Recherche fondamentale

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs foies soient collectés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées et le développement de tumeurs du foie, par groupes de dix. Une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de carcinome hépatocellulaire est annoncée au conditionnel et à terme, quand l'objectif immédiat est de caractériser une protéine et de tester des anticorps qui la bloquent. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne répond de façon fiable à ces questions et minimise l'atteinte en décrivant le foie comme un tissu "peu sensible (peu innervé)".

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire est la principale forme de cancer du foie. Il est particulièrement agressif et cause chaque année environ 800 000 décès dans le monde. Lorsque la chirurgie n’est plus possible, les traitements actuels restent souvent insuffisants : même si l’immunothérapie a marqué un progrès, seul un patient sur trois y répond durablement. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles approches. Notre projet s’intéresse à une protéine présente à la surface des cellules et impliquée dans la croissance des tumeurs du foie. Des anomalies génétiques augmentant l’activité de cette protéine sont retrouvées chez 10–15 % des patients et sont associées à un moins bon pronostic. Cette protéine est encore peu étudiée, mais nos partenaires académiques ont mis au point des anticorps capables de la bloquer. L’objectif est double : (1) comprendre le rôle précis de cette protéine dans l’apparition et l’évolution du cancer du foie à l’aide de modèles pertinents ; (2) évaluer des anticorps ciblant cette protéine comme candidats médicaments, afin de vérifier s’ils freinent la croissance tumorale. À terme, ces travaux pourraient ouvrir une nouvelle piste thérapeutique pour des patients aujourd’hui sans alternative efficace.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats qui éclaireront comment certaines cellules du foie deviennent cancéreuses, avec des enseignements possiblement utiles à d’autres cancers. Le projet devrait préciser le rôle de la protéine étudiée et valider dans nos modèles un anticorps contre cette protéine comme agent thérapeutique capable de ralentir la croissance tumorale. En parallèle, nous viserons l’identification d’un marqueur sanguin simple permettant de repérer les patients les plus susceptibles de répondre, pour aller vers une médecine plus personnalisée. À court terme, les retombées incluent des publications et des outils biologiques partagés ; à moyen terme, ces données pourraient ouvrir la voie à une évaluation clinique précoce et à de nouvelles options thérapeutiques pour des patients aujourd’hui sans alternative efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris), ou bien à une injection de solution saline contenant de l’ADN (30 secondes par souris). Des produits permettant l’imagerie des tumeurs seront injectés avant acquisition des images, et pour certaines souris du sang sera prélevé de manière hebdomadaire.

Impact sur les animaux

Les effets sont le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal,l’injection des produits, et une gêne possible liée à la cicatrice. Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies pour les analyses liées au projet.

Remplacement

Notre objectif est de caractériser in vivo les effets cancereux de la protéine PZR et d’évaluer des anticorps dirigés contre ce récepteur. Nous avons réalisé le plus d’expériences possible sur cellules en culture, ce qui nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux (principe de remplacement). Cependant, pour tester efficacement ces anticorps comme nouvelle option thérapeutique et vérifier leur impact réel sur la formation et la croissance des tumeurs, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes et la réponse globale de l’organisme ne peuvent pas être entièrement reproduits en culture. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de répondre de manière fiable à ces questions. Cette étape in vivo est donc nécessaire ; dès que les informations clés auront été obtenues dans ce modèle, nous reviendrons aux lignées cellulaires pour affiner et prolonger nos analyses

Réduction

Nous avons tout mis en œuvre pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet. En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en limitant à la fois le nombre de cellules testées et le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi une anesthésie plus légère, réduit la durée de la chirurgie et utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Les solutions injectées sont préchauffées. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

425 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent un traitement de superovulation, subissent une anesthésie de trois minutes avec un risque d'hypothermie, puis sont tuées pour que leurs ovules soient récoltés. L'objectif déclaré est de comprendre le rôle d'un gène de la méthylation de l'ADN dans le développement embryonnaire précoce, dont l'absence réduit le réservoir ovarien et rend les femelles stériles. Le porteur affirme qu'aucun protocole ne permet d'étudier ce développement in vitro à partir d'ovules fécondés.

