Recherche fondamentale

Les deux lignées maintenues dans ce projet développent spontanément un cancer du foie à un âge précoce, l'une portant un gène qui en favorise l'apparition. 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un projet qui se limite à élever et conserver ces lignées, toute expérimentation ultérieure devant faire l'objet d'une autre demande. Le génotypage prélève moins de 5 mm au bout de la queue avant l'âge de douze jours, sous crème anesthésiante et sans anesthésie générale, et le porteur indique que les tumeurs du foie peuvent apparaître entre 6 et 12 mois avec perte de poids, baisse d'activité, posture anormale et signes de douleur, les souris étant tuées dès la suspicion forte de tumeur. Le champ structuré du devenir annonce 960 mises à mort, tandis que la narration prévoit qu'une partie sera conservée pour le renouvellement des lignées et que les autres seront tuées ou "réutilisés dans le cadre d'un autre projet dûment autorisé".

Objectifs

Le projet a pour objectif d’assurer le maintien de deux lignées de souris génétiquement modifiées. Ces souris développent spontanément un cancer du foie à un âge précoce. L’une des lignées exprime un gène favorisant l’apparition du cancer, tandis que l’autre exprime en plus une protéine susceptible de moduler l’inflammation et le stress cellulaire. Ce projet concerne uniquement l’élevage et la conservation de ces lignées, notamment en vue de leur préservation à long terme ou de futures études scientifiques. Toute expérimentation ultérieure fera l’objet d’une demande d’autorisation spécifique. Ce travail s’inscrit dans les recherches de notre équipe visant à mieux comprendre les mécanismes du cancer du foie et à évaluer le rôle potentiel de cette protéine dans son développement.

Bénéfices attendus

Le maintien de ces lignées de souris permettra à notre équipe de disposer de modèles fiables pour mieux comprendre le développement du cancer du foie. Ces modèles aideront à étudier le rôle d’une protéine susceptible d’influencer l’apparition et l’évolution de la maladie. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouveaux outils pour mieux diagnostiquer ce cancer et à explorer de nouvelles pistes de traitement. L’objectif est d’améliorer les connaissances sur les mécanismes du cancer du foie afin de favoriser le développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces.

Procédures

La première portée de chaque couple sera testée afin de vérifier que les petits possèdent bien les caractéristiques génétiques attendues. Ce contrôle sera réalisé avant l’âge de 12 jours (généralement vers 8 jours). Il consistera en un très petit prélèvement à l’extrémité de la queue (moins de 5 mm), permettant d’analyser l’ADN et de confirmer le statut génétique des animaux. Ce geste est rapide et permet d’obtenir une quantité suffisante de matériel pour effectuer les analyses nécessaires. La procédure sera réalisée par du personnel formé et expérimenté. Elle nécessite une contention brève de l'animal et dure généralement moins d'une minute par souris. Le prélèvement est effectué à l'aide de matériel adapté et désinfecté afin de limiter les risques de douleur, de saignement et d'infection. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage d'origine et font l'objet d'une surveillance particulière afin de détecter toute complication locale éventuelle. Compte tenu du caractère très bref et peu invasif de la procédure, aucune anesthésie générale n'est prévue. Une anesthésie locale par application d'une crème anesthésiante à base de lidocaïne et de prilocaïne (EMLA®) sera réalisée avant le prélèvement conformément aux procédures en vigueur dans l'établissement. Toutes les précautions seront prises pour limiter au maximum l'inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

Chez certaines souris de ce projet, des tumeurs hépatiques peuvent apparaître entre 6 et 12 mois d’âge. Il s’agit du principal effet indésirable attendu. Le développement tumoral peut s’accompagner d’une altération progressive de l’état général, incluant une perte de poids, une diminution de l’activité, une baisse de la prise alimentaire et hydrique, une posture anormale, ainsi que des signes de douleur ou d’inconfort. Ces manifestations sont susceptibles de s’aggraver avec la progression de la maladie. Les animaux seront surveillés régulièrement par observation et examen afin de détecter précocement tout signe clinique évocateur de développement tumoral ou de détérioration de l’état général. Par mesure de précaution et de raffinement, les souris seront euthanasiées dès la suspicion forte ou la confirmation clinique de tumeur afin de limiter l’inconfort. Par ailleurs, les interventions liées au maintien des lignées, notamment le génotypage, consistent en un prélèvement d’un fragment terminal de queue au moment du sevrage. Cette procédure peut entraîner une douleur légère et transitoire au moment du prélèvement, ainsi qu’un risque limité de saignement, d’inflammation locale ou de retard de cicatrisation. Ces effets seront généralement de courte durée et sans conséquence durable sur le bien-être des animaux. Les souris ne présentant pas le facteur favorisant le cancer ne développent pas d’effet indésirable particulier dans les conditions d’élevage décrites.

Devenir

Après vérification des caractéristiques génétiques, une partie des animaux sera conservée pour assurer le renouvellement et le maintien des lignées. Les autres animaux seront soit euthanasiés selon les procédures en vigueur, soit réutilisés dans le cadre d’un autre projet dûment autorisé, en fonction des besoins de l’établissement et des possibilités de réutilisation. La décision de conservation ou de réutilisation sera prise par le responsable du projet en concertation avec le personnel de l’animalerie.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer complètement l’utilisation de souris par des méthodes alternatives réalisées en laboratoire ou par informatique. En effet, le développement du cancer du foie dépend d’interactions complexes entre différents types de cellules et de leur environnement dans l’organisme entier. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable à l’aide de cultures cellulaires ou de modèles informatiques. L’étude nécessite donc un modèle animal permettant d’observer l’évolution de la maladie dans un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux sera strictement limité au minimum nécessaire pour assurer le maintien des lignées. Les reproductions seront planifiées afin d’éviter la naissance d’un nombre excessif de souris et de limiter autant que possible celles susceptibles de développer des tumeurs. Seuls les animaux indispensables au maintien des lignées seront conservés. Afin de réduire encore le nombre d’animaux élevés à l’avenir, du matériel reproductif (embryons ou spermatozoïdes) sera conservé à très basse température. Cette méthode permettra de préserver les lignées sans avoir à maintenir en permanence un grand nombre de souris.

