Recherche fondamentale

Vingt xénopes adultes nagent six mois dans une eau contenant un mélange de six perturbateurs endocriniens, puis reçoivent deux injections hormonales à vingt heures d'intervalle pour être reproduits. Avec leurs descendants sur deux générations et 1 728 larves, 1 828 animaux sont concernés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la quasi-totalité. Le porteur écrit que les concentrations employées ne provoquent pas de stress connu, après avoir indiqué que ces substances peuvent entraîner une surmortalité et des malformations de la colonne vertébrale. Les mâles sont tués au moment de la ponte pour prélever leurs testicules, les femelles après récupération des œufs, et toutes les larves après prélèvement de leur cerveau.

Objectifs

Des études récentes suggèrent que les effets transgénérationnels induits par des polluants tels que les perturbateurs endocriniens (PE) sont impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant la capacité des animaux à se reproduire. Ce projet a pour ambition d’étudier les effets d’une exposition à un mélange de 6 PE présents dans le milieu naturel utilisés à des concentrations environnementales tout au long de la vie des animaux de la 1ère génération, puis les répercussions transgénérationnelles de cette exposition sur les 2 générations suivantes non exposées chez l’espèce Xenopus tropicalis. Les effets seront évalués à chaque génération en regardant l’impact de cette perturbation sur le développement et le comportement de la descendance des animaux exposés (première génération) et non exposés (les 2 générations suivantes). Les effets au niveau thyroïdien et au niveau du développment des animaux, en particulier les effets neuro-développementaux, ainsi que les effets sur la reproduction et la transmission des effets entre génération seront étudiés. Ces animaux seront comparés à des animaux élevés dans les mêmes conditions mais non exposés aux PE, comme contrôles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les impacts des perturbateurs endocriniens (PE) obésogènes sur les amphibiens et leur conséquence dans le déclin de leurs populations. D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de l'épigénétique et de l'écotoxicologie. D'un point de vue global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Le concept "EcoHealth" est aujourd’hui mis en avant dans nos sociétés. Sous plusieurs aspects, notre projet s'inscrit parfaitement dans ce concept. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes.

Procédures

Les xénopes adultes de la première génération (F0) seront exposés à un mélange de 6 perturbateurs endocriniens dilués dans l’eau des aquariums durant 6 mois. Les xénopes adultes des 2 générations suivantes (F1 et F2) seront maintenus en eau normale durant 3 mois. Toutes les reproductions des animaux seront réalisées au cours de ces périodes. Pour la fécondation in vitro, les animaux adultes males et femelles reçoivent deux injections d’hormone à 20 heures d’intervalle. Ces étapes ne durent pas plus de 30 secondes à chaque fois. Les femelles commencent à pondre environ 2 heures après la seconde injection. Les mâles sont euthanasiés à ce moment pour prélever leurs testicules. Les femelles sont soumises à un massage doux pendant 1 à 2 minutes pour récupérer les œufs qui seront fécondés par leur mise en présence avec une solution contenant les spermatozoïdes. Dans le cas de non ponte, les femelles pourront être de nouveau stimulées en respectant un repos minimum de 2 mois entre deux stimulations. Les larves obtenues des descendances des 3 générations produites seront élevées jusqu’à la fin du développement larvaire puis soumis à ce stade à un test de comportement (analyse de la mobilité sur une période de 12 minutes).

Impact sur les animaux

Les concentrations du mélange de perturbateurs endocrinien (PE) utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations. Au stade larvaire des déformations de la colonne vertébrale sont décrites comme pouvant survenir lors d’un stress. Nous effectuons une stimulation hormonale sur femelles vigiles. Les nuisances attendues sont essentiellement de type inconfort/stress et douleur légère et transitoire. Une douleur légère et transitoire peut être induite par l'injection.

Devenir

Tous les adultes males et femelles utilisés pour réaliser les fécondations in vitro seront euthanasiés en fin de procédure. Des tissus seront récupérés pour analyse. L’ensemble de ces animaux étant destiné à une étude multigénérationnelle suite à l’exposition de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens, il n’est pas possible de réétuliser ces animaux en raison de cette exposition. Toutes les larves utilisées pour étudier les effets direct et transgénérationel du mélange de 6 perturbateurs endocriniens sont euthanasiés en fin de procédure. Des prélèvements d’organes (cerveaux) seront réalisés sur chaque larve en vu de faire des analyses immunologique et d’expression de gène sur ces animaux pour regarder les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens.

Remplacement

Les outils informatiques permettant de faire des prédictions ne peuvent pas reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. De la même façon, les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire (tests in vitro) ne tiennent pas compte du fonctionnement global, notamment des effets hormonaux ou du développement, qui ne peuvent être observés que chez un animal entier. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre comment un mélange de substances peut perturber le système hormonal. Ce type de phénomène dépend des interactions entre plusieurs organes, ce qui ne peut pas être étudié uniquement sur des cellules isolées. C’est pourquoi une approche « in vivo », c’est-à-dire sur des animaux vivants, est nécessaire. Nous avons choisi d’utiliser des grenouilles, car notre objectif est d’évaluer l’effet d’un mélange de produits tel qu’il pourrait exister dans leur environnement naturel. Cette méthode permet d’obtenir des résultats plus fiables et représentatifs des conditions réelles d’exposition.

