Recherche fondamentale

Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Une biopsie de la queue, quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept injections par animal, puis un diabète déclenché par une molécule synthétique : 3 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les manipulations commencent dès l'âge de dix jours, et les animaux qui présentent déjà des signes de la maladie sont mis à mort. L'objectif déclaré est une thérapie cellulaire, des cellules injectées venant compenser un défaut immunitaire. La maladie n'est nommée nulle part dans la description, réduite à "la maladie métabolique d'intérêt", pas davantage que les cellules thérapeutiques ou la molécule qui déclenche l'hyperglycémie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer une thérapie cellulaire contre contre le diabète, une maladie métabolique pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitement permettant une guérison des patients. Le développement d’une thérapie pour cette maladie est important car elle est de plus en plus fréquente, en particulier chez les enfants, et affecte très négativement la qualité de vie des individus atteints. Il a été montré que certaines cellules fonctionnaient de manière anormale dans cette maladie. Il est donc possible que l’injection de cellules compensant pour ces défauts puissent guérir cette maladie. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris développant cette maladie pour mieux caractériser les mécanismes impliqués dans cette maladie, et pour développer une thérapie cellulaire. Les résultats obtenus doivent permettent de développer une thérapie cellulaire pour cette maladie chez l’humain.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est le développement d'une thérapie cellulaire pour la maladie métabolique d'intérêt.

Procédures

Identification d'un animal : 1 fois ~10 secondes et 1 fois ~5 secondes. Prélèvement sanguin : 4 fois ~15 secondes. Anesthésie (lors de la mise à mort): 1 fois ~15 minutes. Injections de deux types: répétées (7 fois) ~10 secondes/injection ou 1 fois ~45 secondes. Ces interventions se font sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle : développement du diabète immuno-dépendant: hyperglycémie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte des tissus d'intérêt.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie du de la maladie métabolique d'intérêt, seuls les modèles souris sont capables de refléter la complexité de la maladie et notamment les interactions entre les cellules circulant dans le sang et l'organe métabolique cible. Une veille bibliographique sera mise en place pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques. Les molécules qui seront utilisées pour produire les cellules thérapeutiques ont été soumises à de nombreux tests pour sélectionner les plus prometteuses. Le protocole de production de ces cellules thérapeutiques a été optimisé.

Réduction

Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Des approches sophistiquées d’analyse ont été établies pour réduire le nombre d’animaux à utiliser pour obtenir un maximum d’information. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le protocole d'induction de la maladie métabolique été raffiné et permet de ne pas utiliser d'immunisation mais seulement une injection de molécule synthétique afin de réduire la souffrance des souris. Dans ce projet, ce protocole sera raffiné davantage pour minimiser la dose de molécule synthétique à injecter. L’induction simultanée de la maladie chez les animaux permet un suivi plus précis des animaux en cours de procédure et permet une détection précoce pour éviter toute souffrance. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs.

Choix des espèces

La souris est le plus petit mammifère permettant d’étudier le développement de la maladie métabolique d’intérêt. C’est également l’espèce dont la connaissance génétique approfondie permet les modifications nécessaires à la création d’un modèle présentant des caractéristiques biologiques proches de celles de l’humain. Ce modèle expérimental permet de tester une approche thérapeutique pouvant être rapidement appliquée chez l’Homme. Par ailleurs, la large gamme d’outils disponibles pour analyser précisément les réponses observées fait de la souris l’espèce la plus appropriée pour ces recherches. Les animaux sont utilisés à partir de l’âge de dix jours pour réaliser les gestes d’identification ainsi que les prélèvements nécessaires à certaines analyses. À partir de quatre semaines, un prélèvement sanguin est effectué afin de confirmer les caractéristiques génétiques des individus. Cet âge est choisi pour garantir que les animaux aient une taille suffisante et que ces manipulations puissent être réalisées sans compromettre leur bien-être. Entre sept et quatorze semaines, les souris peuvent recevoir un traitement destiné à induire la maladie étudiée, période correspondant à une phase de maturité adaptée à l’analyse des mécanismes impliqués. Les animaux présentant déjà des signes de la maladie seront mis à mort.

Une échographie par semaine sous anesthésie, deux IRM d'une heure chacune, une imagerie optique et un prélèvement sanguin hebdomadaires : 3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales pancréatiques leur sont injectées sous la peau ou implantées chirurgicalement dans le pancréas, avant les chimiothérapies hebdomadaires et les produits de thérapie génique. Le porteur décrit une douleur liée à la croissance tumorale qui apparaît dans les 12 à 48 heures après l'implantation puis s'intensifie, avec une perte de poids pouvant atteindre 20 %. Le choix se porte sur des lignées immunodéficientes permettant la greffe de tumeurs humaines, que le porteur présente comme des approches de référence en préclinique.

