Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude d’un candidat médicament pour la drépanocytose dans un modèle de souris Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Anémie, inflammation, épisodes vaso-occlusifs et troubles respiratoires pouvant conduire à la mort : les 136 souris de ce projet portent une mutation qui reproduit la drépanocytose humaine, dans des procédures classées en souffrance sévère. Toutes sont tuées, puis autopsiées, cerveau, cœur, foie, rate, poumons et reins. Elles arrivent âgées de trois à quatre semaines et reçoivent dans leur eau de boisson un candidat médicament à différentes doses, l'équipe suivant leur état de santé et leur survie. Le RNT ne décrit comme procédures que deux prises de sang, et annonce des points limites sans préciser lesquels.
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique dans laquelle les globules rouges, au lieu d’être ronds, prennent une forme de faucille. Cela bloque la circulation du sang, provoque des douleurs, de l’anémie et des infections. C’est la maladie génétique la plus fréquente en France. Pour l’étudier, nous utilisons un modèle de souris qui présente les mêmes symptômes que les patients. Dans ce projet, nous allons tester un médicament prometteur. Il sera donné aux souris dans leur eau de boisson, à différentes doses. Leur état de santé sera suivi, ainsi que leur survie. Des analyses seront ensuite réalisées pour comprendre les effets du traitement.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux. Cette molécule pourrait être proposée à des patients qui expriment une forme sévère de la drépanocytose.
Procédures
Les animaux auront une prise de sang quand ils atteignent l'âge de 6 mois donc une anesthésie gazeuse (2 minutes). Une prise de sang sera effectuée systématiquement quel que soit l'âge de l'animal avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Concernant le candidat médicament les études toxicologiques n'ont pas démontré d'activité toxique aux doses utilisées. Les symptômes de la drépanocytose dans ce modèle animal sont surtout une anémie, une inflammation, des phénomènes vaso-occlusifs sous l'effet d'un stress oxydatif et des problèmes respiratoires pouvant conduire au décès de l'animal. Toutefois il est attendu une amélioration dose dépendante de l'état physiologique des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour étude anatomo-pathologique de leurs organes (cerveau, coeur, foie, rate, poumon, rein).
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, poumon, rate, rein, cerveau), comme il n'existe pas de système ex vivo capable de mimer la complexité entre les organes, un organisme entier vivant s'impose pour réaliser cette étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes car la drépanocytose est une maladie à transmission autosomique. Comme chez l'homme, l'espérance de vie des animaux présentant cette anomalie génétique peut être considérablement réduite en l'absence de traitement. Le nombre d’animaux a été fixé à 34 par groupe, calculé à partir de tests statistiques adéquats afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la fiabilité des résultats
Raffinement
Les conditions d'hébergement (bruit, température, hydratation, stress..) ne doivent pas amplifier les symptômes de la maladie. L'enrichissement sous forme de buchette à grignoter et de matériel de nidification est présent. Les techniciens en charge de ces animaux les manipuleront par cup handling ou tubing. Les observations se feront sans stimuler et sans manipuler les animaux. La pesée des animaux sera effectuée par tubing. Des points limites ont été établis et une médication à base d’analgésique pourra être instaurée ainsi qu’une observation renforcée.
Choix des espèces
Les animaux choisis présentent une modification génétique reproduisant les symptômes observés chez l’homme atteint de drépanocytose. Les animaux inclus dans notre étude proviennent du croisement de reproducteurs porteurs de l’anomalie, élevés chez un fournisseur agréé. Nous recevrons des animaux âgés de 3 à 4 semaines, soit un stade de croissance correspondant chez l’humain à celui d’un jeune enfant. Il est important de travailler sur ces jeunes animaux, car dans ce modèle, un individu âgé de 3 mois correspond à environ 20 ans chez l’homme. Par ailleurs, la maladie est généralement diagnostiquée avant l’âge adulte, ce qui justifie le choix de ce stade de développement pour l’étude.