Raffinement

Les souris seront observées chaque jour afin de surveiller leur état général. La présence éventuelle de tumeurs sera recherchée régulièrement par un examen simple et non douloureux. Des points limites précoces sont définis afin de prévenir toute souffrance inutile. Ils incluent notamment une perte de poids significative, une altération de l’état général, une diminution de l’activité, une posture anormale, une baisse de la prise alimentaire ou hydrique, ou tout signe de douleur ou de détresse. Toute atteinte de ces critères entraînera une évaluation immédiate de l’animal et, si nécessaire, sa mise à mort humanitaire. Dès qu’une tumeur est détectée ou fortement suspectée, l’animal sera euthanasié afin d’éviter toute douleur, stress ou inconfort. Lorsque des analyses complémentaires seront nécessaires, des méthodes non invasives, telles que la collecte de fèces ou d’urine, sont privilégiées. Les souris sont hébergées dans des conditions adaptées et enrichies afin de favoriser leur bien-être tout au long du projet.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier de manière fiable le développement des tumeurs du foie, avec des mécanismes proches de ceux observés chez l’homme. Les lignées utilisées permettent de reproduire l’apparition de tumeurs de façon contrôlée, ce qui aide à mieux comprendre la maladie et à tester de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement.

Injectées une fois sous la peau du flanc avec des cellules de neuroblastome, sur animal vigile, en quinze secondes, 338 souris reçoivent ensuite un composé de reprogrammation dilué dans leur eau de boisson pendant toute l'expérience, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce composé acidifie l'eau et lui donne un goût désagréable, du glucose y est ajouté pour qu'elles continuent de boire, et les biberons sont pesés pour vérifier leur consommation. Elles sont manipulées trois fois par semaine pour la pesée et la mesure des tumeurs, pendant huit semaines ou jusqu'à ce que celles-ci atteignent 1,5 cm3, le porteur signalant que les tumeurs peuvent gêner leurs déplacements et que les tunnels sont remplacés par des igloos souples pour éviter de les blesser à cet endroit. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs.

Objectifs

Le neuroblastome est un cancer pédiatrique responsable de 15% de la mortalité infantile liée aux cancers. Diagnostiqué le plus souvent pendant la première année de vie, c’est le premier cancer extra-crânien chez l’enfant. Pour les patients présentant un neuroblastome à haut risque, le taux de survie à 5 ans reste en-dessous de 50%. La compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies représentent ainsi un enjeu majeur en santé pédiatrique. Des thérapies permettant d’induire la transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels et l’arrêt de la multiplication des cellules de neuroblastome, sont employées mais ont une efficacité limitée. Le but du projet est de déterminer les effets d’une différenciation neuronale forcée, c’est-à-dire une transformation des cellules cancéreuses en neurones fonctionnels, dans une ligné cellulaire murine de neuroblastome. Cette lignée cellulaire sera implantée dans des souris nous permettant de travailler avec un modèle d’étude complexe et physiologiquement représentatif de la situation pathologique rencontrée chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les effets de la transformation de cellules de neuroblastome (cancéreuses) en neurones fonctionnels ayant déjà été étudiés in vitro, cette nouvelle étude nous permettra d’identifier les effets de la transformation cellulaire dans un contexte/environnement physiologique complet. Il sera ici possible d’étudier les impacts de l’organisme sur le développement des tumeurs, notamment les effets de la vascularisation sur la pousse tumorale. Ce projet nous permettra également de mieux comprendre au niveau moléculaire les mécanismes permettant de transformer une cellule cancéreuse de neuroblastome en neurone fonctionnel qui arrête de se multiplier. Ainsi, ce projet permettra potentiellement de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques en cancérologie pédiatrique.

Procédures

Les animaux seront soumis chacun à une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette intervention se fera sur animaux vigiles, et durera 15 secondes maximum. Les animaux recevront un traitement dilué dans l'eau de boisson pendant toute la durée de l'expérimentation. Les animaux seront manipulés 3 fois par semaine pour être pesés et pour que la taille des tumeurs soit mesurée (30 secondes par acte) pendant 8 semaines ou jusqu’à ce que les tumeurs atteignent 1.5 cm3. Un faible volume de sang sera prélevé à certains animaux 1 fois au courant de leur vie en fin d’expérimentation, cette manipulation durera au maximum 10 secondes sous anesthésie et analgésie. Les tumeurs seront prélevées en fin d'expérimentation après mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront chacun une unique injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc, ce qui prendra au maximum 15 secondes pour la préhension et l’injection. Cette procédure, bien que très rapide, peut induire du stress à l’animal ainsi qu’une douleur légère. Puisqu’il est attendu que des tumeurs se développent, ces dernières pourraient gêner les animaux dans leurs déplacements. Aussi, les cages ne seront pas enrichies en tunnels, mais en igloo souples, afin d’éviter toute blessure au niveau des tumeurs contre l’enrichissement. De plus, le composé induisant la reprogrammation acidifie l’eau et apporte un gout désagréable à l’eau de boisson. Selon des tests préliminaires, du glucose est donc ajouté à l’eau de boisson afin d’éviter que les animaux ne cessent de s’hydrater. Pour s’assurer de la consommation d’eau, les biberons seront pesés pendant les phases de traitement (au maximum 2 mois). La prise de sang durera au maximum 10 secondes, elle peut engendrer une baisse de niveau d’hydratation de l’animal, ce qui pourra être compensé par une injection sous-cutanée du serum physiologique, ce qui ne prend que 10 secondes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour des analyses au laboratoire.

Remplacement

Ce projet vise à étudier le potentiel de la reprogrammation de cellules cancéreuses sur leur capacité à former des tumeurs, leur prolifération, et la réaction immunitaire. Ces travaux ayant déjà été menés in vitro sur des cultures simples, il est maintenant nécessaire de travailler avec un modèle intégré représentatif du contexte pathologique observé chez les patients humains.