Objectifs

Le cancer du pancréas (adénocarcinome canalaire) représente la troisième cause de mortalité par cancer dans les pays occidentaux. Son pronostic reste très défavorable, en raison de l'absence de biomarqueurs permettant un diagnostic précoce et du manque d'alternatives thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie curative n’est pas possible. Les chimiothérapies actuelles n’offrent qu’un bénéfice limité en termes de survie, et les thérapies ciblées ou immunothérapies n’ont pas encore démontré d’impact clinique significatif. Dans ce contexte, notre équipe mène depuis plusieurs années des recherches fondamentales et translationnelles, avec pour objectifs de mieux comprendre les mécanismes d’initiation de la maladie, d’identifier les patients à risque ou porteurs de lésions précoces, de surmonter la résistance aux traitements et de développer des stratégies thérapeutiques personnalisées.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à mieux comprendre le cancer du pancréas afin de développer des traitements plus efficaces et mieux adaptés à chaque patient. Nous étudions les mécanismes à l’origine du développement de la tumeur et de sa résistance aux traitements, en particulier le rôle des gènes, des protéines et de leurs interactions. Nous nous intéressons également à de nouvelles approches thérapeutiques, comme l’utilisation de virus capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses, ainsi qu’au développement de tests de diagnostic non invasifs à partir de biomarqueurs présents dans le sang. L’objectif est de transformer ces découvertes en solutions thérapeutiques innovantes et personnalisées, avec l’espoir d’améliorer à terme la prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Sur la période considérée, les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales pancréatiques. D’autres feront l’objet d’une implantation de cellules tumorales directement dans le pancréas, réalisée par voie chirurgicale. La transplantation sera réalisée en une seule intervention par animal, sous anesthésie générale, pour une durée d’environ 15 à 20 minutes. Un traitement antidouleur adapté sera administré afin de prévenir et de réduire toute douleur après l’opération. Les chimiothérapies seront administrées une fois par semaine, pour une durée maximale de trois semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, en fonction des propriétés de la molécule testée. Les produits de thérapie génique seront administrés soit directement au niveau de la tumeur, soit par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, en fonction du type de vecteur utilisé et des objectifs de l’étude. Lorsque nécessaire pour garantir la précision du geste et le bien-être des animaux, les administrations seront réalisées sous anesthésie et en présence d’antalgique. Dans certains cas, des prélèvements sanguins pourront être réalisés chez des animaux vigiles au cours du développement tumoral. Ces prélèvements servent à détecter des signes précoces de la maladie, à mieux comprendre la progression du cancer et à suivre l’efficacité de traitements expérimentaux. Ils seront limités à un seul prélèvement avant l’apparition de la tumeur, puis à une fréquence maximale d’un prélèvement hebdomadaire pendant la durée de l’expérimentation. Un suivi régulier de la croissance tumorale sera assuré par imagerie non invasive. Des échographies seront réalisées une fois par semaine sous anesthésie générale légère. Des examens d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectués sous anesthésie générale à deux reprises : avant administration du traitement puis 1 à 2 semaines après. Chaque examen d’IRM durera environ une heure. Un suivi complémentaire par imagerie optique (environ 5 minutes) pourra également être réalisé avant traitement puis hebdomadairement. L’ensemble des animaux fera l’objet d’une surveillance clinique régulière incluant l’évaluation de l’état général, du poids et de la taille tumorale. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin d’éviter toute souffrance inutile, et les animaux atteignant ces critères seront retirés de l’étude et euthanasiés selon des méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent entraîner une altération de l’état général des animaux, se traduisant par des modifications comportementales (diminution ou augmentation de l’activité, agitation, agressivité, léchage excessif, automutilation), observables généralement dans les 24 à 72 heures suivant l’intervention ou l’administration expérimentale et pouvant persister de quelques heures à plusieurs jours selon la sévérité de l’atteinte et la réponse individuelle. Des changements de l’aspect physique (perte de poids atteignant 20 %, pilo-érection, variations de la température cutanée), peuvent apparaître de manière progressive entre 48 heures et plusieurs jours après le début de la procédure et se maintenir pendant plusieurs jours à une à deux semaines selon l’évolution clinique et la prise en charge mise en place. Des troubles moteurs peuvent survenir dans un délai de 24 à 96 heures selon la nature du protocole et durer de quelques heures à plusieurs jours. Des douleurs liées à l’implantation et à la croissance des tumeurs peuvent apparaître précocement dans les 12 à 48 heures suivant l’implantation, puis s’intensifier progressivement au cours des jours ou semaines suivants en fonction du développement tumoral. Par ailleurs, l’IRM est susceptible d’induire des effets indésirables indirects liés au stress et à la contention, ainsi qu’à l’anesthésie nécessaire à l’examen (hypothermie transitoire, dépression respiratoire, retard au réveil), ces effets étant généralement de courte durée et réversibles en quelques heures après la fin de l’examen. Des effets liés de manière plus générale au stress (anxiété, agitation), à l’anesthésie (hypothermie, dépression respiratoire, retard au réveil) et aux injections (douleur, réactions locales, inconfort transitoire) peuvent également contribuer à l’altération de l’état général des animaux, avec une durée habituellement limitée à quelques minutes à quelques heures pour les réactions aiguës, et jusqu’à 24 à 48 heures pour certaines réactions locales ou effets résiduels de l’anesthésie.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable afin de permettre des analyses comparatives post-mortem nécessaires à l’identification et à la compréhension des mécanismes antitumoraux mis en jeu. À l’issue de la procédure, des prélèvements biologiques multiples seront réalisés afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal et de limiter le recours à de nouveaux animaux, conformément au principe de réduction. Les organes et tissus prélevés seront soit fixés, soit congelés. Les tissus fixés permettront la réalisation d’analyses histologiques et histochimiques destinées à évaluer l’architecture tissulaire, l’évolution tumorale et l’impact des traitements au niveau cellulaire. Les tissus congelés seront utilisés pour des analyses biochimiques, notamment l’étude de l’expression et de l’activation de protéines d’intérêt impliquées dans les voies antitumorales. Des prélèvements seront également effectués pour l’extraction d’ARN afin d’analyser les niveaux d’expression des gènes d’intérêt et de caractériser les mécanismes moléculaires modulés par les traitements. Des prélèvements sanguins seront réalisés et congelés afin de permettre l’analyse de paramètres circulants et de biomarqueurs reflétant la réponse systémique des animaux. L’ensemble des échantillons sera stocké et répertorié dans une base de données interne à l’équipe, assurant leur traçabilité et leur utilisation dans le cadre des analyses prévues par le projet.