Réduction

Le projet concerne 1828 animaux. 100 grenouilles adultes (20 animaux de la génération F0, 40 animaux de la génération F1 et 40 animaux de la génération F2) seront utilisées. Pour chaque étape, nous utilisons 5 mâles et 5 femelles afin de réaliser différents types de croisements. Un prélèvement d’organes (cerveau, thyroide…) sur les individus euthanasiés sera effectué. Au total, 1728 larves seront utilisées dans le projet. Ce chiffre correspond à 480 larves par génération, multipliées par 3 expériences répétées (soit 1 440 larves). Nous ajoutons une marge de 20 pour cent pour tenir compte de la mortalité naturelle des têtards. Le nombre de larves utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats statistiquement fiables : - Pour le comportement, un minimum de 20 animaux testés par condition experimentale est nécessaire pour mesurer une mobilité interprétable et comparable. - Pour l’analyse immunologique, 10 animaux par condition experimentale permettront de tester plusieurs marqueurs immunologiques pour observer les effets du mélange de perturbateurs endocriniens sur le développement neuronal. - Pour l’analyse de l’expression des gènes, 10 animaux par condition experimentale permettront de disposer de suffisamment de materiel génétique (cerveaux) et d’avoir suffisamment de réplicats biologiques pour les analyses. Le nombre de réplicats techniques permettra de prendre en compte la variabilité inter-experimentation généralement associée aux études réalisées sur les animaux vivants. La taille des effectifs a été établie avec un calcul de puissance afin de prendre en compte la robustesse des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. La comparaison des groupes sera réalisée via des tests statistiques permettant une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les protocoles d’exposition permettent de reproduire les conditions naturelles (exposition dans l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce mode d’exposition est non invasif et n’induit pas de souffrance, contrairement à l’injection dans l’abdomen souvent utilisée en toxicologie. Les grenouilles sont élevées dans des aquariums contenant de l’eau filtrée, déchlorée, oxygénée et maintenue à une température de 26 degrés. Des capteurs mesurent en continu la température, le pH et la qualité de l’eau. Les aquariums sont aménagés avec des tubes, plantes, billes, même si les animaux préfèrent rester au fond. Les déchets et restes de nourriture sont retirés chaque jour, et les parois nettoyées toutes les deux semaines. Avant toute expérience, les animaux s’acclimatent à leur environnement pendant un mois. Ils sont nourris trois fois par semaine à satiété, avec des granulés et des vers de vase. La manipulation s’effectue à la main ou à l’épuisette, sans mouvement brusque. Leur comportement et leur état de santé sont suivis tout au long des protocoles grâce à une grille d’observation. Les concentrations de perturbateurs endocriniens utilisées correspondent aux normes environnementales et ne provoquent pas de stress connu. Toutefois, en cas de signe de stress, le traitement est suspendu et les animaux euthanasiés. Lors des fécondations in vitro, les injections peuvent entraîner de légères douleurs. Les Xenopus sont sortis de l’eau uniquement le temps de l’injection puis isolés dans un bac d’eau déchlorée jusqu’au lendemain. Chez les femelles la ponte est repérée grâce à la dilatation du cloaque, et les œufs non fécondés sont recueillis par massage doux. Les femelles qui ne réagissent pas ne sont pas utilisées. Après la ponte, elles sont replacées en aquarium isolé pendant 48 heures avec surveillance de l’alimentation. Les expérimentateurs observent quotidiennement les animaux. Les points limites de stress déclenchant une euthanasie incluent : perte d’appétit, mouvements anormaux, apathie, dégradation de la peau, état de choc, inconscience ou blessures.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce Xenopus tropicalis est justifiée par trois raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (environ 10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet de polluants tels que les perturbateurs endocriniens sur plusieurs générations 2) c’est une espèce non invasive ni en danger ou voie d’extinction et qui est facile à maintenir en laboratoire. C’est un modèle déjà étudié dans notre laboratoire et 3) Le xénope est un vertébré tétrapode non-mammifère et un modèle important pour l’étude du développement des vertébrés. Le génome de Xénopus tropicalis montre d’importante similitude avec le génome humain et c’est une espèce sur laquelle les études sur le génome sont aisées. Les animaux adultes seront utilisés afin d’être reproduits sur 3 générations pour obtenir à chaque génération une descendance qui sera utilisée pour faire une analyse multigénérationnelle des effets de l’exposition des animaux de la première génération à un mélange de perturbateurs endocriniens. Les larves obtenues pour chaque reproduction seront utilisées à un stade qui se situe à la fin du développement larvaire, car à ce stade, les organes sont bien différenciés, ce qui permet d’étudier la physiologie et la morphologie des animaux. Sur ces larves, un test comportemental (par une analyse de leur mobilité à chaque génération) et une analyse des tissus neuronaux après euthanasie et prélèvement des cerveaux seront réalisés, dans le but de voir les effets neurodéveloppementaux de l’exposition aux perturbateurs endocriniens à travers les différentes générations.

