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Etude du rôle de la voie IL-1/IL-1R1 sur la réponse à la chimio-immunothérapie dans des modèles orthotopiques de cancer du poumon 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le poumon puis six séances d'imagerie thoracique sous anesthésie gazeuse. Chaque animal reçoit aussi une injection de chimiothérapie, trois injections d'immunothérapie par semaine pendant trois semaines et cinq injections quotidiennes d'interleukine-1 bêta, une partie d'entre elles portant une délétion du récepteur IL-1R1. La tumeur pulmonaire induite peut dégrader progressivement la respiration et l'état général, et le porteur signale des complications possibles au niveau de la cicatrice thoracique, infection, déhiscence de plaie, douleur. À long terme, il situe le bénéfice dans "l'intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l'Homme".
Objectifs
Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas toujours efficace pour les tumeurs pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’inflammation a un rôle ambigu dans la réponse à la chimiothérapie et peut avoir des effets pro- ou anti-tumoraux. Le but du projet est d’évaluer son rôle sur l’efficacité antitumorale de la chimio-immunothérapie utilisée en clinique, dans un modèle murin de cancer du poumon chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique. Ce projet sera réalisé dans 2 sites, avec un site pour toutes les étapes (EU1/2), excepté les imageries (EU 2/2).
Bénéfices attendus
Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du poumon, leur efficacité reste hétérogène selon les contextes biologiques et immunologiques. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la résistance dans des tumeurs pulmonaires orthotopiques.. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents, et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l’Homme.
Procédures
5 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du poumon murines dans le poumon (EU1/2) : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 384. - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - - Traitements par IL-1β ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection quotidienne pendant 5 jours par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. Imagerie thoracique (EU2/2) : -Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse -1 imagerie par animal répétée 6 fois -Durée : 5 minutes -Nombre de souris : 384
Impact sur les animaux
Injection de cellules tumorales dans le poumon : croissance d’une masse tumorale intrathoracique. Une altération progressive de la fonction respiratoire peut survenir au cours de la progression tumorale. - Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des injections d’IL-1β : perte de poids. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice thoracique : infection, déhiscence de plaie, douleur. - Effets potentiels liés aux anesthésies répétées pour l’imagerie thoracique : refroidissement, ralentissement transitoire de la respiration, récupération retardée exceptionnelle. Les souris déficientes pour IL1-R1 (Il1r1-/-) ne présentent pas de phénotype dommageable en conditions basales. Aucune nuisance spécifique liée à ce génotype n’est donc attendue dans le cadre de ce projet.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.
Réduction
Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs, ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les souris C57BL/6 doivent être utilisées comme contrôles des souris Il1r1-/-. Les expériences seront conduites en même temps sur les souris Il1r1-/-, afin de ne pas doubler le nombre de souris contrôles. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Le nombre de souris par groupe et le nombre de répétitions des expériences ont été déterminés afin de garantir la possibilité d’utiliser ce test statistique et sa fiabilité. Les expériences visant à étudier la charge tumorale, l’imagerie thoracique et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. Le suivi longitudinal par imagerie micro-CT permet une mesure intra-individuelle de la charge tumorale, permettant de confirmer la prise tumorale et de déterminer le moment opportun pour débuter les traitements, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux nécessaires. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.
Raffinement
Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3 % + oxygène 1,5 L/min) sera réalisée avant chaque chirurgie et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte, surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (carprofène 4 mg/kg et buprénorphine 0.05 mg/kg, une fois par jour) seront administrés en sous-cutané en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongés pendant 48 h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4 mg/kg + bupivacaïne 2 mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Pour chaque imagerie, les souris seront transportées d’un EU à l’autre dans leur cage emballée dans un sac opaque afin d’éviter le stress extérieur. Des anesthésies courtes supplémentaires seront réalisées pour l’imagerie thoracique micro-CT. Les animaux seront réchauffés pendant la procédure et surveillés jusqu’au réveil complet. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.
Choix des espèces
Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.
Identification de nouvelles molécules pour lutter contre les maladies de l’œil chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à quatre injections dans l'œil, sous anesthésie de cinq minutes, et jusqu'à huit injections de chaque côté dans la veine ou dans le ventre : 2 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur indique que les injections intraoculaires peuvent enflammer ou endommager l'œil, que les injections répétées dans la veine peuvent abîmer celle-ci et que celles dans le ventre peuvent provoquer une inflammation. L'objet déclaré est de tester des molécules identifiées au laboratoire, censées protéger le nerf optique et le faire repousser dans un contexte de glaucome. Le résumé ne dit pas comment le glaucome ou l'élévation de la pression intraoculaire est provoqué chez ces souris, ni combien d'entre elles subissent chaque type d'injection.
Objectifs
Le glaucome concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Notre projet consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour maintenir la vision. Ce projet a pour but de tester de nouveaux molécules identifiés dans le laboratoire pour induire la neuroprotection et la régénération du système nerveux.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de définir des molécules pour proteger et faire repousser le nerf optique. De ce fait il est important de comprendre leurs actions dans un contexte de glaucome. Ainsi ce projet contribuera à identifier des approches thérapeutiques pour des maladies comme le glaucome où les neurones doivent être protégés.
Procédures
Les souris peuvent subir une ou plusieurs injections : - dans l’œil (au maximum 4) : les souris sont endormies environ 5 min. L’injection dans l’œil dure 20s. - dans la veine ou dans le ventre (au maximum 8 de chaque coté) 20s.
Impact sur les animaux
- L’injection intraoculaire ou dans la chambre antérieure de l’œil peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil - - injections répétées dans la veine peut endommager la veine. - injections dans le ventre répétées peuvent induire une inflammation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses moléculaires ou pour analyse de tissus
Remplacement
Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçables car i) les structures anatomiques sont similaires à l’humain, et ii) les mécanismes de mise en place de l’augmentation de la pression intra-oculaire nécessitent l’intervention de différents composante de l'oeil neurones, cellules gliales, environnement de la rétine et ne peuvent être mimés efficacement dans une culture de cellule ou par modèle informatique. Le modèle murin est le standard international reconnu pour la recherche sur la régénération du système visuel.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -L’entrainement de toutes les personnes qui pratiquent les expériences pour ne pas perdre d’animaux dû à de mauvaises chirurgies. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint possible tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. -Nous testerons d’abord les molécules identifiées en culture cellulaire. Seuls les candidats qui donneront des résultats satisfaisants en culture seront utilisés dans les souris.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie. Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et anti-inflammatoire adapté avant l’opération. Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Les critères de poids, d’apparence physique, et de comportement basés sur la grille proposée par le comité d’éthique n°004 seront pris en compte dans le suivi des animaux qui subissent une intervention chirurgicale. Nous serons également vigilants quant à l’état de l’œil.
Choix des espèces
La régénération du nerf optique et l’augmentation de la pression intraoculaire sont des phénomènes multifactoriels. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo standard dans la communauté scientifique grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. Enfin, les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris adultes (animaux de 28 jours minimum). Nous voulons étudier les mécanismes de neuroprotection dans le système visuel adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.
Comprendre la plasticité cellulaire dans la récidive du glioblastome après traitement MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis l'ouverture du crâne pour retirer la tumeur, avec des hémorragies possibles et une pression intracrânienne modifiée : 1 434 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois jours après la résection, une partie reçoit radiothérapie et chimiothérapie jusqu'à trois fois en trois jours, une autre se voit poser une fenêtre d'observation sur le crâne, et le sang est prélevé deux à trois fois par semaine pendant toute l'étude. Le porteur écrit que la craniotomie est "à l'origine d'une douleur mesurée" mais que "la résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses". Il ajoute qu'aucun effet secondaire n'est décrit dans la littérature pour les thérapies ciblées envisagées, et qu'aucune douleur n'est donc attendue de leur administration.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives chez l’adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire au maximum la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie (protocole de Stupp), la survie moyenne des patients n’excède pas 15 mois en raison de l’apparition, quasi-systématique, de récidives. Le principal facteur supposé pouvant expliquer l’apparition de ces récidives est la repousse de cellules très invasives, se propageant à partir de la masse tumorale. L’environnement protecteur empêche l’élimination de ces cellules par le protocole de Stupp. L'unité gliovasculaire (UGV) faite de cellules tumorales, de cellules immunitaires et de cellules cérébrales localisées à proximité des vaisseaux sanguins- est une niche protectrice favorisant la survie, la résistance au traitement et la dissémination des cellules de GBM. Elle a la pleine compétence pour jouer un rôle clé dans la récidive mais son rôle dans ce processus est encore mal connu. Mieux comprendre le comportement des cellules tumorales ainsi que le rôle du microenvironnement au sein de l'unité gliovasculaire et identifier des biomarqueurs spécifiques de la récurrence pourraient transformer considérablement notre vision actuelle de la thérapie des GBM et ainsi améliorer la prise en charge des GBM chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l’adulte et l’un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements très lourds (chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie), la rechute est pratiquement inévitable (90%). Des données de la littérature ainsi que les résultats préliminaires obtenus au laboratoire, suggèrent que l’unité gliovasculaire (cellules tumorales, endothéliales, péricytaires, astrocytaires et immunitaires) pourrait jouer un rôle déterminant dans la survie des cellules tumorales après traitement. Cette étude nous permettra de définir précisément le rôle de l’unité gliovasculaire dans la résistance au traitement et sera déterminante pour l’identification de cibles thérapeutiques. Ce projet s’insère dans une grande étude réalisée en collaborations avec plusieurs équipes de recherche sur le glioblastome (cliniciens et chercheurs). Les résultats obtenus dans notre modèle préclinique murin seront ensuite validés à partir de biopsie de patients traités ou non au protocole de Stupp. L'application directe et immédiate de ces connaissances pourrait ainsi favoriser le développement de nouvelles thérapies ciblées, dont le GBM a urgemment besoin puisqu’ aucune amélioration thérapeutique pertinente n'a été apportée ces 15 dernières années. Malgré les efforts massifs déployés dans le domaine clinique et de la recherche, le traitement du GBM reste l'un des défis les plus difficiles à relever en oncologie clinique. Presque tous les patients atteints de GBM reçoivent le protocole de Stupp, qui est la norme en matière de soins ; par conséquent, beaucoup d'entre eux bénéficieraient de stratégies thérapeutiques visant à accroître son efficacité. Dans ce contexte, il s'agit d'une approche entièrement nouvelle issue d'une idée novatrice. Les résultats de ce projet jetteront les bases des objectifs futurs : déterminer de nouvelles voies et stratégies pour cibler les voies de résistance gliovasculaire post-Stupp et améliorer le traitement en collaboration avec les cliniciens. La compréhension de la résistance des GBM au protocole Stupp et de la biologie de l’unité gliovasculaire pourraient transformer considérablement notre vision actuelle du traitement des GBM dans le but ultime d’améliorer la survie des patients.