Remplacement

Notre projet sur le cancer du pancréas utilise en priorité des modèles cellulaires et des organoïdes afin de limiter le recours aux animaux. Les cellules tumorales cultivées en laboratoire sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires, identifier des biomarqueurs et tester de premières stratégies thérapeutiques. Les organoïdes, qui sont des structures tridimensionnelles dérivées de tumeurs, reproduisent mieux certaines caractéristiques des tumeurs humaines, notamment leur organisation et leur hétérogénéité. Ils permettent d’évaluer plus finement l’efficacité de traitements dans un système proche de la réalité biologique. Ces approches in vitro sont systématiquement utilisées pour sélectionner et valider les hypothèses avant toute expérimentation animale. Toutefois, certaines questions, comme l’étude des interactions avec le système immunitaire, la dissémination métastatique ou les effets globaux d’un traitement sur l’organisme, nécessitent l’utilisation de modèles murins. Notre recours à l'expérimentation animale est limitée aux situations où les modèles cellulaires et les organoïdes ne permettent pas de répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

La taille des groupes de souris est déterminée à partir de nos données antérieures, de la littérature utilisant des modèles tumoraux comparables et d’une estimation statistique préalable. Celle-ci indique qu’un minimum de 6 à 8 animaux analysables par groupe est nécessaire pour détecter une différence biologiquement pertinente dans la progression tumorale. Afin de tenir compte de la variabilité inter-individuelle, de l’hétérogénéité de la prise de greffe, ainsi que d’éventuels décès ou arrêts anticipés pour raisons éthiques, un effectif majoré d’environ 10 % est prévu. Ainsi, 10 souris par groupe recevront une greffe tumorale expérimentale, permettant d’obtenir in fine 6 à 8 individus analysables sans devoir répéter l’étude. Ce dimensionnement garantit la robustesse statistique des résultats tout en respectant le principe de Réduction des 3R. Au cours de l’expérimentation, un maximum de mesures fonctionnelles et de paramètres biologiques sera réalisé de manière longitudinale et non invasive, sans compromettre la finalité scientifique. Les effets et paliers de douleur liés à l’évolution de la pathologie seront pris en compte, avec application stricte des critères d’arrêt et des mesures de bien-être animal. L’enrichissement de l’environnement et le maintien en groupes sociaux seront assurés tout au long de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux sont hébergés en salle d’acclimatation et bénéficient d’un examen clinique réalisé par un personnel compétent afin d’évaluer leur état général. Leur bien-être est ensuite surveillé quotidiennement tout au long de l’étude à l’aide d’une grille d’observation spécifique, sous la responsabilité de la structure en charge du bien-être animal. Les actes susceptibles d’induire une douleur (interventions chirurgicales, prélèvements, injections intratumorales) sont effectués par des opérateurs qualifiés, avec une gestion appropriée de la douleur et un suivi post-opératoire rigoureux. L’étude est interrompue lorsque les critères d’arrêt prédéfinis sont atteints, notamment en cas de volume tumoral excessif ou de signes de détresse, après avis du vétérinaire référent. Les déplacements entre les zones d’hébergement et les espaces expérimentaux sont organisés de manière à préserver la santé et le confort des animaux. Des mesures d’accompagnement, telles que l’analgésie ou un accès facilité à la nourriture, sont mises en œuvre si nécessaire. Toute manifestation de souffrance est évaluée par le responsable du projet en concertation avec le vétérinaire référent et peut conduire, le cas échéant, à une interruption anticipée de l’expérimentation, conformément aux points limites définis dans le protocole et précisés dans la grille de scoring associée.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour ce projet, en particulier les lignées immunodéficientes permettant les allo- et xénogreffes, qui sont des approches de référence en préclinique oncologique. Ces modèles reproduisent de manière fiable des aspects essentiels de la pathologie humaine et offrent une transposabilité pertinente vers la clinique. De plus, les protocoles expérimentaux sont bien établis, standardisés et partagés, ce qui assure la robustesse des résultats et permet de limiter le nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R. Les animaux pourront être mis à l'étude à partir de 6 à 8 semaines d'âge car ils bénéficient d'un système immunitaire et métabolique matures. Ils seront donc commandés à l'âge de 5 semaines pour prendre en compte la phase d'acclimatation.

Toutes tuées pour prélever leurs organes, 800 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation de l'extrémité de la queue pour établir son génotype, puis une injection quotidienne pendant sept jours. Le porteur indique que les souris de plus de 90 jours développent des signes de douleur et choisit pour cette raison d'étudier les stades qui précèdent, à 30, 60 et 90 jours, quand l'atteinte s'installe sans encore se voir. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reconstituent pas la diversité des neurones moteurs et des fibres musculaires associées.

