Recherche fondamentale

Tuées pour que leurs yeux soient prélevés et l'innervation de leur cornée examinée, 189 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral leur est injecté dans la glande lacrymale et dans la cornée, avec des sutures posées dans la joue, puis un mois plus tard la surface de leur œil est abrasée ou le nerf cornéen sectionné pour mimer une blessure. Le porteur indique que les souris se frottent et peuvent perdre deux ou trois points de suture par joue, ce qui augmente le risque d'infection, et compare la douleur des 72 heures suivant l'abrasion à celle d'un grain de sable dans l'œil. Il conclut que la souris est "le seul modèle" permettant d'explorer cette maladie rare dans son ensemble.

Objectifs

L'œil est protégé par une surface transparente : la cornée. Il s’agit du tissu contenant le plus de nerfs du corps humain. L’extrémité des nerfs se trouve à la surface de la cornée afin de capter les stimulations et agressions extérieures. Ces nerfs confèrent une grande sensibilité à la cornée qui est elle-même protégée par les larmes (rendant la surface de l'œil en permanence humide). Tous ces éléments fonctionnent ensemble formant un équilibre fragile. La moindre atteinte de cet équilibre peut entraîner des défauts de la cornée pouvant eux-mêmes rendre aveugle le patient. Cette situation se déroule typiquement dans la maladie que l’on appelle la kératite neurotrophique, une maladie neurodégénérative rare touchant 5 personnes sur 10 000 en Europe. Elle entraîne la mort des nerfs et donc à terme une perte de sensibilité et de vision. A l’heure actuelle, les traitements disponibles sont limités (gouttes) et les formes sévères de la maladie nécessitent une greffe de cornée. Or, la greffe reste une intervention lourde avec un taux de rejet élevé en plus d’une efficacité souvent temporaire. On se trouve en impasse thérapeutique où le manque de thérapies innovantes constitue un frein majeur à l’avancée scientifique. L’objectif du projet serait donc d’aider à la croissance de ces nerfs contenus dans la cornée qui auront été altérés par la maladie. Or, la repousse des nerfs une fois altérés est un processus long (plusieurs semaines). Le but ici est d’accélérer ce processus en se focalisant sur le facteur responsable de la repousse des nerfs. L’hypothèse de l’équipe repose sur la stimulation de la production d’un facteur particulier déjà contenu dans les larmes mais en quantité limitée. Pour atteindre une production satisfaisante et un effet bénéfique sur les nerfs de la cornée, la technique utilisée est l’injection du facteur en question dans la glande lacrymale (responsable de la production des larmes) ainsi que l’injection de son récepteur dans la cornée. Ainsi, en produisant les larmes, la glande lacrymale produira une grande quantité du facteur d’intérêt qui sera contenu dans les larmes. Ces dernières, une fois à la surface de l'œil, permettront au facteur de se lier directement à son récepteur qui aura été injecté au préalable dans la cornée. On parle donc de double injection (ou de double thérapie génique).

Bénéfices attendus

Dans ce contexte, notre approche innovante de thérapie génique ciblant à la fois la glande lacrymale et l’innervation de la cornée vise à induire la repousse des nerfs de la cornée. Ce travail pourrait ainsi ouvrir la voie à une stratégie thérapeutique curative pour la kératite neurotrophique (KN), en s’attaquant directement au manque d’innervation à l’origine de la maladie rare. Enfin, ce travail devrait aboutir à des publications scientifiques dans des revues à comité de lecture, et potentiellement à un ou plusieurs dépôts de brevet, assurant ainsi une valorisation scientifique et technologique du projet.

Procédures

Un vecteur viral est comme une petite « enveloppe » qu’on utilise pour transporter un message (le gène qu’on veut introduire) vers une cellule afin de soigner une maladie. Celui-ci va être injecté dans un organe cible, c’est ce qu’on appelle la thérapie génique. Dans notre cas, on réalise une injection dans la glande lacrymale, qui sécrète les larmes, couplée à une injection dans la cornée, communément réalisée chez l’Homme avec des antibiotiques. Pour cela, les animaux seront anesthésiés puis recevront une dose d’antidouleur. Les injections se réalisent en une fois pour une durée totale de 7 minutes environ. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil. Un mois après l’injection, on vient réaliser une blessure sur l’œil afin de mimer une maladie ou un accident : l’abrasion ou l’axotomie. Ces deux techniques (5min environ) ne traversent par la barrière protectrice de l'œil, elles restent donc des méthodes n’impliquant pas de défauts profonds à l'œil. Celles-ci sont réalisées en une seule fois sur animaux également endormis ayant à leur tour reçu une dose d’antidouleur. Les souris sont suivies de façon journalière après les procédures afin de prévenir les risques. Les prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne sont effectués en amont et en aval des chirurgies. Le test de sensibilité est réalisé 3 jours consécutifs afin d’avoir une moyenne la plus juste. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention.

