Recherche fondamentale

Jusqu'à 365 administrations de composés et 52 prélèvements de sang par animal : 900 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués pour analyses immunologiques et histologiques. La plupart des gestes se font sur animaux vigiles, sous contention, le porteur décrivant des hématomes aux points de piqûre et une douleur brève à chaque injection. Ces études de pharmacocinétique servent à mesurer où va une molécule dans le corps et à quelle vitesse elle en sort, étape que les autorités de santé exigent avant tout essai chez l'être humain. Le projet pourra comporter dix études, et le bénéfice annoncé pour les patients reste renvoyé à d'éventuels essais cliniques ultérieurs.

Objectifs

La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur sain est une étape essentielle dans le développement de médicaments et de vaccins. Ce projet a pour but de vérifier l'innocuité (absence de toxicité) et de déterminer la biodisponibilité de nouvelles molécules thérapeutique. La pharmacocinétique a pour but d'étudier le devenir d'une substance, contenue dans un médicament, dans l'organisme après son administration selon différentes voies d'administration. Ce projet a pour but d’étudier le devenir des agents pharmacologiques in vivo chez le rat sain qui est une étape essentielle dans le développement d’un candidat médicament afin d'étudier sa bio-distribution et biodisponibilité dans un organisme vivant. La pharmacocinétique est le devenir du médicament, depuis son entrée jusqu'à sa sortie de l'organisme, l'évolution en fonction du temps de son absorption, sa biodisponibilité, sa distribution, son métabolisme, et son excrétion. En effet pour développer un composé, il est indispensable d’étudier sa pharmacocinétique et de vérifier l’absence de toxicité sur un modèle animal. Les caractéristiques pharmacocinétiques sont les premières données générées in vivo après que les tests in vitro aient été concluants. Cette caractérisation des paramètres pharmacocinétiques permet par la suite de déterminer entre autres les voies d’administration et la posologie.

Bénéfices attendus

Les études de pharmacocinétique (PK) chez l'animal sont nécessaires et demandées par les autorités de santé afin de pouvoir réaliser des études cliniques avec un maximum de sécurité. Elles permettent de déterminer les doses, la fréquence des administrations et de calculer la marge de sécurité. Ce projet pourra comporter 10 études et permettra de générer des données scientifiques robustes chez l’animal afin de pouvoir passer ultérieurement aux essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Prélèvements de sang : maximum 52 prélèvements (30 secondes/rat) sur animaux vigiles et un prélèvement de sang en terminal sous anesthésie gazeuse (30 secondes/rat). Administrations de composés : maximum 365 administrations, durée : 30 secondes/injection.

Impact sur les animaux

Les contentions des animaux vigiles pour administrer les molécules thérapeutiques peuvent engendrer un stress mineur à l’animal. L’administration de molécules par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des molécules entraînent une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). La pharmacocinétique nécessite le prélèvement de petites quantités de sang à des intervalles répétés ce qui peut générer du stress et de l’inconfort se traduisant par une douleur légère, de courte durée (quelques secondes). Aucun problème de toxicité n’a été relevé sur les composés testés lors du précédent projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques.

Remplacement

Nous proposons dans ce projet d’étudier la bio- distribution, biodisponibilité de nouvelle molécules thérapeutiques et vérifier l’innocuité de nouvelles thérapies in vivo chez le rat. Les méthodes substitutives à l’expérimentation animale (culture cellulaire, modélisation informatique) ne peuvent être utilisées ici puisque nous testons des molécules candidat médicament. Ces tests sont nécessaires avant l’initiation d’une phase clinique. Aucun modèle substitutif n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la pharmacocinétique de molécules thérapeutiques et les interactions entre les différents acteurs cellulaires et moléculaires des réponses immunitaires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Les tests statistiques utilisés permettront soit de comparer 2 groupes indépendants entre eux en prenant en compte 1 variable ou bien de comparer 2 groupes indépendants entres eux en prenant en compte 2 variables.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement (pour les études de plus de 24h) pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance au cours de l'étude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajoutés dans les cages et le vétérinaire en sera informé. Certains types de traitements seront effectués sous anesthésie ainsi que les prélèvements de sang. Un suivi et scoring quotidien seront effectués. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués. Pour les projets longs, au cours des précédents projet nous avons varié les enrichissements au cours de l’étude (tunnel, dômes, frisures de carton, cylindre de coton, morceau de bois à ronger) afin d’améliorer le bien-être des animaux (curiosité, diminuer l'ennui). Nous allons continuer de procéder ainsi dans ce projet.