Objectifs

Le système neuromusculaire permet de respirer, marcher, manger, sourire. Les muscles squelettiques et les neurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans nombreuses myopathies d’origine génétique. Dans ce dernier cas les interactions entre les neurones et les fibres musculaires se détériorent conduisant à des défauts de contraction des myofibres. Différents modèles de souris génétiquement modifiées permettent de mieux comprendre les propriétés des différents types de fibres musculaires et de neurones et de leur environnement, et du dialogue entre les neurones et les fibres musculaires. L’objectif principal de cette étude sera de caractériser les interactions nerf-fibres musculaires, d’identifier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’axe neuromusculaire.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre les bases du système neuromusculaire, et d’en comprendre ses atteintes est un enjeu majeur. Cette étude sur la vulnérabilité neuromusculaire devrait aussi permettre de mieux comprendre les bases moléculaires qui contrôlent la formation de l’appareil neuromusculaire, en fonction des muscles étudiés. En effet mieux comprendre les interactions entre neurones et fibres musculaires dans le but de caractériser, grâce à des approches techniques innovantes, de nouveaux gènes qui contrôlent son intégrité est essentiel pour un jour permettre de guérir les malades atteints de défauts nuromusculaires. En conclusion, les études menées amélioreront nos connaissances sur les propriétés de l’axe neuromusculaire, en prenant en compte les neurones, et la fibre musculaire.

Procédures

Sur animaux vigiles : le prélèvement unique d'une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage (5 secondes). L'injection quotidienne sur 7 jours, durée de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Une douleur légère et de courte durée est occasionnée lors de la biopsie de l’extrémité de la queue des animaux en vue de leur génotypage. Une douleur passagère et de courte durée est occasionnée lors des contentions et injection en IP, geste qui dure 30 secondes. Avant 90 jours, les douleurs observées chez les souris sont souvent discrètes et difficiles à évaluer objectivement. À ce stade, l’atteinte motrice initiale peut s’accompagner de légers inconforts musculaires, mais la douleur n’est pas un symptôme majeur ou invalidant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.

Remplacement

Le modèle de souris mime les interactions entre neurones et muscles chez l'homme, et renseigne de manière unique sur le dialogue et les les propriétés de l'interaction nerf-muscle. Les modèles cellulaires ne permettent pas à ce jour de comprendre la diversité de ce dialogue et ne permettent pas de reconstituer la diversité des types de neurones moteurs permettant le mouvement et des fibres musculaires associées.

Réduction

Nous prélèverons le maximum de tissus sur les animaux mis à mort, pour éviter l’utilisation ultérieure de nouveaux lots d’animaux. Les effectifs sont déterminés et les résultas analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Le milieu est enrichi d’une roue d’activité. Les animaux sont surveillés 2 fois par semaine par le porteur du projet. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux de plus de 90 jours développent des signes de douleur, aussi nous nous intéresserons aux stades de dévelopement qui précèdent P90, stades asymptomatiques avant que les animaux développent des signes de douleur. Cette période est instructive car c’est pendant cette période que se met en place progressivement un phénotype. Néannmoins si nous observons des signes de souffrance chez les animaux avant ce stade P90, les animaux recevront une analgésie pendant 48h. Des points limites ont été définis, et en absence d'amélioration les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les muscles et les nerfs moteurs humains sont bien conservés chez la souris, qui est de ce fait un bon modèle. Le modèle de souris permet d’accéder à tous les acteurs qui contrôlent la formation des muscles et des nerfs moteurs associés, sa diversité et sa physiopathologie. Les souris à 30 jours (1 mois), 60 jours (2 mois) et 90 jours (3 mois) sont utilisés pour mieux comprendre le dialogue entre les différents muscles et leurs nerfs moteurs associés.

Pour démontrer le rôle d'un gène exprimé dans des cellules non neuronales du cervelet, deux lignées de souris reproduisant l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l'ataxie de Friedreich sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 souris sont concernées par ce volet. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour injecter un vecteur dans le cervelet, puis des séries de tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, et une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur. 52 femelles sont réutilisées pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres tuées pour prélèvement de tissus. Les tests comportementaux, que le porteur qualifie d'indolores et sans dommage durable, ne sont jamais nommés.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Trois anesthésies générales de deux à deux heures trente en quatre à six jours, une injection de manganèse dans l'abdomen sous endoscopie et trois injections intraveineuses à la jugulaire attendent chaque brebis. 24 brebis au maximum vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur prévoit un effectif majoré "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives", tout en indiquant n'avoir observé aucun effet néfaste du manganèse lors de l'expérience pilote, après avoir rappelé sa neurotoxicité à forte dose chez l'être humain. Les brebis sont tuées sous anesthésie parce que la durée de persistance du manganèse dans leur organisme reste inconnue, ce qui interdit toute réutilisation.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse. Dans le cadre de cet avenant, nous souhaitons réaliser l’acquisition d’images IRM supplémentaires pour 6 animaux à 1 temps long, à 22 jours post administration de manganèse. Pour cela, six brebis seront donc anesthésiées 1 fois de plus, à distance de leur dernière anesthésie. MODIFICATION : NOUS DEMANDONS L'AJOUT DE 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR APPORTER DES PREUVES SOLIDES SUR LA FAISABILITE ET LA RESOLUTION DE LA TECHNIQUE DEVELOPPEE, EN UTILISANT UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE POSITIVE.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.