Impact sur les animaux

Des résultats antécédents au projet ont montré que l’injection dans la cornée n'entraîne pas de traumatisme au niveau de la cornée. Toutefois, la qualité des injections peut varier en fonction de l’expérimentateur ; les souris seront donc scrupuleusement surveillées dans les jours suivant la chirurgie. En revanche, les sutures effectuées au niveau de la joue de la souris peuvent entraîner des sensations de tiraillement, malgré la réalisation minutieuse des points. Il arrive que les souris se frottent, ce qui peut provoquer la perte de deux ou trois points par joue, augmentant ainsi le risque d’infection de la plaie. C’est précisément pour cela que les animaux sont sous surveillance pendant les jours qui suivent l’opération. La modélisation d’une blessure de la cornée chez la souris pourra impliquer une douleur passagère dans les 72h suivant la manipulation, douleur comparable à une sensation d’irritation causée par la présence d’un grain de sable dans l'œil. Aussi, le stress d’être manipulé peut être retenu. L’axotomie quant à elle ne détruit pas la surface de la cornée, la dégénérescence des fibres au centre de la cornée n’induit pas de douleur mais au contraire une perte de sensibilité. Pour le test de sensibilité cornéenne, les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 min, une fois par jour, pendant 3 jours consécutifs sur plusieurs semaines afin d’évaluer la régénération de l’innervation (4 +/- 1 semaines).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet des procédures sur l’innervation de la cornée.

Remplacement

La souris comme modèle de pathologie humaine, telle que la kératite neurotrophique, est un excellent système intégrant la complexité des interactions entre les différents éléments de la cornée (nerfs, cellules de surface et larmes). Ces intéractions, à l’origine de l’équilibre naturel de l’œil, se mettent en place durant des mois, et impliquent de nombreux types de cellules, elles ne peuvent donc pas être mimées in vitro (hors organismes vivants, c'est-à-dire dans des boîtes de pétri). Seuls les mammifères présentent la diversité des échanges cellulaires et moléculaires entre les structures de l'œil. Le modèle souris présentant une atteinte des nerfs de la cornée est donc le seul modèle qui permet d’explorer la maladie de la KN dans son ensemble (morphologie, aspect, chimie…). Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour étudier la complexité du projet et la pathologie. Le modèle murin présente l’avantage d’être peu coûteux et de se développer rapidement. Les souris que nous utiliserons présentent une forte variabilité génétique, reflétant celle observée chez les patients humains.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux et de respecter la règle des 3R, un calcul est réalisé à l’aide d’un logiciel. Cette analyse nous permet d’optimiser la quantité d’animaux (ici 189 souris) tout en garantissant un nombre suffisant de souris par condition pour effectuer par la suite les tests statistiques nécessaires. Cette estimation rigoureuse vise à assurer la robustesse des résultats tout en évitant la reproduction inutile des expériences.

Raffinement

Pendant la période d’acclimatation, les procédures habituelles seront appliquées : contacts et observations quotidiens par les soigneurs, hébergement en groupe d’au moins deux individus, et mise en place d’un environnement adapté et enrichi. La durée et la répétition des expérimentations sont rigoureusement réfléchies, afin de limiter au maximum les contraintes pour les animaux, notamment en évitant toute anesthésie répétée. Puisque les animaux seront soumis à des manipulations et contentions journalières rapides (≤2min) nécessaires aux expérimentations, nous mettrons en place une période d’habituation afin de limiter l'angoisse et familiariser les animaux aux expérimentateurs. L’état général, le poids, et le comportement des animaux seront suivis régulièrement pour détecter toute altération. Si nécessaire, un animal présentant des signes de souffrance sera retiré de l’expérimentation et pris en charge conformément aux recommandations vétérinaires. L’animal sera placé sous anesthésie générale durant toute la durée des injections, de l’abrasion cornéenne, et de l’axotomie avec l’administration de médicaments anti-douleur et anesthésiques appropriés. Un suivi quotidien avec la grille de scoring permettra qu’en cas de douleur l’animal soit immédiatement pris en charge. L'œil est formé de telle manière qu’une abrasion superficielle comme celle-ci n’impactera en rien l’intégrité de l'œil, mais simplement la couche la plus superficielle de la cornée. Nos précédentes expériences ont montré qu’une marge supplémentaire de 5 % est nécessaire afin de pallier les pertes potentielles liées à l’anesthésie, ainsi qu’aux complications post-opératoires telles que le développement d’ulcères cornéens. Les animaux développant de telles complications sont retirés de l’étude, les points limites sont décrits dans la procédure. Les animaux en sus seront intégrés aux expérimentations en cours, permettant ainsi d’augmenter la puissance statistique des analyses.