Déplétion génétique d’une cible thérapeutique dans le foie et implication dans le développement de la cholangite sclérosante primitive
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour savoir si une protéine étudiée par l'équipe participe à la fibrose de la cholangite sclérosante primitive, une maladie des voies biliaires, des souris d'une lignée qui développe spontanément une maladie du foie, génétiquement modifiées pour ne pas exprimer cette protéine dans le foie, sont étudiées à partir de 4 semaines selon le stade de la maladie. 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte de leurs tissus. La seule procédure décrite est une prise de sang terminale d'environ une minute sous anesthésie, mais la lignée développe une jaunisse liée à la rétention de bile, une fibrose des voies biliaires et une hypertension portale, avec une perte de poids et un stress à l'effort possibles entre 8 et 12 semaines. Les points limites, dits précoces, ne sont pas détaillés. Le porteur décrit les souris comme "de petits mammifères très proches de l'homme" et sa lignée comme "le modèle le plus pertinent en termes d'homogénéité et de reproductibilité" dont il dispose.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la cholangite sclérosante primitive (CSP). La CSP est une maladie inflammatoire chronique des voies biliaires qui entraîne une fibrose et une destruction progressive des canaux biliaires, menant à des complications très sévères, telles qu’une insuffisance hépatique et des tumeurs hépatobiliaires. La CSP est relativement rare, touchant environ 1 personne sur 10 000 dans la population générale. Elle est plus fréquente chez les hommes que chez les femmes et est souvent diagnostiquée chez les patients atteints de colite ulcéreuse. À l’exception de la greffe du foie, qui est réservée aux patients les plus gravement touchés, il n’existe actuellement aucun traitement pour cette maladie. Nous étudions une protéine d’intérêt localisée sur la membrane cellulaire, jouant un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement cette cible thérapeutique qui ralentit la croissance tumorale des cancers du foie et le processus de fibrose hépatique. Ainsi l’objectif de ce projet est d’évalué le rôle essentiel que joue notre cible thérapeutique dans le développement de la fibrose dans le cas d’une CSP. Pour cela, un nouveau modèle de souris a récemment été développé afin d’obtenir une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’évaluer l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt sur le développement de la CSP.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à évaluer l’implication d’une cible thérapeutique sur le développement de la CSP. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre et d’affirmer le rôle de cette cible dans le développement de la CSP. L'objectif de l'ensemble du projet est de comprendre comment notre cible thérapeutique participe à l’évolution de la maladie et d’identifier des voies cellulaires dérégulées, et potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Ce modèle de souris développe spontanément une maladie hépatique caractérisée par une cholestase intrahépatique avec ictère, une fibrose biliaire, une hypertension portale. Une perte de poids et un stress à l’effort entre 8 semaines et 12 semaines peuvent être observé.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques seront appliquées lors des gestes le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une CSP. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge de 4 semaines minimum. Ce choix permettra une étude en fonction du stade de la maladie.
Mécanismes physiopathologiques de la surdité dans les maladies de l’inflammasome.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Surexposées au bruit pendant quelques heures ou injectées trois jours de suite dans l'abdomen pour déclencher une inflammation de l'oreille, 4 660 souris sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes tuées à l'issue. Leur audition est mesurée environ toutes les deux semaines, chaque séance durant une heure, et une partie subit une chirurgie de deux heures sans réveil. L'équipe cherche à identifier les mécanismes de la perte auditive chez les patients porteurs de mutations d'un gène de l'inflammasome, symptôme qu'elle décrit comme le plus invalidant de la maladie. Le porteur affirme pourtant que ces mêmes atteintes auditives sont "largement compensées" chez la souris et n'entraînent pas de phénotype dommageable, et que les chirurgies terminales ne sont "pas susceptibles d'entraîner une douleur".
Objectifs
Les patients atteints de syndrome auto-inflammatoire rare appelé syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) présentent une inflammation chronique, une fièvre intermittente et des douleurs articulaires, ainsi que des caractéristiques très spécifiques comme une éruption type urticaire (> 95 % des patients) et des caractéristiques neuroinflammatoires telles qu'une perte auditive neurosensorielle (60 %). Les traitements actuels ciblant certaines molécules stabilisent la maladie ; cependant, dans la plupart des cas, ils ne font pas régresser la perte auditive, qui reste le symptôme le plus invalidant. Les mécanismes qui sous-tendent le phénotype de perte auditive chez les patients restent inconnus, ce qui empêche le développement de tests audiologiques et de traitements appropriés. Nous avons récemment découvert que certaines mutations pour un gène entraînaient une forme atypique de maladie avec perte auditive mais où la plupart des autres symptômes sont atténués. Notre projet a pour but i) d'identifier et de caractériser de manière approfondie chez la souris les événements responsables de la perte auditive progressive chez les individus porteurs de mutations de ce gène aux niveaux moléculaire, cellulaire et tissulaire, et ii) de décrire, aux niveaux moléculaire et cellulaire, le nouveau mécanisme physiopathologique qui sous-tend la perte auditive chez les patients porteurs de mutations. Le projet bénéficiera de modèles animaux spécifiques pour les formes classiques et atypiques de cette maladie.
Bénéfices attendus
En caractérisant les atteintes auditives dans les formes génétiques de surdité, notre projet permettra les avancées suivantes : -Nous déterminerons les mécanismes physiopathologiques à l’origine des surdités dans les patients porteurs des mutations du gène étudiées. -Ce gène étant impliqué dans un complexe impliqué dans l’immunité innée, notre travail ouvrira la porte à l’identification d’autres protéines du complexe comme potentiellement impliquées dans la surdité -Un grand nombre de cas de surdités progressives reste souvent inexpliqué. En caractérisant très finement la signature audiologique des souris mutantes et avec un travail similaire qui est en cours chez les patients porteurs de mutations dans ce gène, notre travail aidera à identifier les cas de surdités non expliqués qui pourraient être liés à une mutation de ce gène. Enfin, notre travail générera des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles de prévenir la surdité chez les patients porteurs de mutations de ce gène. L’existence de médicaments capables d’inhiber le complexe dont fait partie cette molécule rend cette perspective très concrète.
Procédures
Les interventions seront : - Une inflammation de l’oreille sera induite sur les modèles animaux de deux façons possibles : i) soit par une surexposition sonore de quelques heures soit ii) par l’injection d’une faible dose d’une substance dans l’abdomen sur trois jours par doses croissantes pour mimer une petite infection. - Nous effectuerons un suivi de l’audition de modèles de souris pour des atteintes auditives à la suite de l’activation de l’inflammation dépendant du gène étudié. Ce suivi aura lieu approximativement toutes les deux semaines afin de suivre l’évolution de la surdité induite par l’inflammation de l‘oreille. Chaque suivi dure environ 1h. - Une partie des animaux auront une chirurgie terminale de 2h pour faire des mesures fonctionnelles dans l’oreille.