Objectifs

La méthylation de l'ADN est une modification chimique pouvant réguler l’expression des gènes sans modifier la séquence d’ADN. Ces modifications chimiques sont des groupements « méthyles » qui peuvent être ajoutés sur l’ADN et qui peuvent modifier la manière dont est perçu l’information génétique. Nous pourrions comparer la méthylation de l’ADN à la ponctuation d’une phrase. Prenez par exemple la phrase : « On va manger, mami ! ». Si vous enlevez la virgule et remplacer le « ! » par une « . » la phrase n’a plus du tout la même signification (On va manger mami.). Chez les mammifères, la méthylation de l’ADN peut induire une répression stable des gènes de façon réversible. En effet, il est important d’exprimer les gènes embryonnaires au bon stade du développement et pas à l’âge adulte. Ainsi, cette modification a des fonctions régulatrices importantes au cours du développement embryonnaire et gamétique et est transmise à travers les générations. Une altération de ces profils de méthylation est observée dans les cadres de cancers et autres maladies. L’objectifs de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’un nouvel acteur de la méthylation de l'ADN sur le développement embryonnaire précoce. En effet, des résultats préliminaires démontrent que son l’absence de ce gène conduit à une hypofertilité chez les femelles avec une réduction du réservoir ovarien ainsi qu’une stérilité (pas de naissance). Les données obtenues au cours de ce projet pourront avoir des retombées pour mieux comprendre l’infertilité humaine puisque ce gène est conservé chez l’être humain.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre le rôle d'un gène dans le développement des ovocytes et de mettre en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires qui régulent la fertilité et le développement embryonnaire chez la souris. L’objectif final de ce projet est de transposer nos résultats à l’homme dont les problèmes d'infertilité sont en constante augmentation et constituent un enjeu de santé publique majeur. En effet, ce gène étant conservé chez l’être humain, il serait envisageable d’utiliser ce dernier soit comme outils de diagnostic, soit comme nouvelle cible thérapeutique dans le cadre de la procréation médicalement assistée pour des maladies tel que l’IOP (Insuffisance ovarienne prématurée, prévalence de 1/10 000 chez les femmes de moins de 20 ans, 1/1 000 chez les femmes de moins de 30 ans et 1% chez les femmes de moins de 40 ans).

Procédures

Les animaux recevront deux injections espacées de 48h sous anesthésie. L'injection dure environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Il y a un risque d’hypothermie des animaux bien que l’anesthésie soit de courte durée (~3min).

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les ovules.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de protocole pour étudier le développement embryonnaire in vitro à partir d’ovules fécondés. C’est pourquoi nous effectuerons nos expériences sur des échantillons primaires isolés de souris.

Réduction

Le protocole de superovulation permet de stimuler la production d'ovocytes et donc de réduire le nombre de femelles utilisées. L’utilisation du protocole de culture in vitro d’embryons à la suite du protocole de superovulation permet d'étudier tous les stades de développement embryonnaire précoce et tardif simultanément pour un nombre significatif d’embryons. Ceci limite fortement le nombre de femelles utilisées par rapport à une approche in vivo qui nécessiterait de sacrifier des femelles à chaque stade de développement embryonnaire.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupe dans des cages aux normes européennes et enrichies (maison, tube en carton, bâton en bois, frisures en carton pour la nidification…). Les enrichissements permettront : -de réduire le stress des animaux au cours de l’élevage en répondant à leur besoin de nidification et de cachette (maison, tube, frisures en carton) -de combler leur besoin de ronger/user leur dent afin de palier à la croissance continue de leurs incisives (bâton en bois) L’environnement et le bien-être des animaux seront vérifiés quotidiennement. Nous avons également établi des points limites afin d’atténuer la souffrance ou/et le stress des animaux. Dès lors que nous observerons un point limite, en fonction du degré de sévérité et de sa durée, soit nous soignerons l’animale, soit nous le mettrons à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce est justifié par les éléments suivants : (i) La méthylation de l’ADN est absente chez les modèles invertébrés tels que la levure, la drosophile (mouche du vinaigre) et le nématode (ver), (ii) les fonctions biologiques sont très conservées entre la souris et l’homme. (iii) la souris offre de nombreux modèles génétiques déjà existant, ce qui justifie son utilisation comme modèle d’étude. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des souris femelles âgées de 4 semaines pour la récolte d’ovules car il s’agit de l’âge auquel les femelles répondent le mieux à la stimulation hormonale.