Choix des espèces

La lignée de souris utilisée présente une grande variabilité génétique en raison de l’absence de consanguinité, ce qui en fait un modèle proche des humains. Nous étudions des souris âgées de 12 semaines car c’est à cet âge que la cornée est mature et que l’animal a dépassé la puberté.

376 souris génétiquement modifiées pour développer un glaucome vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque jour pendant 28 jours, elles reçoivent un collyre conservateur dans les yeux, avec des prélèvements de larmes et des mesures de sensibilité cornéenne répétées trois jours de suite sur animaux vigiles, puis elles sont tuées pour que leurs yeux soient analysés. Leurs yeux peuvent grossir jusqu'à empêcher la fermeture des paupières, et l'animal est alors tué immédiatement. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne suffisent pas et que l'action du conservateur doit être observée sur un œil complet et fonctionnel, ce qui rend selon lui ces expériences "indispensables".

Objectifs

Les collyres, ou gouttes pour les yeux, sont très utilisés pour traiter certaines maladies comme le glaucome. On y ajoute souvent des conservateurs pour que le produit reste efficace et sans danger plus longtemps. Le glaucome est une maladie fréquente après 40 ans, qui touche jusqu’à 10 % des personnes après 70 ans. Elle abîme lentement le nerf optique, ce qui réduit le champ de vision, jusqu’à la cécité si elle n’est pas traitée à temps. Le traitement repose sur l’usage quotidien de collyres dont beaucoup contiennent des conservateurs. Mais au bout de quelques mois, beaucoup de patients ressentent une gêne : la surface de l’œil devient moins sensible, et les opérations deviennent plus difficiles à cause d’une inflammation. Nos recherches ont montré que les conservateurs peuvent abîmer les nerfs de la cornée, la surface transparente de l'œil, ralentissant la régénération naturelle de cette zone fragile. Cela rend l’œil plus vulnérable, et peut aller jusqu’à former des plaies (ulcères), nécessitant parfois une greffe de cornée : une opération lourde, avec des résultats souvent temporaires. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de ce conservateur sur la cornée dans un contexte de glaucome. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris qui développe la maladie de façon naturelle et progressive, comme chez l’humain. Nous mesurerons différents indicateurs, comme la sensibilité de la cornée, la pression dans l’œil, ou encore la qualité des larmes. D’autres examens, comme des photos du fond de l’œil ou des tests de réponse à la lumière, permettront de suivre l’évolution de la maladie. Grâce à cette étude, nous espérons mieux évaluer les effets secondaires des collyres avec conservateurs et, à terme, améliorer les traitements pour les patients atteints de glaucome.

Bénéfices attendus

Dans le glaucome, surtout lorsque les patients sont traités avec des collyres contenant des conservateurs, la perte de vision peut évoluer lentement. Cela donne un certain délai pour agir, mais une fois les lésions installées, elles sont irréversibles. Aujourd’hui, les options de traitement restent limitées : certains collyres permettent de contrôler la pression dans l’œil au début de la maladie, mais quand celle-ci progresse, la vision peut être fortement altérée. Dans certains cas, les collyres irritants abîment aussi la surface de l’œil, ce qui complique les soins. Cela peut mener à des atteintes de la cornée graves, parfois nécessitant une greffe. Mais cette solution reste lourde, avec un risque de rejet et un bénéfice souvent temporaire. Notre projet vise à mieux comprendre les effets des conservateurs présents dans les gouttes et du glaucome sur la cornée. En identifiant les changements précoces au niveau cellulaire, nous espérons ouvrir la voie à de nouveaux traitements plus ciblés et mieux tolérés. Ces recherches pourraient donner lieu à des publications scientifiques et peut-être à des dépôts de brevets, valorisant les résultats du projet à l’échelle médicale et technologique.

Procédures

Les souris génétiquement modifiées sont génotypées à l'aide d'un morceau de queue de moins de 2mm prélevé avant l’âge de 10 jours, le prélèvement dure environ 1min. Le projet implique ensuite l’administration quotidienne de gouttes (pendant 28 jours), ainsi que la réalisation de prélèvements de larmes et la mesure de la sensibilité cornéenne avant et après traitement, sur des animaux vigiles. La mesure de la sensibilité se fait sur 3 jours afin de faire une moyenne des résultats. Ainsi, ces procédures sont de courte durée. Les souris sont contentionnées pendant 1 à 2 minutes maximum par animal, mais leur caractère répété nécessite une attention particulière. Afin de limiter le stress induit par la contention, les souris seront habituées progressivement à la manipulation dès le sevrage. Cette habituation permet de réduire considérablement les réactions de défense, en favorisant une meilleure tolérance aux gestes techniques. Les traitements oculaires sont appliqués de manière non-douloureuse, avec une goutte de collyre déposée délicatement sur chaque œil pendant 30 secondes. Les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté, afin d’assurer une gestuelle rapide et précise, minimisant l’impact sur les animaux. Les animaux seront mis à mort pour prélever les yeux qui seront ensuite analysés. Aucun prélèvement invasif ne sera effectué sur animaux vivants.