Réduction

Le nombre d’animaux requis a été calculé grâce à un logiciel de tests statistiques, permettant de déterminer le nombre d’animaux suffisants afin d ‘obtenir des résultats statistiques significatifs.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, ceux-ci seront habitués à être manipulé (contention) pendant une semaine entre la semaine d’acclimatation à l’animalerie et le début de la procédure expérimentale. L‘implantation des cellules de lignées cancéreuses impliquant le développement tumoral, un suivi de poids des souris ainsi que de volume des tumeurs sera réalisé trois fois par semaine. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été déterminés. Pour faciliter et uniformiser le suivi des animaux, une grille de calcul des points limites sera utilisée. Si une douleur est détectée (selon la grille de scoring), on administrera de l'analgésie pendant 2 jours.

Choix des espèces

Les modèles de greffes de cellules cancéreuses murines sur souris sont déjà bien établis et caractérisés et dans le cadre de nos travaux, nous avons besoin de souris dont la lignée cellulaire utilisée a initialement été établie. Ainsi, on limite les risques de rejet de greffes. Les animaux seront âgés de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie afin de mener nos projets sur un stade jeune adulte (8 à 10 semaines au début de la procédure). Les données de la littérature montrent que les greffes de cellules tumorales à ce stade permettent d’obtenir des résultats significatifs et cohérents. Les animaux mâles et femelles seront utilisés de manière équitable dans ce projet.

Des souris sont isolées de leurs congénères 96 heures pour mesurer leur dépense énergétique, d'autres placées au froid seules jusqu'à cinq heures ou ensemble pendant sept jours. 3 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récolter des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de caractériser deux mutants d'une protéine du tissu adipeux brun créés par Crispr-Cas9, chez des souris soumises à des régimes obésogènes et à plusieurs températures d'hébergement, avec des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline de 150 minutes. Le porteur écrit que les mesures de dépense énergétique "nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux" et que les mises au froid provoquent "sûrement le plus grand stress", tout en indiquant que les classes de gravité employées "ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d'animaux".

Objectifs

CCe projet a pour objectif de caractériser les effets potentiels de mutants d’une protéine dans la physiologie et la pathologie, notamment dans la prévention du diabète associé l’obésité, autrement appelé Diabésité. Cette protéine est la protéine majoritairement présente dans le tissu adipeux brun des rongeurs, tissu véritable régulateur du métabolisme énergétique, notamment grâce à la présence en abondance de mitochondries. Cette protéine est localisée dans la membrane interne de ces organites, véritable usine énergétique des cellules. Elle est également retrouvée dans des dépôts adipeux humains sous certaines conditions et notamment chez des volontaires sains plongés dans des eaux froides de manières aigue ou chronique (à 17°C durant 2h ou pendant 6 semaines par exemple). Elle intervient donc dans la chaîne de production de l’énergie. Récemment, des études ont mis en évidence l’importance de mutants de cette protéine, grâce à un modèle de sphéroplastes de levure. Ces premiers résultats in vitro ont permis de sélectionner des mutants de cette protéine qui seront créés par la technologie Crispr-Cas9 (plus communément connue sous le terme de ciseaux moléculaires) puis analysés dans des modèles cellulaires puis murins transgéniques. Ces analyses comprendront divers tests de tolérance à différentes molécules, des mesures de composition corporelle et de dépense énergétique, sur des animaux hébergés à plusieurs températures et dans des conditions nutritionnelles standard ou obésogènes. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle in vivo d’une protéine thermogénique majeure du tissu adipeux brun dans la régulation du métabolisme énergétique à travers l’analyse de mutants. Ces modèles murins trangéniques pourraient également servir à cribler des molécules d’intérêt dans le traitement de la « Diabésité » chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux, quelles que soient les procédures réalisées dans l’EU-0549 subiront : 1. des tests in vivo d’une durée de 150 min chacun avec administration de glucose ou d’insuline par voie orale ou par voie intrapéritonéale; 2. des mesures de composition corporelle en début, moitié et fin de protocole, soit 3 x 2 min par animal. Des animaux seront isolés de leurs congénères pour mesure de leur dépense énergétique à trois températures différentes durant une période de 96h. D’autres animaux seront mis au froid isolés pendant une durée maximale de 5h (test aigu) ou gardés ensemble pendant 7 jours (test chronique). Enfin, il est possible que des animaux soient traités de manière aigue ou chronique, selon la nature de la molécule administrée, les traitements sont généralement réalisés de manière quotidienne. Si une chirurgie devait être pratiquée, elle serait unique et durerait environ 1h par animal, de l’administration d’un antalgique en pré-opératoire au réveil. Les tests de sensibilité à l'insuline et de transport du glucose réalisés le jour des nécropsies et nécessitant l'utilisation de molécules radiomarquées seront menés dans l'EU2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances potentielles associées aux expérimentations incluent : les effets liés au régime alimentaire enrichis en lipides, entraînant un risque d’inconfort de l’animal avec une prise de poids qui ne limitera cependant pas sa mobilité ; les prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale lors des tests in vivo provoquent un stress modéré chez les souris; les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant environ 2 minutes seulement ; les gavages peuvent également induire un inconfort voire un léger stress ; les mesures de dépense énergétique nécessitent un isolement des animaux, ce qui va nuire au bien-être des animaux ; les mises au froid lors des tests de tolérance ou lors des mesures de calorimétrie indirecte génère sûrement le plus grand stress, le réveil post-chirurgie peut s’avérer douloureux même si des antalgiques sont administrés, enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre peut entraîner de l’inconfort même si la distance est restreinte et sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt.

Remplacement

Les approches de remplacement ont été soigneusement considérées dans le cadre de ce projet. Les résultats in silico de modélisation de nombreux mutants de notre protéine d’intérêt ont donné lieu à une parution abondante en 2023. Certains de ces mutants ont été testés in vitro dans des sphéroplastes de levure ou après reconstitution de liposomes. Nous allons ainsi nous focaliser sur deux d’entre eux. Comme ces modèles restent insuffisants pour analyser l’importance des mutants de notre protéine d’intérêt dans un contexte physiologique ou pathologique nous allons créer des animaux génétiquement modifiés par la technique « des ciseaux moléculaires » et déclencher par une mise en régime enrichi en lipides et/ou par un hébergement à thermoneutralité des conditions pathologiques.