Procédures
L’objectif 1er de cette étude est d’établir un modèle pré-clinique de traitement du GBM chez la souris (protocole de Stupp). Pour cela, différents groupes de souris seront constitués. Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau de tous les lots d’animaux (anesthésie de 20min/souris). Groupe 1 : dans cette première procédure visant à mettre au point le retrait chirurgical de la tumeur, des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau (durée de l’anesthésie : 30 min). Après le développement de la tumeur les souris sont opérées afin de procéder au retrait de la tumeur (durée de l’anesthésie : 30min). Groupe 2 : Après mise au point du retrait de la tumeur avec le groupe 1, nous implanterons des cellules tumorales dans de nouvelles souris. Après développement de la tumeur, elle sera retirée. 3 jours après la résection de la tumeur, les animaux anesthésiés seront traités par radiothérapie (durée 15 minutes). Un traitement sera également administré directement dans l’abdomen de l’animal vigile (5 minutes). Ces traitements (radiothérapie et chimiothérapie) seront répétés au maximum 3 fois sur 3 jours consécutifs. Groupe 3 : sur certaines souris du groupe 2, une fenêtre d’observation sera posée après la résection (durée d’anesthésie 30 min). Ces animaux seront également traités par chimiothérapie et radiothérapie selon le même protocole décrit plus haut. Les animaux seront suivis par imagerie une fois avant le début du traitement puis en fin de traitement à raison d’une fois par semaine pendant 3 semaines. MODIFICATION Des prélevements de sang seront réalisés à raison de 2 à 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (1min/souris). Groupe 4 : un dernier lot d’animaux bénéficiera en plus du protocole Stupp (comme décrit pour le groupe 2 : retrait chirurgical de la tumeur, irradiation, chimiothérapie), une thérapie ciblée par injection ou par voie orale (environ 1 min/souris, 7 administrations max /semaine), qui pourra être administrée pendant le protocole Stupp, quelques jours après, ou quelques semaines après selon la dynamique d’activation des cibles identifiées.
Impact sur les animaux
Lors de l’injection : Les animaux greffés avec les cellules tumorales vont développer une tumeur cérébrale dont la taille sera évaluée fréquemment par dosage sanguin. Lors la résection : L’os du crane étant peu innervé, la craniotomie est à l’origine d’une douleur mesurée. La résection de la tumeur en elle-même ne provoque pas de douleurs puisque le cerveau ne possède pas de terminaisons nerveuses. Cependant, la craniotomie peut engendrer un changement de pression intracrânienne et la résection en elle-même peut être à l’origine de petites hémorragies. Suite à cette intervention, une réduction des mouvements et de la mobilité de l’animal, une perte de coordination peuvent subvenir dans les heures qui suivent la chirurgie. Dans les jours suivant, une perte de poids peut également être observé. Le traitement aux rayonnement ionisants n’entraine pas d’inconfort en lui-même et est réalisé sur des animaux anesthésiés Les nuisances attendues suite à l’injection de la chimiothérapie seront celles liées à l’injection (douleur légère de courte durée). D’après notre expérience aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ce traitement. MODIFICATION Lors de l’injection des thérapies ciblées : Les nuisances attendues suite à l’administration des traitements seront celles liées à l’injection (stress et douleur légers, de courte durée). D’après la littérature disponible, aucun effet secondaire n’est décrit pour les drogues envisagées. De fait, aucune douleur n’est attendue suite à l’administration de ces traitements. Les prélèvements sanguins réalisés au niveau de la queue de l’animal provoqueront une douleur légère et un stress de courte durée chez la souris.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Des résultats préliminaires du laboratoire couplés à des données de la littérature nous mènent à penser que les modifications de comportement des cellules tumorales après traitement (protocole de Stupp) sont intimement dépendantes de leur environnement. Or, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus : il est aujourd’hui impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo. C’est pour cela que nous devons avoir recours à des études sur l’animal dans lequel tous les paramètres sont réunis. Notre hypothèse est qu’après le traitement les cellules tumorales résiduelles localisées au sein de l’unité gliovasculaire protectrices sont à l’origine de la récidive. Nous avons développé des méthodes alternatives pour éviter au maximum d’avoir recours aux animaux. Ainsi, nous avons au préalable observé in vitro que des cellules de GBM acquéraient un phénotype de résistance lorsqu’elles étaient au contact de vaisseaux sanguins. Cependant, ce modèle ne représente qu’une version simplifiée du microenvironnement tumoral. En effet, le microenvironnement tumoral est un système complexe aux paramètres extrêmement nombreux et dont la plupart sont inconnus il nous est donc impossible de recréer totalement cet environnement ex vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons fait un travail de recherche bibliographique rigoureux. De plus, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d’animaux. En effet : 1-Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur qui sera résécable environ un mois après l’injection. Nous ne testerons donc pas différentes concentrations de cellule. 2-Nous maitrisons la résection de la tumeur 3-Pour le traitement radio et chimiothérapeutique, nous avons mené de nombreuses expériences in vitro qui nous permettent de cibler les doses et le timing de traitement ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux utilisés. 4-Le suivi régulier de la progression tumorale grâce à la mesure d’un marqueur sanguin nous permet de savoir quand effectuer la résection mais également de monitorer la récurrence de la tumeur ce qui réduira également le nombre d’animaux utilisés. 5-Les analyses requièrent une faible quantité de matériel et permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. 6-Nos analyses bioinformatiques poussées nous aideront dans le choix des cibles thérapeutiques, ce qui nous permet de diminuer le nombre de cibles à tester et de privilégier les plus pertinentes.
Raffinement
En accord avec les recommandations internationales, en particulier dans le domaine de la cancérologie, les animaux sont suivis individuellement et ce plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin d’assurer leur bien-être. Celui-ci sera évalué selon une grille de score. Si nécessaire, les expérimentations seront stoppées avant toute souffrance. Les manipulations lourdes sont faites sous anesthésie et les animaux recevront systématiquement les traitements antibiotiques et analgésiques adaptés pendant et après les opérations. Dès l’apparition d’une tumeur de taille importante (évaluée par un marqueur sanguin) les animaux sont suivis quotidiennement afin d'évaluer leur bien-être selon la grille de score jointe. En cas de signes de détresse les soins adaptés seront apportés (analgésie, hydratation …). Si aucun soulagement n’est possible ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Nos expérimentations seront menées chez la souris, modèle de choix pour les expériences en cancérogenèse. Leur petite taille, et la méthodologie expérimentale bien établie en font une espèce animale pertinente pour les expériences de laboratoire. Nous étudierons des lignées cellulaires humaines et murines. Deux souches de souris seront utilisées dont des souris immunodéficientes pouvant recevoir des injections de cellules humaines sans développer de réactions immunitaires contre celles-ci. A l’inverse, l’autre lignée de souris est immunocompétente et permet donc de réaliser notre étude dans un contexte de réponse immunitaire complète. Adulte de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale mais également avec un potentiel de croissance limité afin d’éviter que les dispositifs chirurgicaux (fenêtres crâniennes) ne gênent leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie.
Étude du rôle de la sous-unité GluN3A dans le sevrage à la morphine.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à onze injections de morphine en six jours, puis à une période de sevrage, 1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure, avec injection de virus et implantation de fibres optiques ou de canules, puis jusqu'à dix injections directement dans le cerveau, sur animal éveillé. Le porteur décrit un sevrage qui réduit l'activité pendant une semaine, puis des "symptômes psychiatriques" sur environ quatre semaines, le suivi comportemental s'étendant sur huit semaines. Les comportements annoncés dans les objectifs sont les interactions sociales, les signes anxio-dépressifs et la consommation de nourriture et de boisson, mais la rubrique des procédures se limite à indiquer qu'elles "subiront également des tests comportementaux".