Rendues diabétiques par une injection de streptozotocine, 360 souris reçoivent ensuite des peptides radiomarqués au fluor-18 ou au cuivre-64 et passent des examens d'imagerie TEP d'une heure sous anesthésie. Elles subissent jusqu'à dix prélèvements sanguins, un par semaine, également sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes et vérifier ce que l'imagerie n'a pas su montrer. Le porteur qualifie cette imagerie de "totalement atraumatique et non invasive", tout en décrivant chez les mêmes souris hyperglycémie, urines abondantes, soif anormale et perte de poids provoquées par le diabète qu'il a induit.

Objectifs

Les ions métalliques sont impliqués dans de nombreux processus biologiques fondamentaux et sont des éléments essentiels pour la croissance et le développement de tous les organismes vivants. Les cellules régulent étroitement l’accumulation, le transport, la distribution et l’exportation de métaux, et une mauvaise régulation de la quantité d’ions métalliques peut être signe de pathologies comme les maladies cardiaques, le cancer et les maladies neurodégénératives. Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents. La teneur en zinc est particulièrement importante dans la prostate, le sein et surtout le pancréas. Une mauvaise régulation du zinc a été clairement associée aux cancers du pancréas ou au diabète même si son rôle n’est pas complètement compris. Dans ce projet, nous nous focalisons sur la variation de concentration en zinc au niveau du pancréas en cas de diabète dans des modèles de souris diabétiques. Nos collaborateurs dans ce projet ont développé un premier agent de contraste biocompatible en imagerie par résonance magnétique (IRM) qui a montré son intérêt dans la détection du zinc in vivo sur des pathologies de type diabète. Ils ont élargi la famille à d’autres agents de détection du zinc, plus sensibles. Ces agents doivent permettre d’une part de mieux caractériser et comprendre le rôle physiologique du zinc dans ces pathologies, et d’autre part, de pouvoir réaliser leur diagnostic précoce. Pour les besoins de notre étude, il est nécessaire de pouvoir détecter précisément la distribution de ces agents de contraste. L’IRM, bien que très sensible, ne permet pas d’y parvenir, contrairement à l’imagerie TEP (tomographie par émission de positons). Les agents de contraste seront donc radiomarqués ce qui permettra de quantifier leur biodistribution précise dans nos modèles.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront multiples. Notre étude de biodistribution est indispensable pour d’une part valider l’utilisation de cette nouvelle famille d’agents de contraste IRM pour des futures applications de recherche (meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le diabète) et à terme cliniques avec l’espoir d’un réel diagnostic précoce.

Procédures

Le modèle de diabète sera obtenu par injection (d’une minute à deux minutes) d’une molécule chimique (une seule injection) de streptozotocine largement décrite dans la littérature scientifique et utilisée pour induire le diabète chez la souris. Sept jours après induction du diabète les agents de contraste radiomarqués seront injectés sur différents groupes de souris (un agent par souris) et des examens d’imagerie TEP seront réalisés : une première acquisition sera réalisée juste après injection et une deuxième acquisition sera réalisée 4 à 6 heures plus tard. Cette technique est totalement atraumatique et non invasive. Ces examens sont réalisés sous anesthésie et la température des animaux sera maintenue à 37°C tout le long de l’examen. Un examen dure environ 60 minutes. Des prélèvements de sang, une fois par semaine (10 secondes) avec un maximum de 10 prélèvements seront réalisés sur les souris sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sont attendus au bout de 7 jours après injection de la molécule induisant le diabète et liés au développement du diabète : hyperglycémie, polyurie (quantité d’urine anormalement élevée et odeur particulière), polydipsie (soif anormalement élevée), perte de poids. Ce dernier effet sera monitoré tout au long de l’étude. Une attention particulière sera portée sur l’hygiène de la cage en raison de la polyurie des souris diabétiques. L’injection intraveineuse des agents de contraste provoque une douleur celle d’une piqure d’aiguille.

