérience. Les prélèvements sanguins en présence de tumeurs se réaliseront 1 fois par expérience, sur animal vigile ; et/ou 1 à 2 fois sur animal endormi par expérience si une réponse anti-tumorale est observée. La mesure de la taille tumorale se réalise avec un pied à coulisse, sur animal vigile, 2 fois par semaine jusqu’à la fin de chaque expérience. La mesure du poids des animaux est sur animaux vigiles, sur une semaine et/ou 2 fois par semaine.
Impact sur les animaux
La manipulation régulière des souris en début de procédure en particulier lors de l’injection des cellules tumorales puis des traitements, peut engendrer un stress et des douleurs légères sur les animaux. Le développement de tumeurs peut engendrer un stress et des douleurs plus importants sur les animaux. Les différents prélèvements de sang en particulier ceux nécéssitant une anesthésie générale peuvent entraîner un stress pour les animaux ainsi que des inflammations aux niveaux des sites de prélèvements.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. Des tissus seront prélevés post-mortem pour analyses.
Remplacement
Les mécanismes étudiés impliquent des interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les biomolécules administrées, qui ne peuvent être reproduites de manière intégrée par des modèles in vitro/ex-vivo. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour l’évaluation de ces nouvelles thérapies. Néanmoins, elles ont été au préalable évalué in vitro afin de sélectionner un nombre réduit de molécules à injecter dans les souris.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à chaque procédure a été évalué statistiquement afin de définir le nombre minimum d'animaux requis pour obtenir la puissance statistique nécessaire. De plus, des test statistiques sont apliqués sur l'analyse des résultats obtenus.
Raffinement
Concernant l’enrichissement, les souris bénéficieront dans leurs cages des éléments suivants, selon leur disponibilité à l’animalerie : bâtonnets de coton et/ou maison en carton et/ou bâtonnets de bois. La mise à mort anticipée des souris sera effectuée lorsqu’un point limite est atteint grâce à une grille de suivi. Certaines injections ou prélèvements sanguins peuvent se faire sous anesthésie générale et la cage sera sur un tapis chauffant après leur réveil. Certain prélèvement sanguin nécessite en plus de l'anesthésie gérérale, un anesthésique locale pour réduire la douleur au site de prélèvement. Certaines injections de cellules tumorales se fera également sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant et la cage sera ensuite déposée sur un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Les souris seront surveillées par les porteurs de projet pour les paramètres cliniques au minimum deux fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les expériences menées en thérapeutique du cancer et elle a depuis longtemps servi à l'étude de thérapies anti-tumorales, notamment car la physiologie de la souris est proche de celle de l'Homme, en particulier sur la similitude du système immunitaire. Les souris seront utilisées à l’âge de jeune adulte (6-9 semaines), afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs induites par le transfert de lignées de cellules tumorales.
Endothélium et immunité au cœur de l’effet FLASH après radiothérapie thoracique à ultra-haut débit de dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Transportées trente minutes vers le site d'irradiation, anesthésiées, irradiées au thorax, puis ramenées, 1 280 souris seront gardées une semaine, deux semaines, trois mois ou six mois avant d'être tuées pour prélèvements. 416 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 416 un niveau modéré et 448 un niveau léger. Le porteur écrit que la radiothérapie est imperceptible et ne peut causer de souffrance, tout en décrivant une fibrose pulmonaire tardive qui provoque fatigue, atteinte de la mobilité et modification de la respiration chez environ 10 % des animaux. Il annonce un suivi quotidien et une mise à mort si les signes persistent plus de trois jours, sans préciser combien de souris atteindront les six mois d'observation.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement souvent utilisé contre le cancer, car elle permet de détruire les cellules malades. Mais elle touche aussi les tissus sains autour de la tumeur, ce qui peut provoquer des effets secondaires parfois importants et limiter l’efficacité du traitement. Pour améliorer cela, une nouvelle méthode appelée radiothérapie FLASH attire beaucoup d’attention. Contrairement à la radiothérapie classique, elle envoie les rayons à une intensité très forte, mais pendant un temps très court. Les premières recherches montrent que cette technique pourrait mieux protéger les tissus sains tout en restant efficace contre la tumeur. Cet effet protecteur, appelé « effet FLASH », n’est pas encore bien compris. Parmi les explications possibles, le rôle du système immunitaire semble important. Il est possible que la réaction du corps aux rayons change selon la méthode utilisée. Ce projet cherche donc à savoir si la façon dont le système immunitaire réagit pourrait expliquer pourquoi la méthode FLASH provoque moins d’effets secondaires. L’étude se concentre sur les cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales. Elles jouent un rôle clé dans les réactions aux rayons et dans la défense du corps. Elles aident aussi les cellules de défense à atteindre les zones abîmées. Nous voulons observer comment ces cellules réagissent à la radiothérapie FLASH chez la souris, en particulier dans les poumons, et voir si cette technique change leur comportement, leur capacité à attirer les cellules de défense et la nature de la réaction inflammatoire, par rapport à la radiothérapie classique. Ce travail s’appuie sur des recherches précédentes faites chez la souris avec des rayons classiques. Cette nouvelle étape aidera à mieux comprendre comment limiter les effets secondaires de la radiothérapie sans réduire son efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins des poumons réagissent à une nouvelle forme de radiothérapie appelée FLASH. Cette technique envoie des doses très fortes de rayons en un temps très court. Elle pourrait permettre de soigner les tumeurs tout en limitant les dégâts sur les tissus sains. L’objectif est d’observer, chez la souris, comment ces cellules réagissent après une irradiation FLASH et comment elles interagissent avec le système immunitaire. Cela aidera à savoir si cette méthode protège mieux les tissus sains. Ce projet apportera plusieurs bénéfices. Sur le plan scientifique, il permettra de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans la réaction du corps à la radiothérapie, notamment leur influence sur l’activation et l’arrivée des cellules de défense. Comprendre leur rôle dans l’effet FLASH, c’est-à-dire la protection des tissus sains malgré un traitement efficace, pourrait ouvrir la voie à de nouvelles façons d’améliorer la radiothérapie. Ces découvertes pourraient aussi inspirer de nouveaux traitements qui protègent mieux les tissus sains tout en renforçant la défense du corps contre la tumeur. Ce projet pourrait aider à réduire les effets secondaires parfois graves de la radiothérapie, comme les cicatrices dans les poumons ou les inflammations chroniques, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients. Sur le plan médical, mieux comprendre les mécanismes responsables des dommages causés par les rayons permettra de créer des traitements plus ciblés pour les éviter ou les soigner. Cela rendra la radiothérapie plus sûre et plus facile à supporter.