Objectifs
Le but de ce projet est de décrire le rôle de la sous-unité GluN3A du récepteur N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) au glutamate dans le sevrage aux opiacés. Cette sous-unité permet de former un hétéromère NMDA dit « non-conventionnel » car activé par la glycine. Son implication dans les pathologies psychiatriques émerge progressivement mais reste à être complètement caractérisé. Il a notamment été démontré que sa dérégulation, dans l’habénula médiane (HbM), une région clé dans le phénomène d'addiction aux opiacés, altère la réponse comportementale face à des stimulations aversives. Ainsi, cette sous-unité semble pouvoir participer aux symptômes aversifs observés lors du sevrage aux opiacés. Dans ce projet, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de moduler l’activité de GluN3A dans des régions spécifiques du cerveau, chez des souris mâles et femelles. Nous analyserons les effets de ces manipulations sur différents comportements, notamment les interactions sociales, les symptômes anxio-dépressifs ainsi que la consommation de nourriture et de boisson. Ces mesures seront réalisées de manière automatisée et continue chez des animaux vivant en groupe, avant, pendant et après un traitement chronique à la morphine. Les comportements et les symptômes de sevrage seront suivis sur une période de 8 semaines, incluant des tests ponctuels permettant d’évaluer des signes d’anxiété et de dépression. Dans un second temps, nous mesurerons l’activité neuronale dans certaines régions cérébrales impliquées dans le sevrage, grâce à des enregistrements calciques réalisés pendant et après le traitement à la morphine, ainsi que lors des tests comportementaux. L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de GluN3A dans le sevrage aux opiacés et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la sous-unité GluN3A dans le sevrage aux opiacés. Il permettra à la fois de caractériser son implication dans les symptômes de sevrage et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique. À court terme, le projet est principalement fondamental et descriptif. Il s’agira de déterminer si, et à quel moment, GluN3A intervient dans le sevrage à la morphine. Ces travaux apporteront également de nouvelles connaissances sur les mécanismes cérébraux impliqués, en particulier dans les régions associées aux états émotionnels négatifs liés au trouble d’usage des opioïdes. À plus long terme, le projet visera à évaluer le potentiel thérapeutique de GluN3A, notamment en identifiant les périodes les plus pertinentes pour cibler cette sous-unité dans le traitement du sevrage. Dans son ensemble, ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements visant à atténuer les symptômes de sevrage aux opiacés.
Procédures
Différentes procédures de ce projet nécessitent que des animaux subissent une chirurgie (1 intervention d'environ 1h). Les animaux recevront un traitement chronique de morphine (11 injections pendant 6 jours; une injection dure environ 1 minute). Les injections se feront sur animal vigile. Des composés seront administrés de façon intra-parenchymateuse (maximum 10 injections) et systémique, sur animal vigile. Les animaux subiront également des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Deux types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- Ce projet vise à étudier les symptômes de sevrage à la morphine. Ainsi, dans chaque les souris recevront un traitement chronique de morphine puis subiront une période de sevrage. Ce sevrage engendre des symptômes physiques transitoires, essentiellement visible par une réduction de l’activité de l’animal (durée : ~1 semaine). Suite à ces symptômes physiques, des symptômes psychiatriques se développe sur une période plus longue (~4 semaines) avant de progressivement disparaitre. 2- Chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus et/ou implantations de fibres ou optiques ou de canules pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les contrôles histologiques et prélèvements.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer les mécanismes neurobiologiques du sevrage, notamment les modifications de comportements sociaux des individus. De plus, il permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques. Ainsi, l’animal entier, vivant et se comportant, est nécessaire et ne peut être remplacé par un autre modèle.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe. Les analyses statistiques seront essentiellement réalisées à l’aide de test de Student ou d’analyse de la variance à un ou plusieurs facteurs, selon les comparaisons.
Raffinement
Nos conditions d’hébergement, en groupes sociaux avec un enregistrement continu des souris permet un suivi quotidien du bien-être animal. De plus, dans ces conditions d’hébergement, l’enrichissement de l’environnement des animaux est important. En effet, les animaux sont hébergés en groupe social avec à disposition: bâtonnets à ronger, cotons compressés pour faire des nids et dômes en polycarbonate. Nous avons établi des points limites standards tels que des signes comportementaux d’inconfort et des signes cliniques qui seront recherchés quotidiennement par visionnage des cages et lors de la visite quotidienne de la pièce d’hébergement, par l’expérimentateur. Lors des chirurgies, toutes les conditions d’aseptise, d’anesthésie et d’analgésie respectent la réglementation vétérinaire en vigueur. De plus, la température des animaux est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. Après chaque chirurgie, les animaux sont réhydratés et ont accès à une nourriture gélifiée pour faovriser la récupération post-chirurgicale et leur état de santé est évalué et objectivé selon des points limites définis par les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. Les animaux sont habitués aux conditions d'hébergement, aux manipulateurs, ainsi qu'aux procédures experimentales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris pour ce projet car leur cerveau est suffisamment complexe pour nos études, elles possèdent une molécule appelée GluN3A qui est très similaire chez de nombreuses espèces, et leurs réactions à la morphine sont bien connues et ressemblent à celles observées chez l’humain. Notre projet ne s’intéresse pas au développement du cerveau. De plus, la consommation de substances comme la morphine concerne principalement les adultes, c’est pourquoi toutes les souris utilisées seront adultes (8 semaines) au moment des expériences.
Impact de la fibrose hépatique sur le développement de l’athérosclérose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Des lignées de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme forment une partie des 2 736 souris utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole associe un régime riche en graisses et en sucres, un traitement chimique qui déclenche la fibrose du foie, des injections dans le péritoine et dans une veine, une biopsie de l'oreille pour le génotypage et une mise à jeun de six heures. L'objet déclaré est de suivre chez la souris l'évolution simultanée des lésions du foie et des artères, les retombées annoncées pour les patients, dépistage, cibles de traitement, thérapie génique, restant au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que ces nuisances seront "prises en charge de manière adéquate" et que "le bien-être de l'animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte".
Objectifs
La maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) est une maladie chronique du foie très fréquente. Elle est notamment associée à l’obésité, au diabète de type 2, à des anomalies des lipides sanguins et à l’hypertension artérielle. Elle se caractérise initialement par une accumulation excessive de graisses dans le foie. Chez certaines personnes, elle peut évoluer vers une inflammation et des lésions des cellules du foie, puis vers une fibrose. Dans les formes les plus sévères, la fibrose peut conduire à une cirrhose ou à un cancer du foie. Les personnes atteintes de MASLD présentent également un risque accru de maladies cardiovasculaires, notamment d’athérosclérose. Celle-ci correspond à la formation progressive de dépôts dans la paroi des artères pouvant entraîner un rétrécissement et des complications cardiovasculaires graves. Ce risque semble particulièrement augmenté lorsque la maladie du foie s’accompagne d’une fibrose importante. Les mécanismes expliquant le lien entre fibrose hépatique et athérosclérose restent encore mal compris.L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle chez la souris permettant d’étudier simultanément les atteintes du foie et des artères. Il permettra de déterminer si la fibrose hépatique participe au développement ou à l’aggravation de l’athérosclérose et d'identifier les mécanismes impliqués. Différentes conditions expérimentales seront utilisées. Les souris recevront soit une alimentation normale, soit une alimentation favorisant l’apparition de troubles métaboliques et de lésions du foie et des vaisseaux sanguins. Des interventions complémentaires permettront d’induire ou d’aggraver progressivement la fibrose hépatique. Certaines souris feront également l’objet d’une modification ciblée du fonctionnement du foie afin d'étudier le rôle de mécanismes biologiques spécifiques. L’état général et le poids des animaux seront surveillés régulièrement. Des prélèvements permettront d’étudier le sang, le foie et les vaisseaux sanguins. Les analyses porteront notamment sur les lésions du foie, l’inflammation, la fibrose, et la formation des plaques d’athérosclérose. Elles permettront également d’identifier les modifications biologiques associées à ces maladies. L’utilisation de souris est nécessaire car le projet vise à étudier les interactions entre plusieurs organes et l’évolution simultanée des maladies du foie et des vaisseaux sanguins dans un organisme vivant.
Bénéfices attendus
Le projet présente un impact direct chez l'Homme en mettant en avant le rôle clé de la fibrose du foie dans les maladies cardiovasculaires, première cause de décès des patients atteints de MASLD. En s’appuyant sur des modèles précliniques bien caractérisés et des cohortes humaines validées, il permettra 1) de mieux comprendre les mécanismes entre pathologie du foie et complications cardiovasculaires et d’identifier des biomarqueurs dans le sang qui pourraient aider aux stratégies de dépistage en clinique humaine ; 2) de tester de nouvelles cibles de traitement ciblant le foie pour prévenir ou limiter les maladies cardiovasculaires ; 3) d'explorer des approches innovantes de thérapie génique ciblant le foie, avec des applications potentielles à la médecine personnalisée. Ces avancées contribueront à réorienter les stratégies de traitement actuelles qui sont soit orientées sur le foie, soit sur le cœur, vers une approche globale tenant compte des interactions entre les organes, ce qui permettrait de mieux prendre en charge la santé cardiovasculaire.
Procédures
Biopsie à l'oreille : anesthésie gazeuse isoflurane, temps pour le prélèvement inférieur à 10 secondes. Prélèvement de sang à la queue : anesthésie gazeuse isoflurane , temps inférieur à 1 minute. Injection intrapéritonéale: anesthésie locale, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Injection intraveineuse : anesthésie par spray xilocaïne 5%, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Euthanasie des souris : anesthésie gazeuse isoflurane, disclocation cervicale temps < 1 seconde
Impact sur les animaux
Certaines procédures peuvent engendrer du stress : douleurs liées à la biopsie à l’oreille pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague (courte durée et léger), injections intrapéritonéales d’un composé chimique ou pharmacologique (modérée) ; Stress métabolique suite à une alimentation enrichie en graisses et en sucres (léger) ; stress lié à une mise à jeûn des animaux pendant 6h (léger). Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate et le bien-être de l’animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte grâce à un environnement contrôlé dépourvu de germes pathogènes, la présence d’abris et de jeux dans les cages, une surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux par du personnel formé, et la prise en compte de tout signe physique de stress ainsi que de la hiérarchie sociale.