Devenir

Les souris sont mises à mort à la fin des procédures pour prélever certains de leurs organes. Cela permettra de réaliser des études complémentaires et de valider les résultats obtenus en imagerie TEP, notamment pour certains organes très petits qui sont parfois difficilement observables en imagerie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier d’induction du diabète et l’étude de l’efficacité d’agents de contraste ne peut se faire que sur un organisme vivant entier, étant donné que nous cherchons à comprendre la localisation et la concentration de plusieurs agents de contraste IRM. En l’état actuel, il n’existe pas de modèle alternatif permettant de reproduire la complexité d’un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera strictement limité au minimum nécessaire pour garantir des résultats fiables. Il a été déterminé en s’appuyant sur les données disponibles dans la littérature et sur les résultats préliminaires du laboratoire. Seuls les animaux indispensables pour répondre aux objectifs scientifiques seront inclus. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de méthodes validées, qui permettent d’identifier des différences significatives tout en limitant le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Pendant toute la durée de l’expérimentation, les souris seront hébergées par groupe sociaux de 5 dans les cages en portoir ventilé, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Divers objets d'enrichissement du milieu seront à leur disposition (maison transparente rouge, granulés, bâtonnets de bois à ronger). Les souris auront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des études TEP. Elles seront manipulées par du personnel formé et entraîné et observées quotidiennement afin de déceler toute souffrance, respecter leur bien-être et éviter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. L’hygiène de la cage sera contrôlée en raison de la polyurie des souris diabétiques (quantité d’urine et odeur particulière de l’urine). Le niveau des biberons sera contrôlé tous les jours en raison de la polydipsie des souris diabétiques. Des mesures adaptées seront mises en place pour éviter ou limiter la douleur, notamment par l’administration d’antalgiques lorsque cela est nécessaire. Enfin, des critères d’arrêt clairs seront définis : si un animal présente des signes de souffrance ou un état de santé dégradé, il sera retiré de l’expérimentation et pris en charge de manière appropriée. D’autre part, les injections et les expériences d’imagerie seront réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour plusieurs raisons : 1. Le modèle de souris diabétique proposé est largement décrit et utilisé dans la littérature. 2. Le modèle pharmacologique est facile à mettre en œuvre ; 3. Le modèle est le plus homogène en termes de progression de la pathologie : les animaux répondent globalement de façon similaire et dans les mêmes temps, ce qui facilite leur utilisation dans une étude. La lignée de souris choisie est celle qui répond le mieux au modèle d’après la littérature. Le métabolisme du zinc est équivalente entre la souris et l’humain avec des quantités et la distribution tissulaire qui peuvent varier et dont nous allons prendre en considération. Des souris âgées de 8 semaines seront utilisées conformément aux études déjà publiées sur l’induction du diabète par streptozotocine. En effet, à cet âge, les souris ont atteint leur maturité, les résultats de l’étude ne sont donc pas influencés par le développement des souris.

Pour comparer le passage de biothérapies administrées par les poumons, par le nez ou par la veine, 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 920 d'entre elles et modéré pour 280. Une partie reçoit cinq administrations d'allergène sous anesthésie pour déclencher une maladie respiratoire inflammatoire, puis trois administrations du candidat thérapeutique. Le porteur indique que l'introduction du dispositif dans la trachée est douloureuse et que l'allergène peut provoquer des difficultés respiratoires et une douleur à la respiration les jours suivants. Un score clinique bâti sur le poids, l'état général et le refus de se nourrir décide de la poursuite ou de l'arrêt de l'expérience, animal par animal.

Objectifs

Le projet a pour objectif de soutenir le développement de biothérapies innovantes pour une administration locale par voie inhalée (pulmonaire et nasale). La voie inhalée est depuis longtemps utilisée pour le traitement loco-régional des pathologies du tractus respiratoire car elle assure une exposition maximale et rapide du composé actif directement dans l’organe cible. L’administration intranasale offre également un accès direct vers le cerveau, aussi appelé transport « nez-vers-cerveau », et représente une voie d’administration non invasive pour le traitement des maladies du système nerveux central. A ce jour, l’inhalation est majoritairement utilisée pour l’administration de molécules de petites tailles et est très peu exploitée pour les biothérapies. Le projet repose sur l’utilisation par inhalation de candidats biothérapeutiques, en tirant partie de leurs avantages, notamment leur petite taille et leur stabilité. Plus spécifiquement, ce projet vise à évaluer la tolérabilité, la biodisponibilité et l’efficacité de candidats biothérapeutiques après administration intra-trachéale, intra-nasale ou intraveineuse (voie de référence pour les biothérapies) dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer de nouvelles biothérapies par voie inhalée (pulmonaire et nasale) pour le traitement de pathologies respiratoires et neurologiques. Des connaissances liées à la distribution dans l’organisme de biothérapies administrées par inhalation (nasale ou pumonaire), nécessaires pour leur développement clinique, seront apportées par ce projet. L’ambition à long-terme de ce projet est d’accélérer la production de biothérapies, par voie inhalée, afin d’améliorer leur ciblage, leur biodisponibilité et leur efficacité. In fine, ceci permettra d’améliorer globalement la prise en charge des patients atteints de pathologies respiratoires et de pathologies neurologiques.