Procédures
Les animaux seront d’abord transportés vers le site d’irradiation (30 min). Les animaux seront anesthésiés et irradiés localement (durée max de 20 min par irradiation). Puis ils reviendront sur le site d’hébergement (30 min de transport). Les animaux seront gardés 1 semaine, 2 semaines, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie avant euthanasie. Certains animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie juste avant l’euthanasie (durée max de 10-15 minutes). D’autres animaux seront analysés par échographie sous anesthésie à plusieurs temps après l’irradiation (suivi longitudinal, cinq fois en tout). Ces examens seront réalisés au site d’hébergement des animaux, la phase de transfert n’excédera donc pas 5 min. Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Lors des phases de transport vers le lieu d’irradiation ou vers les locaux d’imagerie, mais également lors de la préhension, de la contention ou de l’anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La radiothérapie en elle-même est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. Dans les temps précoces, des rougeurs et irritations peuvent apparaitre au niveau cutané chez certains animaux. Le développement de fibrose au niveau pulmonaire dans les temps tardifs après irradiation peut engendrer une détresse telle que : atteinte de la mobilité, fatigue, modification de la respiration. Ces signes sont facilement détectables et concernent environ 10% des animaux.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour l’instant, il n’existe pas de méthode sans utiliser d’animaux qui permette d’étudier précisément comment les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins réagissent dans leur environnement naturel. Cet environnement est important, car il influence leur comportement ainsi que la façon dont les cellules endothéliales attirent les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi il est encore indispensable d’utiliser des animaux vivants pour cette étude. Toutefois, ce projet participe au développement d’un modèle en laboratoire, sans animaux, capable de prédire les risques de toxicité liés à la radiothérapie. Ce modèle utilisera des cellules cultivées en laboratoire pour simuler la réaction aux rayons, ce qui pourrait, à terme, diminuer voire remplacer certaines expériences sur les animaux. De plus, certaines idées issues de ce projet seront testées directement sur des modèles cellulaires en laboratoire, notamment pour étudier comment les cellules endothéliales interagissent avec les cellules immunitaires. Cela permettra de mieux cibler les expériences à faire ensuite sur les animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour la suite des recherches.
Réduction
Les résultats des expériences sur les lésions pulmonaires causées par la radiothérapie dépendent beaucoup de la physiologie des animaux utilisés. Pour pouvoir faire des analyses fiables, il faut travailler avec un certain nombre d’animaux. Par exemple, pour les analyses des tissus au microscope, on a besoin de groupes d’environ 10 à 12 animaux. Pour étudier les molécules à l’aide d’une technique appelée cytométrie de flux, des groupes de 6 à 8 animaux suffisent. Pour des analyses plus fines, comme le séquençage de l’ARN à l’échelle de chaque cellule ou l’étude de l’expression des gènes dans les tissus, moins d’animaux sont nécessaires (entre 4 et 6), car ces méthodes étudient des milliers de cellules par échantillon, ce qui améliore la précision des résultats. Enfin, pour tester les interactions entre les cellules des vaisseaux sanguins et les cellules du système immunitaire, il faut aussi des groupes de 6 à 8 animaux afin de collecter assez de cellules pour les expériences.