Réduction

Le principe de réduction a été appliqué dans ce projet pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse scientifique des résultats. Le nombre d’animaux par groupe a été basé sur des données existantes de la littérature et des études menées par l’équipe sur d’autres sujets. Une taille de groupe de 32 animaux (16 mâles et 16 femelles répartis dans les deux génotypes d’intérêt) a été retenue pour garantir une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires. Des approches complémentaires ont été mises en œuvre pour réduire encore davantage le recours aux animaux. Par exemple, des analyses bio-informatiques ont été utilisées en amont pour rationnaliser le choix des mutants et orienter les expérimentations in vivo. En cas d’effets imprévus ou de résultats statistiquement concluants obtenus avec un sous-groupe, les expériences seront immédiatement réévaluées pour affiner le nombre d’animaux encore à utiliser.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront regroupés au moment du sevrage de manière à éviter d’avoir un animal isolé durant la durée de la procédure. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements, dont le choix est fait en accord avec la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) des sites (feuille d’essuie-mains, coton, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest, igloo). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet ; ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les injections ou gavages seront réalisées par des personnes formées et compétentes. Enfin, le transport inter-sites n’excèdera pas 10 minutes, les deux sites étant distants d’environ 100 m et sera réalisé selon la charte de transport mise en place par les deux établissements utilisateurs et signée par les expérimentateurs. Les animaux seront transportés dans leur cage d’origine dans des sacs exclusivement prévus à cet effet afin de minimiser leur stress durant cette période.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte grâce à l’utilisation de divers régimes alimentaires, températures d’hébergement, âges et sexes. À travers l’utilisation du modèle Souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une ou des modifications pour le/les gène(s) d’intérêt et en analyser les conséquences phénotypiques. Les souris seront étudiées entres les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure. Les souris seront majoritairement étudiées entre les âges de 8 à 24 semaines, car c’est la tranche d’âge la plus étudiée dans la littérature, notamment pour les études physiologiques et métaboliques. Cependant, et selon les résultats obtenus sur les premières cohortes, des analyses sur des animaux âgés entre 12 et 18 mois n’est pas à exclure.

Toute souris qui montre l'un des signes d'alerte définis est prise en charge puis tuée si son état l'exige. 8 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever foie, cœur et poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une inflammation chronique qui ramène leur survie moyenne à six mois environ, avec problèmes cardiaques, gêne respiratoire et pâleur des oreilles et des pattes. D'autres reçoivent pendant quatorze semaines des régimes enrichis en acides gras ou des traitements, avec injections, prélèvements de sept gouttes de sang sur deux heures, prises de température, ou une administration par voie aérienne chaque jour pendant trois semaines. Le porteur justifie l'effectif en indiquant qu'un groupe de dix suffit à obtenir des résultats fiables et que "tous les animaux nés seront inclus dans les expériences", sans expliquer comment on parvient de là à 8 240.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre le lien entre les problèmes de métabolisme et l’inflammation dans certaines maladies comme les maladies auto-immunes. Pour cela, nous utiliserons des souris qui ont des troubles similaires à ceux observés chez certaines personnes malades. Nous avons déjà pu observer que ces souris produisent des lipides qui accentuent l’inflammation provoquée par la maladie . Nous voulons maintenant savoir si agir sur l’inflammation et le métabolisme en même temps pourrait aider à mieux traiter ces maladies.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait aider à mieux comprendre certaines maladies inflammatoires de type maladie auto-immunes et à trouver de nouvelles façons de les traiter en agissant à la fois sur les défenses naturelles du corps et sur son métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront des régimes alimentaires spécifiques supplémentés en certains acides gras ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront testés pour voir comment leur corps réagit au sucre (glucose) ou à l’insuline, et comment leur foie régule le taux de sucre dans le sang. Ces tests seront espacés d’au moins 14 jours. Pour cela, il faudra prélever environ 7 petites gouttes de sang sur une période de 2 heures. Ces tests seront réalisés sur des animaux vigiles mais manipulés avec précaution. -Injection 1 fois/2 semaines (x3) ; Prélèvement goutte sang 6 fois/2 semaines (x3) D’autres animaux recevront ces mêmes régimes alimentaires spécifiques ou des traitements pharmacologiques pendant 14 semaines, puis seront prélevés au niveau sanguin toutes les 4 semaines pour suivre des marqueurs sanguins inflammatoires. -Administration traitement 2 fois/semaine (x14) ; Prélèvement sang 1 fois/4 semaines (x4) ; Prise de température environ 1min/2 semaines (x7) Des animaux modèles de maladies inflammatoires chroniques recevront des traitements pharmacologiques pendant 3 semaines via une administration par voie aériennes. Des animaux, dont on aura induit l’inflammation seront traités par voie aérienne ou par injection. -Injection 1 fois ; Administration traitement voie aérienne 40 secondes/jour (x21) Ou 30 secondes/jour (x21)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certains animaux utilisés présentent une inflammation chronique importante, ce qui réduit fortement leur espérance de vie, avec une survie moyenne d’environ 6 mois. Ces animaux peuvent développer des problèmes cardiaques, respirer difficilement ou avoir une peau pâle au niveau des oreilles et des pattes, signes d’un cœur fatigué. D’autres animaux peuvent aussi montrer une faiblesse du système immunitaire, des inflammations des poumons et un poids plus faible que les animaux sains. À noter que certains animaux porteurs d’une seule copie du gène concerné ne développent aucun signe de maladie et vivent normalement.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement des organes d’intérêt (foie, cœur, poumons...)

Remplacement

Ce projet a besoin d'utiliser des modèles animaux, car les méthodes alternatives comme les tests en laboratoire sur des cellules ne permettent pas d’étudier comment les organes communiquent entre eux, ni comment un changement d’alimentation peut influencer tout le corps, notamment le métabolisme et les réactions inflammatoires.

Réduction

Nous adapterons le nombre d’animaux utilisés en fonction des besoins réels de l’étude. Tous les animaux nés seront inclus dans les expériences. Des groupes de référence seront utilisés pour chaque groupe étudié. Par ailleurs, nos expériences précédentes et une analyse préalable nous indiquent qu’un groupe de 10 animaux est suffisant pour obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique.