Procédures

Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute). LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES SUBIRONT 3 ANESTHESIES SUR UNE DUREE DE 6 JOURS. LA 1ERE ANESTHESIE DURERA 30 MINUTES, LES 2 AUTRES 2H. ILS RECEVRONT EGALEMENT UNE INJECTION INTRA-PERITONEALE SOUS ANESTHESIE GENERALE. ILS SUBIRONT 3 INJECTIONS PAR VOIE INTRAVEINEUSE A LA JUGULAIRE POUR INDUIRE LES ANESTHESIES (DUREE TOTALE CONTENTION COMPRISE D'UNE MINUTE).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux. POUR LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES DEMANDES LES CERVEAUX SERONT PRELEVES A L'ISSUE DU PROJET.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM, ET DE PROUVER L'EFFICACITE DE LA TECHNIQUE SUITE A UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE, ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (24 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques). LA MODIFICATION CONCERNE 4 ANIMAUX EXPERIMENTAUX. ELLE PERMETTRA D’APPORTER UNE REPONSE CLAIRE (OUI/NON) SUR LA FAISABILITE DE LA TECHNIQUE TESTEE, SUITE A UNE STIMULATION POSITIVE FORTE. AU COURS DE CE PROTOCOLE, 3 ANESTHESIES SUCCESSIVES SONT PREVUES. LE NOMBRE DE 4 ANIMAUX NOUS PERMETTRA DE NE PAS RE-ENDORMIR UNE BREBIS SI SON REVEIL PRECEDENT A ETE TROP COMPLIQUE.

Raffinement

Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.

192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Un cathéter intraveineux leur est implanté à demeure sous anesthésie, puis ils enchaînent cinquante séances quotidiennes d'auto-administration de cocaïne de trois heures chacune, et dix séances de mesure de choix où des impulsions électriques servent de punition. Le but déclaré est de comprendre comment une consommation répétée devient incontrôlable, pour mieux prévenir et traiter l'addiction chez l'être humain. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test in vitro ou in silico ne permet cette recherche et qu'il n'est donc "pas envisageable d'utiliser des méthodes de substitution à l'animal entier".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie qui se traduit par une perte de contrôle : la personne continue de consommer malgré les conséquences négatives sur sa santé, sa vie sociale ou professionnelle. Cette perte de contrôle n’apparaît pas chez tout le monde, mais peut survenir chez certaines personnes après une consommation prolongée. Elle est due à des interactions complexes entre la drogue et le fonctionnement du cerveau. Pour mieux prévenir et traiter l’addiction, il est essentiel de comprendre ce qui rend certaines personnes plus vulnérables que d’autres. Des recherches suggèrent que la prise répétée de drogue pourrait conduire à des habitudes de consommation qui peuvent devenir pathologiques, si bien qu'une personne continue de consommer même si elle sait que cela lui fait du mal. Cependant, on ne sait pas encore précisément comment ces habitudes peuvent évoluer vers une consommation compulsive, c’est-à-dire incontrôlable. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment la répétition de certains comportements peut conduire à une perte de contrôle. Plus spécifiquement, l’objectif est de vérifier si certains individus sont plus enclins que d’autres à former des habitudes de consommation qui peuvent ensuite devenir compulsives. L’objectif final est de mieux comprendre les mécanismes cognitifs de l’addiction pour pouvoir, à terme, améliorer la prévention et les traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche pourrait permettre de mieux comprendre pourquoi certaines personnes deviennent dépendantes à la drogue et n’arrivent plus à s’arrêter, même si elles en souffrent. En identifiant les mécanismes cognitifs qui transforment une consommation volontaire en une habitude incontrôlable, nous espérons trouver de nouvelles façons de prévenir l’addiction avant qu’elle ne s’installe, et de développer des traitements plus efficaces pour aider les personnes déjà dépendantes.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. Sur animaux vigiles : - 50 sessions d’auto-administration de cocaine (1 session / jour, 3 heures par session,). - 10 sessions de mesure de choix (1 session / jour, 5 minutes par session).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : Chirurgies : inconfort transitoire au réveil ; implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons ; Impulsions électriques légères lors des tests de punition. Stress généré lors des différentes manipulations.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour étudier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la drogue.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 192 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 3 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; balle de jeu) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues/récompenses naturelles qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Neuf tests comportementaux répartis sur deux semaines, deux gavages de glucose, une injection d'insuline, dix-neuf prélèvements de sang et un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures sont infligés à 96 souris génétiquement modifiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu du cæcum. L'étude cherche à établir si le fond génétique modifie la réponse des souris au fructose, étape que le porteur présente comme préalable à une future étude sur les mécanismes d'action. Les neuf tests censés mesurer l'anxiété, l'humeur dépressive et la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