Raffinement
Lors des séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées pour qu’elles restent immobiles et ne ressentent aucune douleur. Pour certains examens nécessitant l’injection d’un produit dans le sang avant le prélèvement final, un analgésique sera administré afin de garantir l'absence de douleur chez l’animal. Pendant toute la durée de l’étude, elles seront logées dans de bonnes conditions, avec des jouets comme des tubes ou des caches, de la nourriture et de l’eau à volonté, ainsi qu’une température et une humidité contrôlées. Les animaux seront surveillés chaque jour pour s’assurer qu’ils restent en bonne santé. Ils seront pesés plusieurs fois par semaine au début, puis une fois par semaine pendant plusieurs mois, pour vérifier qu’ils ne perdent pas trop de poids. Nous observerons aussi leur comportement et leur état de santé, en vérifiant par exemple s’ils bougent normalement ou s’ils montrent des signes de souffrance, comme des difficultés à respirer. Si un animal présente des signes inquiétants pendant plus de trois jours, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge correspondant à l’âge adulte, ce qui permet de limiter la variabilité liée à la croissance. Cette tranche d’âge est d’ailleurs celle couramment utilisée pour les modèles d’irradiation localisée. Pour garantir une certaine homogénéité, nous travaillerons avec des souris mâles, qui ont un poids d’environ 20 à 22 grammes à cet âge. Ce choix s’appuie aussi sur notre expérience préalable, puisque notre laboratoire dispose déjà d’un solide recul sur ce modèle chez les mâles. Nous prévoyons néanmoins d’étendre nos recherches aux femelles dans un projet futur, afin d’étudier les effets du débit de dose selon le sexe. La souris est un modèle bien connu et largement utilisé dans les études précliniques, notamment au sein de notre laboratoire pour étudier l’irradiation thoracique et le rôle des cellules endothéliales vasculaires dans les lésions radio-induites. Cette expérience accumulée nous assure une bonne maîtrise des conséquences de l’irradiation dans ce modèle.
MODIFICATION Production d’anticorps spécifiques de protéines recombinantes et EVALUATION de candidats vaccins contre le paludisme CHEZ LES RONGEURS.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 230
Une injection de protéines de Plasmodium avec adjuvant complet de Freund, des rappels, une prise de sang pour vérifier le titre d'anticorps, puis une exsanguination par ponction intracardiaque sous anesthésie : 2 770 souris et 230 rats vont être utilisés, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que des alternatives non animales existent pour produire des anticorps, anticorps recombinants et aptamères, et écarte cette voie parce qu'une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée. Les animaux dont le titre d'anticorps satisfait sont tués pour récupérer leur sérum, ceux dont le titre ne convient pas sont tués aussi, ayant déjà reçu une injection. Le texte ajoute qu'ils pourraient tout de même être réutilisés dans d'autres projets, "dans la mesure du possible".
Objectifs
Le paludisme est un problème de santé publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 627 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludiques et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludiques. La maladie est causée par le parasite du genre Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 5 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus répandues : Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anopheles, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Notre laboratoire étudie les mécanismes d’invasion des globules rouges humains par Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, pour Plasmodium falciparum, peut être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez la souris, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons d’inhiber ces protéines à la surface du mérozoïte (forme du parasite permettant d’infecter un nouveau globule rouge) ainsi que de déterminer la réponse immunitaire des candidats vaccins contre Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax.
Bénéfices attendus
Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces de Plasmodium disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, l’inhibition de la croissance parasitaire, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de l’invasion chez P. falciparum, P. vivax et P. knowlesi. De plus, les infections de souris par des candidats vaccins permettront un criblage des préparations vaccinales.
Procédures
1) Une prise de sang (une minute). 2) Une injection (une minute). 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection des protéines avec adjuvant et des candidats vaccins. Dans des très rares cas les souris peuvent mal supporter les protéines recombinantes et les candidats vaccins à ARNm. Elles peuvent montrer une réaction inflammatoire. Les souris recevront les protéines recombinantes en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres injections. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie sous-cutanée peut induire des effets indésirables. Les injections des candidats vaccins à ARNm se feront par la voie intra-musculaire sans adjuvant. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse.
Devenir
Toutes les souris et tous les rats ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mises à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant pour l’études des protéines d’invasion ou déterminer les candidats vaccins permettant la meilleure immunisation possible contre P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi. Toutes les souris n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant lors de prélèvements intermédiaires seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car elles ont reçu au moins une injection de protéines recombinantes ou une dose de candidats vaccins à ARNm. Elles ne peuvent donc pas être réutilisés dans notre projet. Cependant, elles peuvent être réutilisées dans d’autre projets dans la mesure du possible.
Remplacement
L’alternative possible à l’emploi de sérums serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêt et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de Plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale. Cependant, pour chaque protéine identifiée avec certitude dans l’invasion du globule rouge par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi, nous ferons des hybridomes permettant d’obtenir des anticorps monoclonaux. Ce qui nous permettra de bénéficier d’une banque d’anticorps pour l’étude des mécanismes d’invasion du globule rouge par les Plasmodium. De plus, l’utilisation de souris préalablement infectées par du Plasmodium berghei permet de valider les préparations vaccinales avant d’envisager de futur développement de ces vaccins.