Impact sur les animaux

Le glaucome est une maladie chronique de l’œil qui évolue lentement et peut entraîner une perte totale de la vue s’il n’est pas traité. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris génétiquement modifié qui présente une mutation sur le gène jouant un rôle essentiel dans le développement de l’œil. Ce modèle est bien connu grâce à des recherches précédentes. Les souris glaucomateuses présentent une perte progressive de la vue, mais cela n’affecte ni leur santé générale ni leur espérance de vie. Chez la souris, la vue n’est pas le sens principal, et cette baisse de vision n’a pas de conséquences visibles sur leur comportement : elles continuent à manger, interagir normalement et prendre soin de leurs petits. Les souris peuvent développer une augmentation anormale de la taille des yeux, comme cela peut arriver chez les personnes atteintes de glaucome. Si les yeux deviennent tellement gros que l’animal ne peut plus fermer les paupières, il ne poursuivra pas l'expérimentation et sera euthanasié immédiatement pour éviter toute souffrance. Les traitements utilisés lors de cette étude sont couramment utilisés chez l’humain, agissant uniquement sur l’œil et n’étant pas douloureux. Toutes les expériences seront menées sur des animaux jeunes (moins de 5 mois), avant que la perte de vision ne devienne importante. Les souris recevront quotidiennement des collyres et seront manipulées brièvement pour ces soins. Ces gestes peuvent générer un peu d’angoisse, mais un programme d’habituation est prévu pour qu’elles s’y adaptent en douceur. Les manipulations seront aussi espacées et limitées dans le temps, afin d’éviter un stress inutile ou des anesthésies répétées, en accord avec les bonnes pratiques en matière de bien-être animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever des yeux afin d’étudier l’effet du conservateur sur les différentes structures du segment antérieur (cornée, iris, cristallin).

Remplacement

Il est encore très difficile de reproduire toute la complexité d’un organe comme l’œil en laboratoire, notamment ses différentes structures et leur fonctionnement coordonné. C’est pourquoi les tests uniquement réalisés « in vitro » (c’est-à-dire sur des cellules en culture) ne suffisent pas pour étudier certaines maladies oculaires. Dans notre projet, nous utilisons un modèle animal qui développe le glaucome. Ce modèle est essentiel car il permet de mieux comprendre comment la maladie évolue dans un organisme vivant. De plus, les conservateurs présents dans les collyres peuvent avoir des effets secondaires sur l’œil. Pour les étudier de manière fiable, il est nécessaire d’observer leur action dans un contexte réel, c’est-à-dire sur un œil complet et fonctionnel, avec tous ses mécanismes de défense, d’irrigation et de régulation. C’est pour cela que les expérimentations doivent se faire sur un organisme vivant : elles sont indispensables pour comprendre précisément l’impact de ces substances dans un cadre pathologique comme celui du glaucome.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été soigneusement réfléchi. Il a été calculé à l’avance afin d’avoir assez d’animaux pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique, tout en évitant de multiplier inutilement les tests. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en garantissant que les expériences n’auront pas besoin d’être répétées. Les analyses prévues permettront de comparer les différents groupes traités de manière rigoureuse, en utilisant des méthodes statistiques adaptées. Au total, sur toute la durée du projet (42 mois), un maximum de 376 souris sera utilisé, avec une petite marge de sécurité de 16 animaux supplémentaires, pour pallier d’éventuelles pertes imprévues. Par ailleurs, des souris mâles et femelles seront incluses afin d’assurer une bonne représentativité dans les résultats.

Raffinement

Pendant la période d’adaptation, les souris seront suivies chaque jour par les soigneurs, logées par petits groupes (au moins deux par cage) et bénéficieront d’un environnement confortable et stimulant. La mise en place de points limite permet de retirer les animaux de l'expérimentation afin d'éviter toute forme de souffrance (physique et psychique). Pour les examens comme le fond d’œil, la mesure de la pression oculaire, les animaux seront endormis grâce à une anesthésie générale. Ils ne ressentiront donc ni douleur ni gêne pendant les procédures. De plus, les souris ne seront pas gardées au-delà de 16 semaines, ce qui permet d’éviter les effets tardifs du glaucome, notamment la perte de vision qui apparaît habituellement vers 8 mois.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris pour ce projet car c’est un modèle bien connu, couramment utilisé en recherche médicale, notamment pour les maladies de l’œil. Sa petite taille, sa reproduction rapide et le fait qu’elle partage de nombreuses similarités génétiques avec l’être humain en font un outil précieux pour mieux comprendre certaines pathologies. Dans notre étude, nous utilisons des souris transgéniques porteuses d’une mutation connue pour provoquer un glaucome, une maladie oculaire fréquente chez l’humain. Ce modèle a déjà été bien étudié et permet de reproduire les signes du glaucome de manière fiable. Les expériences seront réalisées sur des souris jeunes, âgées de moins de 16 semaines. À cet âge, les animaux sont en bonne santé, ne présentent pas encore de perte de vision liée à la maladie, et les examens seront effectués sans douleur, sous anesthésie. Ce choix permet également de limiter le stress et d’éviter toute souffrance liée à l’évolution de la maladie. Ainsi, ce modèle permet d’étudier de manière précise l’impact de certains traitements sur l’œil, dans un cadre contrôlé, tout en garantissant des conditions éthiques et respectueuses du bien-être animal.