Choix des espèces

Le choix du rat pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordre scientifiques, pratiques et éthiques : - Nos modèles d'études ont été développé sur des fonds génétique de rat dont les génomes possèdent 90% de similitude avec le génome humain, et ne présentent aucun gène manquant ou supplémentaire pouvant modifier l’intensité de la réponse immunitaire attendu. - De nombreux outils génétiques, anticorps spécifiques permettent la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire chez le rat. - Le rat est l’autre espèce de rongeur utilisée en recherche biomédicale (en plus de la souris), même si son importance numérique est moindre que celle de la souris. C’est aussi une espèce de petite taille qui présente l’avantage, par rapport à la souris, d’être plus proche physiologiquement de l’homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure comparaison inter-espèces. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

Importées d'autres établissements ou déjà hébergées sur place, les lignées de souris concernées doivent changer de statut sanitaire, ce qui passe par la mort de toutes les femelles servant au transfert d'embryons. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les donneuses, âgées de quatre à six semaines, reçoivent deux injections hormonales à deux jours d'intervalle avant d'être tuées pour la récolte des embryons, les receveuses subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale puis partent chez un prestataire où elles sont tuées pour vérifier leur statut sanitaire. Celles chez qui la réimplantation échoue sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, et le porteur affirme qu'un tel projet ne peut pas se faire sans souris, l'étude du cerveau étant selon lui hors de portée des modèles in vitro.

Objectifs

Les recherches réalisées dans l'établissement portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur. Ces projets de recherche visent à développer les connaissances sur ces sujets et identifier des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Les lignées murines nécessaires pour ces projets sont élevées en interne. Afin de pouvoir importer de nouvelles lignées d’intérêt possédant des caractéristiques génétiques précises il est parfois nécessaire de les décontaminer, de même pour certaines lignées déjà hébergées sur place mais nécessitant un statut sanitaire plus strict, notamment pour leur élevage. La décontamination des lignées et leur hébergement dans une zone protégée (exempte d’agent pathogènes et opportunistes pour les souris, ou SOPF) permettra un meilleur contrôle de leur statut sanitaire et une amélioration de leurs conditions d’hébergement. La décontamination se fera par la technique de transfert d’embryons se basant sur le principe que l’embryon est protégé de tout contaminant présent chez sa mère. Les embryons à transférer seront récoltés, puis lavés et réimplantés chez une femelle dite receveuse (pseudogestante) dans la zone protégée de l’animalerie dans le but d’obtenir des souriceaux de statut sanitaire SOPF.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les conditions d’élevage des lignées murines concernées, grâce à un meilleur contrôle du statut sanitaire des animaux et de leurs conditions d’hébergement. En effet la zone protégée bénéficie d’un accès très restreint et donc un environnement plus calme, permettant aux animaux de ne pas être exposés au stress lié aux nombreux passages de personnes fréquentant l’animalerie, mais également aux pathogènes pouvant être amenés via ces mêmes personnes. Les animaux d’élevage seront donc placés dans des conditions optimales pour se reproduire. Les petits générés dans cette zone protégée pourront ensuite être récupérés par les chercheurs dans la zone expérimentale pour participer aux projets de recherche et donc contribuer à l’avancée de la recherche pour différentes pathologies du cerveau telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la sclérose en plaques, l’épilepsie, les tumeurs cérébrales, etc…

Procédures

Des souris femelles recevront 2 injections d’hormones à 2 jours d’intervalle (durée quelques secondes par injection, souris vigile) pour obtenir une superovulation. D’autres souris femelles auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réimplanter les embryons (durée environ 45 minutes, une fois).

Impact sur les animaux

Lors des injections les animaux ressentiront une légère et brève douleur au niveau des zones de piqûre. La chirurgie sera associée à un risque de douleur et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et plus rarement un risque de difficultés cardiaque et, ou respiratoire. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable. Pour la majorité de ces lignées le phénotype dommageable ne s’exprimera qu’à partir de l’âge adulte (plus de 8 semaines, exemples : perte de poids, apparition de tumeurs, difficultés motrices, etc.), ici nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 6 semaines), les phénotypes dommageables que nous prévoyons de rencontrer pour ces jeunes animaux pourraient consister en des tremblements, des anomalies cognitives ou une différence de poids par rapport aux souris non génétiquement modifiées.