Raffinement

Des signes d’alerte spécifiques ont été définis pour repérer rapidement tout problème lié à leur état de santé. Si un animal montre l’un de ces signes, il sera immédiatement pris en charge et euthanasié si nécessaire. Leurs besoins sociaux et biologiques sont bien connus, ce qui permet de réduire au maximum toute douleur ou souffrance. Les animaux vivront par petits groupes de cinq, dans des cages enrichies avec une maisonnette et du coton pour leur confort. Lors des expériences, un anti-douleur sera appliqué sur leur queue pour limiter toute gêne.

Choix des espèces

Les souris adultes ( à partir de 6 semaines) sont les animaux les plus utilisés pour étudier le fonctionnement du système immunitaire et du métabolisme, notamment pour comprendre comment certains régimes alimentaires influencent ces mécanismes. Grâce à de nombreux modèles génétiquement modifiés disponibles, nous pouvons obtenir des résultats fiables et les comparer facilement avec ceux d'autres études.

Douleur au site d'injection une à deux heures après l'immunisation, puis plaie, infection ou nécrose possible à partir de 24 à 48 heures et jusqu'à cinq jours, prostration ou piloérection pouvant durer jusqu'à la fin de l'expérience à quinze jours : 27 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections sur animal vigile, trois souris par manipulation, trois manipulations par an sur trois ans si les précédentes échouent. Elles sont tuées pour prélever les ganglions où se trouvent les cellules productrices d'anticorps, l'objectif étant de générer des anticorps qui reconnaissent les tumeurs puis de les rendre radioactifs pour l'imagerie et la thérapie. Le choix de l'espèce tient à une raison inverse de celle qu'on lit d'ordinaire : le porteur écrit employer "la souris qui est suffisamment éloignée de l'homme" pour obtenir une réponse immunitaire forte.

Objectifs

La génération d’anticorps pour l’imagerie du cancer s’inscrit dans le développement de la médecine nucléaire. La recherche actuelle vise à optimiser l’obtention d’anticorps capables de combiner haute spécificité, bonne pénétration tumorale et efficacité thérapeutique, afin d’améliorer la stratification et la prise en charge des patients atteints de cancer. L’objectif de ce projet est de générer des anticorps reconnaissant la tumeur. Les anticorps générés seront ensuite modifiés pour les rendre radioactifs à visée diagnostique et/ou thérapeutique.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’anticorps pour l’imagerie et le traitement du cancer présente plusieurs avantages importants. Elle permet d’abord une meilleure précision diagnostique, en ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses, ce qui aide à localiser plus facilement les tumeurs et les métastases. Cette approche favorise aussi une médecine personnalisée, car les traitements sont adaptés aux caractéristiques de la tumeur de chaque patient. Sur le plan thérapeutique, les anticorps peuvent délivrer le traitement directement sur les cellules malades, ce qui limite les effets secondaires sur les tissus sains. Les anticorps obtenus au cours de ce projet permettront le développement à moyen terme de stratégies innovantes en imagerie nucléaire et dans le traitement de diverses tumeurs solides telles que le cancer du sein, certains cancers de la prostate ou encore les cancers gastriques.

Procédures

Les injections se font sur animal vigile à raison de 2 injections par animal. La procédure dure 2 minutes. 3 animaux sont utilisés par manipulation. Nous pouvons faire 3 manipulation par an. Cette expérience est réitérée si pas de succès pendant 3 ans maximum ce qui fait 27 animaux au maximum.

Impact sur les animaux

Il peut apparaitre des signes de douleur au site d'injection 1 à 2h après l'immunisation voire une plaie, infection ou nécrose à partir de 24-48h et jusqu'à 5j, voire une prostration/hypoactivité ou piloérection à partir de 24, 48h jusqu'à la fin de l'expérimentation (15j).

Devenir

Les souris sont mises à mort en fin de procédure afin de prélever les ganglions où se trouvent les cellules qui produisent des anticorps.

Remplacement

Nous utilisons des souris qui ont un système immunitaire qui ressemble à celui des humains, ce qui permet de mieux comprendre comment notre propre corps pourrait réagir. Pour ce projet, les souris sont indispensables en raison de l'absence d'alternatives pratiques : bien qu'il existe des méthodes alternatives comme les cultures cellulaires ou les simulations informatiques, elles ne reproduisent pas encore la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme entier. Elles ne peuvent pas, à ce stade, remplacer la capacité des souris à produire des anticorps complexes et diversifiés. En résumé, nous employons donc des souris car elles offrent une combinaison unique de caractéristiques qui ne peut pas être reproduite par d'autres moyens disponibles actuellement.

Réduction

Le protocole que nous utilisons est très efficace et ne nécessite que trois souris pour obtenir un grand nombre de cellules immunitaires. Avec ces trois souris, nous obtenons plus de 100 millions de cellules productrices d'anticorps, ce qui nous permet de tester environ 10 000 anticorps différents. Parmi ceux-ci, il est probable que nous trouvions un anticorps spécifique qui cible les cellules que nous étudions. Même si le processus pour identifier les antigènes du virus est long et compliqué, nous n'avons besoin que de neuf souris par an au maximum pour nos expériences.

Raffinement

Des points limites adaptés sont prévus, spécifiques et généraux. Des mesures conservatoires seront appliquées pour soulager les animaux douloureux (antalgiques, réhydratation, accès facilité à la nourriture) selon un arbre décisionnel. Sans amélioration, et selon des critères d’arrêt des souffrances définies, l’expérimentation prend fin.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris qui est suffisamment éloignée de l'homme nous permettant de générer une réponse immunitaire forte induspensable à la production des anticorps. Les souris adultes sont commandées (10-12 semaines) car elles ont un système immunitaire développé.