Procédures

Procédure « temps de rétention dans les matrices biologiques d’intérêt des candidats biothérapeutiques à visée pulmonaire ou cérébrale chez des souris en fonction de la voie d’administration » : 1.1_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°1 : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1.2_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°2 : vigile, en contention, 1 fois, 1min 1.3_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°3 : sous anesthésie générale, 1 fois, 30 sec Procédure « efficacité anti-inflammatoires des candidats biothérapeutiques dans un modèle induit de maladie respiratoire inflammatoire chez des souris » 2.1_Induction de la maladie respiratoire inflammatoire par administration d’un allergène : sous anesthésie générale, 5 fois, 30 sec 2.2_Adminitration des biothérapies selon la voie d'administration n°1 : sous anesthésie générale, 3 fois, 1min 2.3_Administration des biothérapies selon la voie d'administration n°2 : vigile, en contention, 3 fois, 1min

Impact sur les animaux

Pour la procédure « temps de rétention dans les matrices biologiques d’intérêt des candidats biothérapeutiques à visée pulmonaire ou cérébrale chez des souris en fonction de la voie d’administration » , il s’agit d’évaluer la biodisponibilité de plusieurs candidats biothérapeutiques en fonction de leurs voies d’administration, sans avoir recourt à un modèle pathologique. Pour la procédure « efficacité anti-inflammatoires des candidats biothérapeutiques dans un modèle induit de maladie respiratoire inflammatoire chez des souris », un modèle pathologique de maladie respiratoire inflammatoire sera utilisé chez la souris pour évaluer les efficacités antiinflammatoires de plusieurs candidats biothérapeutiques. Des données préliminaires in vitro obtenues précédemment vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différents candidats. Les nuisances associées aux administrations (allergène pour induire le modèle pathologique, ou des solutions thérapeutiques) comprennent : le stress généré par l'anesthésie gazeuse et la douleur associée à l'introduction du dispositif pour inhalation dans la trachée ; ou le stress généré par l'anesthésie gazeuse et la douleur associée à l'administration d'un bolus par le nez ; ou le stress généré par l’introduction d’une aiguille pour une injection ; et le stress généré par la manipulation et la contention à plusieurs reprises. De plus, l’administration de l’allergène peut provoquer une difficulté respiratoire et une douleur associée à la respiration sur les jours qui suivent.

Devenir

L’objectif de ce projet de 5 ans est d’améliorer nos connaissances sur la distribution dans l’organisme de biothérapies après inhalation (pulmonaire ou nasale), ainsi que nos connaissances sur les effets anti-inflammatoires à visée pulmonaire de candidats biothérapeutiques. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à morts et des prélèvements (poumons, cerveau, lavages bronchoalvéolaires, lavages nasaux, sang, foie), seront réalisés afin de quantifier la rétention des biothérapies dans chacun de ces compartiments, et d’évaluer la réponse inflammatoire de l’organisme.

Remplacement

Ce projet in vivo est la suite d’études in vitro sur des modèles cellulaires pour évaluer le passage des candidats biothérapeutiques de la barrière épithélilale pulmonaire ou nasale, ainsi que d’études in vitro pour évaluer l’efficacité de ces biothérapies à visée anti-inflammatoires. Le recourt à l’expérimentation animale chez un modèle murin fait suite à ces précédents résultats, et est pertinent pour prendre en considération la distribution d’une molécule dans un organisme entier, ainsi que les réponses immunitaires. De plus, les modèles in vivo, et notamment les modèles murins permettent de reproduire des processus immunitaires plus proches de ceux retrouvés chez l’Homme – dans notre cas : remodelage de la paroi des voies respiratoires, hyperplasie des cellules épithéliales et calciformes, accumulation de collagène, de fibronectine et d’autres protéines de la matrice. Et l’utilisation d’un modèle animal de petite taille permet une meilleure accumulation des produits dans les régions cibles. Des méthodes in silico existent pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques. Cependant, les mécanismes multifactoriels intrinsèques aux biothérapies ne permettent pas encore d’avoir des modèles suffisament prédictifs. Ces approches in silico pourront gagner en importance grâce aux capacités croissantes de corrélation entre les propriétés des biothérapies et les données in vivo générées.