Devenir

Toutes les souris utilisées pour la production des embryons seront euthanasiées pour pouvoir récupérer ces embryons. Les souris réimplantées avec succès seront transférées à un prestataire pour la confirmation de leur statut sanitaire, ceci nécessitera leur euthanasie afin de réaliser des prélèvements d'intérêt post-mortem pour les différentes analyses nécessaires à la validation du statut sanitaire. Les femelles pour lesquelles la réimplantation n'aura pas fonctionné seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées.

Remplacement

Ce projet consistant à décontaminer des lignées murines il ne peut se faire sans l’utilisation de souris. Cette décontamination intervient dans le contexte de souris utilisées pour des projets de recherche dédiés à l’étude du cerveau. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas à représenter les interactions complexes mises en jeu au niveau cérébral. De plus lorsqu’il est nécessaire d’étudier des composantes comportementales ou motrices, notamment pour certaines maladies du système nerveux, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux car cela ne peut pas être représenté in vitro.

Réduction

Nous utiliserons au total 600 souris pour ce projet. Nous avons défini cet effectif par rapport à notre expérience de la technique et au taux de réussite de chaque étape. Ainsi nous avons estimé que 6 souris donneuses étaient nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’embryons fécondés et viables à réimplanter. Ces femelles recevront un traitement de stimulation hormonale pour augmenter le nombre d’embryons récoltés permettant ainsi de réduire le nombre de femelles donneuses nécessaires pour chaque transfert. Pour les femelles receveuses nous avons défini qu’il nous faudrait 4 femelles maximum afin de prendre en compte le risque lié à la chirurgie et le risque de perte de la portée lié aux aléas de l’élevage. Nous avons choisi une souche de souris spécifique comme receveuses car elle permet d’avoir un bon rendement de réimplantation et présente un comportement maternel fort permettant ainsi de réduire le nombre de femelles à réimplanter pour obtenir un nombre de souriceaux suffisants. Nous estimons que nous aurons au maximum 12 lignées à décontaminer par an. Les mâles vasectomisés ne sont pas soumis à déclaration dans ce projet, mais, à titre informatif ils seront conservés pendant 10 mois afin de participer à plusieurs sessions de transfert dans un souci de réduction plus global.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu avec un carré de coton et un bâtonnet de bois à ronger au minimum, complétés par une maisonnette pour les femelles gestantes. Les animaux en provenance extérieure bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum avant leur entrée en procédure. La chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter toute sécheresse oculaire. Leur température corporelle sera maintenue grâce à l’utilisation de chambres d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant thermorégulé. Le réveil des animaux sera surveillé, et des croquettes et de l’hydrogel seront mis à disposition dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération la première journée. Une évaluation de leur état général sera assurée en période post-chirurgicale. Tous les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie, celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer la meilleure prise en charge des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable, pour les femelles génétiquement modifiées qui pourraient être impliquées dans ce projet (cas des mutations génétiques complexes) nous nous assurerons que le phénotype ne soit pas impactant pour la reproduction et, ou, qu’il ne soit pas encore exprimé. Nous utiliserons des femelles très jeunes à un âge auquel nous ne devrions observer (au maximum) que des signes cliniques légers en lien avec ces phénotypes dommageables.

Choix des espèces

Ce projet portant sur le transfert d’embryons de lignées de souris transgéniques, il est impératif de conserver la même espèce. Le choix de cette espèce sera justifié dans les différentes demandes d’autorisation de projet afférentes aux lignées utilisées dans ce projet. Les femelles donneuses d’embryons seront utilisées à un jeune âge de 4 à 6 semaines. A cet âge la maturité sexuelle n’est pas complète et la souris n’est pas cyclée. Ainsi le traitement hormonal déclenche une maturation folliculaire massive et une ovulation. Les femelles receveuses seront utilisées à un âge compris entre 2 et 8 mois afin d’être sexuellement matures mais pas trop âgées pour conserver de bonnes capacités reproductives et maternelles. Cet âge permet également à la femelle de bien supporter la chirurgie.