Devenir
A la fin de P1+P2/P3 +P4, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la fibrose hépatique sur le développement de l’athérosclérose dans un conteste métabolique qui met en jeu une communication inter-organes. Pour répondre à cette problématique, il sera utilisé des modèles de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme mais également des procédures d'altération nutritionnelles de type régime riche en graisse associé à un traitement chimique qui va favoriser le développement de la fibrose hépatique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées. Concernant la nécessité de recourir à des méthodes alternatives, nous privilégions cette option quand elle est possible.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre équipe sur les 5 ans à venir est estimé à 2736. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui permet de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d'animaux utilisés peut être obtenue par trois moyens principaux : 1.Optimisation des élevages : Éviter la production d'animaux inutiles. 2. Optimisation des groupes expérimentaux : Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe sera réalisée pour respecter le principe des 3R à l’aide du site : https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group. 3. Formation adéquate : Assurer une bonne formation des personnes manipulant les animaux afin de maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-animale et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement non anxiogène regroupant des conditions favorables à leur bien-être : 2 à 6 souris par cage, une alternance lumière/obscurité de 12 h/12 h, un accès permanent à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’un enrichissement de l’habitat comprenant des abris et du matériel pour la confection de nids, favorisant l’expression des comportements naturels et la stimulation cognitive. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et un registre de suivi du bien-être sera tenu afin de garantir des conditions d’hébergement optimales. Lors de la mise sous régime, le changement de litière et des cages sera effectué deux fois par semaine pour maintenir un environnement propre et confortable. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées selon les techniques les moins invasives possibles. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés, combinée à des manipulations douces et à l’habileté du personnel, contribuera à réduire le stress et l’inconfort des animaux. Les souris seront progressivement habituées aux manipulations et aux protocoles expérimentaux lorsque cela est possible. Des critères précis de points limites précoces seront définis et une surveillance rapprochée permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. En cas de dépassement de ces critères, les animaux seront retirés de l’étude et euthanasiés conformément aux recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
La souris offre de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et peuvent développer des pathologies telles que l'obésité, l'insulino-résistance, la stéatohépatite non alcoolique, la fibrose et l’athérosclérose avec des caractéristiques similaires à celles observées chez l'homme. De plus, cette espèce permet de réaliser des manipulations génétiques. L'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il sera donc nécessaire d'utiliser des souris adultes (de 2 à 6 mois). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes et ce, en accord avec les 3R. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 sem). Les pathologies métaboliques recherchées sont des pathologies de l’adulte.
Etude de la voie de signalisation Slit/Robo et son rôle dans la réponse aux immunothérapies dans les glioblastomes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La chimiothérapie est injectée cinq jours par semaine "jusqu'à ce que l'animal arrive à son point limite", et le suivi de la tumeur au microscope dure environ deux heures sous anesthésie, trois fois par semaine, jusqu'à ce même point limite. 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Un glioblastome leur est implanté dans le cerveau par chirurgie sous anesthésie, ce qui peut provoquer une baisse d'appétit, une perte de poids, des difficultés à se déplacer et une désorientation qui persistent tout au long de l'étude, l'objectif étant de bloquer la voie Slit/Robo pour voir si les immunothérapies gagnent en efficacité. Une partie des souris est immunodéficiente, donc sensible aux infections et au stress dans des conditions normales d'hébergement, et le porteur espère montrer une augmentation du temps de survie sous traitement, avec des publications attendues dans trois à cinq ans.
Objectifs
Les glioblastomes sont des tumeurs du cerveau particulièrement complexes. Elles sont composées de plusieurs zones différentes dans lesquelles les cellules cancéreuses interagissent avec leur environnement. Certaines zones favorisent l’invasion des cellules dans le tissu cérébral sain, d’autres sont situées autour des vaisseaux sanguins, et certaines manquent fortement d’oxygène. Le glioblastome est la tumeur cérébrale la plus agressive chez l’adulte. Les cellules cancéreuses ont une grande capacité à se propager dans le cerveau et résistent souvent aux traitements actuels. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre un mécanisme biologique qui pourrait jouer un rôle important dans la progression de cette tumeur et dans la manière dont le système immunitaire réagit face au cancer. Des travaux récents suggèrent que ce mécanisme peut aider la tumeur à se protéger du système immunitaire, ce qui limite l’efficacité de certaines thérapies. À l’inverse, bloquer ce mécanisme pourrait permettre de réactiver les défenses immunitaires contre la tumeur. Cela pourrait aussi améliorer l’architecture vasculaire tumorale, souvent anarchique, et ainsi optimiser la distribution des traitements. Dans ce projet, nous souhaitons d’abord comprendre comment ce mécanisme influence la capacité des cellules cancéreuses à envahir le tissu cérébral sain. Nous voulons également évaluer s’il pourrait représenter une nouvelle piste thérapeutique. Pour cela, nous testerons un traitement expérimental visant à bloquer ce mécanisme afin d’observer son effet sur la croissance de la tumeur et sur l’efficacité des immunothérapies. L’objectif final est d’améliorer les traitements disponibles contre ce cancer particulièrement difficile à soigner.
Bénéfices attendus
Grace à cette étude, nous pourrons tester l'impact d’un traitement test sur la progression du cancer afin d'améliorer le traitement des patients. Nous souhaitons montrer une augmentation du temps de survie lorsque les animaux sont traités avec le traitement test, pouvant être amené, selon les résultats, à des essais cliniques. Dans le cas où les résultats de ces expériences sont probants, ils feront l’objet de publications scientifiques dans les prochaines années (3 à 5 ans).
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à 5 injections sur une semaine, puis 3 la semaine d’après (moins d’une minute par souris). Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie (environ 30 min). Injection d'un agent chimiothérapeutique (1 par jour, 5 jours par semaines jusqu’à ce que l’animal arrive à son point limite, moins d’une minute par souris). Injections de traitement(s) test(s) 1 à 5 fois par semaine (jusqu’à ce que l’animal arrive à son point limite, moins d'une minute par souris). Suivi de la tumeur 3 fois par semaine à l’aide d’un microscope sous anesthésie (environ 2 heures, jusqu’à ce que l’animal arrive à son point limite).
Impact sur les animaux
Le développement de tumeurs dans le cerveau peut entraîner une souffrance chez les souris. Celle-ci peut se manifester par une diminution de l’appétit, une perte de poids et l’apparition de troubles neurologiques tels que des difficultés à se déplacer ou une désorientation. Ces effets peuvent apparaître progressivement et persister tout au long de l’étude. Les différentes anesthésies nécessaires aux procédures expérimentales peuvent provoquer un stress temporaire chez les animaux, ainsi qu’un refroidissement du corps, une respiration ralentie et un réveil plus lent après l’intervention. Ces effets sont généralement transitoires et de courte durée. Les interventions chirurgicales entraînent des douleurs après l’opération, principalement durant les premières 24 à 48 heures. Les traitements administrés par différentes voies (injection ou administration par voie orale) peuvent occasionner un inconfort passager, une douleur locale, une irritation au point d’administration ou un stress lié à la manipulation répétée des animaux. Dans de rares cas, l’administration par voie orale peut entraîner des difficultés respiratoires accidentelles. Certains traitements peuvent également provoquer des effets indésirables généraux, comme une fatigue, une baisse d’activité ou une perte de poids, en fonction de la nature et de la dose du traitement utilisé. Les séances de suivi par imagerie, bien que non douloureuses, nécessitent une manipulation de l’animal pouvant être source de stress léger pendant quelques minutes. Enfin, les souris Rag gamma utilisées dans ce projet présentent un déficit du système immunitaire. Cette particularité les rend plus sensibles aux infections et au stress, même dans des conditions normales d’hébergement. Elles nécessitent donc un environnement très contrôlé afin de limiter ces risques tout au long de leur vie.
Devenir
L’analyse tumorale nécessite un prélèvement cérébral réalisé post-mortem. Tous les animaux implantés développant la tumeur attendue, chacun sera mis à mort au moment prévu pour procéder au prélèvement du cerveau conformément aux dispositions réglementaires.