Réduction
LE NOMBRE DE SOURIS ET DE RATS POUR CHAQUE EXPERIMENTATION A ETE CALCULE AU PLUS JUSTE POUR PERMETTRE L’UTILISATION D’UN NOMBRE MINIMUM D’ANIMAUX. CETTE ESTIMATION A ETE REALISEE EN CONCERTATION AVEC UN BIOSTATISTICIEN. AINSI, NOUS AVONS CHOISI DES GROUPES DE 7 SOURIS ET 5 RATS DONT LES SERUMS SERONT POOLÉS AFIN D’AVOIR UNE QUANTITE DE SERUMS SUFFISANTE POUR UNE ETUDE APPROFONDIE ET REPETEE. IL N’EXISTE PAS ACTUELLEMENT DE SYSTEME QUI PERMETTE DE REPRODUIRE LE CYCLE DE VIE COMPLET DE PLASMODIUM IN VITRO. PAR CONSEQUENT, POUR REALISER CE PROJET, DES INFECTIONS HEBDOMADAIRES DE RONGEURS ET DE MOUSTIQUES SONT NECESSAIRES. LES PROTOCOLES UTILISES ONT ETE MIS AU POINT DANS DIFFERENTS LABORATOIRES Y COMPRIS LE NOTRE ET TOUTES LES ETAPES SONT BIEN MAITRISEES NOUS UTILISONS LE NOMBRE MINIMAL POSSIBLE D’ANIMAUX POUR NOS EXPERIENCES. POUR LES PROCEDURES 1, 2 ET 3, EVALUATION DES CANDIDATS VACCINS A ARNM, NOUS UTILISERONS DES SOURIS ET DES RATS POUR TESTER LA REPONSE IMMUNITAIRE. POUR LA PROCEDURE 4, PREPARATION DE STOCKS DE SANG INFECTE POUR P. BERGHEI, NOUS UTILISONS DES RATS CAR LEUR VOLUME SANGUIN EST PLUS IMPORTANT QUE CELUI DES SOURIS. AINSI NOUS REDUISONS LE NOMBRE D’ANIMAUX UTILISES.
Raffinement
Si signes de détresse ou de souffrance pendant les prélèvements nous pouvons utiliser une anesthésie gazeuse sous isoflurane. Une surveillance accrue pendant 3 jours suivant les injections et puis 2 fois par semaine entre les injections et les prélèvements ainsi que des soins post manipulation. 1) Les souris ET LES RATS sont hébergés dans des animaleries agrées de l’Institut Pasteur dans des conditions optimales répondant aux normes européennes, avec une surveillance quotidienne. La température, l’hygrométrie et la photopériodicité sont très rigoureusement contrôlées par le système d’alarmes informatisé. L’accès est strictement contrôlé (badge) et les animaux sont manipulés par des techniciens qualifiés et par des expérimentateurs formés. 2) Les souris ET LES RATS sont inoculés avec P. berghei, espèce adaptée aux rongeurs de laboratoire, par voie intrapéritonéale ou intra-veineuse. Il s’agit de gestes rapides. Le niveau de parasitémie durant la phase sanguine est suivi quotidiennement à partir du jour 3. De plus et si nécessaire, nous utiliserons la grille standard comportementale/clinique de la SBEA pour évaluer l’état de santé des animaux. Les critères principaux évalués seront les suivant : poils hérissés, motricité lente, prostration, pâleur des pattes (anémie). LES ANIMAUX OBTENANT UN SCORE DE 2 POURRONT BENEFICIER DE MESURES D’AMELIORATION DES CONDITIONS D’HEBERGEMENT (ENRICHISSEMENT, CHAUFFERETTE) ET DE L’ALIMENTATION (GEL DIETETIQUE). POUR UN SCORE SUPERIEUR A 2, ILS SERONT MIS A MORT. 3) POUR EVITER LA DOULEUR ET LA SOUFFRANCE PENDANT CERTAINES MANIPULATIONS, LES SOURIS SONT ANESTHESIEES..
Choix des espèces
Nous avons choisi de produire nos anticorps ET D’EVALUER NOS CANDIDATS VACCINS chez la souris ET LE RAT car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de Plasmodium sont très immunogènes CHEZ CES ANIMAUX. De plus il est indispensable de tester des candidats vaccins sur des souris ET DES RATS avant de continuer leurs développements. LES HOTES NATURELS DES PARASITES P. BERGHEI SONT DES ESPECES DE RONGEURS SAUVAGES D’AFRIQUE CENTRALE. DES ISOLATS DE CE PARASITE ONT ETE TRANSMIS ET ADAPTES AUX SOURIS ET RATS DE LABORATOIRE DEPUIS DE NOMBREUSES ANNEES PAR PLUSIEURS EQUIPES. IL EST RECONNU DANS LA COMMUNAUTE SCIENTIFIQUE QUE L’INFECTION DES RONGEURS AVEC CES PARASITES EST UN MODELE BIOLOGIQUEMENT PERTINENT POUR ETUDIER PLUSIEURS ASPECTS DU PALUDISME CHEZ L’HOMME. Les souris ET LES RATS utilisés pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.
Formation du personnel à l’anesthésie et mise au point d’un protocole de suivi anatomique et fonctionnel par IRM chez le cochon
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Six des douze cochons repartiront vivants chez leur fournisseur, les six autres seront tués après leur deuxième IRM puis serviront à des formations à l'autopsie et à l'entraînement chirurgical sur cadavre. Les douze animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soumis jusqu'à deux fois à une anesthésie pouvant durer six heures, espacée d'au moins deux jours. Le projet ne produit aucune connaissance sur les cochons eux-mêmes, il sert à former le personnel de l'établissement à l'anesthésie, à l'analgésie et au réveil, et à caler un protocole d'imagerie. Le porteur juge l'usage d'animaux vivants "indispensable" à cette formation et inscrit le projet au crédit de la réduction et du raffinement, puisqu'un même cochon peut passer deux examens.