Injectés vigiles avec des globules rouges parasités, 2 822 souris et 150 rats sont ensuite piqués à la queue chaque jour pendant environ huit jours pour un prélèvement d'une goutte de sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur annonce une parasitémie faible et aucun signe clinique attendu, tout en indiquant que le paludisme cérébral peut provoquer des mouvements désordonnés, une paralysie partielle puis un coma irréversible. L'objectif déclaré est d'identifier les gènes qui commandent la multiplication du parasite, une centaine de gènes pouvant désormais être modifiés en une seule expérience. Tous sont tués à la fin de la procédure, leur sang étant prélevé après la mort pour récupérer les parasites.

Objectifs

Malgré de nombreux efforts depuis des décennies, le paludisme reste un problème de santé majeur dans le monde. Il touche environ 100 pays, et 40 % de la population mondiale vit dans des zones à risque. En 2020, on a recensé 241 millions de cas, entraînant 627 000 décès, principalement chez les enfants de moins de 5 ans. Le paludisme est causé par un parasite appelé Plasmodium, qui a besoin de deux hôtes pour survivre : un moustique du genre Anopheles et l’être humain, dans le cas du paludisme humain. Chez ce dernier, le parasite se multiplie dans les globules rouges, provoquant les symptômes de la maladie. Bien qu’il existe des médicaments, leur efficacité diminue à cause de l’apparition de résistances. Il est donc crucial de mieux comprendre ce parasite pour développer de nouveaux traitements. Notre projet vise à étudier comment le parasite contrôle son cycle de vie et se développe dans les globules rouges. Nous cherchons à identifier les gènes clés impliqués dans sa multiplication. Pour cela, nous allons créer des parasites fluorescents, puis les modifier afin de bloquer l’expression de certains gènes. Cela nous permettra de comprendre leur rôle et d’identifier de nouvelles cibles pour lutter contre le paludisme. Nous utiliserons Plasmodium berghei, un parasite qui infecte les rongeurs. Il est très similaire à Plasmodium falciparum, le plus dangereux pour l’Homme. De plus, il permet de mener des expériences en laboratoire qui sont impossibles à réaliser avec Plasmodium falciparum. Grâce à une technique innovante de transformation des parasites, nous pourrons réduire drastiquement le nombre d’animaux nécessaires, tout en obtenant des résultats robustes qui permettront d’ouvrir de nouvelles voies de lutte contre cette maladie toujours aussi dramatique.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre le paludisme ne sont plus assez efficaces, car les parasites deviennent de plus en plus résistants. Il est donc urgent de trouver de nouveaux médicaments pour éliminer cette maladie. Pour cela, il faut chercher des solutions innovantes et viser de nouvelles cibles afin de limiter l’apparition de résistances. Notre projet va aider à mieux comprendre la biologie du parasite responsable du paludisme, d’abord chez la souris, puis chez l’Homme.Cette meilleure compréhension pourrait permettre de découvrir de nouveaux moyens de lutter contre le paludisme, surtout dans les pays où la maladie est très présente et où les résistances augmentent.

Procédures

Dans chacune des procédures, les animaux seront infectés par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles ; il s’agit d’une injection unique. Tout au long de l’infection, environ 8 jours, un prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue sera réalisé, de manière journalière. Cette procédure ne prend que quelques secondes, et correspond à un prélèvement identique à celui de la glycémie. Finalement, à la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et un prélèvement total du sang sera fait de manière post-mortem. Au total, 2 822 souris et 150 rats seront injectés vigiles, monitorés par prélèvements sanguins et euthanasiés dans cette étude.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un léger stress lors de la contention ainsi qu’une légère douleur lors de l’injection ou du prélèvement d'une goutte de sang au bout de la queue, sur animaux vigiles. Lors de notre étude, nous atteindrons uniquement une faible parasitémie (correspondant au nombre de globules rouges infectés sur la totalité des globules rouges). À ce niveau-là, aucun signe clinique n’est à prévoir. Cependant, dans les cas rares de paludisme cérébral, la parasitémie reste faible, mais les souris peuvent développer des signes cliniques tels que : l’apparition de mouvements du corps désordonnés ou mal contrôlés, puis paralysie partielle allant jusqu’au coma irréversible.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures, pour récupérer le sang contenant les parasites pour la suite des analyses in-vitro.