Réduction

Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, quantification des biothérapies dans les organes cibles …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et les porteurs de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point, et donc de réduire le nombre d’animaux. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des études antérieures sur des modèles cellulaires ont permis de définir une concentration efficace en candidats biothérapeutiques à visée anti-inflammatoires, permettant ainsi de réduire le nombre de doses à tester sur les expériences in vivo. De plus, des cinétiques de transport des solutions biothérapeutiques ont été réalisées sur des modèles cellulaires d’épithélium bronchique et nasal afin de réduire le nombre de temps d’analyse à effectuer sur les expériences de biodistribution. Des tests statistiques ont été utilisés afin de considérer une taille de groupe d’animaux optimisée en fonction des besoins du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables (5 souris/cage) permettant les interactions entre congénères de la même espèce. Plusieurs types d’enrichissements sont prévus dans leurs hébergements, notamment pour permettre une complexification de leurs milieux de vie, et pour stimuler leurs comportements naturels (jeux, caches...) : boîtes à œufs, sopalin, bâtonnet en coton ou en bois, tube carton, sizzle pad, nestlets, igloo en plexi ou en carton, et tube, dome, ou cabane en plexi. Une attention particulière des animaux par les expérimentateurs sera apportée pendant la période d’acclimatation des animaux, et au cours des expérimentations envisagées. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique des animaux sera réalisée de façon quotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites. L’observation sera portée sur : (1) le poids de l’animal, (2) l’état général, (3) comportements physiologiques (refus de se nourrir ou de boire, aspect des poils…), (4) autres symptômes. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux dans cette étude est indispensable pour étudier la biodisponibilité des candidats biothérapeutiques et leurs efficacités anti-inflammatoires, car cela dépend de l’organe considéré et de sa voie d’administration. Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il s’agit d’un modèle pertinent pour des études sur la biodistribution de molécules thérapeutiques. Le modèle murin a, de plus, été largement documenté sur l’induction de maladie respiratoire inflammatoire à l’aide d’administration répétée d’allergène. Nous utiliserons plus particulièrement dans ce projet des souris largement utilisées pour des recherches en immunologie. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec des gestes techniques et des procédures expérimentales.

673 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant douze heures seule en cage pour la mesure d'activité spontanée, avec un test de force des membres postérieurs sous anesthésie chaque semaine pendant un mois et, pour une partie, un test d'endurance sur tapis de course de près d'une heure. La thérapie génique est injectée soit dans la première semaine de vie, soit après l'apparition des symptômes de myopathie, et une mesure de contraction musculaire sous anesthésie clôt le protocole. La moitié des animaux issus des croisements n'auront pas le génotype recherché et seront tués s'ils ne servent pas à renouveler l'élevage. Le porteur écrit qu'aucun symptôme clinique sévère n'est attendu, tout en décrivant "l'angoisse et la douleur durant la course" et une fatigue physique liée aux anesthésies répétées.

Objectifs

Ce projet s'intéresse à deux maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces myopathies. Le but de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une potentielle thérapie commune pour ces deux maladies. Modification : Dans la première maladie, des atteintes musculaires et cardiaques sont décrites. L’objectif était donc de cibler ces deux types d’organes avec une seule injection de traitement. Cependant, le cœur s’avère beaucoup plus ciblé que les muscles. La modification de projet porte donc sur un changement de voie d’injection. Cette optimisation de délivrance du traitement, s’accompagne également d’une optimisation de la dose à injecter. Enfin, des tests cardiaques légers sont ajoutés pour le groupe qui recevra cette nouvelle stratégie d’injection.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait fournir une preuve de concept commune pour soigner deux myopathies. En outre, cette étude nous permettra de mieux comprendre ces maladies et les acteurs impliqués.

Procédures

Dans ce projet, il y aura 4 groupes d’animaux : les groupes 1 et 3 (Myopathie 1) et les groupes 2 et 4 (Myopathie 2), qui seront soumis à différents tests musculaires et cardiaques. Groupes 1 et 2 : Les animaux recevront la thérapie génique durant la première semaine après la naissance avant l'arrivée des symptômes (prévention de la maladie). Les tests seront réalisés à l’âge attendu d’arrivée des symptômes. Groupe 1 : Les capacités cardiaques seront évaluées par deux tests cardiaques effectués consécutivement au cours de la même anesthésie (30 mins) une fois durant la vie de la souris. Les capacités sportives seront testées une fois par test d’endurance sur tapis de course (moins d’une heure). L’activité spontanée sera également surveillée sur 12h. Groupe 2 : Les capacités sportives seront testées une fois par semaine pendant 1 mois par deux tests de force (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs sous anesthésie générale) durant chacun moins d'une heure. L’activité spontanée sera surveillée sur 12h, une fois durant la vie de la souris. La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin de la caractérisation sous anesthésie générale. Groupes 3 et 4 : Les animaux recevront la thérapie génique après l’apparition du phénotype (réversion de la maladie). Groupe 3 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, mesure de force des membres postérieurs et endurance sur tapis de course) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (activité spontanée et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Groupe 4 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, test de suspension et mesure de force des membres postérieurs) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Modification:Le groupe 3 sera divisé pour améliorer la délivrance du traitement. Les capacités cardiaques seront mesurées deux fois dans la vie de la souris : avant et après traitement. Le groupe 5 recevra des injections, et la force sera évaluée un mois plus tard pour certains animaux.

Impact sur les animaux

Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont le stress dû à l'isolement durant la mesure d'activité spontanée, l'angoisse et la douleur durant la course, ainsi que la douleur lors des injections de traitement ou d'anesthésiants. Il est possible que les animaux ressentent une fatigue physique due aux anesthésies répétées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles et organes nécessaires aux analyses moléculaires, et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies. La moitié des animaux issus des croisements ne possèderont pas les génotypes d'intérêt et seront euthanasiés s'ils ne sont pas nécessaires pour renouveller des croisements.