La consommation de fructose a fortement augmenté au cours des dernières décennies, notamment par le biais des produits alimentaires ultratransformés et par les boissons sucrées. Plusieurs études ont montré l’impact négatif de cette surconsommation sur la santé (obésité, diabète de type 2, etc.), troubles de l’humeur (anxiété, dépression). On ne sait pas comment le fructose provoque ces effets néfastes. Dans l’intestin grêle, il est peu absorbé par rapport au glucose. Son excès provoque sa présence en quantités anormales dans le gros intestin et y altère la flore bactérienne. Ce phénomène est amplifié chez près de la moitié de la population qui présente des problèmes d’absorption intestinale du fructose, pathologie encore mal diagnostiquée. Des travaux préliminaires sur la souris montrent que les cellules immunitaires du cerveau sont activées par l’excès de fructose indiquant un état inflammatoire néfaste à long terme. De plus, des tests de comportement révèlent un état dépressif de ces animaux. Mais on ne sait pas si le fructose agit directement sur le cerveau ou/et si ses effets sont la conséquence d’un dysfonctionnement intestinal ou sanguin. Cette étude va nous permettre de déterminer si les différences génétiques ont un impact sur les effets du fructose chez la souris.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’évaluer dans quelle mesure le fond génétique des souris et leurs conditions d’hébergement influencent leur réponse au fructose, tant sur le plan comportemental que physiologique. Ces données sont cruciales pour mettre en place une étude sur les mécanismes d’action du fructose.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des tests de comportement durant 5 à 20 minutes pour permettre d’analyser des comportements émotionnels et de mémoire : 4 tests différents répartis sur 4 jours une semaine (jour de repos le mercredi) et 5 tests différents répartis sur 5 jours une autre semaine. Trois semaines sépareront les 2 semaines de tests. Au cours du protocole expérimental, les animaux vigiles seront soumis à 2 reprises à un test de tolérance au glucose et une fois à un test de résistance à l’insuline. Ils recevront au total 2 gavages de glucose et 1 injection d’insuline pour un suivi de la glycémie pendant 2 heures (glycémie mesurée à 7 et 5 temps différents par prélèvement d’une goutte de sang d’une durée inférieure à 10 secondes, soit un total de 19 prélèvements). Les gavages et injections ne durent qu’une dizaine de secondes, maximum 20 secondes. Les animaux seront mis à jeun 16 heures maximum une fois, et 6h deux fois, une fois 4h, puis 2h en fin de protocole. Un prélèvement sanguin sera effectué une fois, d’une durée d’environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress sur des temps très courts au cours de la contention nécessaire lors des gavages et des prélèvements (moins de 20 secondes). Les animaux seront soumis à un stress durant les tests de comportement (10 minutes maximum). Les animaux seront soumis à une légère douleur lors des prélèvements sanguins. Les souris seront soumises à des périodes de jeûne (16 heures, 6 heures et 4 heures) ce qui n’entraine qu’une diminution modérée de la glycémie et aucune hypoglycémie.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever et analyser certains tissus (cerveau, pancréas, foie, intestin et contenu de caecum).

Remplacement

L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives ne peut être faite que sur des animaux vivants, tout comme l’étude des effets physiologiques d’un changement de consommation alimentaire. Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant les remplacer. Enfin, les analyses tissulaires doivent être réalisées sur des organes entiers qui tiennent compte de l’anatomie réelle qui existe chez les individus, en particulier le cerveau constitué d’un réseau de voies nerveuses encore impossible à reproduire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. D’après de précédentes études, 12 animaux par groupe expérimental semblent nécessaires pour obtenir des résultats rigoureux suite aux tests comportementaux.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, une semaine avant le début du protocole, ils seront habitués à être pris de leur cage au moyen d’un tunnel en plastique et à être manipulés pour les gestes de contention. Un suivi visuel quotidien des animaux sera opéré et leur poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris, qui est un mammifère comme l’Homme. Les tests de glycémie et de comportement sont bien connus chez ces rongeurs et nous pourrons comparer nos résultats à ceux d’études antérieures. Elles seront étudiées à l’âge adulte (10 semaines) pour reproduire la malabsorption intestinale du fructose observée chez l’Homme lorsque la flore intestinale est mature et évaluer leur santé mentale. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés qui seront nécessaires pour la poursuite de notre projet, où le transporteur au fructose sera invalidé spécifiquement dans le cerveau ou l’intestin afin de déterminer si l’effet du fructose est du à son action directe au niveau du cerveau ou à sa malabsorption au niveau intestinal.

1 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une ou deux injections provoquant la présence de bactéries dans le sang, puis cinq prélèvements sanguins étalés sur quatre à dix jours selon la procédure, avant récupération de leurs organes. Le bénéfice annoncé, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques face à la résistance aux antibiotiques, reste au conditionnel, quand les atteintes décrites sont l'inconfort des injections et des prélèvements répétés et une perte de poids liée aux infections. L'effectif de 1 530 animaux tient en une phrase, justifié par des "calculs statistiques" dont le détail n'est pas donné.

Objectifs

Les maladies infectieuses sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde et représentent la troisième cause de mortalité en France, avec un impact sanitaire et économique majeur. Les bactéries dites « pathogènes » sont à l’origine de la majorité de ces maladies, soit par leur simple présence dans les tissus infectés, soit par la production de molécules qui déclencheront une réponse immunitaire. L’inflammation est un mécanisme naturel qui permet à l’organisme de se défendre contre les infections. Mais lorsqu’elle est mal contrôlée ou excessive, elle peut contribuer à des déficits immunitaires et des cancers. Une bonne connaissance des phénomènes de contrôle de cette inflammation est donc indispensable pour la protection de l’hôte contre les microbes. L’objectif de ce projet est d’identifier les systèmes impliqués dans la défense de l’organsime contre l’infection. Une étude de la littérature, ainsi que des résultats préliminaires obtenus in vitro sur cellules, ont mis en évidence le rôle de certaines protéines dans la réponse immunitaire contre les bactéries. Nous souhaitons donc confirmer le niveau d’implication de ces protéines dans la bactériémie (présence de bactéries dans le sang) induite chez la souris.

Bénéfices attendus

Du fait de l’étendue actuelle et à venir de la résistance aux antibiotiques, le développement de nouveaux médicaments dans le traitement des maladies infectieuses est crucial. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu dans ces échanges entre l’hôte et le pathogène devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles pour de nouvelles applications thérapeutiques dans la prise en charge des patients atteints d’infections bactériennes.