Remplacement

Plasmodium falciparum est le parasite responsable du paludisme le plus dangereux pour l’Homme. Pour bien comprendre comment il vit et se développe, il faudrait l’étudier directement dans un organisme vivant, mais cela est très difficile. Cependant, il existe un parasite très proche, Plasmodium berghei, qui infecte les rongeurs et que l’on peut étudier de manière in vivo. Cela permet de mieux comprendre le cycle de vie du parasite et donc de pouvoir lutter plus efficacement contre la maladie. Pour cette étude, nous ne pouvons pas remplacer complètement l’étude sur les rongeurs, mais nous faisons d’abord le plus d’expériences possibles en laboratoire pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux dans nos recherches, nous avons mis en place une méthode innovante permettant d’étudier plusieurs gènes en une seule expérience. Plutôt que de tester un gène à la fois, nous pouvons désormais modifier une centaine de gènes en une seule étape, en infectant un seul groupe de souris, réduisant considérablement le nombre d’animaux nécessaires. De plus, Plasmodium berghei infecte systématiquement les rongeurs, ce qui nous permet d’optimiser nos expériences en utilisant le strict minimum d’animaux. Le nombre de rongeurs est calculé en fonction de la quantité de globules rouges infectés dont nous avons besoin pour nos analyses.

Raffinement

Avant l’expérimentation, durant toute la période d'acclimatation d'une durée d'une semaine minimum, les souris sont manipulées de manière journalière pour éviter un stress lors de l'expérience. Lors des expérimentations, les animaux seront manipulés et injectés le plus rapidement possible, de manière à les remettre avec leurs congénères rapidement, et ainsi éviter un trop grand stress d’isolement. Lors de notre étude, nous nous limiterons à de faibles taux de parasitémie. Cela nous permettra d’obtenir une quantité de parasites suffisante pour une étude robuste, tout en évitant l’apparition de signes cliniques chez l’animal. Les animaux seront monitorés de manière journalière, l'observation de leur comportement ainsi qu'un examen clinique sera retranscrit sur une grille de score, que nous avons établi préalablement, et qui permettra de s'assurer de leur bonne santé. Cette grille comporte des critères considérés comme points limites, s’ils sont atteints les animaux seront immédiatement euthanasiés, afin d'éviter toute souffrance animale

Choix des espèces

Les recherches sur Plasmodium falciparum nécessitent généralement des modèles animaux complexes, comme certains singes ou des souris génétiquement modifiées, qui sont rares, difficiles à élever et très coûteux. Grâce à un génome très proche de ce dernier, nous pouvons utiliser Plasmodium berghei, qui infecte naturellement les rongeurs, pour mieux comprendre le paludisme humain. De plus, ces parasites murins ne présentent aucun risque pour l’Homme et ne se transmettent entre rongeurs que par la piqûre de moustiques Anopheles, absents en France métropolitaine. Nous utilisons des souris et des rats âgés de 8 à 12 semaines, car à cet âge, ils sont assez développés pour fournir un volume de sang suffisant pour nos analyses, tout en restant en bonne santé pour supporter l’infection.

Privés du gène de l'immunoglobuline D par ciseaux moléculaires, les poissons zèbres créés dans ce projet perdent une partie de leurs défenses et deviennent plus sensibles aux infections. 900 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un génotypage par section d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, geste de moins de deux minutes qui peut réduire son activité de nage et modifier sa prise alimentaire dans la journée. Seuls 50 hétérozygotes de la première descendance sont maintenus pour produire la génération suivante, dont les œufs partiront vers un autre laboratoire pour y être infectés par des virus, les 850 autres étant tués.

Objectifs

Malgré la conservation évolutive dans le système immunitaire de l'immunoglobuline D (IgD), les fonctions spécifiques de cette Immunoglobuline restent une énigme. Le rôle précis de l'IgD lorsqu'elle est exprimée avec d'autres immunoglobulines à la surface des cellules immunitaire (cellules B) n'a été clarifié ni chez les poissons ni chez les mammifères. On pense que l’IgD joue un rôle important dans les muqueuses mais son rôle exact n’est pas encore bien compris. Pour mieux comprendre la fonction de l’IgD nous allons utiliser le modèle poisson zébrafish qui produit aussi ces immunoglobulines D au niveau des cellules immunitaires B. Pour cela, nous créerons deux lignées de poissons-zèbres dont le gène de l’IgD aura été inactivé grâce à la technique des ciseaux moléculaires : les Crispr/Cas9. Dans un deuxième temps et dans un autre laboratoire (nouvelle demande d'autorisation de projet), les poissons mutants seront soumis à des infections virales afin d’étudier les effets de l’absence d’IgD sur leur système immunitaire.