Mesurer si l'exposition des parents à une eau chaude se répercute sur leur descendance conduit ici à chauffer l'eau de 26 à 33 °C, par paliers d'un degré toutes les deux heures. 96 poissons medaka, 56 femelles et 40 mâles, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leurs ovaires et leurs testicules. Le porteur attend un stress thermique léger, avec réduction de l'exploration, repli dans les coins et nage désorganisée, tout en indiquant que les études antérieures du centre n'ont jamais rapporté de tels changements. Il qualifie de "non invasive" la collecte de sperme obtenue en pressant l'abdomen des mâles anesthésiés, geste répété au début puis à la fin du projet.

Objectifs

Au cours des dernières décennies, le changement climatique et le réchauffement global ont eu des impacts profonds et étendus sur les écosystèmes aquatiques, affectant particulièrement la physiologie et la biologie moléculaire des poissons. De nombreuses études ont démontré que l'augmentation de la température de l'eau peut compromettre le succès reproductif des poissons en perturbant l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique et en modifiant la signalisation hormonale. Cependant, des hypothèses émergentes suggèrent que l'exposition parentale au stress avant la fertilisation pourrait influencer la descendance par des mécanismes d'héritage non génétique. Ces mécanismes, qui n'impliquent pas de modifications de la séquence ADN ni de transmission d'allèles génétiques, pourraient jouer un rôle significatif dans la transmission de traits à la fois avantageux et délétères à la génération suivante. Les recherches chez les mammifères, notamment les rongeurs, ont fortement appuyé ce concept en démontrant que le stress paternel peut engendrer des effets durables sur le comportement et la physiologie de la descendance via un héritage non génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet explorera comment l’exposition des poissons parents à des températures élevées durant le développement des gamètes affecte le succès reproductif. Nous étudierons ces effets à la fois aux niveaux phénotypique et moléculaire, en mettant l’accent sur l’héritage non génétique — notamment les modifications de la composition et de l’expression des petits ARN dans les œufs, qui agissent comme des médiateurs clés des signaux environnementaux à travers les générations chez les vertébrés aquatiques. Les objectifs principaux du projet sont : 1. Évaluer la capacité du poisson medaka à s’adapter de manière transgénérationnelle aux températures élevées et identifier les vulnérabilités possibles dans la reproduction ; 2. Identifier les signaux moléculaires sensibles à la chaleur et les facteurs régulateurs chez les parents qui sont transmis via les gamètes à la génération suivante ; 3. Fournir des preuves mécanistiques démontrant comment les petits ARN contribuent à la transmission des effets environnementaux à la génération suivante ; 4. Identifier les voies moléculaires et épigénétiques induites par la température qui impactent la reproduction. Les résultats amélioreront notre compréhension de l’impact du réchauffement climatique sur l’écologie reproductive et la dynamique des populations aquatiques, tout en proposant des stratégies pratiques de gestion thermique en aquaculture. En définitive, en explorant la transmission épigénétique de l’information environnementale, notamment via les miARN, ce projet vise à améliorer les prévisions du potentiel d’adaptation chez les espèces aquatiques et à soutenir le développement de pratiques d’élevage plus résilientes face au réchauffement global.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : augmentation progressive de la température de l’eau pour les animaux des lots exposés: la température de l’eau passera progressivement de 26–27 °C à 32–33 °C, avec une augmentation d’environ 1 °C toutes les deux heures. Transfert des poissons entre les réservoirs : Le transfert des poissons du réservoir principal vers d’autres réservoirs d'une durée inférieure à 2 secondes. Collecte de sperme (1 fois au début du projet et une fois en fin de projet): pour l’échantillonnage du sperme, les mâles reproducteurs seront d’abord anesthésiés. Ensuite, en appliquant une pression douce sur la région abdominale, un petit volume de sperme (environ 1 à 2 microlitres) sera prélevé. Cette procédure est très brève (moins d’une minute) et non invasive. Prélèvement des gonades (testicules et ovaires): À la fin de l’expérience, tous les poissons de chaque groupe de température seront d’abord anesthésiés puis euthanasiés. Leurs testicules et ovaires seront soigneusement prélevés et conservés pour des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