Remplacement

Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique d'une thérapie sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisamment proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.

Réduction

La grande majorité des tests étant peu invasifs, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.

Raffinement

Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre et un tube pour permettre la préhension des animaux avec un minimum de stress. En cas de fatigue ou difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Les animaux seront pesés une fois par semaine et observés. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour limiter son stress. Lors des tests sous anesthésie une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Le bien-être global des animaux sera surveillé quotidiennement après injection du traitement pendant une semaine. Pour les nouveau-nés, la poche de lait sera observée, car une diminution de l'alimentation peut indiquer un mal-être, et les animaux seront pesés. Des analgésiques pourront être administrés sur avis du vétérinaire si les animaux montrent des signes de douleur persistante. La zone d'injection du traitement sera surveillée et dès l'apparition de rougeurs, elle sera nettoyée avec une solution antiseptique douce. En cas d'infection importante, l'animal pourra recevoir des antibiotiques ou être euthanasié sur avis vétérinaire.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris récapitulent le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et permettent donc d'évaluer correctement l'efficacité des traitements. Les défauts locomoteurs du premier modèle sont établis à 12 semaines après un exercice forcé et le phénotype cardiaque léger peut être détecté à 7 semaines. Pour les souris injectées avec le traitement dans les premiers jours de vie, les tests seront réalisés entre 7 et 12 semaines. Pour les souris injectées à 12 semaines, les tests seront réalisés de 11 à 16 semaines. Le deuxième modèle est plus précoce, bien que toujours léger, les tests seront donc effectués de 6 à 8 semaines ou de 6 à 12 semaines en fonction de l'injection du traitement (en prévention ou après l'apparition des symptômes). Modification : L'étude pilote pour l'optimisation des doses d’injection sera faite sur des animaux de 12 à 20 semaines, pour permettre la réduction du nombre de souris, mais aussi pouvoir comparer les données avec des données standards du modèle.

Transférés en photopériode courte puis hébergés seuls jusqu'à la fin de la procédure, les hamsters syriens subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale, puis chaque semaine une mesure de la taille des testicules et un prélèvement sanguin, certains passant en plus des tests de mémoire et d'olfaction d'une semaine chacun. 452 hamsters syriens et 120 souris vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour les hamsters et léger pour les souris, tous tués à l'issue. L'ensemble sert à établir le rôle de la prolifération cellulaire de l'hypothalamus dans la reproduction saisonnière, les souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine étant utilisées pour situer le point d'action de l'hormone. Le texte annonce la mise à mort de 540 animaux, soit 452 hamsters et 88 souris, quand la déclaration porte sur 120 souris, écart de 32 individus qu'aucune ligne n'explique.

Objectifs

Il est bien établi que les variations des concentrations de mélatonine nocturne permettent l’intégration des saisons au niveau de l’hypothalamus, une zone cérébrale connue pour contrôler la fonction de reproduction. L’hypothalamus comprend des cellules gliales spécifiques bordant le 3ème ventricule, appelées tanycytes, qui jouent un rôle important dans la physiologie saisonnière et dans la prolifération cellulaire. De récents résultats de l’équipe, obtenus chez le hamster syrien (rongeur saisonnier) indiquent que le nombre de cellules néoformées augmente rapidement après le transfert en photopériode courte (hiver, période de l’année où la durée du jour est plus courte que celle de la nuit). Cette augmentation de la prolifération cellulaire en photopériode courte a été préalablement observée chez une autre espèce saisonnière, la brebis et il a été montré qu’elle participait à la synchronisation saisonnière de la fonction de reproduction. La brebis se reproduit en photopériode courte (automne/hiver), contrairement au hamster qui se reproduit en photopériode longue (printemps/été), ce qui interroge sur le rôle de la prolifération cellulaire hypothalamique sur la fonction de reproduction du hamster. De plus, nous avons récemment observé que l’augmentation de la durée de production nocturne de mélatonine en photopériode courte entraine l’augmentation de cellules néoformées dans l’hypothalamus. De plus, notre étude montre également que la mélatonine n’agit pas classiquement via l’hormone thyroïdienne (T3) intra-hypothalamique, suggérant qu’elle pourrait agir directement via ses récepteurs MT1 et/ou MT2 , pour contrôler la prolifération cellulaire. Pour vérifier notre hypothèse d’un effet direct de la mélatonine, il est nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés, présentant des mutations pour les récepteurs à la mélatonine (MT1 et/ou MT2), ce qui est possible uniquement chez la souris. Ainsi, ce projet vise à évaluer chez le hamster syrien le rôle biologique de la prolifération cellulaire dans l’hypothalamus sur la synchronisation saisonnière de la reproduction, et d’établir chez la souris les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire saisonnière. MODIFICATION : La production des souris mutées MT2 s'est avérée compliquée et l'âge des animaux s'en est trouvé très variable. Or l'âge des animaux impacte la neurogenèse. La modification porte sur l'ajout de 32 souris d'âge homogène afin de reproduire une des études du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet nous aidera à mieux comprendre d’une part, les mécanismes d’action de la mélatonine sur la prolifération cellulaire hypothalamique, et d’autre part le rôle biologique de cette prolifération cellulaire saisonnière sur le contrôle annuel de l’activité de reproduction chez un mammifère saisonnier. En effet, la neurogenèse (formation de nouveaux neurones) chez les mammifères adultes est un sujet de recherche assez récent, c’est pourquoi la recherche des facteurs environnementaux influençant cette neurogenèse, comme ici les saisons, est nécessaire à la compréhension des mécanismes et du rôle biologique de celle-ci dans le cerveau adulte. Par ailleurs, ces travaux ont des implications cliniques car de plus en plus d’études montrent l’impact physiologique des saisons chez l’humain. Une étude a montré que les concentrations circulantes d’hormones liées au métabolisme, à la reproduction et à la croissance varient selon les saisons. L’étude des mécanismes d’intégration des saisons dans le système nerveux central est donc indispensable pour comprendre comment les différentes espèces, dont l’humain, s’adaptent aux cycles annuels de leur environnement.