Bénéfices attendus

Malgré la conservation évolutive de l'IgD, les fonctions spécifiques de cette immunoglobuline restent une énigme. C'est pourquoi la génération de mutants de poisson zèbre dépourvus de l'expression de l'IgD serait un outil extrêmement précieux pour comprendre le rôle de l'IgD à la fois lorsqu'elle est sécrétée et lorsqu'elle est co-exprimée avec l'IgM à la surface des cellules. Plus précisément, cela nous permettrait de déterminer comment l'absence d'IgD affecte la réponse immunitaire aux agents pathogènes qui pénètrent dans l'hôte par les voies muqueuses et comment elle conditionne la réponse IgM. Le fait de disposer de ces poissons sera déterminant pour clarifier le rôle immunitaire de cette immunoglobuline énigmatique.

Procédures

Ce projet concerne uniquement la création de 2 lignées mutantes n'exprimant pas le gène de l'immunoglobuline. Pour l'établissement de ces lignées, une procédure de génotypage (section d'un fragment de nageoire caudal) sera réalisé sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l'anesthésie et de la récupération à l'anesthie du poisson compris.

Impact sur les animaux

L’inactivation du gène codant l’IgD peut entraîner une altération des fonctions immunitaires. Ainsi: la reconnaissance des microbes et la régulation des cellules immunitaires sont altérées.Les animaux pourraient être un peu plus sensibles aux infections ou au stress environnemental. Cependant, d’autres anticorps (comme l’IgM) peuvent compenser partiellement cette absence, donc les effets ne sont pas toujours graves, mais ils peuvent apparaître dans certaines conditions (infection, changement d’environnement, etc.). Le génotypage est invasif (prélèvement d'un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l'anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l'activité de nage. L’anesthésie pratiquée pour le prélèvement de fragment de nageoire peut aussi entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.

Devenir

Ce projet vise à créer 2 lignées mutantes pour étudier le fonctionnement du système immunitaire après l’inactivation de l’Immunoglobuline D. Seuls les 2 x 25 animaux hétérozygotes de la première descendance seront maintenus en vue de la production de la descendance suivante.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du fonctionnement du système immunitaire. Il n’existe donc pas d’alternative à l’expérimentation in vivo pour étudier le rôle du gène IgD dans la fonction des cellules B du système immunitaire et les interactions avec les autres cellules immunitaires.

Réduction

In fine, il s’agit de créer 2 lignées pures (dans la descendance de 2ème génération) présentant une inactivation du gène de l'immunoglobuline D. Pour cela, par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus de la porteurs de mutations intéressantes (génération fondatrice). Au maximum 150 de ces individus atteindront le stade adulte selon les chiffres habituels. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygotes (possédant des copies de gènes différentes) en descendance de 1ère génération lorsque les animaux fondateurs sont croisés avec des animaux de génotype naturel. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes de la génération de 1ère descendance produira une descendance de deuxième génération homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif obtenu). Après validation de chacune des lignées, nous produirons et conserverons un minimum de poissons respectant dans le même temps la demande en œufs de cette descendance pure contenant 100 homozygotes mutants complets.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce. Les différents paramètres de suivi sont relevés quotidiennement. Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en densité optimale . Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à l’invalidation génique de IgD) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien-être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier) et la SBEA sera immédiatement avertie. La procédure de génotypage (permettant d'estimer le taux de mutants) qui consiste en un prélèvement de fragment de très petite taille durera moins de 2 minutes, temps d'anesthésie et réveil du poisson compris.