Procédures

Les animaux subiront des injections : selon les procédures 1 injection, ou 2 injections espacées de 15 jours. Ils subiront également des prélèvements sanguins à différents temps post injection : 5 prélèvements étalés sur 4 jours ou 5 prélévements étalés sur 10 jours en fonction de la procédure. La durée de chaque intervention n’excède pas une dizaine de secondes. A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : un léger inconfort produit par les injections intra-veineuses et les prélèvements de sang répétés, et une perte de poids possible liée aux infections.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette demande seront infectés, et leurs organes récupérés après leur mise à mort. Ils ne pouront donc pas être réutilisés.

Remplacement

Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro afin d’identifier au préalables les acteurs du dialogue entre la bactérie et l’hôte. Ces résultats doivent maintenant être confirmés in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet est basé sur des calculs statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats robustes et fiables.

Raffinement

Après infection et/ou toute intervention, ils seront surveillés quotidiennement par les responsables du projet afin de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection. Le cas échéant les animaux seraient plus particulièrement surveillés et si les symptômes se prolongeaient au-delà de 24 heures, les animaux concernés seraient mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude pertinent de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la drosophile aux mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Marquées avec des perles de couleur, soumises deux fois par jour pendant un mois à un courant de 50 cm/s, puis injectées de puromycine et tuées vingt-cinq minutes plus tard : 60 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de relier l'exercice de nage à l'activité des cellules à l'origine des fibres musculaires, avec des recommandations attendues pour les pisciculteurs sur la gestion du débit d'eau en élevage. La description des atteintes ramène l'effort à un courant intense de dix minutes, quand le protocole annonce deux séances quotidiennes sur un mois. Les truites sont tuées pour prélever muscle et foie, et le porteur précise que des échantillons de ces mêmes individus alimenteront un autre projet.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est d’évaluer chez les poissons les effets de l’exercice physique sur les cellules à l'origine des fibres musculaires— en termes d’activité et de nombre — et de les relier aux variations de taille et de nombre des fibres musculaires. Nous pourrons également déterminer dans quelle mesure l'activité physique chez la truite altère l'activité respiratoire des cellules et la production des protéines, et étudier le lien entre ces deux processus.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, il sera possible de déterminer si l’exercice appliqué durant la phase exponentielle de croissance influence l’activité des cellules nécessaires à la formation des fibres musculaires, lesquelles jouent un rôle déterminant dans le potentiel de croissance ultérieur des animaux. Par ailleurs, les connaissances acquises permettront d’élaborer des recommandations à destination des pisciculteurs concernant la gestion du débit d’eau dans les systèmes d’élevage, dans le but d’optimiser la croissance musculaire et la qualité des produits.

Procédures

Après un marquage externe à l'aide de perles de couleur, 20 animaux seront soumis à un courant d'eau de 50 cm/s, 2 fois par jour, pendant 1 mois. Ensuite les animaux seront injectés avec de la puromycine puis euthanasiés 25 min plus tard pour réaliser des prélèvements de tissus (foie et muscle).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un courant intense (50cm/s) pendant 10 minutes, ce qui peut induire un stress transitoire. Bien que cet effort soit intense, il est de courte durée, et les animaux devraient s'habituer à ce changement soudain de courant.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puisque nous devons prélever des échantillons de muscle et de foie pour des analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de déterminer l'impact des de l'exercice sur la plasticité des cellules nécessaires à la formation in vivo de fibres musculaires, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons construit un couloir de nage de petite taille pour maintenir une densité optimale et un effectif de 30 poissons/bac pour éviter les comportements agressifs. Avec cette quantité, nous pouvons prélever 20 poissons à chaque prélèvement ce qui est suffisant pour atteindre les objectifs scientifiques de l'étude et détecter des différences de plasticité des cellules souches musculaires. Par ailleurs, des échantillons de ces mêmes animaux seront utilisés dans le cadre d'un autre projet, évitant ainsi l'utilisation d'animaux additionnels.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans un environnement optimal pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité). Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, pH) seront également régulièrement contrôlés. L’ensemble des transferts et manipulations sera réalisé dans les plus brefs délais afin de limiter au maximum la durée d’émersion et le stress induit par la capture. Le marquage des animaux et les injections seront réalisés sous anesthésie. Les dispositifs expérimentaux seront installés à proximité immédiate des bassins d’élevage afin de réduire les temps de transfert. Une grille d'évaluation du bien-être animal a été mise en place et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance. Nous allons utiliser des poissons de 10g car c'est durant cette période que la croissance est exponentielle et avec la plus grande plasticité.

Pour construire un atlas vasculaire cérébral et automatiser le recalage entre imagerie par résonance magnétique et imagerie ultrasonore, 66 rats de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure d'IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter veineux, puis, vingt-quatre à soixante-douze heures plus tard, une chirurgie d'amincissement du crâne suivie sans réveil de l'imagerie ultrasonore, jusqu'à trois heures en tout. Une partie des rats reçoit en plus une injection de lipopolysaccharide dans le cerveau, pour provoquer une inflammation locale. La méthode sera mise à disposition des utilisateurs de la plateforme d'imagerie, et le porteur indique que des animaux de réforme pourront servir à la mise au point des protocoles.