Rasés, équipés d'un gilet à électrocardiogramme porté 6 h 30 par jour pendant trois jours, épilés à la crème dépilatoire, puis soumis à six injections intrapéritonéales espacées de trois ou quatre jours, chacune suivie d'un électrocardiogramme d'une heure, 40 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur neuf semaines de suivi par individu. Quatre d'entre eux subissent en plus une restriction calorique de 30 % et une pièce ramenée à 15 °C. Le résumé ne nomme jamais l'espèce, seulement "un modèle de petit primate", et compare l'activité cardiaque des individus de 1 à 5 ans à celle des individus de 6 à 12 ans. Le champ structuré du devenir annonce 24 mises à mort et 16 réutilisations, tandis que la narration prévoit la mise à mort de tous les individus de la classe 6-12 ans et une dégradation possible de l'état de santé chez les plus âgés de la classe 1-5 ans.

Objectifs

Avec le vieillissement de la population, 75% des personnes de plus de 65 ans souffriront de déficiences cardio- vasculaires, limitant leur autonomie physique et cognitive et pouvant dégénérer en maladies potentiellement mortelles. Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies. La fréquence cardiaque maximale diminue chez les personnes âgées, indépendamment du mode de vie. Chez ces personnes, le remodelage fonctionnel du stimulateur naturel du cœur, et sa modulation anormale par le système nerveux autonome pourraient être à l'origine de la diminution de fréquence cardiaque. Les statistiques nous indiquent que 1 personne âgée sur 600 développera ralentissement du coeur directement appelées syndrome du sinus malade. Ce syndrome pourrait aussi être une des causes de la fibrillation auriculaire, l’arythmie la plus courante chez les personnes âgées, qui se vérifie dans 5 à 10 % de ces personnes. Pour clarifier la modification de la fréquence cardiaque au cours du vieillissement, nous allons étudier l'activité cardiaque chez un modèle de petit primate. Les données seront comparées aux études déjà réalisées chez la souris et pourront, à plus long terme, permettre le développement de traitements visant à réduire la déficience cardiaque chez les personnes âgées.

Bénéfices attendus

Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies, ainsi que la morbidité et mortalité associés à ces maladies. Pour clarifier la modification de la fréquence cardiaque au cours vieillissement, nous avons choisi un modèle de petit primate qui présente de plus grandes similitudes avec l’homme comparé à la souris. En effet, bien que de taille similaire aux petits rongeurs, cette espèce à une espérance de vie (12 ans) bien plus longue que celles des souris (3 ans). Par conséquent, le nombre de battements cardiaques générés dans une vie chez cette espèce est de 3 milliards, similaire au nombre qui peut attendre le cœur humain au long d’une vie alors que la majorité des autres mammifères génèrent un maximum de 1 million de battements cardiaques dans une vie. Ces comparaisons montrent la similarité entre homme et ce petit primate et justifient l'utilité de cette espèce comme meilleur modèle pour des études sur le vieillissement cardiaque. A plus long terme, cela permettrait d'envisager des thérapies visant à réduire la déficience cardiaque au cours du vieillissement

Procédures

Contention pour rasage et pose du gilet incluant un dispositif d’Electrocardiogramme (5 minutes), permettant l'enregistrement dans lieu de vie (6h30) pendant 3 jours, anesthésie gazeuse (30 minutes), épilation à la crème dépilatoire (2 minutes), échographie (30 minutes), injection intrapéritonéale de molécules (durée 1 minute) avec un intervalle de 3 ou 4 jours, 6 injections au total suivi d'un électrocardiogramme (1h) sur une durée de 2 semaines. Pour 4 animaux, restriction calorique de 30% et diminution de la température de la pièce à 15°. La durée totale du suivi est de 9 semaines pour chaque animal. En fin de procédure, lors de l'euthanasie le prélèvement de sang intracardiaque est fait sous analgésie et anesthésie profonde .

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à la pose du gilet pour enregistrer les électrocardiogrammes peut provoquer un léger stress. Les injections intrapéritonéales des molécules ou des anesthésiques entrainent aussi un stress de très courte durée. Les analyses d' échographie seront faites après anesthésie gazeuse de l’animal, ce qui permet ensuite un réveil très rapide. Les animaux en fin de vie seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie pour permettre les prélèvements d'organes pour des études post mortem au niveau tissulaire et cellulaire.

Devenir

Tous les animaux dont l'état de santé se dégrade seront euthanasiés pour récupérer les organes d'intérêt et étudier l'effet du vieillissement sur ces organes. Donc on estime que tous les individus de la classe 6-12 ans seront euthanasiés au cours du projet et certains individus les plus âgés de la classe 1-5 ans pourraient présenter une dégradation de leur état de santé compte tenu de la durée du projet.

Remplacement

Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des dysfonction cardiaques dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. Par ailleurs, la variabilité individuelle chez les primates mime la variabilité chez l'homme. Ainsi,cette forte similitude entre la physiologie de ce petit primate et la physiologie humaine, comparée aux rongeurs, permet d’obtenir des données plus fiables qui auront une meilleure applicabilité pour le développement de traitement clinique.

Réduction

Nos procédures sont planifiées de façon à réutiliser les mêmes animaux dans plusieurs tests non invasifs. Les expériences précédentes sur d'autres animaux de laboratoire, suggèrent que 10 animaux par groupe seraient suffisants pour appliquer des tests et mettre en évidence des différences statistiquement significatives. Nos protocoles prévoient un suivi individuel (avant et après traitement). Ainsi chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de réduire le nombre d'individus dans les groupes, sans compromettre les objectifs du projet. Pour ce qui concerne les analyses statistiques, tous les tests seront faits de façon telle à comparer les groupes sur la base de l'âge et du sexe des animaux . Pour les données post mortem, les analyses sont faites sur le cœur isolé à partir des animaux dont l'euthanasie est décidée car en fin de vie ou présentant une altération forte de leur bien-être (blessure, pathologie) et pour lesquels les points limites de bien-être animal sont atteints. Tous les organes seront prélevés et conservés pour partage éventuel de tissus à la communauté scientifique, ce qui réduit le besoin d’animaux à plus large échelle.