Choix des espèces

La demande concerne la fourniture de 2 lignées zébrafish présentant une inactivation de gène en vue de test infectieux. Le zébrafish est un poisson osseux qui possède un système immunitaire adaptatif fonctionnel. Le zébrafish exprime les immunoglobulines communes aux mammifères. Dans le cas de zébrafish présentant une mutation de gène, cela permet de réaliser des cribles en conditions infectieuses à grande échelle, ce qui est non réalisable chez les mammifères. De plus, le poisson zèbre est une espèce chez laquelle les outils d’édition de génome peuvent être appliqués de manière simple en raison du très fort taux de fécondité chez cette espèce et du développement rapide : 1 animal mature sexuellement peut être obtenu en 3 mois. Il est possible de produire beaucoup d’individus avec un gène inactivé plus rapidement que chez d’autres modèles vertébrés. Les animaux seront utilisés au stade adulte (pour la génération fondatrice et les animaux de 1ère génération) pour la création de lignée puis les œufs de la 2ème génération seront fournis au demandeur pour la suite des expérimentations (tests ultérieurs d’infection virale non réalisés par notre laboratoire). Au préalable, une vérification du taux de transmission de la mutation sera faite sur des alevins de la 2ème génération âgés de 1 mois. Cela permettra aussi de vérifier la qualité phénotypique et comportementale des individus cette 2ème génération.

7 960 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 7 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur prélevé sur une personne atteinte de mélanome métastatique, puis un traitement quotidien par injection ou gavage pouvant se poursuivre pendant cinquante semaines. Le porteur mentionne comme suites l'inflammation locale et les plaies que les souris se font en se grattant à cause de la tumeur, et indique que certaines seront tuées quand elles seront trop âgées pour la reproduction. Les bénéfices annoncés tiennent en deux lignes, mieux comprendre la biologie du mélanome et tester des combinaisons thérapeutiques, pour un effectif de près de huit mille souris dont le calcul ne s'appuie que sur "un outil mathématique".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements sur les mélanomes cutanés. Ceci permettra de proposer des solutions à des patients en échec thérapeutique et d’étudier les mécanismes de la croissance tumorale in vivo. POur cela nous avons besoin d'implanter dans des souris des fragments de tumeurs issus de patients atteint de mélanome métastatique afin de pouvoir tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques dans les conditions les plus proche possible de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettre une meilleure compréhension de la biologie du mélanome et de tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques qui pourronts bénéficier aux patients atteint de ce type de cancer.

Procédures

La principale nuisance sera due à l'implentation de tumeur sous-cutanée après anesthésie/analgésie des animaux ainsi qu'aux traitements quotidiens avec des molécules à visé thérapeutique. La durée maximale des traitement sera de 50 semaines. Ces administrations par injection ou gavage ne prendront pas plus de 10 secondes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles seront: - léger inconfort produit par les contention, injections et gavages. Ces opérations auront une durée maximum de 10 secondes chacunes; - implantation de tumeur sous-cutanée; - inflammation locale due à la croissance tumorale; -plaies dues à une prurit cutané consécutif à la croissance tumorale.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort lorsqu'ils seront trop âgés pour la reproduction ou à la fin des procédures expérimentales, afin de pouvoir prélever les tumeurs et réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Nous caractériserons et testerons tout d’abord nos composés in vitro, puis nous sélectionnerons les plus efficaces sur les cellules tumorales et les moins toxiques pour les cellules normales. Il sera ensuite nécessaire de passer à l'expérimentation sur des rongeurs afin d'avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer les traitements les plus efficaces avec les modèles cancéreux utilisés. Cette étape est cruciale avant de développer ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait de pallier l’échec des traitements actuels.

Réduction

Les nombres d’animaux utilisés dans nos groupes expérimentaux ont été déterminés en utilisant un outil mathématique qui permet de définir l’effectif d’unités expérimentales à prévoir afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage. Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux qui permettra l’arrêt de l’expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance. Les souris sont maintenues et manipulées dans un environnement stérile. Leurs alimentation et leur eau de boisson est également stérile. L’ensemble de ces conditions d’hébergement permettent ainsi d’éviter aux animaux de contracter des pathologies infectieuses.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont le patrimoine génétique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction rapide et une taille réduite, ce qui facilite son hébergement. Nous utiliserons un modèle de souris immunodéficiente (c'est-à-dire dépourvue de système immunitaire), un modèle préclinique permettant l’étude in vivo des effets de traitements sur le développement de tumeurs chez les patients. L’injection de cellules tumorales sera réalisée sur des animaux âgés de 6 à 12 semaines, afin d’éviter toute interférence entre la formation de tumeurs et la croissance et le développement de l’animal.