Pour cribler jusqu'à douze candidats médicaments par cible et sur trois cibles au maximum, 6 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines par injection dans la veine de la queue sur animal vigile, un poinçonnement auriculaire sans anesthésie, puis des prélèvements sanguins une à deux fois par semaine et un prélèvement de moelle osseuse deux fois par mois. Le porteur fixe la mise à mort à 80 % de cellules humaines détectées dans le sang ou à 20 % de perte de poids. Le criblage doit aboutir à un candidat principal mené en développement réglementaire et à une estimation de la dose pour la première injection chez l'être humain.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données d’efficacité antitumorale lors d’administration par voie intraveineuse de candidats médicaments de thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC), dans des souris immunodéficientes porteuses de xénogreffes de lignées cellulaires leucémiques humaines. Ces composés étant majoritairement cross-réactifs humains/souris avec le même profil d’expression dans les deux espèces), les résultats chez la souris permettront de modéliser l’efficacité chez l’humain. Ces données d’efficacité en escalade de dose permettront d’effectuer une étude de criblage de candidats médicaments en fonction de leur cible, de leur niveau d’expression et des indications thérapeutiques pertinentes. Ces données permettront de sélectionner un candidat principal à mener en développement réglementaire et de contribuer à l’évaluation les doses minimales efficaces antitumorales (MED) pour la première injection chez l’homme. Ce projet est divisé en 2 procédures consécutives et interdépendantes pour chaque cible (répétables jusqu’à 3 cibles) : # Procédure-1 : Consiste en une Tumorogénèse sur différents modèles de xénogreffe tumorale issue de lignée cellulaire cancéreuse humaine (CDX – jusqu’à 10 modèles). Différents protocoles de la littérature seront testés en termes d’expression de la cible, de dispersion des courbes de croissance et d’homogénéité de croissance tumorale. # Procédure-2 : A l’issue des procédures de mise au point et de sélection des modèles CDX en termes de croissance tumorale, cette deuxième procédure (cœur du projet), consiste à cribler différents candidats médicaments (jusqu’à 12 par cible), en face de contrôles positifs et négatifs, à différentes doses et fréquences, sur 1 à 5 modèles CDX validés et sélectionnés précédemment.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble vise à développer de nouvelle thérapie ciblée à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques (poumon, tète et cou, colorectal, utérus, ovaire, pancréas, leucémies…), tout en minimisant les effets secondaires et représente l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Cette étude permettra ainsi d’évaluer la dose minimale efficace antitumorale (MED), qui, en comparaison avec la dose maximum tolérée (MTD - étude séparée), définiront les bornes de la fenêtre thérapeutique. Ces études permettront ainsi de cribler les molécules sur leur fenêtre thérapeutique la plus grande et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser dans les modèles pré-cliniques et cliniques. La première procédure permettra de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La deuxième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans la procédure précédente.