Impact sur les animaux
La plupart des procédures impliquent des expérimentations légères ou une succession d’expérimentations légères. On ne s’attend donc pas à des nuisances majeures ou effets indésirables sur les animaux. Les modèles de souris que nous utilisons ont des modifications génétiques entraînant des surdités périphériques associées parfois à des atteintes auditives centrales. La souris reposant principalement sur l’olfaction, son système sensoriel et dans une moindre mesure sur son système visuel lors des interactions sociales, ces atteintes auditives sont largement compensées et n’entrainent pas de phénotype dommageable. Quelques manipulations du projet pourraient entraîner de légères nuisances : -Certaines expositions sonores pourraient induire un stress temporaire sur l’animal. C’est pourquoi les différentes mesures utilisant ces tests sont espacées dans le temps. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. -En ce qui concerne les chirurgies, celles-ci sont terminales et donc ne sont pas susceptibles d’entraîner une douleur. -En ce qui concerne l’induction de la réaction inflammatoire, celle-ci sera limitée à l’oreille et pourrait causer une douleur légère et/ou un inconfort léger. - Les doses typiquement utilisées sont 4-5 fois inférieures à celles utilisées pour induire une réaction inflammatoire forte qui peut entraîner des pertes de poids importantes les deux premiers jours après injection puis une reprise de poids les jours suivants. Aux doses plus faibles, on s’attend à pas d’effet ou un effet mineur. De plus, une douleur légère au point d’injection de et une réduction de l’activité et de la mobilité peut survenir pendant quelques jours.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, l’ensemble des animaux du projet sont des organismes génétiquement modifiés, de nombreuses procédures nécessitent la mise à mort de l’animal pour récupérer des tissus afin d’effectuer différentes expérimentations ex vivo. D’autres procédures impliquent des interventions qui signifient qu’on ne peut pas les réutiliser. La plupart des animaux sont porteurs de mutations de gènes de surdité très spécifiques rendant leur réutilisation, par d’autres équipes. Cependant, une fois les animaux mis à mort, nous essayons de les utiliser pour des entraînements à la dissection et la mise au point de nouveaux protocoles lorsque c’est possible. Ces partages se font typiquement à l’échelle du centre de recherche au-delà de notre équipe.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative que ce soient des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.
Réduction
La détermination du nombre d’animaux a été réalisée en tenant compte à la fois des contraintes techniques (coût, hébergement, temps, etc.) et de l’expertise développée dans l’équipe sur des expériences similaires. Pour les procédures qui en nécessitent, une analyse de puissance détaillée a été effectuée. Dans toutes les procédures, des cages standard de 5 animaux seront utilisées.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (observation du poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Plusieurs méthodes de raffinement sont utilisées dans nos projets. Nous avons par exemple veillé à ce que nos tests comportementaux ne reposent pas sur des motivations par des déprivations de nourriture ou d’eau. Lors des enregistrement de données sous anesthésie, des antalgiques et des couvertures chauffantes sont utilisées afin de limiter au strict minimum le risque d’hypothermie et de stress physique. Nous utilisons également des enrichissements de cage par défaut et renforcés après certaines procédures. En cas d’hypothermie, des couvertures chauffantes sur le fond de la cage sont également utilisées. En cas de déshydratation, des réhydratation sous-cutanées sont réalisées ainsi que la fourniture de gel hydrique.
Choix des espèces
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. Le projet impliquera des animaux de stades différents. Nous étudierons les conséquences de l’inflammation principalement à des âges adultes mais nous serons amenés à considérer de temps en temps des expériences de suivi chez la jeune souris afin de s’assurer (en cas de doute) qu’il n’y a par exemple pas d’inflammation spontanée avant son induction. L’étude utilisera des animaux âgés de 0 jour (naissance) à l’âge adulte (15 mois maximum).
Etude de stratégies protectrices dans un modèle de syndrome de détresse respiratoire aigüe chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Choisis parce que leur masse corporelle et leur anatomie cardiaque se rapprochent de celles de l'être humain, et parce que 35 à 45 kg est un poids que le porteur juge idéal pour la manipulation, 130 porcs juvéniles vont être opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chacun subit deux heures de chirurgie, puis quatre-vingts minutes de détresse respiratoire aiguë provoquée, avec des prélèvements sanguins tout au long de la procédure. L'objectif est de comparer une ventilation aux perfluorocarbones aux soins courants administrés en réanimation humaine. Le porteur indique que des échecs de survie liés au manque d'oxygène peuvent survenir pendant le suivi, et que tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole pour prélever leurs organes.