Objectifs
Le projet vise à établir un protocole de suivi anatomique et fonctionnel non invasif du cochon par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Pour de nombreux projets, un suivi anatomique et fonctionnel de certains organes se révèle nécessaire. L’IRM est un outil non invasif doté d’une résolution spatiale importante permettant une caractérisation anatomique précise des organes d’intérêt. Outre sa fonction anatomique, il permet également de suivre des fonctions précises de ces organes. L’obtention d’images de qualité nécessite cependant l’absence de mouvement du sujet étudié. Dans le cadre de l’expérimentation animale, l’anesthésie se révèle donc indispensable pour l’acquisition de ces images. Il est donc nécessaire que le personnel de l’établissement utilisateur soit formé à l’anesthésie/analgésie, ainsi qu’au suivi de constantes physiologiques des animaux. Le cochon est un modèle particulièrement pertinent pour beaucoup de recherche, sa physiologie étant proche de celle de l’homme. Notre objectif est double : former le personnel à la prise en charge de cochons du point de vue de l’anesthésie, de l’analgésie, du suivi de constantes et du réveil, ainsi que de mettre en place un protocole d’acquisition d’images IRM sur le cochon.
Bénéfices attendus
Ce projet aura pour principal bénéfice d’établir un protocole d’acquisition IRM standardisé en participant à la formation des personnels de l’établissement utilisateurs aux procédures d’anesthésie, analgésie, au réveil, ainsi que suivi de constantes physiologiques des animaux. De ce point de vue, nous estimons pouvoir agir sur les items Réduction et Raffinement de la règle des 3R. La Réduction est permise par l’accès à un suivi temporel facilité de l’animal. L’examen étant non-invasif, un animal peut faire l’objet de deux acquisitions, en respectant une période de récupération inter-anesthésie, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Le Raffinement est favorisé par la nature non-invasive et atraumatique de cet examen d’imagerie et par une formation adaptée du personnel à la bonne conduite des procédures expérimentales, limitant ainsi autant que possible le stress des animaux que ce soit pour ce projet ou pour de futurs projets.
Procédures
Les animaux (n=12) seront soumis à un protocole d’anesthésie/analgésie dans le but de faire des acquisitions d’image IRM pour une durée de 6 h maximum. Ce protocole sera réalisé au maximum deux fois par animal avec espacement de 2 jours minimum (un jour de repos complet minimum entre les deux acquisitions).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels pour les animaux sont principalement lié à l’anesthésie : faiblesse après le réveil, stress, déshydratation ou baisse d’appétit dans les heures qui suivent l’anesthésie. La procédure d’IRM étant non invasive, aucun effet indésirable liée à celle-ci n’est attendu.
Devenir
Les animaux (minipigs) seront gardés en vie et rendu au fournisseur sur avis du vétérinaire ou du responsable du projet. Les animaux (porcs fermiers) seront euthanasiés après la deuxième IRM. Ces animaux serviront pour des formations à l’autopsie et à l’entrainement au geste chirurgicaux sur animaux euthanasiés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivant est indispensable à la formation à l’anesthésie, analgésie, suivi de constante et réveil, qui, par définition, se réalisent sur animal vivant. La mise en place du protocole d’acquisition d’image nécessite lui aussi l’utilisation d’animaux vivant.
Réduction
Ce projet se justifiant d’un point de vue scientifique et de formation, le nombre d’animaux a été limité au minimum assurant la formation du personnel compétent pour suivre le tutorat du vétérinaire désigné de l’établissement utilisateur. Nous estimons que l’utilisation de 12 animaux permettra aux personnels actuels et futurs d’être formés. L’acquisition d’IRM étant non-invasive, elle pourra être réalisée deux fois par animal avec un délai de récupération de 2 jours minimums. La réalisation de l’imagerie deux fois par animal permets de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés par 2. Chaque cage bénéficiera d’un enrichissement adapté (corde naturelle, rondins de bois non traités, chaînes métalliques, jouets en plastique). Les animaux seront dirigés et gardés contre les grilles du box par des plaques de tirage pour porc pour l'anesthésie et l'analgésie. Une attention particulière sera apportée au maintien de leur température corporelle pendant l’anesthésie. Les animaux seront maintenus à la table d’examen par des blocs de mousse et des sangles pour éviter toute chute. Des points limites précoces seront appliqués pour éviter toute souffrance (absence de reprise d’alimentation ou d’abreuvement ; immobilité persistante ; comportement anormal ou signes de mal être persistants malgré les traitement décidé par le vétérinaire).
Choix des espèces
Le porc a été choisi pour ce projet en raison de son anatomie et de sa physiologie comparable à l’humain. Étant donné que ce projet a une vocation de formation du personnel sur la gestion de l’anesthésie/analgésie, il est pertinent de le réaliser sur une espèce souvent utilisée en recherche pour sa proximité biologique avec l’humain.