Procédures

# Après une semaine d'adaptation à l'environnement, les souris seront identifiées : - Soit par poinçonnage auriculaire sur souris vigiles (2-3 minutes si moins de 100 souris). - Soit par puçage électronique (injection sous-cutanée sous capsulaire du transpondeur), sous anesthésie gazeuse (4-6 minutes). # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Des échantillons de sang périphérique seront prélevés 1 ou 2 fois par semaine. Chaque prélèvement de sang cumulé ou non retirera en fonction du poids de la souris un volume qui n’excédera pas la limite de 7.5% du volume sanguin total par semaine glissante (2-3 minutes). Ces échantillons de sang pourront être analysés NFS et/ou en cytométrie de flux pour évaluer l’évolution de l’infiltration blastique. De manière plus précise, prélèvements sanguins, de préférence par micro-échantillonnage ou par échantillonnage classique (veine caudale, sinus submandibulaire ou SRO). Des prélèvements de moelle osseuse en intra-fémoral seront également réalisés, sous anesthésie générale gazeuse en alternant les sites de prélèvements entre patte arrière gauche et droite, à un intervalle de deux semaines et à une fréquence d’un prélèvement par patte (J Vis Exp. 2014 Jul 5;(89):51660. doi: 10.3791/51660). Une dose préventive de buprénorphine avant la procédure, à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée toutes les 6 à 12 heures, peut être utilisée pour prévenir la douleur associée à la procédure, en complément du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée pourra être utilisé. Les souris prélevées en intra fémoral sont ensuite anesthésiées (induction de l’anesthésie dans la boîte à 3% d’isoflurane et 3% d’oxygène puis entretien de l’anesthésie au masque à 2-2,5% d’isoflurane et 2% d’oxygène) (6-8 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort. Une nécropsie ainsi qu’un prélèvement d’organes / tumeur pourront être réalisés post-mortem sur les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que sur les animaux arrivant en fin d’expérience. En cumule toutes ces manipulations ne dureront pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésie (s'il y a lieu - puçage électronique). Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la numérotation sur animal vigile par poinçonnement auriculaire, (2) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection intraveineuse dans la veine caudale ainsi que lors (3) de l’injection par intraveineuse dans la veine caudale sur souris vigiles des candidats médicaments et (4) lors du prélèvement sanguin sur animal vigile et de moelle osseuse sous anesthésie. De façon plus particulière à cette étude (basée sur des modèles de souris dépourvues de système immunitaire et greffées en injection intraveineuse avec des cellules tumorales humaines - CDX), ces animaux seront suivis pour la croissance tumorale 1 à 2 fois par semaine par prélèvement sanguin et 2 fois par mois par prélèvement de la moelle osseuse, pour mesurer et analyser la tumeur et l'état général des animaux. Cette surveillance sera renforcée à l'approche des points limites. Les souris ayant un % de hCD45 de plus de 80% seront mises à mort par dislocation cervicale ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique (CO2).

Devenir

Pour chacune des deux procédures: - Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés.

Remplacement

Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ces candidats médicaments anticancéreux (efficacité, stabilité dans les sérums, internalisation/vectorisation dans cellules tumorales), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique physiologique complexe est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » dans les conditions d'injection par voie intraveineuse afin d’appréhender la dose minimale efficace anticancéreuse (MED) normalisées sur les données d’exposition pharmacocinétiques (PK). S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant majoritairement cross-réactif entre la souris et l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle murin. Également, l’implantation des cellules tumorales par voie intraveineuse est primordiale à évaluer. En effet, ces cellules sont nichées dans une matrice extracellulaire riche en molécules allant de différents métabolites et d’espèces réactives d’oxygène jusqu’à plusieurs facteurs inflammatoires, comme c’est notamment le cas de la niche ostéo-médullaire chez les patients atteints de leucémie. L’ensemble de ces acteurs cellulaires et moléculaires sont soumis à des contraintes mécaniques et à des niveaux d’oxygénation différents d’une localisation à une autre au sein de la même niche. Ainsi, l’étude d’efficacité de médicaments ciblant des cellules notamment leucémiques exige le maintien des interactions qu’il peut y avoir entre ces cellules et leur environnement, et ceci ne peut être assuré in vitro.