Objectifs
Le taux de mortalité des patients atteints d’un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) reste très élevé. Ce syndrome est une forme grave d’insuffisance respiratoire aiguë, associée à une inflammation sévère et un œdème pulmonaire. Il conduit à une atteinte pulmonaire diminuant les échanges gazeux. Le traitement actuel repose sur l’assistance ventilatoire de ces patients avec de faibles volumes inspiratoires et de fortes pressions en fin d’expiration, pour limiter l’étirement des alvéoles. Dans les cas de SDRA sévère, cette approche s’avère moins efficace et est associée à l’oxygénation extracorporelle (ECMO) du sang qui consiste à remplacer les poumons par la circulation du sang via une machine externe. Dans ce dernier cas, les volumes inspiratoires de l’assistance ventilatoire sont encore plus faibles. Mais ce traitement n’est pas toujours suffisant et entraîne des complications hémorragiques et infectieuses. Afin d’améliorer cette prise en charge, nous proposons d’étudier une stratégie expérimentale utilisée dans notre laboratoire : la ventilation liquide totale. Cette ventilation utilise les perfluorocarbones. Ce sont des liquides « volatiles » qui maintiennent les échanges gazeux et permettent une ventilation à faibles pressions. Dans ce projet, notre objectif sera donc de comparer l’effet de la ventilation liquide au protocole de soins courants utilisés en clinique à l’heure actuelle. Pour cela, nous utiliserons un modèle de syndrome de détresse respiratoire aiguë chez le porc. L’utilisation du porc est nécessaire car la validation du dispositif de ventilation liquidienne dans l’atteinte pulmonaire est en cours d’évaluation pré-clinique chez le gros animal.
Bénéfices attendus
Nous évaluerons l’impact sur l’oxygénation sanguine des différents traitements mis en place dans le syndrome de détresse respiratoire aigüe. Ainsi cela permettra de comparer ces nouvelles approches avec les traitements utilisés à l’heure actuelle chez l’homme. L’utilisation de la ventilation liquide dans ce contexte diminuerait les lésions pulmonaires et augmenterait significativement l’oxygénation comparativement au groupe Témoin.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de 2 heures et à l’induction de la détresse respiratoire aigüe pendant 80 minutes. Des prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés tout le long de la procédure.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les échecs de survie liés à l’hypoxémie durant le suivi peuvent survenir.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole afin de prélever les organes et de réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Les affections respiratoires sont des situations complexes impliquant des interactions majeures avec les autres organes (interactions hémodynamique, biochimique, etc). Dans la mesure où notre objectif est d’évaluer un dispositif médical agissant in vivo, cela ne peut pas être mimé in vitro avec une méthode alternative (absence de Remplacement possible).
Réduction
Le critère de jugement principal sera l’oxygénation dans le sang avant sacrifice. Pour montrer une augmentation de 100% de l’oxygénation à la fin du suivi expérimental dans les groupes traités par rapport au groupe témoin, il nous faudra un effectif de 15 animaux par groupe. Le calcul a été déterminé par un eapproche statistique. Ce calcul permet d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et un enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant toute la durée des expériences. De plus, le protocole anesthésique inclut une forte valence analgésique avec administration d’antalgiques puissants. Pendant le suivi, en cas d’une pression artérielle basse pendant 30 minutes, la mise à mort sera réalisée.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. De plus, la validation du dispositif de ventilation liquidienne est en cours d’évaluation pré-clinique chez le gros animal. Les porcs seront des porcs juvéniles de 35 à 45kg car ce poids est idéal pour la manipulation.
Etude de l’impact d’anticorps anti-Facteur Von Willebrand sur l’hémostase et la thrombose artérielle
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à cinq injections par animal, puis une chirurgie de quarante-cinq minutes maximum sous anesthésie sans réveil : 160 souris vont être utilisées et tuées avant tout retour à la conscience. Une thrombose leur est provoquée, ou leur carotide est ponctionnée pour mesurer le temps de saignement, afin de tester trois agents anti-facteur Von Willebrand mis au point par l'équipe. Certaines sont utilisées entre trois et quatre semaines d'âge, parce que leur carotide a alors la taille jugée idéale. Le porteur indique que les modèles employés ne permettent pas de garder les animaux en vie, sans préciser lesquels ni comment les 160 souris se répartissent entre les procédures.
Objectifs
L’hémostase est le processus qui permet l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, vont former un caillot appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui survient dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose, qui correspond à une accumulation de graisses, de calcium et de cellules au niveau de la paroi d’un vaisseau. Suite à la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un caillot pouvant entraîner des pathologies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC). Lorsque la plaque rompt, le flux sanguin augmente considérablement, ce qui entraîne le dépliement d’une protéine plasmatique (le facteur Von Willebrand) qui favorise la formation du caillot. Le but de ce projet est de tester l’effet anti-thrombotique de trois agents que nous avons développé, ainsi que leur impact sur l’arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
Le facteur Von Willebrand joue un rôle important dans la croissance du caillot, il est donc une cible anti-thrombotique intéressante. Nous avons déjà montré in vitro que les agents ciblant cette protéine plasmatique inhibent la formation caillot dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L’évaluation de ces 3 agents pourrait conduire à l’identification d’un nouvel antiplaquettaire n’induisant pas de risque de saignement et qui pourrait être utilisé plus tard chez l’Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (animal vigile ou anesthésié), maximum cinq par animal et d’une durée de 30 secondes. Cesrtains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celle-ci seront de maximum 45 min. Toutes les procédures chirurgicales se font sous anesthésie et analgésie. Ces anesthésies sont sans réveil.