Le stress, de manière générale, peut entraîner des modifications du comportement chez les poissons. Dans ce projet, les poissons exposés à une température de l’eau de 32 à 33 °C peuvent présenter un stress thermique léger par rapport à ceux maintenus à la température témoin de 26 à 27 °C. Ce stress thermique peut influencer le métabolisme énergétique, la prise alimentaire, ou une modification du niveau de curiosité et d’activité. Par « modification de la curiosité et de l’activité », on entend l’apparition de comportements tels qu’une réduction de l’exploration de l’environnement, un repli dans les coins, ou une nage désorganisée, qui peuvent être interprétés comme des indicateurs d’un niveau accru de stress thermique ou d’anxiété comportementale. Ces comportements seront suivis systématiquement tout au long de l’étude, à titre d’indicateurs observables de stress thermique. Ces mesures ont un caractère préventif, car les études précédemment menées sur le medaka dans ce centre, en réponse à une augmentation progressive de la température, n’ont jamais rapporté de modifications comportementales associées à un stress thermique.

Devenir

la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques, des échantillons d’ovaires et de testicules sont nécessaires. Par conséquent, après l’évaluation du phénotype reproducteur, tous les poissons seront euthanasiés afin de prélever leurs ovaires et testicules.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets non génétiques de l’augmentation de la température de l’eau sur les réponses transgénérationnelles. Il est donc essentiel d’utiliser un modèle animal capable de répondre directement aux variations de température. Les poissons, en tant qu’organismes poïkilothermes (c’est-à-dire dont la température corporelle varie en fonction de l’environnement et qui ne peuvent pas réguler leur température interne), présentent des fonctions physiologiques et comportementales très sensibles aux changements de température environnementale. Cette caractéristique rend les poissons plus pertinents que les mammifères homéothermes (animaux à sang chaud capables de maintenir une température corporelle relativement constante, tels que les souris ou les lapins) pour l’étude des effets des variations de température. De plus, l’étude des effets transgénérationnels nécessite des espèces avec un cycle reproductif court, permettant l’observation de plusieurs générations dans un délai raisonnable. Les espèces poissons comme le medaka sont adaptées en raison de leur maturation rapide. À ce jour, aucune alternative adéquate, tels que les modèles in vitro, ne peut pleinement aborder l’impact de la température élevée sur les phénotypes au niveau de l’organisme, tels que le succès reproductif, ainsi que les aspects transgénérationnels de cette étude avec une pertinence et une exhaustivité comparables.

Réduction

Un total de 96 poissons (56 femelles et 40 mâles) sera utilisé pour évaluer les phénotypes reproducteurs sous deux conditions de température. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche, le sperme et les oeufs seront d’abord prélevés chez les poissons reproducteurs mâles et femelles afin d’évaluer leur phénotype reproducteur. Après cette étape, les mêmes poissons reproducteurs seront utilisés pour le prélèvement des ovaires et des testicules Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une puissance statistique suffisante pour détecter des différences significatives entre les groupes, en utilisant des tests appropriés tels que le test t.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions optimales spécifiques à l’espèce, incluant une photopériode appropriée, une qualité de l’eau adaptée, une densité contrôlée et une gestion sanitaire rigoureuse. La seule exception concernera le groupe exposé à 32–33 °C, température qui, selon la littérature, n’induit pas de mortalité chez le medaka. Afin d’améliorer le bien-être animal, les aquariums seront enrichis avec des plantes artificielles. Les poissons seront maintenus dans des aquariums de 10 litres avec une densité maximale de 24 poissons par bac. Toutes les manipulations animales — y compris l’induction de la ponte, la collecte des œufs et du sperme — seront réalisées par du personnel compétent avec soin et rapidité afin de minimiser le stress. Le personnel portera des gants en nitrile et les poissons seront transférés à l’aide d’épuisettes de petite taille, en limitant au maximum le temps de manipulation. La collecte des œufs sera effectuée de manière douce, rapide et non invasive. La collecte du sperme et des gonades (ovaires et testicules, prélevés en fin d’expérience), qui nécessite une manipulation précise, sera réalisée sous anesthésie afin de limiter l’inconfort. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel formé de l’animalerie pour surveiller leur état de santé et leur comportement. Tout poisson présentant des signes d’infection ou des troubles de santé sera examiné par la personne responsable désignée du laboratoire, qui déterminera les soins appropriés, incluant l’euthanasie si nécessaire. Par ailleurs, l’unité est dotée d’une structure Bien-Être Animal de l’établissement, et qui est consultée pour chaque demande d’autorisation de projet garantissant l’application continue des techniques de raffinement les plus récentes. Celles-ci comprennent notamment l’enrichissement de l’environnement, comme l’ajout de plantes artificielles, afin d’optimiser les conditions d’élevage. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, formé spécifiquement pour l’espèce et mettant régulièrement à jour ses compétences afin de maintenir des standards élevés de soins aux animaux.