Réduction

La procédure-1 permettra de mettre au point les modèles et de les caractériser au mieux grâce à une tumorogénèse couplée à une étude d'efficacité, toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). Seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors de ces procédures de mise au point (tumorogénèse et étude pilote) seront utilisés par la suite. La procédure-2 s’effectue également sur un nombre limité d’animaux (qui sera adapté à la baisse en concertation avec notre structure bienêtre animal, en fonction des résultats obtenus lors de la procédure 1).Egalement, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau (Q7D x1, x2 ou x3), permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés en testant jusqu’à deux doses pour la même molécule, au plus près des résultats biologiques. L'analyse statistique des résultats obtenus par les différentes expériences se fera au moyen de tests de Student et de Mann-Whitney (comparaison de deux groupes) ou d'analyses des variances (comparaison de plusieurs groupes), et de Kaplan-Meier (analyse de survie). L'analyse du nombre minimum d'animaux à utiliser pour répondre à chaque objectif avec une puissance statistique suffisante a été implémentée grâce au logiciel G*Power (critères de calcul : effectifs d'animaux équivalents entre chaque groupe, two-tailed, alpha = 0.05). Ce nombre sera de 10 souris par groupe, et a été estimé afin de générer des résultats significatifs en restant en accord avec la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4/5 dans des cages transparentes, aux dimensions adaptées, avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels…). Les conditions sanitaires permettent que leur phénotype ne soit pas dommageable (SPF). Une période de stabulation d’au moins 7 jours avant le début du protocole permettra leur acclimatation afin de réduire le stress des animaux. L’identification des souris sera effectuée sous anesthésie gazeuse si besoin pour le puçage électronique ou par poinçonnage auriculaire. Une surveillance comportementale/physiologique poussée des animaux et la définition d’une grille de score adaptée suffisamment prédictive, permettront de prévenir toute souffrance animale. Concernant les souris ayant reçu les cellules tumorales via injection intraveineuse, l’utilisation d’une technique d'imagerie non invasive ou des prélèvements de sang 1 à 2 fois par semaine sans anesthésie sera effectué pour suivre la croissance tumorale. Les prélèvements resteront dans la limite de 7,5% du volume sanguin total par semaine glissante. Aussi, 2 fois par mois, un prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie sera effectué pour suivre le développement leucémique et la charge tumorale. Les animaux auront reçu une dose préventive de buprénorphine avant la procédure (à raison de 0,05–0,1 mg/kg par voie sous‑cutanée pouvant être répétées toutes les 6 à 12 heures). En plus, pour prévenir la douleur associée à la procédure e plus du carprofène à 5 mg/kg par voie sous‑cutanée, pourra être utilisé. Cela permet de déterminer le plus précocement possible le début du traitement et de la réponse. Le pourcentage limite de 80% de détection de hCD45 dans le sang et perte de poids de 20% constitueront des points limites. Un système de surveillance 7/7 est mis en place au sein de l'EU pour le suivi des animaux. Les animaux inclus dans la grille de score n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés dès que nécessaire (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience sont mis à mort par dislocation cervicale si besoin sous anesthésie gazeuse ou par augmentation progressive de la concentration en gaz carbonique. Afin de s’assurer de la mort effective des animaux, une vérification de la mort (prise de pouls …) sera effectuée.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Afin d’étudier les effets de candidats médicaments sur des xénogreffes de tumeurs humaines (CDX), dans un contexte physiologique, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données allométriques permettant de transposer ces données chez l’Homme). Enfin, les candidats médicaments étudiés dans ce projet pouvant être cross-réactif entre la souris et l’humain, aucune alternative ne peux se substituer à un modèle murin. Les animaux immunodéprimés (portant la mutation Nude ou SCID et de fond génétique choisi en cohérence avec le modèle tumorale décrit dans la littérature), seront livrés à partir de 7 semaines de développement et inclus en expérience après 7 jours d’acclimatation dans l’EU. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant une allométrie pertinente par rapport aux thérapies médiées par des anticorps. Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos conditions d’hébergement et d’expérimentation (animalerie SPF et expérimentation sous PSM).

Infectées par le virus de la grippe directement dans la mamelle ou par une seconde voie d'administration, 12 brebis en lactation développent une inflammation mammaire et une montée de température. Elles portent un capteur télémétrique implanté par une petite chirurgie et sont traites deux fois par jour pour rester en lactation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de projet, du fait de l'infection expérimentale. Le porteur justifie six animaux, trois par lot pour deux souches ou deux voies d'inoculation, et prévoit de recommencer l'infection en l'absence de signes, sans expliquer d'où viennent les six autres brebis déclarées.