Impact sur les animaux
Une des complications attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire. Une autre est le risque de saignement au site d’incision ou d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’induction d’une thrombose chez l’animal ne permet pas son maintien en vie après la procédure. De même, le temps de saignement par ponction de la carotide ne permet pas le maintien en vie.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents anti-facteur Von Willebrand sur la thrombose et le risque de saignement. Le risque de saignement ne peut pas être étudié in vitro car il n’existe pas de modèle adéquat à l’heure actuelle. De plus, la thrombose artérielle, étant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: - L’environnement des cages est enrichi de coton compressé et de frisure de papier afin de permettre aux animaux de construire un nid et ainsi augmenter la diversité de leur comportement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de la procédure - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure - Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutanée et également appliqué sur l’oeil lorsque nécessaire Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entraîné pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles in vivo sont largement maîtrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose artérielle. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant certains récepteurs plaquettaires et certaines protéines plasmatiques humaines, permettant ainsi de tester de nouveaux traitements de la thrombose artérielle. Les souris seront utilisées entre 3 et 4 semaines car c’est le stade auquel elles présentent une carotide de taille idéale, excepté pour le temps de saignement pour lequel elles seront utilisées entre 2 et 6 mois, ce qui correspond à l’âge adulte.
Réponse des oiseaux marins aux changements environnementaux : adaptations et limites physiologiques (MODIFICATION)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés dans une colonie sauvage de 20 000 couples reproducteurs, 100 manchots royaux adultes et 50 poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Certains ont déjà été suivis les années précédentes sans que le porteur puisse l'établir avec certitude, les bagues métalliques ayant été abandonnées pour leurs effets délétères à long terme. Chaque oiseau subit jusqu'à sept prises de sang à la veine alaire en un an, la pose sous la peau d'un transpondeur, un enregistreur fixé aux plumes du dos pendant huit à quinze jours, et un capteur avalé qui reste dans son tube digestif de sept jours à deux mois. Les 145 oiseaux relâchés sur leur site de capture et les 5 réutilisés échappent à la mise à mort, le porteur limitant chaque manipulation à moins de 35 minutes, yeux couverts d'une cagoule opaque.
Objectifs
A l’échelle de la Terre, l’environnement change à un rythme sans précédent. Le changement climatique, la fragmentation des habitats, les interactions entre l’homme et la nature, l’émergence de nouvelles maladies ; tous ces facteurs exercent une pression intense sur des écosystèmes autrefois préservés. De tels changements sont exacerbés dans les milieux polaires des hautes latitudes où le forçage climatique, l’écotourisme et les zones de reproduction limitées accentuent le stress auquel sont soumis les populations animales, en particulier les oiseaux marins. Des connaissances sur les adaptations physiologiques individuelles des oiseaux marins et leurs limites sont nécessaires pour comprendre et prédire si les individus et les populations sont capables ou non de faire face aux changements environnementaux. Le présent projet a pour ambition de poursuivre un observatoire à long terme des réponses physiologiques des manchots royaux aux changements de leurs environnements. Le projet sera construit en combinant des données précédemment collectées, complétées par un suivi annuel d’un échantillon représentatif de manchots se reproduisant dans différentes conditions coloniales et saisonnières (l’objet de la présente demande). Ce suivi permet d’étudier la variabilité inter- et intra-annuelle des réponses physiologiques (en termes d’énergie, de température corporelle et de stress) mises en oeuvre par les oiseaux face aux changements à terre de leur micro-habitat, des conditions de vie en colonie, du parasitisme et de la prédation. En combinant des protocoles d’échantillonnage standardisés sur le long-terme à des outils d’analyse statistiques avancés, nous étudions la contribution des différentes sources exogènes de pressions environnementales (climat, prédation, parasitisme, dérangement lié à l’homme) au phénotype du stress ainsi qu’à la reproduction et al croissance du manchot royal, afin de comprendre à quels facteurs et à quelles périodes ces animaux sont le plus vulnérables.
Bénéfices attendus
Les changements climatiques actuels et ceux prédits par les différent scénarios IPCC posent de nouvelles contraintes pour les espèces animales. Les observations répétées de stress thermique chez le manchot royal (i.e. comportement de halètement et ajustements posturaux des adultes diminuant la protection de l’œuf et du poussin) suggèrent que les espèces sub-Antarctiques sont également sensibles au stress thermique de chaleur, mais il n’existe à ce jour aucune données / publications sur cet enjeu majeur de conservation de la biodiversité. Les résultats obtenus seront cruciaux pour ajuster les projections concernant les dynamiques de populations de cette espèce en fonction des différents scénarios climatiques futurs (IPCC) pour renforcer les mesures de protection des espèces en fonction de leur sensibilité, et permettrons l’utilisation de l’approche la moins invasive possible pour d’autres étude du stress thermique de chaleur chez le manchot royal et possiblement d’autres espèces sub-Antarctiques et Antarctiques
Procédures
Les animaux seront soumis à maximum quatre types d’interventions sur animaux vigiles (maximum 100 adultes de 50 couples et leurs 50 poussins) : - Prélèvement sanguin à la veine alaire (7x en l’espace d’environ 1 an, durée du prélèvement ~ 2 minutes) - Implantation sous-cutanée d’un transpondeur d’identification thermo-sensibles (durée de la pose < 5 min) - Pose d’un enregistreur électronique comportant un accéléromètre tri-dimensionnel et un cardio-fréquencemère sur une durée de 8 à 15j - Equipement avec un logger ingérable mesurant la température interne (en place pour 7 jours à 2 mois selon la durée de rétention naturelle dans le tractus digestif)
Impact sur les animaux
Les procédures du projet sont assez peu invasives (capture, prise de sang, marquage par transpondeur sous-cutané, équipement avec loggers peu invasifs) mais soumettent les individus à un stress de courte durée (manipulations < 35 min). Des manipulations relativement similaires réalisées depuis plus de 15 ans n’ont pas révélé d’effets indésirables sur la reproduction ou la survie des individus.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront relâchés sur leur site de capture. Des animaux ayant participé au suivi à long-terme (classe Légère) les années antérieures comme adultes reproducteurs ou comme poussins pourront être à nouveau suivis, bien que cela reste rare du fait de la taille de la colonie d’étude (20000 couples reproducteurs) et de l’absence de marquage externe permanent des individus ; les bagues métalliques ayant été abandonnées du fait d’effets délétères à long-terme. Etant donné la légèreté des procédures, et l’intervalle de temps d’au moins une année entre la première utilisation et la seconde, aucun effet cumulatif n’est attendu.