Objectifs

L’imagerie ultrasonore ultrarapide est une technique récente d’imagerie qui permet d’étudier l’activité cérébrale, grâce à la mesure des changements de volume sanguin dans les vaisseaux qui irriguent le cerveau. En combinaison avec un agent de contraste ultrasonore (sous forme de microbulles injectées dans la circulation, la technique permet de créer des images haute résolution de la microcirculation. Cependant ces images offrent un contraste uniquement vasculaire, sans autre repère anatomique que les vaisseaux intra-cérébraux dans le champ de vue de la sonde ultrasonore. L’acquisition comme l’analyse de ces images requiert de pouvoir repérer les régions anatomiques cérébrales depuis un référentiel, qui ne contient en général aucune information vasculaire. Actuellement la méthodologie d’analyse des données ultrasonores reste très insatisfaisante car l'alignement des images vasculaires avec les images anatomiques (obtenues en IRM) est réalisé manuellement, avec un contrôle visuel de leur adéquation. C'est une source d'imprécision majeure dans la quantification des données. L’objectif est donc de développer une méthodologie robuste, reproductible et automatique de recalage des modalités d’imagerie ultrasonore et IRM.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un développement méthodologique qui permettra d’exploiter de manière plus fiable les données d’imagerie cérébrale ultrasonore acquise chez le rat. Plus généralement, l’intégration de cette modalité, qui permet l'enregistrement de l'activité cérébrale chez des animaux anesthésiés mais aussi vigiles, dans des projets exploitant l’imagerie médicale, sera facilitée. La méthodologie de recalage des modalités d’imagerie du cerveau par résonance magnétique (IRM) et ultrasonore (fUS/ULM) sera mise à disposition de tous les utilisateurs de la plateforme, et pourra, le cas échéant, être adaptée à la souris. Enfin une nouvelle classe d’agents de contraste ciblés sera évaluée, ouvrant la voie à une imagerie ultrasonore moléculaire, ce qui constituerait une nouveauté scientifique. A terme, cette technique d’imagerie pourra être utilisée pour l’évaluation de nouveaux agents de contraste ou médicaments à visée humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une session d’imagerie par résonance magnétique (1 heure au maximum), sous anesthésie générale, avec pose d’un cathéter veineux. Entre 24h et 72h après, ils subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, nécessaire pour l’imagerie ultrasonore, qui sera réalisée dans la foulée (3 heures au maximum, pour l’ensemble, sans réveil de l’animal), avec pose d’un cathéter veineux. En outre certains animaux, auront préalablement subi une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale, réalisée 24 à 72h avant la première session d’imagerie. Le délai minimal entre chaque session (imagerie ou chirurgie) est de 24h, le délai maximal est porté à 72h pour tenir compte du week-end.

Impact sur les animaux

L'injection intracérébrale peut entraîner une douleur locale ainsi qu’une gêne transitoire susceptible d’affecter temporairement la prise alimentaire. L’induction de l’anesthésie par voie gazeuse peut être source de stress pour les animaux. Il sera nécessaire de poser un cathéter veineux caudal afin d’administrer des produits de contraste, ce qui constitue une source supplémentaire d’inconfort ponctuel. Préalablement à l’acquisition des images en ultrasons, les animaux subiront une chirurgie consistant en un amincissement du crâne, susceptible d’entraîner des douleurs.

Devenir

Mise à mort

Remplacement

Les développements méthodologiques en imagerie cérébrale doivent être réalisés sur des animaux vivants. En effet, seule l’expérimentation in vivo permet de tester et de valider ces approches dans des conditions physiologiques réelles, où interviennent des paramètres tels que la circulation sanguine, la respiration, l’activité cérébrale et les réactions biologiques de l’organisme.

Réduction

Des animaux de réforme pourront être utilisés pour la mise au point des protocoles d’imagerie. Des animaux de même âge et poids seront utilisés pour la construction de l'atlas vasculaire cérébral, et chaque animal sera mis à profit de manière optimale en subissant à la fois un examen d’imagerie IRM et ultrasonore. Ceci limite considérablement la variabilité et donc le nombre total d’animaux nécessaire. Pour l'évaluation de nouveaux agents de contraste "intelligents" ( car ciblant des protéines particulières), des groupes expérimentaux réduits au minimum (3-4 animaux) seront utilisés pour mener une comparaison exploratoire entre les deux modalités d’imagerie.

Raffinement

L’imagerie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lors de l’induction de l’anesthesie, une lampe infrarouge est utilisée pour réchauffer la boite et limiter la perte de température corporelle. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse, avec supplémentation en oxygène, un traitement anti-douleur adapté, une thermorégulation continue, une hydratation sous-cutanée, et un monitoring respiratoire. Les groupes sociaux sont conservés (pas d'isolement en dehors de la période d'anesthésie). Le modèle animal d’inflammation cérébrale locale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que d’autres modèles inflammatoires aigus (comme ceux mimant un accident vasculaire cérébral ou une sclérose en plaques). De plus les méthodes d’imagerie ciblées apportent une grande sensibilité de détection, ce qui permet de limiter à la fois la quantité de LPS injecté et la durée de suivi longitudinal.

Choix des espèces

Les développements méthodologiques visés utilisent des appareils d’imagerie dédiés aux rongeurs. Le projet est mis en oeuvre chez le rat, pour bénéficier d’une imagerie cérébrale mieux résolue en raison de la plus grosse taille de cerveau en comparaison avec la souris. La méthodologie sera entièrement adaptable chez la souris, si besoin. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte, l’os crânien suffisamment développé et robuste, et le poids suffisant (250-300g) pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.