Procédures

Les hamsters pourront être soumis à une procédure chirurgicale (d’une durée d’environ 2h00) effectuée sous anesthésie générale. La mesure de la taille des testicules et le prélèvement de sang des hamsters seront effectués sous anesthésie générale à la fréquence d'une fois/semaine sur la durée de la procédure. Chaque geste durera environ 2-3 minutes par animal. Certains hamsters seront soumis à des tests comportementaux (1 à 2 fois) afin d’évaluer la mémoire et l’olfaction (durée d’1 semaine pour chaque type de test). L’hébergement en cage individuelle aura lieu suite au transfert en photopériode courte jusqu’à la fin de la procédure expérimentale. La totalité des souris et certains hamsters seront soumis à une injection sur animal vigile, une seule fois, 24 heures avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’intervention chirurgicale est jugée douloureuse et inflammatoire, et donc entrainer une perte de poids post-opératoire ; 2) la préhension de l’animal afin d’effectuer les injections intrapéritonéales pourra engendrer un stress et une irritation de la zone injectée ; 3) les prélèvements de sangs récurrents pourront induire une irritation, une douleur légère, des ecchymoses, une hémorragie, une compensation temporaire via le membre opposé pour se déplacer ou une infection ; 4) les tests comportementaux peuvent induire un stress aigu.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 540 animaux, soit 452 hamsters syriens et 88 souris. Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus et organes pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps. Par conséquent ce projet ne peut pas être réalisé chez des invertébrés, des lignées cellulaires ou des modèles biomathématiques. Dans ce contexte nous ne pouvons pas proposé d’alternatives pour des études préliminaires dans des modèles hors-champs.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d’obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l’aide des tests statistiques appropriés. Les études préparatoires sont mises en place afin de maitriser et d’améliorer les gestes techniques ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux dans la procédure en elle-même. Dès que l’expérience s’y prête, un suivi longitudinal a été privilégié. C’est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs semaines, cela permet une réduction du nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Les hamsters et les souris seront hébergés en groupes sociaux ou seront isolés, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress, les cages seront enrichies avec du matériel de nidation, un bâton à ronger, et avec apport d’eau et de nourriture à volonté et un tunnel. Ce tunnel sera utilisé pour déplacer les animaux lors du change ou pour capturer l’animal. Après leur arrivée à l’animalerie, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, ils seront manipulés quotidiennement pendant 1 semaine avant le début des procédures expérimentales. Toute procédure invasive est réalisée sous anesthésie/analgésie et après entrainement au geste technique. Tous les animaux seront observés et pesés hebdomadairement. Des points limites ont été établis afin de d’identifier les animaux en souffrance et de pouvoir les y soustraire.

Choix des espèces

Le hamster syrien est un modèle de rongeur saisonnier dont les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la physiologie saisonnière sont largement étudiés. De récents résultats ont montré l’existence d’une prolifération cellulaire hypothalamique induite par un transfert en photopériode courte (hiver). Par conséquent, il est opportun d’utiliser la même espèce pour analyser le rôle biologique de cette prolifération saisonnière, d’autant que nous maitrisons les procédures expérimentales proposées chez cette espèce. Des injections quotidiennes de mélatonine pendant 1 semaine augmentent la prolifération cellulaire hypothalamique chez le hamster. La détermination de sites d’action de la mélatonine nécessite des individus mutés pour les récepteurs de la mélatonine. Comme nous ne disposons pas de ces outils génétiques chez le hamster, nous utiliserons des souris mutées pour les récepteurs à la mélatonine. Pour cette étude, nous utiliserons des hamsters syriens jeunes adultes (3-8 mois), et des souris mâle jeunes adultes (7-8 semaines), période où la maturité sexuelle est optimale.