Remplacement
Le but de ces études est de comprendre les stratégies adaptatives de l’animal dans son milieu : les méthodes alternatives sont donc inexistantes. De plus, nous étudions un modèle animal qui présente des adaptations particulières et quasi-uniques dans le règne animal, ceci permet d’aborder la notion fondamentale des compromis énergétiques ayant des répercussions sur le taux de reproduction et de survie de l’individu. Nos expérimentations ont pour but de cerner les capacités physiologiques et comportementales d’adaptation de ces animaux aux contraintes de l’environnement, un point clé dans la compréhension des réponses populationnelles au changement global.
Réduction
Le projet est réfléchi afin de réduire au maximum l’impact des procédures sur le bien-etre des animaux et réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous mutualisons nos animaux et données avec d’autres programmes scientifiques (la base de données a vocation à être entièrement publique d’ici à 2027, les premiers élements étant déjà publiés en ligne) et cherchons à répondre à plusieurs problématiques en n’utilisant qu’un groupe d’oiseaux. Par ailleurs, les effectifs animaux sont choisis à minima (12-13 couples par zone * 4 zones contrastées pour le suivi longitudinal) au regard d’analyses statistiques permettant de caractériser la variation naturelle observée. Ceci comprend notamment l’étude de l’attribution de variance à travers de modèles statistiques complexes (Modèles Linéaires Mixtes Généralisés (GLMMs), Analyses en Composantes Principales (ACPs), Equations d’Estimations Généralisées (GEEs)).
Raffinement
Des précautions particulières sont prises pour minimiser le dérangement des animaux et réduire l’impact des procédures sur leur bien-être. En termes de Raffinement, nous avons développé une méthodologie d’étude du fonctionnement mitochondrial visant à remplacer les biopsies musculaires par l’analyse des cellules sanguines, ce qui limite considérablement le côté invasif des expérimentations. De manière semblable, nous combinons l’utilisation de transpondeurs pour l’identification des animaux avec la collecte des données de température corporelle afin de minimiser le côté invasif de nos manipulations (transpondeurs thermo sensitifs). Les interventions sur les animaux se limitent en fait à des captures, pesées, mensurations, prises de sang à la veine alaire, identification par transpondeur et pose de biologgers externes ou ingérables. Le temps de manipulation est réduit au minimum grâce notamment à l’intervention de chercheurs confirmés et formés à manipuler des manchots royaux. Durant les manipulations les animaux ont de plus les yeux couverts d’une cagoule opaque qui limite leur stress. Toutes les manipulations sont effectuées dans le calme et les oiseaux sont surveillés en permanence pendant les interventions et quotidiennement après. Nous avons fixé le point limite d’arrêt des manipulations à l’apparition de polypnée (indice du stress de l’animal) ou d’une apathie. Les biologgers utilisés sont fixés (de manière non permanente) en externe sur les plumes dorsales, ce qui n’entraine pas de souffrance chez l’animal. Les modèles que nous déployons sont utilisés en routine avec succès chez cette espèce depuis plusieurs années, sans effets négatifs sur la reproduction et la survie.
Choix des espèces
Le manchot royal est choisi comme modèle au regard de son écologie chez l’adulte que le poussin. Les adultes se nourrissent en mer et jeûnent plusieurs semaines lors des séjours à terre, durant l’incubation et la mue. Ils font face à de fortes contraintes environnementales à terre (stress social, parasites, climat) et en mer (hypoxie en plongées profondes, prédation). Le poussin a une croissance très longue (+1 an) pour un oiseau, interrompue par une phase de jeûne pendant l’hiver austral. C’est un modèle idéal pour l’étude de la plasticité des mécanismes physiologiques et des compromis énergétiques dans un contexte de changement global. Le manchot royal, espèce adaptée au froid, souffre de plus en plus de vagues de chaleur à terre dues au réchauffement climatique (stress thermique), justifiant par ailleurs la recherche de nouvelles méthodologies de suivi non-invasif de la température corporelle des animaux à l’aide de transpondeurs d’identification passifs. Adultes, indispensables pour la part des expériences basées sur l’évaluation du succès reproducteur et les caractéristiques de la recherche alimentaire en mer qu’ils sont les seuls à effectuer. Poussins pour étudier l’influence des conditions environnementales sur la croissance, le statut hormonal et la survie.