Objectifs

Contexte et objectif : Jusqu'à récemment, les ruminants n'étaient pas considérés comme des hôtes sensibles aux virus de la grippe aviaire. Cette vision a toutefois changé à la suite d’études récentes faisant état d'infections par le virus de la grippe aviaire hautement pathogène chez des vaches laitières aux États-Unis. Ces infections se caractérisent par une réplication virale massive dans la glande mammaire, entraînant une propagation du virus au sein des troupeaux et entre ceux-ci, ainsi qu'une transmission de la vache à l'homme par le lait infecté. Un cas d'infection par le virus chez une chèvre a également été documenté aux États-Unis début 2024. Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux aviaires présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. Cependant, le tropisme viral pour la glande mammaire, ainsi que les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire des mamelles des ruminants aux infections par le virus grippal aviaire, sont mal compris. Pour répondre à ces questions, cette proposition rassemble l'expertise de cinq équipes dans le but de : 1/ Évaluer la capacité de souches du virus Influenza A faiblement pathogène à infecter de manière productive les cellules épithéliales mammaires primaires ovines; 2/Mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin afin d'étudier les intéractions entre le virus de la grippe et son hôte, ainsi que les défenses antivirales dans la glande mammaire des ruminants. La demande d’autorisation de projet formulée ici concerne donc le point 2.

Bénéfices attendus

Le consortium bénéficiera du partage des connaissances, des outils et des ressources afin d'anticiper le développement de solutions pour un problème émergent en matière de santé animale. Ce projet représente également une opportunité pour les équipes disposant de compétences complémentaires de nouer des collaborations et de produire des travaux préliminaires qui pourraient ouvrir la voie à des projet scientifiques plus ambitieux. Il sera tiré parti de ce projet pour mettre en œuvre et valider des modèles d'infection par Influenza chez les petits ruminants qui pourront être mis à disposition des scientifiques et d’autres parties prennantes du secteur de la santé animale. La mise en œuvre de ce projet représente ainsi une précieuse opportunité de formation pour le personnel. Enfin, le programme scientifique proposé de tester de nouveaux outils de surveillance clinique chez les moutons (capteurs de température et caméra thermique infrarouge) et de mettre en place un modèle animal original (et plus abordable) pour reproduire les infections par le virus chez les bovins ou d'autres ruminants, qui pourrait être exploité pour le dépistage de vaccins/traitements.

Procédures

Pose des capteurs télémétriques : 20 minutes par animal 2 voies d'infection : 5 minutes par animal Prises de sang : 5 minutes par animal Ecouvillons nasaux : 1 à 2 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis soit à une administration de deux souches de virus, dans un des deux quartiers sous contention, soit à deux voies d'administration d’une souche de virus, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes attendus sont une inflamation localisée de la mamelle accompagnée d’une montée en températue localisée ou systémique. Il peut y avoir un stress supplémentaire lié aux des différentes interventions (traite ou contention pour observation clinique).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet, étant donné qu’ils seront soumis à une infection expérimentale.