Remplacement
Des études précédents réalisés en laboratoire ont montré que l'environnement qui entoure la tumeur joue un rôle essentiel dans son développement. Cet environnement comprend notamment les cellules voisines, les vaisseaux sanguins et les substances présentes autour de la tumeur. Même si certains modèles expérimentaux réalisés en dehors de l'animal permettent de reproduire partiellement cet environnement, ils ne peuvent pas refléter fidèlement ce qui se passe dans un organisme vivant. En particulier, ils ne reproduisent pas l'organisation en trois dimensions du cerveau, la circulation du sang ni les interactions complexes entre les différentes cellules. L'implantation de tumeurs chez la souris est donc nécessaire pour étudier la maladie dans des conditions proches de la réalité biologique, en tenant compte du fonctionnement global de l'organisme. De plus, les conditions de traitement utilisées chez les patients ne peuvent pas être reproduites de manière fiable uniquement en laboratoire, ce qui rend l'utilisation d'un modèle animal indispensable pour cette étude.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées afin de réduire le nombre d'animaux, le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre de bons résultats statistiques correspond à 10 souris par groupe. Enfin, femelles et mâles seront utilisés. Par ailleurs, nos modèles murins de tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences. Dans certaines expériences, nous utilisons des souris spécialement modifiées pour rendre les vaisseaux sanguins visibles grâce à un signal fluorescent. Cette caractéristique permet d’observer directement la tumeur et son environnement à l’aide de techniques de microscopie avancées. Grâce à cette approche, il est possible de suivre l’évolution de la tumeur chez un même animal au fil du temps. Les observations répétées sur un même individu permettent ainsi de recueillir plus d’informations tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires à l’étude. Cette stratégie contribue à limiter l’utilisation des animaux, conformément au principe de réduction, tout en améliorant la qualité et la fiabilité des résultats obtenus.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux sont maintenus dans des conditions sanitaires strictement contrôlées : hébergement en environnement protégé, manipulations réalisées dans des conditions stériles et suivi régulier de leur état de santé. Ces mesures permettent de prévenir l’apparition de problèmes liés à leur fragilité immunitaire. Les prises de traitements sont rapides. Les animaux sont replacés dans leurs cages avec leurs congénères en suivant. Des analgésiques sont donnés en amont de la chirurgie. Les animaux ont du gel oculaire tout au long de l'opération afin de réduire la sécheresse oculaire. La chirurgie, les sessions d’imagerie et le réveil se font sur tapis chauffant. Pour le suivi par imagerie, les souris seront anesthésiées et maintenues sous anesthésie dans une boîte d’imagerie. Les souris seront réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Des points limites prédéfinis, des soins conservatoires adaptés et un arbre décisionnel validé par l’animalerie et le comité d’éthique sont appliqués pour garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle expérimental car elle permet l’étude du glioblastome dans un environnement présentant une organisation cérébrale, une vascularisation et un microenvironnement tumoral comparables à ceux de l’homme. Ceux-ci sont indispensables à la compréhension des mécanismes tumoraux étudiés, et pour lesquels aucune méthode alternative ne permet actuellement un remplacement complet. L’utilisation de cellules humaines nécessite des souris immunodéprimées afin éviter un rejet de greffe, de plus les tumeurs se développent de manière très reproductible dans ce modèle, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences. Nous utiliserons également des lignées de souris possédant un système immunitaire fonctionnel mais modifiées pour rendre les vaisseaux sanguins visibles grâce à un signal fluorescent. Cela permet d’observer directement la tumeur et son environnement, notamment la circulation sanguine, au cours du temps. Les expériences sont menées des animaux âgés de 7 a 12 semaines. Ce stade correspond à de jeunes adultes présentant une physiologie stable et une croissance tumorale optimale. Les procédures pouvant s’étaler sur plusieurs mois, l’utilisation d’animaux jeunes permet d’éviter les effets confondants liés au vieillissement, tels que la fragilisation générale ou la mortalité non liée au protocole.
Effets des hormones sexuelles sur la cicatrisation des artères EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Ovariectomisées pour 500 d'entre elles, puis soumises à une lésion électrique ou mécanique de la carotide, 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces chirurgies peuvent entraîner une douleur, une perte de poids et un stress, et toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure pour analyser les tissus prélevés. L'ablation des ovaires reproduit la chute hormonale de la ménopause, que les souris ne connaissent pas naturellement, et la cicatrisation de l'artère lésée sert à mesurer l'effet de traitements œstrogéniques sur la paroi vasculaire, 360 souris recevant en plus un comprimé à libération prolongée. Le porteur écrit qu'aucune culture cellulaire ne recrée cet environnement dynamique et que les lignées vasculaires "perdent rapidement l'expression du récepteur des œstrogènes au cours des passages", et conclut qu'aucune alternative ne répond aux objectifs du projet.
Objectifs
Les maladies du coeur et des vaisseaux sont la première cause de décès chez les femmes. Pourtant, on ne comprend pas encore très bien comment la ménopause joue un rôle dans ce phénomène. Après la ménopause, le taux d’oestrogènes (les hormones féminines) chute, ce qui pourrait augmenter le risque de problèmes cardiovasculaires. Ce projet cherche à savoir si certains traitements à base d’oestrogènes, ou de substances qui agissent comme eux, peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, on utilise un modèle de souris dont on retire les ovaires, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (car les souris n'ont pas de ménopause naturelle). L’efficacité des traitements est mesurée en observant comment les artères se réparent après une petite blessure, ce qui permet de voir si les molécules testées aident à maintenir une bonne santé vasculaire. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre d’identifier les traitements hormonaux les plus efficaces pour protéger les artères après la ménopause, une période où le risque cardiovasculaire augmente fortement chez les femmes. En comparant différents types d’oestrogènes et de molécules ciblant leur récepteur, il deviendra possible de mieux comprendre quels composés sont réellement bénéfiques pour le système cardiovasculaire. À terme, ces connaissances pourraient aider à améliorer les traitements existants ou en développer de nouveaux, plus sûrs et plus adaptés aux besoins des femmes ménopausées. Cela contribuerait à réduire la mortalité cardiovasculaire chez les femmes, en tenant mieux compte de leurs spécificités biologiques souvent négligées dans la recherche médicale.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Ovariectomie (10 à 20min) 500 animaux 2-Pose de comprimé à libération prolongée (5min) 360 animaux 3-Lésion életrique de la carotide (20min) 500 animaux 4- Lésion mécanique de la carotide (20-30min) 315 animaux. Les animaux subissant la lésion électrique de la carotide ne sont pas les mêmes que ceux subissant la lésion mécanique. Les procédures chirurgicales seront réalisées dans l’EU ½.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sur la souris telles que l’agression de la carotide (mécanique ou électrique), l’ovariectomie ou la pose de capsule à libération prolongée peuvent engendrer une douleur, une perte de poids et un stress.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés.
Remplacement
L’utilisation du modèle murin nous permettra d’identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation des cellules de la paroi vasculaire. Ce processus implique des phénomènes complexes de communication intercellulaire entre les différentes populations cellulaires de la paroi vasculaire, ainsi que l’influence des contraintes hémodynamiques (flux et forces de cisaillement), de la réponse inflammatoire et des interactions avec les cellules circulantes. Ces paramètres sont indispensables au déroulement de la cicatrisation et ne peuvent être reproduits de manière fidèle dans des modèles ex vivo ou in vitro. Aucun système de culture cellulaire ne permet aujourd’hui de recréer simultanément cet environnement multicellulaire, tridimensionnel et dynamique. Les cultures de cellules isolées ne reproduisent ni les interactions entre les différents types cellulaires (cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, fibroblastes, cellules immunitaires), ni les contraintes mécaniques exercées par la circulation sanguine, qui modulent fortement les réponses cellulaires. Par ailleurs, les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les variations hormonales physiologiques observées in vivo, tant en termes d’amplitude que de cyclicité ou de métabolisme des hormones. Cette limitation est d’autant plus importante que les principales lignées cellulaires vasculaires utilisées en culture perdent rapidement l’expression du récepteur des œstrogènes au cours des passages, rendant impossible l’étude des mécanismes dépendants des œstrogènes dans des conditions physiologiquement pertinentes. Ainsi, à ce jour, aucun modèle cellulaire ou ex vivo ne constitue une alternative permettant de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi il ressort que 5 animaux/groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisament prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du récepteur aux oestrogènes ou de ces sous fonctions. Ces souris sont sous fond génétique C57BL6 qui est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés après la puberté, à partir de 7 semaines d’âge dans le cadre de l'étude de la ménopause.
Evaluation préclinique de systèmes nanoparticulaires destinés à l’administration de biomédicaments chez des modèles murins de diabète de type 2 -EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris utilisées sont diabétiques, soit par leur génotype db/db, soit par un régime riche en graisses et en sucres, avec les dérèglements qui suivent : hyperphagie, polydipsie, polyurie, troubles de la thermorégulation et risque important de déshydratation. 1 083 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois à quatre semaines, une mesure de glycémie à la queue tous les deux jours, des prélèvements hebdomadaires de 20 et 50 microlitres de sang, et certaines passent plusieurs jours à plusieurs semaines seules en cage métabolique, isolement que le porteur juge "mineur" puisque le plexiglas leur permet de voir leurs congénères. La majorité est tuée pour prélever pancréas, foie, muscle et tissu adipeux, et 100 souris sont déclarées réutilisables dans d'autres procédures, les groupes témoins pouvant être partagés entre plusieurs études.