Evaluation de nouveaux traceurs d’imagerie dans un modèle murin femelle sous-cutané de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Trois heures d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avec l'hypothermie que cela entraîne : 290 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent d'abord une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, dont la croissance dégrade leur état général, puis une injection de radiotraceur par cathéter, geste qui peut laisser un hématome. Le travail vise à repérer par imagerie deux enzymes du métabolisme d'un acide aminé, marqueurs possibles de cancers et de maladies du système nerveux. Le porteur retient des souris immunodéficientes de six à dix semaines, jeunes précisément pour qu'une "légère immunocompétence" ne fasse pas rejeter la greffe.
Objectifs
Nous développons de nouveaux outils d’imagerie médicale appelés traceurs, qui permettront d’observer directement dans le corps deux enzymes importantes liées au métabolisme d'un acide aminé présent dans de nombreux tissus et cellules du corps humain. Quand ce métabolisme est perturbé, cela peut être lié à de nombreuses maladies, allant du cancer à des troubles du système nerveux (comme certaines maladies du cerveau). Ces perturbations entraînent souvent une augmentation de la quantité de ces enzymes. Pouvoir les détecter dans le corps pourrait donc aider à diagnostiquer certaines maladies, notamment les tumeurs, ou même à développer de nouveaux traitements. Il existe déjà des traceurs à base de tryptophane pour ce type d’imagerie, mais ils sont difficiles à fabriquer à cause de la complexité du processus de marquage radioactif. Une autre solution consiste à créer de nouveaux traceurs à partir de petites molécules capables de se fixer directement sur ces enzymes, plutôt que d’utiliser l'acide aminé lui-même.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de nouveaux traceurs d’imagerie capables de se lier spécifiquement à deux enzymes majeures du métabolisme de l'acide aminé. Après une caractérisation plus précise de leurs propriétés, ces traceurs pourraient être proposés pour le diagnostic, le suivi et le traitement de nombreuses affections cancéreuses ou neurologiques.
Procédures
Injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse 1 fois pendant 10 min par animal. injection sous anesthésie gazeuse suivi d'une imagerie de 3h, 1 fois par animal pendant 5 min.
Impact sur les animaux
La manipulation avant l’anesthésie entraine un léger stress chez l’animal. L’injection des cellules peut infliger une douleur correspondant à celle d’une piqûre d’aiguille. La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale. Une hypothermie durant l’imagerie induite par l’anesthésie gazeuse. Un hématome peut se former suite à la cathéterisation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des études d’immunohistochimie cérébrales complémentaires aux études d’imagerie.
Remplacement
L’objectif du projet étant de développer un traceur d’imagerie utilisable chez l’humain, aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'animal entier, étant donnée la complexité des processus mis en jeu telles que les interactions avec le microenvironnement tumoral et ne permet d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution et le développement de nouveaux radiotraceurs d'imagerie.
Réduction
L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. La première étude permet grâce à l’imagerie d’évaluer la cinétique du radiotraceur après une injection intra-veineuse. Les moyennes de captation du traceur dans la tumeur et les différents tissus seront comparés entre les 2 groupes d’animaux par des tests statistiques. Nous prévoyons d’inclure un total de 28 animaux par traceur (2 groupes de 14 animaux) et par lignée cellulaire, toutefois, ce nombre de 14 animaux par groupe représente une valeur maximale car les sessions d’imagerie seront réalisées séquentiellement, à raison de 2 à 3 animaux/groupe. Pour exemple, si un traceur ne se fixe pas du tout dans la tumeur car il ne passe pas la barrière tumorale alors les sessions d’imagerie ne seront pas répétées et le nombre d’animaux utilisé sera moindre. Ces sessions d’imagerie seront répétées si nécessaire, jusqu’à atteindre, le cas échéant, le plafond des 14 animaux/groupe.
Raffinement
Dès leur arrivée, les souris seront hébergées en portoir ventilé afin d’empêcher l'installation du phénotype dommageable lié à l’immunodéficience. Elles seront hébergées en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique) et observées quotidiennement. Lors de l’injection tumorale en sous cutanée, les souris seront anesthésiées en gazeux et placées sur un tapis chauffant et une protection oculaire sera appliquée. Après ces implantations, les animaux seront récompensés (morceau de fruit...) et auront une surveillance accrue jusqu'à l'imagerie. Nous prendrons soin de mesurer tous les jours pendant 5 jours, l’évolution de la tumeur grâce à un pied à coulisse. Avant l'imagerie, les animaux auront une phase d'habituation à l'environnement de la pièce pour éviter le stress lors de l'imagerie. Pour cette dernière (maximum 3h), les animaux seront anesthésiés en gazeux, une protection oculaire sera appliquée, les souris seront maintenues dans un lit thermorégulé (environ 37°C) et la température corporelle sera monitorée. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Etude de l’hemodynamique cérébrale après une réanimation par circulation extracorporelle par rapport à une réanimation conventionnelle dans un modèle porcin d’arrêt cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Aucun de ces cochons ne se réveillera de l'anesthésie. 36 cochons juvéniles de 30 kilos vont être utilisés, opérés puis tués sans retour à la conscience, dans un modèle que le porteur juge trop sévère pour autoriser un réveil. On leur provoque un arrêt cardio-respiratoire, puis on les réanime soit par compressions thoraciques et adrénaline, soit par circulation extracorporelle, avec des prises de sang tout au long, pour comparer ce que devient l'irrigation de leur cerveau. Le porteur reconnaît que des échecs de réanimation et des hypotensions sont possibles "compte tenu de la difficulté du modèle", et prévoit d'arrêter la réanimation si la circulation ne repart pas après plusieurs minutes.