Remplacement

Travail in vitro : depuis plus de 20 ans, des études ont été réalisées in vitro pour mieux comprendre les mécanismes de défense de la mammelle des ruminants. Au vu de la complexité des mécanismes de la réponse immunitaire, pas reproductibles en laboratoire, la mise au point du modèle doit être réalisée chez l’espèce cible(la brebis, dans ce cas particulier). Concenant la pertinance des modèles murins comme modèle, des différences majeures entre les cycles de lactation chez les rongeurs et chez les ruminants sont amplement décrites dans la littérature. Ces différences limitent l’utilisation de la souris pour aborder des questions précises, comme la réponse innée de la mamelle contre les infections. Outre les principales différences entre la souris et la brebis, il est pertinant de souligner que chez la souris, au retrait des souriceaux, la glande mammaire entre en tarissement/involution. Ainsi, la souris doit continuer d’allaiter afin de maintenir ses glandes mammaires en lactation. Lors des infections expérimentales, la présence de souriceaux genererait leur infection par l’ingestion du lait contaminé et rendrait l’étude inviable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un criblage in vitro de souches sera réalisé afin de tester leurs capacités à se répliquer de manière productive dans des cellules épithéliales mammaires primaires ovines. Les résultats de ces travaux permettront ainsi de réduire le choix à 1 ou 2 souches qui seront utilisées dans les infections in vivo. Le projet visant à mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin, nous estimons qu’il faut à minima 3 animaux par lot pour tester soit 2 souches virales, soit 2 voies d’inoculation, donc 6 animaux au total. Etant dans une démarche de preuve de concept, nous prévoyons de pouvoir reconduire l’infection au bout de quelques jours si nous ne constatons pas de signes d’infection lors de la première série d’inoculations. Ce projet constitue une étude pilote visant à évaluer pour la première fois la faisabilité du modèle expérimental proposé. Compte tenu de la taille limitée des effectifs, aucune analyse statistique n’est envisagée. Des analyses comparatives des paramètres avant et après infection seront effectuées pour chaque animal et les données individuelles seront présentées sous forme de graphiques de dispersion, afin de visualiser la variabilité interindividuelle et d’évaluer la cohérence des réponses observées. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la mise en œuvre pratique du modèle, sa tolérance par les animaux et la pertinence des procédures expérimentales, afin d’ajuster si nécessaire le protocole avant toute étude ultérieure de plus grande ampleur

Raffinement

A partir de la période d'acclimatation, les brebis seront équipées d’un dispositif télémétrique afin de suivre la température corporelle, dispositif couramment utilisée dans nos installations. Une petite chirurgie sera necessaire pour l’implantation du capteur sur la brebis. Les données de température seront transmises à une base positionnée à proximité des animaux. Cette base est équipée d’un écran pour permettre de relever les températures enregistrées. Elle pourra également être connectée ultérieurement à un système informatique pour récupérer l’ensemble des données de températures acquises tout au long du projet. Ces données permettront de visualiser très précisement les changements de température liés à l’infection. La technologie de thermographie infrarouge (caméra thermique) sera testée pour assurer le suivi de l’inflammation et de la température au niveau de la glande mammaire. Cette approche serait une alternative moins invasive et moins contraignante pour les animaux. En effet, lors d’une mammite, une augmentation de la température au niveau local est attendue et pour l’analyser, nous devons utiliser des approches complémentaires comme la thermographie infrarouge. Cette analyse nous permettra ainsi d’évaluer la faisabilité de cette approche dans le cadre d’une inflammation contrôlée et les données générées pourrons nous aider à raffiner nos futurs modèles de mammite. Il est prévu également d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues lors de la traite. Les animaux étant déjà présents dans notre élevage, ce travail sera mis en place et initiée sur ces animaux pour les préparer notamment aux interventions lors de la traite. Plusieurs agents de l’unité se sont formés à cette méthode. Enrichissement social : Les animaux seront hébergés en groupes. Une visite régulière des animaliers sera assurée. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions.

Choix des espèces

Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. La mise en place d’un modèle infectieux sur petits ruminants est le plus pertinent et plus adapté à notre capacité actuelle de travail et d’hébergement en confinement biologique. Pour ce projet, nous avons decidé de travailler sur l’espèce ovine en tant que modèle plus abordable que l’espèce bovine pour sa facilité d’hébergement sous confinement biologique et d’approvisionnement. Cela nous permettra également d’effectuer un travail d’acclimatation et de conditionnement renforcé des animaux avant le démarrage de la procédure expérimentale. Le projet portant sur la mise en place d’un modèle d'infection in vivo chez la brebis afin d'étudier les mécanismes de défense antivirale dans la glande mammaire, les animaux utilisés seront des brebis en lactation. Les brebis seront soumises à une traite biquotidienne pour être maintenues en lactation.