Objectifs
Le diabète et ses complications métaboliques sont en constante augmentation, touchant aujourd’hui des millions de personnes dans le monde. Malgré les avancées de la recherche, les options thérapeutiques efficaces restent limitées, en particulier pour cibler les causes profondes de la maladie. Un diabète mal contrôlé peut, avec le temps, entraîner de graves atteintes cardiaques, vasculaires, rénales, oculaires et nerveuses. Au coeur de cette pathologie se trouvent les cellules bêta-pancréatiques, dont la défaillance ou la destruction limite la production d’insuline nécessaire à la régulation de la glycémie. À ce jour, les traitements ciblant directement ces cellules restent rares. Dans ce contexte, les nanotechnologies offrent de nouvelles perspectives thérapeutiques. L’encapsulation de principes actifs dans des nanovecteurs permet une meilleure distribution des molécules dans l’organisme, en ciblant plus spécifiquement les tissus malades. Ces systèmes favorisent la libération contrôlée des principes actifs, réduisent leur toxicité, protègent les molécules fragiles de la dégradation précoce et améliorent leur pénétration intracellulaire. Ils peuvent également renforcer certaines méthodes d’imagerie et de diagnostic. Notre laboratoire a ainsi développé plusieurs types de nanoparticules, associées à des médicaments ou des composés actifs, dans le but de protéger les cellules bêta et de préserver leur fonctionnalité. Ces formulations ont démontré leur efficacité et leur innocuité à travers divers tests in vitro. Nous visons désormais à évaluer in vivo l’efficacité de trois de ces nanomédicaments, en les testant sur deux modèles animaux distincts de diabète de type 2. Nous prévoyons la réalisation de 5 études par an dans ce cadre. Ces travaux soulignent le rôle central des modèles murins dans la recherche sur le diabète de type 2, en tant qu’outils indispensables pour faire progresser notre compréhension et nos capacités de traitement face à cette pathologie complexe.
Bénéfices attendus
Le diabète et l’obésité constituent aujourd’hui des enjeux majeurs de santé publique, classés parmi les urgences sanitaires en raison de la croissance rapide du nombre de personnes touchées. Actuellement, les options thérapeutiques disponibles pour traiter ou ralentir la progression de ces pathologies et de leurs complications demeurent limitées. Il apparaît donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des agents pharmacologiques innovants pour répondre à ce besoin médical non satisfait. Parmi les approches prometteuses, l’utilisation de molécules capables de protéger les cellules bêta pancréatiques et de renforcer leur fonction représente une stratégie intéressante dans le développement de traitements antidiabétiques. Dans cette perspective, les nanotechnologies offrent des solutions innovantes et durables pour améliorer la délivrance ciblée de principes actifs. En particulier, l’encapsulation de peptides dans des nanovecteurs permet d’optimiser leur stabilité, leur biodisponibilité et leur efficacité thérapeutique. Nous utiliserons ainsi différents types de nanovecteurs biocompatibles : l’alginate, un polysaccharide naturel extrait d’algues brunes, des capsules phospholipidiques, ainsi que des nanoparticules d’amidon. Ces nanovecteurs, déjà largement utilisés dans l’industrie pharmaceutique en tant qu’adjuvants ou excipients, présentent un excellent profil de sécurité, ce qui en fait des candidats de choix pour des applications en nanomédecine.
Procédures
Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite piqûre à l'aide d'une fine aiguille au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Après chaque mesure, un analgésique local de type xylocaïne sera appliqué au niveau de la queue. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3-4 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour la dernière procédure, l'utilisation des cages métaboliques impose l'isolement des souris pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui peut provoquer un inconfort. Celui-ci reste mineur puisque les animaux sont libres de tout mouvement dans des cages de type standard et en plexiglas ce qui leur permet de visualiser leurs congénères.
Devenir
Tous les animaux diabétiques, ainsi qu’une partie de leurs contrôles, seront utilisés dans les procédures expérimentales et la majorité d’entre eux sera euthanasiée afin de procéder au prélèvement d’organes (pancréas, foie, muscle, tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d’autres procédures. Par exemple, les animaux des groupes contrôle pourront être partagés entre plusieurs études, ou, si cela est possible, être transférés à d’autres groupes.
Remplacement
Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.
Réduction
Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en oeuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Excepté pour quelques animaux de la procédure 5 (n=24), tous les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuropolydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniennes et inflammatoires de la souris ne peuvent pas être entièrement reproduites in vitro. L’utilisation d’animaux d’expérimentation s’avère donc particulièrement pertinente dans le cadre du développement de dispositifs de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Dans ce projet, les modèles animaux retenus sont des souris atteintes de diabète de type 2 : les souris db/db et les souris C57Bl/6N soumises à un régime riche en graisses et en sucres (HFD). Ces modèles sont largement validés et couramment utilisés pour l’étude de l’efficacité de traitements antidiabétiques, notamment pour l’évaluation de la réduction de la glycémie. Il est essentiel de travailler avec des animaux dont le développement physiologique est achevé, sans toutefois recourir à des individus trop âgés, afin d’éviter tout biais dans l’interprétation des résultats. Ainsi, les protocoles expérimentaux débuteront avec des souris âgées d’au moins 5 à 6 semaines, aussi bien pour les souris db/db que pour les C57Bl/6N.
Effet de la surexpression de calbindine sur la physiopathologie de la boucle cortico-sous-corticale 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 3
Deux heures d'anesthésie pour une IRM, avec des nausées, des vomissements et des troubles respiratoires ou cardiovasculaires donnés comme effets secondaires fréquents, puis quatre heures de chirurgie et des douleurs post-opératoires transitoires. 6 macaques, trois rhésus et trois à longue queue, âgés de 4 à 8 ans, sont utilisés dans cette seconde partie du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous sont tués pour l'étude post-mortem de leur cerveau. S'y ajoutent une heure hebdomadaire de contention pour un test de préhension de nourriture et des séances d'enregistrement des cellules nerveuses, afin de mesurer l'effet d'une surexpression de calbindine sur les circuits moteurs. Les retombées restent lointaines, le porteur écrivant que ces travaux "pourraient aider à identifier de nouvelles pistes" à moyen terme, quand les quatre heures de chirurgie et les un à deux mois d'habituation à l'animalerie sont, eux, programmés.
Objectifs
Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la régulation du calcium, la calbindine, élément essentiel au bon fonctionnement des neurones. Nous étudions son action dans un circuit du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements, un circuit souvent touché dans des maladies neurodégénératives. Chez les rongeurs, un manque de cette protéine fragilise les neurones, tandis que le rétablissement de sa production sur des cellules en culture semble les protéger. Chez le macaque, nos travaux montrent qu’elle pourrait aussi jouer un rôle important dans le contrôle de la motricité.
Bénéfices attendus
Nous étudions son action dans un réseau cérébral impliqué dans le contrôle des mouvements, un réseau souvent perturbé dans les maladies neurodégénératives. En obtenant des résultats chez le macaque, nous cherchons à comprendre comment cette protéine influence la santé des neurones et le bon fonctionnement des circuits responsables de la motricité. À moyen terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour mieux traiter certains troubles moteurs.
Procédures
IRM (EU2, 2 heures), la chirurgie (EU1, 4 heures), enregistrements des cellules nerveuses (1 heure par séance). Prélèvements sanguins potentiels (15 minutes, 1 fois par semaine). Tests comportementaux (EU1, 1 heure/hebdomadaire).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’anesthésie pour l’IRM (2 heures, effets secondaires fréquents tels que nausées, vomissements, ainsi que des troubles respiratoires ou cardiovasculaires) et la chirurgie (4 heures, douleurs post-opératoires transitoires). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (15 minutes, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi qu’a la contention pendant le test comportemental de préhension de nourriture (1 heure, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi que pour les enregistrements électrophysiologiques (1h, stress lié à l’immobilisation).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valides et réalistes permettant d’étudier les lésions dues à de tels symptômes moteurs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal, tout d’abord le rongeur (données de la littérature), puis ici, le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions et une grande reproductibilité dans les différents modèles, ce qui limite le nombre d'animaux.
Raffinement
Un protocole d’acclimatation et d’habituation progressif des singes à leur nouvel environnement d’animalerie est mis en place pendant 1 à 2 mois. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, des soins appropriés en cas d’atteinte de points limites sont prodigués, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter. Les compléments alimentaires, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons, nous permettant de concourir à l’amélioration de l’état de santé de nos animaux. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties. Pendant le transport pour réaliser l’IRM, le singe est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.
Choix des espèces
Le choix du macaque se justifie par la proximité phylogénétique, anatomique et fonctionnelle de son système nerveux central avec celui de l’Homme, en particulier au niveau du contrôle moteur. Contrairement aux modèles de rongeurs, le macaque présente une spécialisation des circuits moteurs hautement comparable à celles observées chez l’humain. Ce modèle permet ainsi une investigation plus fine des corrélats neurobiologiques de la motricité et une meilleure transposabilité des résultats, notamment pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’identification de cibles thérapeutiques pertinentes. Le choix du stade de développement adulte se justifie par la nécessité d’étudier un système nerveux central pleinement maturé, caractérisé par une organisation stabilisée des circuits nerveux et une homéostasie calcique comparable à celle observée chez l’adulte humain. Les animaux ont en général entre 4 et 8 ans, en fonction de leur origine. Par ailleurs, les troubles moteurs associés aux maladies neurodégénératives surviennent majoritairement à l’âge adulte, rendant ce stade développemental particulièrement pertinent pour garantir la validité translationnelle des résultats.
Etude du potentiel anti-inflammatoire d’une molecule dans un modele murin d’inflammation systemique et hepatique aigue
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour évaluer si une molécule inhibitrice des cyclophilines réduit l'inflammation, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide bactérien déclenche chez elles une réaction inflammatoire générale et rapide, pouvant se traduire par une baisse d'activité, un aspect prostré et un hérissement du pelage, ainsi que par une atteinte inflammatoire du foie. Le porteur écrit que ces effets régressent spontanément en moins de vingt-quatre heures aux doses employées, et que des points limites ont été définis pour tuer par anticipation toute souris qui les atteindrait. Toutes sont tuées six ou vingt-quatre heures après l'injection, sous anesthésie générale profonde, pour prélever leur sang et leur foie.