Raffinement

Les animauxen élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. Les animaux sont groupés par 4 ou 5 individus de même sexe. L’observation quotidienne des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux est réalisée. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux sont enregistrés par des dispositifs externes posés sous des gilets, ce qui évite l’installation d’implants télémétriques. Les enregistrements sont réalisés sur des animaux qui continuent à avoir une vie normale en élevage et qui portent le gilet seulement durant 6h30, et pas sur une durée de plusieurs mois comme c'est le cas pour des animaux implantés. De plus la technique d échographie sous anesthésie gazeuse permet d’obtenir des informations structurales sur le cœur et le cerveau des animaux in vivo, sans intervention invasive. En cas d'atteinte des points limites, les animaux sont retirés de l'étude voire euthanasiés. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement d'organes, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Le nombre de battements cardiaques dans une vie est commun à plusieurs espèces de primates et trois fois plus élevé que dans les espèces de rongeurs (souris et rat) communément utilisées en recherche. Notre modèle primate possède l'avantage, par sa petite taille, d'être facile à maintenir en élevage. De plus, au cours de leur vie (espérance de vie de 12 ans), ces petits primates génèrent autant de battements cardiaques qu’une personne âgées, soit environ 3 milliards. Cela indique que les cœurs de ce modèle, des humains et d’autres primates doivent avoir des adaptations qui leur permettent de soutenir dans une vie, une activité cardiaque trois fois plus longue que les autres mammifères. De ce fait, cette espèce est un meilleur modèle pour étudier les effets du vieillissement au niveau cardiaque . Les animaux est considérés comme âgés à partir de 5 ans donc nous comparerons les fréquences cardiaques des animaux âgés (plus de 5 ans) à celles d'animaux adultes (moins de 5 ans) . Notre étude sera donc réalisée sur des animaux , entre 1 et 5 ans pour les adultes et entre 6 et 12 ans pour les individus âgés.

292 souris porteuses d'une mutation provoquant une dystrophie musculaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Onze gavages quotidiens sous anesthésie légère, jusqu'à 21 tests d'accrochage à une grille, des isolements de trois heures pour collecter l'urine, 48 heures d'isolement pour mesurer les déplacements, trois heures en pléthysmographe, et pour finir une mesure des propriétés contractiles des muscles du mollet de trois à quatre heures sous anesthésie terminale, avant prélèvement du sang total et mise à mort. L'objet est de comparer l'endoxifène au tamoxifène et à la prednisolone à deux âges de la maladie, un essai clinique étant annoncé comme possible dans les trois à cinq ans. Le porteur affirme qu'il s'agit, à sa connaissance, de "la seule approche scientifiquement valide", et écrit par ailleurs que ces souris ont "une maladie très légère pendant l'essentiel de leur vie" du point de vue clinique.

Objectifs

Les myopathies sont des maladies génétiques rares qui touchent les muscles. Les patients sont progressivement paralysés et décèdent prématurément. Aucun traitement efficace n’est disponible à ce jour. Pour développer des traitements avant des essais cliniques, on utilise des souris modèles. Lors d’essais cliniques, le tamoxifène, un médicament connu depuis 40 ans, s’est montré peu efficace. En effet, son efficacité dépend de sa transformation en plusieurs produits dans le foie. Cette étape est variable d’un malade à l’autre. L’endoxifène est le produit final normalement fabriqué dans le foie. Il serait le véritable médicament actif et aurait moins d’effets secondaires que le tamoxifène. On va tester si ce produit final, endoxifène, est efficace contre la myopathie, et est bien toléré. Nous allons évaluer l’endoxifène dans des souris modèles de myopathie et le comparer à deux traitements de référence : le tamoxifène et la prednisolone, le médicament le plus prescrit aux patients myopathes. Nous allons décrire les effets des traitements, seuls ou en combinaison sur les mouvements des animaux, la force musculaire et la composition des muscles.

Bénéfices attendus

Récemment, il a été établi que le tamoxifène est efficace chez des souris, ce qui a donné lieu à un essai clinique chez des garçons atteints de myopathie. Le tamoxifène est bien toléré, les paramètres cliniques se sont améliorés, mais sans atteindre un niveau statistique. Le faible nombre de patients, les fonds limités et des différences dans la capacité de chaque patient à transformer le tamoxifène (peu efficace) en endoxifène (le médicament actif) dans leur foie expliquent probablement les résultats mitigés de l’essai clinique. Nous allons étudier l’endoxifène comme traitement de la myopathie, dans un projet préclinique qui utilisera le moins d’animaux possible. Nous allons déterminer la dose optimale d’endoxifène à 2 âges clés de la maladie chez les souris modèles de myopathie : lorsque la maladie commence, et lorsque la maladie se stabilise et devient chronique. Les effets de l’endoxifène seront comparés à ceux du placébo et de 2 traitements de référence : le tamoxifène et la prednisolone, un médicament couramment prescrit aux myopathes. On étudiera aussi si une combinaison endoxifène + prednisolone est plus efficace que chaque médicament seul. L’étude pourrait conduire à un essai clinique dans les 3-5 prochaines années.

Procédures

Pour la PROCEDURE 1, sur 133 animaux : 11 traitements par gavages quotidiens sous anesthésie légère isoflurane (tranquillisation ; 1 min max) / traitements avec des nourritures supplémentées (pendant 11 jours) / 1 analyse de composition corporelle, non invasive et sans stress (3 min environ) / isolements pour collecte d’urine, 1 à 3 fois si nécessaire (3h max par séance) / 1 injection d’anesthésique réalisée sous anesthésie légère isoflurane (environ 1 min) / collecte de 2 gouttes sang sous 3 des anesthésies mentionnées (environ 1 min) / chirurgie pour prélèvement de sang total (3 min max.) suivi de mise à mort. Pour la PROCEDURE 2A, sur 123 animaux : 21 tests d’accrochage à une grille : 8 entrainements 2 fois par semaines pendant 4 semaines, + 13 mesures expérimentales hebdomadaires (20 min max par séance) / traitements par des nourritures supplémentées (13 semaines) / 2 analyses de composition corporelle, non invasive et sans stress (3 min environ par séance) / 3 isolements pour mesure de la récupération après tests d’accrochage à la grille (20 min environ par séance) / isolements pour collecte d’urine, 2 à 4 fois si nécessaire (3h max par séance) / 1 isolement dans une cage contenant seulement de la litière (peu de stress) pour la mesure des déplacements de la souris (48h) / 1 isolement dans un pléthysmographe pour mesurer les propriétés respiratoires (3h max) / 1 injection d’anesthésique réalisée sous anesthésie légère isoflurane (environ 1 min) / collecte de 2 gouttes sang sous 3 des anesthésies mentionnées (environ 1 min) / sous anesthésie-analgésie terminale : mesure de la perfusion musculaire, mesure des propriétés contractiles des muscles du mollet (procédure de 3-4h), chirurgie pour prélèvement de sang total (3 min max.) suivi de mise à mort. La PROCEDURE 2B, sur 36 animaux, est semblable à la PROCEDURE 2A, sauf : les 13 tests d’accrochage à la grille qui sont remplacés par 1 injection de colorant 24h avant mise à mort.