Évaluation de candidats médicaments sur le développement de l’anaphylaxie
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le mode d'administration, le nombre de prélèvements et le rythme des doses dépendent ici de l'appréciation du client. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les expérimentateurs leur injectent des anticorps IgE, puis l'allergène vingt-quatre heures plus tard pour déclencher une réaction anaphylactique, qui provoque une chute de la température corporelle, de fortes démangeaisons et parfois un gonflement du museau. Aucun anti-inflammatoire ni analgésique ne leur sera administré, un tel traitement faussant la mesure de la réaction, et le porteur ajoute qu'une molécule doit avoir été testée chez l'animal pour obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Objectifs
Quel que soit l’âge du patient, l’anaphylaxie est une réaction allergique grave qui apparait rapidement et peut être mortelle même en cas de prise en charge rapide. Elle est imprévisible et peut être déclenchée par différents types d'allergènes (l’ovalbumine contenue dans les œufs, le venin d’abeille…). Les patients qui déclenchant l’anaphylaxie ont été en contact une première fois avec l’allergène ce qui a induit une réponse de leur système immunitaire qui, lors d’un deuxième contact, va réagir de manière excessive pour combattre l’allergène. L’anaphylaxie peut alors déclencher une baisse de la pression artérielle, des douleurs abdominales, des démangeaisons autour de la bouche…amenant jusqu’à la mort du patient en quelques heures ou minutes. À ce jour, il est donc impératif d’améliorer le suivi des patients et de diminuer le risque de décès. Pour ce faire, il est nécessaire de disposer de modèles animaux fiables mimant la physiopathologie de l’anaphylaxie. L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques sur la récupération des souris suite à l’induction d’une anaphylaxie générale ou d’une anaphylaxie locale cutanée. Les animaux seront d’abord mis en contact avec l’allergène une première fois par injection, puis une deuxième fois avec une deuxième injection qui déclenchera alors la réaction anaphylactique. Les animaux recevront la molécule thérapeutique à tester avant, pendant ou après l’induction de l’anaphylaxie, dépendamment du mode d’action et de la connaissance que possèdent nos clients sur l’efficacité potentielle de leur molécule. Le sang et les organes prélevés dans les études inclues dans ce projet permettront de répondre à l’objectif de caractérisation et de quantification de l’inflammation et d’évaluer l’efficacité de la molécule testée. L’objectif général de ce projet est de contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients et réduire leur risque de mourir.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu à court et moyen termes réside dans l’identification des mécanismes impliqués dans l’atténuation des symptômes de l’anaphylaxie. Le bénéfice attendu à long terme de ce projet est l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients sujets à l’anaphylaxie et une réduction de la mortalité associée.
Procédures
Plusieurs interventions pourront être mises en place sur les animaux. L’induction de la pathologie (une seule fois par animal) pourra se faire par injection intraveineuse ou intrapéritonéale des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) et de l’allergène correspondant 24h plus tard (allergène de synthèse). Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute) pour la voie intraveineuse. L’injection se fera sans anesthésie pour la voie intrapéritonéale (30 secondes). L’induction de la pathologie pourra aussi se faire par injection sous-cutanée des IgE (anticorps produits en cas de réponse allergique) puis injection intraveineuse de l’allergène correspondant 24h plus tard. Pour cela, les souris seront anesthésiées (5minutes) à l’aide d’un gaz anesthésiant et recevront l’injection sous-cutanée (1minute) puis, 24h plus tard, les souris seront de nouveau anesthésiées à l’aide du gaz anesthésiant et recevront l’injection intraveineuse (1 minute). Au cours de la procédure, les souris recevront des administrations répétées de composés client : les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique (environ une minute par animal : saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). Selon l’appréciation du client, un ou plusieurs prélèvements de sang pourrons être effectués. Les prélèvements de sang n’excèderont pas 12 % du volume de sang total de l’animal et seront suivis d’une semaine minimum de récupération avant le prochain prélèvement. Le volume prélevé est dépendant du poids de l’animal.
Impact sur les animaux
L’anaphylaxie généralisée provoque comme effets indésirables : une baisse de la température corporelle et une sensation de démangeaison importante. Parfois, un gonflement du museau peut être observé. L’anaphylaxie cutanée provoque comme effets indésirables : une sensation de démangeaison localisée à l’oreille ainsi qu’un léger gonflement de l’oreille. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations (uniques ou répétées, selon les études) pourront également générer un stress chez l’animal. Les modes d’administration considérés comme nuisibles (pouvant induire une gène ou une douleur) incluent tous les modes d’injection.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire terminal.