Objectifs
L’inflammation joue un rôle important dans de nombreuses maladies, notamment les maladies du foie. Lorsqu’elle est excessive, elle peut aggraver les lésions des tissus et contribuer à la destruction des cellules. Il est donc important de développer de nouvelles approches permettant de mieux contrôler cette réponse inflammatoire. Des travaux récents ont montré que certaines protéines libérées par les cellules endommagées peuvent amplifier l’inflammation. Parmi elles, la cyclophiline A semble jouer un rôle important dans l’activation des cellules immunitaires et la production de molécules inflammatoires. L’objectif de ce projet est d’évaluer les propriétés anti-inflammatoires d'une molécule capable d’inhiber les cyclophilines, appelée InhCyp, chez la souris. Pour cela, une inflammation aiguë sera induite à l’aide d’une molécule bactérienne appelée LPS, classiquement utilisée dans les modèles expérimentaux d’inflammation. Les effets de l’InhCyp sur cette réponse inflammatoire seront ensuite étudiés grâce à des analyses sanguines et tissulaires réalisées à différents temps après l’administration du LPS.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si une nouvelle molécule est capable de réduire l’inflammation chez la souris. Les résultats obtenus aideront à mieux comprendre certains mécanismes impliqués dans les réactions inflammatoires et le rôle joué par les cyclophilines dans ce processus. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour limiter l’inflammation excessive observée dans certaines maladies inflammatoires et du foie.
Procédures
Les animaux recevront une injection intrapéritonéale de LPS ou de son diluant (NaCl 0,9 %), et une injection intrapéritonéale d’InhCyp ou de son diluant ( (3 % DMSO et 30 % PEG400 dans l’huile de maïs). Chaque injection intrapéritonéale a une durée approximative de quelques secondes par animal. Les animaux seront mis à mort 6 heures ou 24 heures après l’administration de LPS. Des prélèvements sanguins et hépatiques seront réalisés sous anesthésie générale profonde afin de permettre les analyses nécessaires à l’évaluation de la réponse inflammatoire et des effets du traitement.
Impact sur les animaux
Les manipulations et administrations peuvent entraîner une contrainte légère et transitoire liée à la contention et aux injections. L’administration de LPS entraîne une réaction inflammatoire générale et rapide de l’organisme pouvant s’accompagner de signes cliniques transitoires tels qu’une diminution de l’activité, un aspect prostré, un hérissement du pelage. Ces effets apparaissent généralement dans les heures suivant l’administration et régressent spontanément en moins de 24 heures aux doses utilisées dans ce projet. L’évaluation de l’inflammation hépatique pourra également être associée à une atteinte hépatique inflammatoire modérée induite par le LPS. À ce jour, l’administration de l’InhCyp n’est pas associée à des effets indésirables connus aux doses utilisées. Par ailleurs, en raison de ses propriétés anti-inflammatoires attendues, ce composé pourrait limiter les effets inflammatoires induits par le LPS et ainsi améliorer l’état général des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets du LPS et de l'inhibiteur de cyclophilines.
Remplacement
Le recours à un modèle animal est indispensable pour étudier les effets anti-inflammatoires d’un inhibiteur de cyclophilines dans un contexte d’une réaction inflammatoire générale et rapide de l’organisme. En effet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire la complexité de la réponse inflammatoire observée in vivo. Cette réponse met en jeu de multiples types cellulaires et mécanismes physiopathologiques interconnectés, incluant notamment la libération de cyclophiline A par les cellules lésées, la production par différentes cellules immunitaires de cytokines pro-inflammatoires (des protéines qui orchestrent la réponse immunitaire et inflammatoire), ainsi que le recrutement et l’activation de cellules inflammatoires circulantes dans les tissus. Les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire l’ensemble de ces interactions cellulaires et systémiques, ni d’évaluer les effets intégrés du composé sur la réponse inflammatoire globale de l’organisme.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé afin de pouvoir mettre en évidence une différence d’environ 30 % de l'expression d’un marqueur de l’inflammation. Les données obtenues seront analysées à l’aide de méthodes adaptées afin de comparer les différents groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Par ailleurs, un suivi des souris sera réalisé en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Des points limites ont été définis. Si un animal atteint l'un de ces points limites, il sera mis à mort de manière anticipée afin de prévenir toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est une espèce largement utilisée dans les modèles expérimentaux d’inflammation systémique aiguë. Les modèles murins d’inflammation induite par le lipopolysaccharide (LPS) sont bien caractérisés et largement décrits dans la littérature scientifique. Ces modèles permettent de reproduire des mécanismes clés d'une réaction inflammatoire générale et rapide de l’organisme observée chez l’Homme, notamment l’activation de l’immunité innée, la production de cytokines pro-inflammatoires et le recrutement de cellules inflammatoires dans les tissus. La souris présente par ailleurs des caractéristiques physiologiques et immunologiques compatibles avec l’étude des mécanismes impliqués dans l’inflammation systémique et la réponse aux traitements pharmacologiques. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude du rôle des cyclophilines dans l’amplification de la réponse inflammatoire. L’utilisation de ce modèle permet également de disposer d’outils expérimentaux validés (marqueurs inflammatoires, analyses histologiques, données de référence), facilitant l’interprétation des résultats et leur comparaison avec les données existantes. Des souris jeunes adultes seront utilisées dans ce projet. Les animaux seront inclus dans les procédures expérimentales à partir de l’âge de 8 semaines, âge auquel le système immunitaire et les fonctions physiologiques sont matures tout en limitant les variations liées au vieillissement. L’utilisation de souris jeunes adultes est classiquement décrite dans les modèles murins d’inflammation systémique aiguë induite par le LPS et permet d’obtenir une réponse inflammatoire reproductible et homogène entre les animaux. Ce choix permet également de limiter la variabilité expérimentale liée au développement ou au vieillissement des animaux.
Etude des traits morphologiques, physiologiques et du régime alimentaire le long d’un gradient de salinité chez le lézard des murailles
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés sur huit sites côtiers, gardés environ une heure en tube, mesurés pendant vingt minutes, les lézards des murailles subissent une prise de sang dans le sinus post-orbital puis une biopsie de 3 millimètres au bout de la queue. 1 152 individus adultes et subadultes sont utilisés sur trois sessions dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous sont relâchés sur leur point GPS de capture après vingt minutes de balnéation en tube et d'observation. Aucune anesthésie ne précède la prise de sang, le porteur indiquant qu'elle doit être réalisée vite après la capture parce que l'hormone dosée est sensible au stress, une pommade analgésique étant appliquée quinze minutes avant la biopsie caudale. Le choix s'est porté sur ce reptile pour son abondance, sa large répartition côtière et son régime alimentaire généraliste, le porteur ajoutant que l'IUCN lui attribue un statut de préoccupation mineure et stable en Europe.
Objectifs
Les écosystèmes côtiers sont soumis à une augmentation de la teneur en sel dans l’eau et le sol (salinisation) et ce phénomène devrait s’accentuer dans le futur via l’élévation du niveau de la mer, l’intensification des événements extrêmes comme les tempêtes, et la modification des températures et des précipitations. La salinisation peut avoir un impact direct sur les organismes en favorisant la déshydratation. Chez les reptiles et les amphibiens, les mécanismes de régulation de l’état d’hydratation demandent de l’énergie. Ainsi, l’énergie utilisée pour réguler leur hydratation dans des environnements salés peut compromettre les processus physiologiques, la croissance, la reproduction et la survie. Par ailleurs, la salinisation peut altérer l’abondance et la qualité nutritive des proies, ce qui pourrait contraindre ces animaux à ajuster leur régime alimentaire, avec des répercussions potentielles sur leur capacité à réguler leur état d’hydratation, leur croissance et leur survie. Si les effets de la salinisation sur ces processus ont été étudiés chez les amphibiens, nous avons peu de connaissances sur l’impact de la salinité sur les reptiles. Comprendre comment la salinité influence la morphologie, la physiologie et le régime alimentaire des reptiles est donc essentiel pour évaluer la capacité de ces espèces à faire face aux perturbations climatiques et à la salinisation des zones côtières.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension des effets de la salinité sur les reptiles terrestres qui sont peu documentés. Cette étude transversale permettra (1) d’améliorer nos connaissances sur les effets de la salinité sur la morphologie, la physiologie et le régime alimentaire des reptiles présent au niveau des zones côtières, (2) d’étudier les liens entre la morphologie, la physiologie, le régime alimentaire et la salinité en milieu naturel pour ensuite mener des expériences en laboratoire afin de tester nos hypothèses, (3) de mieux anticiper les effets de la salinisation sur les reptiles et d’orienter les stratégies de conservation des populations dans les zones côtières.
Procédures
Une prise de sang et une biopsie de l'extrémité de la queue. Durée < 2 minutes
Impact sur les animaux
Le projet impliquera un stress ponctuel au moment de la capture, des mesures (environ 20 min effectuer toutes les mesures et appliquer les analgésiques) et de la détention en tube (environ 1h comprenant le temps entre la capture et les mesures et une période d’observation de 20min) avant d’être relâchés sur leur point GPS de capture. Une seconde nuisance potentielle sera la prise de sang qui devrait générer une douleur légère de courte durée. Enfin, le prélèvement de tissu caudal (3 mm), réalisé sous analgésie, induira une petite lésion sans saignement et une douleur de courte durée.