Impact sur les animaux

La classe de sévérité des animaux passe lentement de normal à la naissance à léger à 6 mois environ, l’âge maximum pour ce projet. Chez les souris myopathes, les contentions fermes pour les prises de sang à la queue et les injections peuvent causer une augmentation des marqueurs de lésions musculaires dans le sang. Malgré l’acclimatation et les mesures prises, certains tests réalisés et les isolements pendant 3-48h pour les collectes d’urine et pour mesurer les déplacements peuvent causer un stress léger aux animaux. Les médicaments testés peuvent ralentir la progression de la maladie, en partie via une adaptation de la composition en fibres musculaires, qui peut se traduire par une légère perte de poids (muscles plus oxydatifs, comme chez les cyclistes ou les marathoniens).

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux sont mis à mort pour récupérer des organes et faire des analyses post-mortem.

Remplacement

Les cultures de cellules musculaires ne peuvent pas répondre aux questions que nous nous posons sur les maladies qui touchent le maintien du muscle mature. En effet, les cultures de cellules musculaires permettent de reproduire le développement initial du muscle (par exemple lors du développement embryonnaire), mais elles restent trop immatures pour servir de modèles aux maladies qui touchent le muscle des patients après la naissance. En l’absence de méthodes alternatives non-animales, nous sommes contraints d’utiliser des animaux vivants pour atteindre les objectifs du projet. A notre connaissance, il s’agit de la seule approche scientifiquement valide pour augmenter nos connaissances et pour obtenir des données précliniques pertinentes susceptibles de permettre une transition vers des essais cliniques chez l’Homme pour traiter des maladies neuromusculaires à ce jour toujours fatales.

Réduction

Nous nous sommes basés sur notre expérience et sur les données publiées dans la littérature scientifique. Nous avons réalisé des calculs de puissance statistique afin de déterminer le nombre minimal d’animaux qu’il est nécessaire d’utiliser pour collecter des données scientifiquement pertinentes et suffisamment robustes. Les groupes contrôle contiennent moins d’animaux sains parce qu’ils ont moins de variabilité que les groupes d’animaux myopathes. Il n’est pas possible de réutiliser les tissus d’études antérieures car les muscles utilisés pour les analyses post-mortem sont de très petite taille et les nombreuses analyses à effectuer consomment le matériel biologique. Par ailleurs les différences dans les conditions d’hébergement d’une institution à une autre, le type de nourriture utilisée, interdisent d’utiliser des données précédentes pour épargner un groupe d’animaux dans ce projet.

Raffinement

Des points limites prédictifs et précoces sont mis en place pour mettre en évidence tout problème ou anomalie chez nos animaux et prendre les mesures pour limiter leur douleur, souffrance ou angoisse. Les agents pharmacologiques sélectionnés sont sans danger pour les animaux : le tamoxifène et la prednisolone sont utilisées depuis des décennies chez l’homme et ont été évalués précédemment chez les souris dystrophiques. Des études réalisées avec l’endoxifène montrent qu’il est bien toléré à des doses élevées chez les souris saines. Il est en cours d’évaluation clinique contre le cancer du sein et est bien toléré chez les patientes (moins d’effets secondaires chez les femmes que le tamoxifène). Il n’y a aucune alerte concernant un risque chez les souris. Nous avons sélectionné les procédures expérimentales de sorte à minimiser les risques d’interférence avec la fonction et la structure du muscle tout en optimisant le bien-être des animaux. Les interventions et tests fonctionnels sur l’animal vigile (pour mesurer la résistance à la fatigue musculaire, l’activité locomotrice, la fonction respiratoire, la composition corporelle) sont peu ou pas invasifs ou traumatisants. Les prises de sang, les gavages, les injections et les mesures de contraction musculaire isométrique se pratiquent sur l’animal tranquillisé ou profondément anesthésié selon ce qui convient le mieux. La plupart des procédures employées respectent des Standard Operating Procedures élaborées par le consortium TREAT-NMD, afin que les données collectées puissent être comparées aux données obtenues précédemment ou dans d’autres laboratoires.

Choix des espèces

Les souris dystrophiques utilisées ici sont une référence pour étudier les mécanismes de la myopathie et évaluer les approches thérapeutiques pour cette maladie fatale. Certains aspects (par exemple les défauts de structure des muscles) représentent bien la maladie humaine. Cependant, d’un point de vue clinique (perte de fonction musculaire), ces souris ont une maladie très légère pendant l’essentiel de leur vie. La connaissance du génome de la souris et la multitude de mutants disponibles rend cette espèce particulièrement adaptée pour combiner des facteurs génétiques impliqués dans les maladies rares. Le projet porte sur des souris à 2 âges clés de la dystrophie musculaire : Pour certains animaux, les traitements commencent 10 jours avant le sevrage et s’achèvent 10 jours après le sevrage, vers l’âge de 5 semaines (35 jours). Cela permet de déterminer si les traitements retardent l’apparition de la maladie chez les individus immatures, équivalent des jeunes enfants au début de la maladie. Pour d’autres animaux, le projet porte sur des jeunes adultes entre 3 et 6 mois. Cette période de 3 mois correspond au début de la phase chronique de la maladie, pendant laquelle la myopathie progresse lentement, comme chez l’Homme. C’est la période appropriée pour étudier la mise en place de mécanismes d’adaptation du muscle à la maladie et la réponse des traitements sur le moyen-terme.