Remplacement
Lorsque cela sera possible, les composés de nos clients seront préalablement testés sur culture cellulaire ou organes isolés permettant ainsi de mieux définir les doses à administrer par exemple. Cependant, l’utilisation des animaux sera nécessaire car les modifications physiopathologiques liées à l’anaphylaxie sont très complexes, doivent être mesurées dans un organisme entier. De plus, pour obtenir une autorisation de mise sur le marché, une molécule doit avoir été testée chez l’animal afin d’engranger des preuves d’efficacité fonctionnelle et de détecter d’éventuels effets indésirables. Nous devons donc être en mesure de prévoir l’apparition d’effets secondaires dans l’éventualité de l’utilisation future des candidats médicaments en clinique. Les effets indésirables ne peuvent s’observer que sur un animal vivant car ils peuvent impliquer plusieurs organes et plusieurs régulations physiologiques. L’utilisation des animaux sera donc essentielle à nos études mais nous nous efforcerons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en effectuant des tests préliminaires sur d’autres modèles n’impliquant pas les animaux.
Réduction
Au sein de cette étude, nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum pour une étude statistique soit 8 animaux par groupes. La comparaison des groupes entre eux sera faite à l'aide de test statistiques. Le nombre d’animaux nécessaires pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant sur des travaux préliminaires ainsi que sur l’expertise de notre société sur l’utilisation de ces modèles animaux. Les doses à tester seront au préalable, systématiquement évaluées après documentation dans la littérature ou par retour d’expérience du client. Par ailleurs, compte tenu de la variabilité des paramètres observés au sein d’un groupe homogène, une analyse sur des groupes de 8 animaux sera nécessaire afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Les tests statistiques seront réalisés sur un ligiciel spécifique afin de vérifier les différences obtenues entre les groupes.
Raffinement
Les procédures seront réalisées en respectant le bien-être animal, afin de limiter souffrance, douleur et angoisse. Les souris seront hébergées conformément à la réglementation avec enrichissement environnemental (igloo, carrés de ouate systématiquement et, si nécessaire, tunnel en carton, buchettes et boulettes en bois). Après induction de la pathologie, un suivi régulier sera effectué (score 1 et/ou score 2). Le score 1, reportera l’aspect général de l’animal et sera mis en place dans les deux modèles. Le score 2 reportera la réponse clinique à l’induction de la pathologie. L’atteinte d’un score trop important induira la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort s’il ne récupère pas dans les heures qui suivent. Étant donné que l’anaphylaxie est basée sur l’inflammation, aucun traitement anti- inflammatoire ou analgésique ne sera administré, car cela compromettrait les résultats en agissant sur les voies de signalisation ciblées ainsi que sur le comportement et l’état physique, paramètres clés de l’évaluation. De plus, des interactions possibles entre le traitement testé et les médicaments anti-inflammatoires ne peuvent être exclues. Les prélèvements et administrations répétées pouvant induire du stress, un enrichissement sera maintenu. Les aiguilles et sondes de gavage seront adaptées au poids et au mode d’administration. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des anesthésiques pourront être utilisés.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans la modélisation de pathologies présentes chez l’Homme a longuement été décrite et justifiée de par leur proximité avec l’Homme. Par ailleurs, la souris est largement décrite comme une espèce de choix dans les modèles de développement de maladies inflammatoires telles que l’anaphylaxie compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. Il s’agit en effet d’un modèle bien établi et bien documenté dans la littérature pour l’analyse de la fonction immunitaire. Par ailleurs, l’étude de l’anaphylaxie nécessite des animaux ayant un système immunitaire mature, c’est-à-dire âgées de 7 à 12 semaines.
Rôle d’une protéine de l’immunité innée dans le lupus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 370 souris pour une étude qui, selon le porteur, se satisfait de dix animaux par groupe : 2 080 d'entre elles subiront des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 6 290 autres un niveau modéré, et aucune ne sera maintenue en vie. Certaines reçoivent un produit pro-inflammatoire sur la peau chaque jour pendant huit jours, d'autres une irradiation suivie d'une injection de moelle, d'autres une greffe de cellules tumorales, avec jusqu'à vingt-cinq injections par animal. Les souris génétiquement modifiées développeront une maladie lupique avec augmentation de la taille de la rate, atteinte des reins, amaigrissement, poil terne, léthargie et parfois anémie. Sur le raffinement, le porteur mentionne une semaine d'acclimatation, du personnel compétent et des points limites, sans autre précision pour 8 370 animaux.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’une nouvelle protéine dans le lupus, une pathologie autoimmune. Le lupus est une maladie auto-immune où le système immunitaire attaque par erreur le corps, touchant environ 5 millions de personnes dans le monde. Il peut provoquer une grande fatigue, des douleurs, des problèmes de peau ou d’organes vitaux, ce qui perturbe fortement la vie quotidienne des personnes atteintes. Selon les formes et la sévérité, les symptômes peuvent être discrets ou au contraire très invalidants, impactant durablement la santé et le bien‑être. Pour mettre au point des traitements, il faut comprendre quelles protéines de l’immunité participent à cette activation, car elles ne sont pas totalement connues. Dans le cadre d’un autre projet, nous avons récemment identifié une nouvelle protéine centrale dans l’activation de l’immunité. Ce projet a pour but de comprendre son rôle dans le lupus. A terme, il est possible que les résultats de cette étude permettent de mettre au point des thérapies permettant de réduire l’activation non-voulue de l’immunité chez ces patients. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle d’une nouvelle protéine immunitaire dans le lupus, une pathologie autoimmune.