Devenir
L'ensemble des animaux sera relâché à l'endroit de leur capture après les mesures réalisées. La remise en nature est cadrée dans l'autorisation de capture de cette espèce de la faune sauvage.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle biologique par un équivalent cellulaire ou in silico car l'étude des effets de la salinité sur les traits morphologiques, écophysiologiques et le régime alimentaire des reptiles necéssite l'utilisation d'animaux en milieu naturel (comme dans notre projet) ou dans des conditions contrôlées au laboratoire.
Réduction
L'échantillon d’animaux prévu pour quantifier les conséquences de la salinité sur les traits morphologiques, physiologiques et le régime alimentaire (1152 individus adultes ou subadulte au total et toutes sessions d’échantillonnage confondues) a été dimensionné pour prendre en compte la forte variabilité inter-individuelle (âge, sexe, etc.), et permettre des comparaisons entre populations continentales et insulaires. Ces effectifs ont été réduits au minimum par rapport aux besoins du suivi transversal ainsi qu’à notre expérience concernant ces études le long de gradient environnementaux où la variabilité intra et interpopulationnelle des traits est forte et façonnée par de multiples facteurs. L'étude se déroulera au cours de trois sessions d'échantillonnage réalisées avant, pendant et après l'été. Chaque session nécessitera la capture de 384 individus, soit un total de 1152 individus sur l'ensemble du projet. Les captures seront réalisées sur huit sites répartis entre quatre sites insulaires et quatre sites continentaux. Les sites ont été sélectionnés de manière à couvrir un gradient de salinité comprenant quatre niveaux : forte, modérée, faible et très faible (ou nulle). Pour chaque session, 192 individus seront capturés sur les îles et 192 sur le continent. Ainsi, sur chacun des huit sites, 48 individus seront échantillonnés par session, répartis de la manière suivante : 24 mâles (12 adultes et 12 subadultes) et 24 femelles (12 adultes et 12 subadultes). Cet effectif est nécessaire pour tester les effets de la saison, de la salinité, du sexe et de l’âge sur la morphologie et la physiologie des lézards.
Raffinement
Afin de raffiner le protocole, les mesures seront réalisées sur le terrain et les animaux ne seront pas ramenés au laboratoire afin de limiter le stress lié à la captivité. Pour les sessions d’échantillonnage pendant (deuxième session) et après l’été (troisième session), nous vérifierons que les individus n’ont pas été capturés à la session précédente à l’aide des scans ventraux et dorsaux (reconnaissance de l’individu à l’aide de la disposition/forme des écailles ventrales et du pattern coloré du dos) pour éviter que les animaux subissent deux fois la procédure. Les mesures seront effectuées le plus rapidement possible afin de limiter la durée du stress et de ne pas biaiser les dosages d’hormones sensibles au stress. Après la prise de sang dans le sinus post-orbital, nous appliqueront un collyre ophtalmique analgésique. La prise de sang sera suivie d’une balnéation en tube Falcon (voir ci-dessous). Une anesthésie préalable à la prise de sang ne peut pas être effectuée car la prise de sang doit être réalisée rapidement après la capture. En effet, l’arginine vasotocin semble être étroitement lié à l’axe hypothalamo-hypophysaire et sensible au stress. Quinze minutes avant la biopsie caudale, un analgésique local (pommade Emla lidocaïne prilocaïne 5%) sera appliqué à l’extrémité de la queue en amont et à proximité immédiate de la zone de la biopsie afin de limiter l’impact du prélèvement sur l’animal, tout en évitant tout contact avec la zone prélevée afin de ne pas perturber le traitement ultérieur des échantillons (extractions d’ADN). Après les mesures, une période de surveillance ainsi qu’une balnéation de 20 minutes est réalisée en tube Falcon et à l’obscurité. La balnéation sera réalisée en mettant 3mm d’eau à température ambiante dans le tube falcon. Des observations répétées de l’individu seront effectués toutes les 5 minutes pour s’assurer du bon état de santé de l’animal avant qu’il soit relâché sur son point GPS de capture. Des points limites associés à des comportements atypiques lors de la contention pour la prise de sang ou le prélèvement caudal seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite.
Choix des espèces
Le lézard des murailles est un petit lacertidé héliophile d'Europe occidentale, largement distribué en France, et occupant généralement des habitats ouverts et rocailleux depuis l’intérieur des terres jusqu’aux zones côtières. La forte abondance de cette espèce, sa large répartition sur les zones cotières (continent et îles) et son régime alimentaire généraliste et flexible en font un modèle d’étude idéal pour étudier les effets de la salinité sur les traits morphologiques, les traits écophysiologiques et le regime alimentaire des reptiles. Selon l’IUCN, cette espèce a un statut de préocupation mineur et stable en Europe. Les animaux utilisés seront des individus subadultes (1 an) ou adultes (de 2 ans ou plus) afin de quantifier les réponses différentielles à la salinité en fonction de la classe d’âge et afin d’avoir un échantillon représentatif de l’entiereté de la population.
Effet de la surexpression de calbindine sur la physiopathologie de la boucle cortico-sous-corticale 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 3
6 macaques, trois à longue queue et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour une étude post-mortem du cerveau. Chacun subit deux heures d'IRM sous anesthésie, quatre heures de chirurgie, des séances d'une heure d'enregistrement de ses cellules nerveuses, des prélèvements de sang hebdomadaires de quinze minutes et un test comportemental de préhension de nourriture d'une heure par semaine, sous contention. Il s'agit d'observer l'effet d'une surexpression de calbindine, protéine de régulation du calcium, sur un circuit cérébral du contrôle des mouvements. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'il n'existe pas de "modèles mathématiques valides et réalistes" pour cette question et que le recours au primate non humain, "du fait de sa proximité avec l'homme", constitue "une étape préliminaire nécessaire" aux thérapies visées.
Objectifs
Cette étude se déroulera sur deux établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la régulation du calcium, la calbindine, élément essentiel au bon fonctionnement des neurones. Nous étudions son action dans un circuit du cerveau impliqué dans le contrôle des mouvements, un circuit souvent touché dans des maladies neurodégénératives. Chez les rongeurs, un manque de cette protéine fragilise les neurones, tandis que le rétablissement de sa production sur des cellules en culture semble les protéger. Chez le macaque, nos travaux montrent qu’elle pourrait aussi jouer un rôle important dans le contrôle de la motricité.
Bénéfices attendus
Nous étudions son action dans un réseau cérébral impliqué dans le contrôle des mouvements, un réseau souvent perturbé dans les maladies neurodégénératives. En obtenant des résultats chez le macaque, nous cherchons à comprendre comment cette protéine influence la santé des neurones et le bon fonctionnement des circuits responsables de la motricité. À moyen terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes pour mieux traiter certains troubles moteurs.
Procédures
IRM (EU2, 2 heures), la chirurgie (EU1, 4 heures), enregistrements des cellules nerveuses (1 heure par séance). Prélèvements sanguins potentiels (15 minutes, 1 fois par semaine). Tests comportementaux (EU1, 1 heure/hebdomadaire).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’anesthésie pour l’IRM (2 heures, effets secondaires fréquents tels que nausées, vomissements, ainsi que des troubles respiratoires ou cardiovasculaires) et la chirurgie (4 heures, douleurs post-opératoires transitoires). Les nuisances sont liées aux prélèvements sanguins (15 minutes, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi qu’a la contention pendant le test comportemental de préhension de nourriture (1 heure, stress modéré lié à l’immobilisation et à l’environnement expérimental) ainsi que pour les enregistrements électrophysiologiques (1h, stress lié à l’immobilisation).
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour une étude post-mortem du cerveau.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non humain (PNH) car il n’existe pas de modèles mathématiques valides et réalistes permettant d’étudier les lésions dues à de tels symptômes moteurs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à coller à la réalité de la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal, tout d’abord le rongeur (données de la littérature), puis ici, le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus lésionnels et réparateurs est une étape préliminaire nécessaire à la mise en place de nouvelles thérapies.
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions et une grande reproductibilité dans les différents modèles, ce qui limite le nombre d'animaux.
Raffinement
Un protocole d’acclimatation et d’habituation progressif des singes à leur nouvel environnement d’animalerie est mis en place pendant 1 à 2 mois. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, des soins appropriés en cas d’atteinte de points limites sont prodigués, avec un scoring permettant de décider des actions conservatoires à apporter. Les compléments alimentaires, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons, nous permettant de concourir à l’amélioration de l’état de santé de nos animaux. Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties. Pendant le transport pour réaliser l’IRM, le singe est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte, ses paramètres vitaux sont surveillés.
Choix des espèces
Le choix du macaque se justifie par la proximité phylogénétique, anatomique et fonctionnelle de son système nerveux central avec celui de l’Homme, en particulier au niveau du contrôle moteur. Contrairement aux modèles de rongeurs, le macaque présente une spécialisation des circuits moteurs hautement comparable à celles observées chez l’humain. Ce modèle permet ainsi une investigation plus fine des corrélats neurobiologiques de la motricité et une meilleure transposabilité des résultats, notamment pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’identification de cibles thérapeutiques pertinentes. Le choix du stade de développement adulte se justifie par la nécessité d’étudier un système nerveux central pleinement maturé, caractérisé par une organisation stabilisée des circuits nerveux et une homéostasie calcique comparable à celle observée chez l’adulte humain. Les animaux ont en général entre 4 et 8 ans, en fonction de leur origine. Par ailleurs, les troubles moteurs associés aux maladies neurodégénératives surviennent majoritairement à l’âge adulte, rendant ce stade développemental particulièrement pertinent pour garantir la validité translationnelle des résultats.