Choix des espèces

Le poisson medaka (Oryzias latipes) a été choisi comme espèce modèle en raison de ses avantages biologiques et expérimentaux en accord avec les objectifs du projet. Le medaka possède un temps de génération court (environ 3 mois), ce qui permet une évaluation rapide des effets intergénérationnels et épigénétiques. Sa reproduction continue et quotidienne offre un accès répété à des œufs à différents stades, idéal pour les analyses moléculaires et phénotypiques. La fécondation et le développement embryonnaire externes permettent un contrôle strict de l’environnement après la fécondation, réduisant les effets maternels confondants et favorisant une investigation précise des facteurs pré-fécondation. De plus, le medaka bénéficie d’un génome entièrement séquencé et de ressources moléculaires importantes (par exemple, bases de données bioinformatiques), ce qui en fait un modèle puissant pour l’étude des interactions gène-environnement. Ces caractéristiques rendent le medaka un modèle fiable, reproductible et éthiquement gérable pour les études multigénérationnelles. Dans cette étude, les poissons sont à l’état adulte afin d’évaluer précisément le phénotype reproducteur, de collecter les œufs et de réaliser les analyses moléculaires nécessaires.

Un virus injecté dans une zone précise du cerveau et une canule reliée à une pompe osmotique implantée sous anesthésie, en trente minutes d'opération, puis dix-huit semaines de tests métaboliques avec injections dans l'abdomen et prises de sang sur animal vigile. 1 180 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourries dès cinq semaines d'un régime enrichi en graisses et isolées en cage individuelle quand la prise alimentaire doit être mesurée. Le porteur annonce des variations du comportement alimentaire "sans entraîner de souffrance" et des effets indésirables "modérés et transitoires", tout en décrivant des jeûnes, une perte de poids et une mobilité réduite après l'opération. Toutes finissent par une chirurgie terminale sans réveil, pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

Nous étudions comment le cerveau contrôle la faim et le poids. Certaines cellules du cerveau aident le corps à savoir quand manger. Dans ces cellules, une protéine appelée CaMK1D joue un rôle clé pour réguler l’appétit. Si cette protéine est trop active, elle peut favoriser l’obésité et le diabète. Nous avons identifié un autre acteur important dans cette même voie, appelé CALHM6, qui agit agir comme un frein naturel : lorsqu’il est très présent, il envoie des signaux chimiques qui ralentissent l’activité des cellules qui stimulent la faim, ce qui aide à réduire l’appétit. L’objectif de notre projet est de mieux comprendre ce mécanisme pour savoir comment il régule la prise alimentaire et l’équilibre énergétique : Observer ce qui se passe quand CALHM6 est absent : nous voulons voir si les souris mangent plus ou moins et comment leur métabolisme est affecté. Comprendre comment CALHM6 agit : en modifiant l’activité de cette molécule, nous voulons savoir comment elle influence la faim et le comportement alimentaire des souris. En résumé, ce projet vise à découvrir les signaux qui contrôlent la faim, ce qui pourrait aider à mieux comprendre l’obésité et les troubles liés au métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau contrôle la faim et l’équilibre énergétique. Nous étudions une molécule appelée CALHM6 et son lien avec une protéine appelée CaMK1D, ainsi que les signaux chimiques qu’elles envoient pour réguler l’appétit. À court terme, nous voulons savoir quel est le rôle de CALHM6 dans différentes zones du cerveau impliquées dans la faim, et comment sa modification influence la quantité de nourriture consommée et le métabolisme des souris. À long terme, ces recherches pourraient aider à trouver de nouvelles pistes pour traiter l’obésité et d’autres troubles liés au métabolisme, en particulier ceux causés par un dérèglement du contrôle de l’appétit par le cerveau. Enfin, ce projet pourrait améliorer notre compréhension des liens entre cerveau, alimentation et maladies chroniques, avec des retombées positives pour la santé publique.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie générale, des interventions chirurgicales afin d’injecter des virus expérimentaux dans une zone spécifique du cerveau et d’implanter des canules reliées à une pompe osmotique. La durée totale de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est d’environ 30 minutes. Avant et après ces interventions, les animaux seront soumis à des tests métaboliques réguliers pour suivre leur alimentation et leur métabolisme pendant 18 semaines. Pour chaque test, plusieurs injections intrapéritonéales seront réalisées rapidement (durée = 10 secondes). Par ailleurs, des prélèvements sanguins seront effectués sur les animaux vigiles avant la chirurgie et à un mois de suivi afin d’évaluer différents paramètres biologiques. Certains animaux seront soumis à un régime enrichi en graisses pour observer l’impact sur la prise de poids et le métabolisme. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel qualifié, sous anesthésie, et conformément aux règles de bien-être animal afin de limiter toute souffrance ou stress inutile.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés aux manipulations expérimentales et au modèle métabolique étudié. Les souris pourront présenter une perte de poids transitoire lors de périodes de jeûne ou à la suite d’injections expérimentales visant à moduler l’appétit. Des variations du comportement alimentaire sont attendues selon les modèles utilisés, sans entraîner de souffrance. L’implantation de canules ou de pompes osmotiques peut engendrer un stress modéré ou une réduction temporaire de la mobilité pendant la période post-opératoire, mais une surveillance rapprochée et des soins adaptés seront assurés. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer un stress ponctuel lié aux manipulations et aux prélèvements sanguins, mais leur fréquence et leur durée seront limitées. Globalement, les effets indésirables attendus sont modérés et transitoires, et feront l’objet d’un suivi clinique rigoureux pour assurer le bien-être des animaux tout au long du protocole. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages afin de garantir des mesures précises. Les procédures expérimentales se termineront avec une chrirugie terminale sans réveil pour prélever les organes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques

Remplacement

Ce projet cherche à comprendre comment certaines cellules du cerveau contrôlent la faim et l’équilibre énergétique. Les expériences faites uniquement sur des cellules ou par ordinateur ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme entier, où interagissent le cerveau, les hormones, le métabolisme et le comportement alimentaire. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser des souris génétiquement modifiées, afin d’observer comment la modification d’un gène précis influence la faim, le poids et le métabolisme. Ces modèles permettent de relier directement des changements dans le cerveau à leurs conséquences sur l’organisme. Comme il n’existe pas d’alternative équivalente, l’expérimentation animale est indispensable, mais elle sera réalisée dans le respect du principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner).

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un total de 1 180 souris. Ce nombre a été déterminé pour s’assurer que les observations réalisées soient fiables et comparables entre différents groupes expérimentaux, tout en respectant strictement le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs manipulations expérimentales seront réalisées sur les mêmes groupes de souris, avec un temps de récupération approprié pour chaque animal. Certaines interventions chirurgicales permettent d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Toutes les données seront ensuite analysées pour comprendre comment ces interventions influencent le poids, la consommation alimentaire et d’autres aspects du métabolisme des souris, dans le respect du bien-être animal.

Raffinement

Les animaux sont logés dans des cages enrichies systématiquement fournies en matériau de nidification et en éléments manipulables en carton afin de favoriser les comportements naturels et réduire le stress La litière est renouvelée hebdomadairement ou plus fréquemment si nécessaire pour maintenir une hygiène optimale Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie multimodale préventive et postopératoire selon des protocoles validés par le vétérinaire responsable Les interventions stéréotaxiques se déroulent en conditions strictement aseptiques avec matériel stérile et opérateurs formés spécifiquement à cette technique Pendant la phase de réveil les animaux sont placés sur des dispositifs de maintien thermique et surveillés en continu jusqu’à reprise d’une activité normale Un protocole de surveillance clinique standardisé est appliqué après toute manipulation invasive avec des observations rapprochées dans les 24 premières heures puis au minimum une fois par jour ensuite Un score de bien-être comportemental et physiologique est utilisé pour détecter précocement douleur, déshydratation, perte d’appétit ou immobilité et déclencher une prise en charge vétérinaire ou un critère d’euthanasie si nécessaire L’habituation des animaux à la manipulation est systématique plusieurs jours avant les manipulations expérimentales par du personnel qualifié pour réduire la réactivité au contact humain Les manipulations stressantes pouvant nécessiter isolement sont réalisées en minimisant la durée d’isolement et en utilisant des cages transparentes pour maintenir la visibilité des congénères Les soins postopératoires incluent administration d’analgésiques selon un calendrier prescrit, surveillance de la plaie, contrôle du poids et réhydratation si besoin. Les actes invasifs sont limités.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet en raison de la disponibilité de nombreux modèles permettant d’étudier le rôle de certaines molécules dans le cerveau. Son système de régulation de l’appétit et de l’énergie présente de nombreuses similitudes avec celui de l’humain, ce qui permet de transposer les résultats. Sa petite taille, son cycle de reproduction court et la connaissance approfondie de sa physiologie en font un modèle de référence pour l’étude du métabolisme et du comportement alimentaire. Certaines souris subiront des interventions chirurgicales permettant d’introduire des substances dans des zones spécifiques du cerveau, afin d’étudier leur rôle dans la régulation de la faim et du métabolisme. Ces interventions seront réalisées lorsque les animaux auront atteint un âge où leur cerveau est pleinement développé. Les animaux seront nourris avec une alimentation riche en graisses dès l’âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids adaptée pour les expériences.