Bénéfices attendus
Les mécanismes derrière la pathologie auto-immune lupus ne sont pas totalement compris. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire aux premières étapes d’activation du système immunitaire. Ce projet propose d’analyser son rôle chez la souris. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle dans l’organisme dans la pathologie lupus. Il a également pour but de tester l’effet thérapeutique d’une petite molécule démontrée comme inhibant l’activité de cette protéine d’intérêt en contexte lupique. Ce projet pourrait donc amener vers une nouvelle thérapie du lupus pour les patients.
Procédures
Toutes les interventions se font sur animaux éveillés. Toutes les injections correspondent à un geste d’une durée inférieure à 10s. Un 1er lot d’animaux sera injecté avec un produit activant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience), puis pour partie injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience). Un produit pro-inflammatoire sera appliqué sur la peau d’un 2e groupe d’animaux (tous les jours, pendant 8 jours- durée du geste inférieur à 5 min). Ces animaux pourront être injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire (tous les jours pendant les 8 jours). Alternativement, certains animaux seront injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire quatre fois au cours des 8 jours d’expérience. Du sang sera prélevé 2 fois. Un 3e groupe de souris sera irradié, puis injecté avec de la moëlle épinière (1 fois au cours de l’expérience). Un produit pro-inflammatoire sera appliqué sur la peau des animaux comme précedemment. Du sang sera prélevé 2 fois. Un 4e lot d’animaux sera injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Du sang sera prélevé 3 fois. Un 5e lot d’animaux sera injecté avec un produit activant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience), puis injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (13 fois au cours de l’expérience, une fois par jour pendant 13 jours, ou alternativement 25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Alternativement, certains animaux seront injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire quatre fois au cours des 13 jours d’expérience. Du sang sera prélevé 2 fois. Dans un 6e lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux pourront être traités à raison de deux fois par semaine pendant un mois (administration des traitements aux animaux vigiles), ainsi qu’avec un produit inhibant la réponse immunitaire (25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Du sang sera prélevé 3 fois.
Impact sur les animaux
L’injection de traitements ou de cellules tumorales au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire et courte (quelques secondes) due à la piqure elle-même. Pour les injections, les animaux seront immobilisés transitoirement, ce qui entrainera un stress limité et court. Les souris génétiquement modifiées développeront au cours du temps des symptômes de maladie lupique, incluant une augmentation de la taille de la rate, ainsi que des atteintes du rein résultant en l’apparition de protéine dans les urines. Des signes cliniques tels que amaigrissement, poil terne, léthargie, et parfois anémie sont attendus. Dans le modèle induit par injection de produit chimique, une réaction immunitaire locale avec rougeur au site d’injection peut survenir, ainsi qu’une accumulation de liquide dans la cavité abdominale. Ces effets sont caractéristiques de la pathologie auto-immune recherchée. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs .Les animaux pourront perdre du poids, manger moins et avoir du mal à se déplacer.
Devenir
Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des expériences en laboratoire ont montré que notre protéine immunitaire joue un rôle clé dans l’activation des défenses immunes de l’organisme. Quand cette protéine est absente, les cellules ne réagissent plus aux signaux censés déclencher une réponse immune. Le projet cherche maintenant à comprendre si cette protéine est impliquée dans le lupus, en utilisant des souris comme modèle vivant. Même si des méthodes alternatives comme la culture de cellules ont été utilisées, l’étude sur l’animal reste essentielle pour observer la réponse immunitaire dans son ensemble, telle qu’elle se produit dans un organisme complet et fonctionnel. La réponse immune implique de nombreux types de cellules différents, dans des organes particuliers et une temporalité précise. Cette complexité n’est pas observable avec des méthodes simplifiées impliquant de la culture cellulaire.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons prévu une première série de trois expériences destinées à vérifier si la protéine que nous étudions joue bien un rôle dans le mécanisme responsable du lupus. Cette étape fonctionne selon un principe de “go/no go” : si les résultats sont positifs (go), nous poursuivons avec trois expériences supplémentaires ; si les résultats sont négatifs (no go), nous arrêtons là, ce qui évite d’utiliser des animaux inutilement. Nous avons également réduit la taille des groupes au strict minimum. Notre expérience de laboratoire montre que 10 souris par groupe suffisent pour évaluer de façon fiable l’effet anti inflammatoire d’un gène ou d’un traitement. Avec ce nombre, nous pouvons détecter une différence claire entre deux groupes avec une très bonne précision statistique (90 % de chance de repérer un véritable effet et seulement 5 % de risque de se tromper). Enfin, pour certaines manipulations, nous récupérons autant d’organes que possible chez chaque animal afin de réaliser plusieurs analyses sur le même individu. Cette approche permet de répondre à un maximum de questions scientifiques tout en réduisant encore le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Avant toute manipulation, les souris auront au minimum une semaine d’acclimatation afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles sont manipulées par des personnels compétents afin de limiter au maximum le stress dû à la manipulation. Le bien être des souris sera suivi par le personnel de l’équipe de recherche. . Le suivi des animaux est basé sur des points limites généraux et spécifiques de la pathologie est effectué en utilisant pour évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche sur le lupus : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez l’humain et chez la souris. Souris adultes ( >6 semaines) car leur réponse immune est active.