Objectifs
L’arrêt cardiaque est un enjeu majeur de santé publique, à l’origine de 46 000 décès chaque année en France. La réanimation cardio-pulmonaire d’un arrêt cardiaque repose sur des compressions thoraciques ainsi que l’injection d’un médicament vasopresseur : l’adrénaline. L’utilisation de ce médicament améliore certes la survie globale, mais serait potentiellement responsable d’aggravation des lésions neurologiques induites par l’arrêt cardiaque. Au vu de ces considérations, une autre stratégie de réanimation cardio-pulmonaire a été proposée chez certains patients. Elle consiste au déploiement rapide d’une oxygénation par la circulation extracorporelle (ECMO), permettant de remplacer artificiellement les fonctions cardiaque et pulmonaire. Le recours tardif à cette stratégie de réanimation cardio-pulmonaire extracorporelle a récemment montré une amélioration de la survie avec devenir neurologique favorable en comparaison à une réanimation cardiopulmonaire conventionnelle avec adrénaline. Cependant, l’impact sur l’hémodynamique cérébrale d’une réanimation cardio-pulmonaire sans adrénaline et avec seulement une circulation extracorporelle n’est pas connu à ce jour et sera donc l’objectif de cette étude. Pour cela, nous utiliserons un modèle porcin d’arrêt cardiaque sévère et nous comparerons les fonctions cérébrales chez des porcs ayant reçu soit une réanimation cardiopulmonaire conventionnelle avec injection d’adrénaline soit avec mise en place d’une circulation extracorporelle.
Bénéfices attendus
Nous évaluerons précisément l’impact sur les paramètres d’hémodynamique cérébrale soit au décours d’une réanimation cardio-pulmonaire conventionnelle avec adrénaline soit avec mise en place d’une circulation extracorporelle. Ainsi, cela permettra de comparer l’impact des effets de l’adrénaline utilisée à l’heure actuelle comme référence de réanimation cardio-pulmonaire face à la circulation extracorporelle, stratégie répandue dans la réanimation cardiopulmonaire tardive.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale , à un arrêt cardio-respiratoire puis à une réanimation cardiopulmonaire. Pour les groupes tests, la réanimation cardio pulmonaire sera suivie de la mise en place de la circulation extracoporelle à un débit sanguin constant. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les échecs de réanimation et des hypotensions sont possibles chez les animaux, compte tenu de la difficulté du modèle.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole. La sévérité du modèle ne permet pas de réveiller les animaux.
Remplacement
L’arrêt cardiaque induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet donc pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Le critère de jugement principal sera le débit carotidien, reflet du débit cardiaque. En considérant une différence dans le groupe « réanimation conventionnelle avec adrénaline » et dans les deux groupes « réanimation extracorporelle précoce et ultra-précoce », le calcul a été déterminé par une approche statistique. Ce calcul permet d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté. Les valeurs estimées de débit carotidien mentionnées sont issues de travaux antérieurs.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure. Si la pression de perfusion artérielle diastolique est basse pendant la réanimation cardiopulmonaire ou en cas d’absence de reprise de la circulation spontanée après plusierus minutes après le bolus d'adrénaline ou la mise en place de la circulation extracorporelle, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques systémiques et cérébraux. Porcs juvéniles de 30 kg car ce poids est utilisé pour les modèles d'arrêt cardiaque chez le porc.
Etude de la maladie chronique rénale associée à la glycogénose de type 1a dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un morceau d'oreille prélevé sur des nouveau-nés de sept à dix jours, un rein retiré par chirurgie à deux ou trois mois pour accélérer la maladie, puis quinze mois de suivi : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent six recueils d'urine et quatre prises de sang en tube de contention, sur animal éveillé, avant un jeûne de six heures le dernier jour. Le porteur décrit une maladie rénale qui reste silencieuse jusqu'à un stade très avancé, autour de quinze mois, où les souris commencent à perdre du poids, à se toiletter moins, à se prostrer et à moins se déplacer. Toutes sont tuées pour qu'on prélève leurs reins, leur intestin, leur foie, leur hypophyse, leur hypothalamus et leurs gonades.
Objectifs
La glycogénose de type 1 est une maladie génétique rare caractérisée par une incapacité de l’organisme à produire du sucre en dehors des repas. La maladie se caractérise par des chutes des taux de sucre dans le sang (hypoglycémies) sévères, rapidement entre les repas. A l’âge adulte, la plupart des patients développent une maladie rénale, qui reste longtemps silencieuse mais détectable par mesure de marqueurs urinaires (présence d’albumine dans les urines ; albuminurie). En progressant lentement, elle évolue vers une insuffisance rénale caractérisée par une perte de la fonction du rein et l’accumulation de déchets dans le sang. A ce stade, les patients présentant aussi des kystes (formation d’un « sac » rempli de liquide) sur la surface des reins ou dans les reins. Des études récentes ont montré que dans cette maladie les cellules du rein ont la capacité de se multiplier de façon anormale ce qui favorise le développement de kystes et possiblement de cancers (2 cas décrits chez des patients atteints de glycogénose de type 1. A l’exception d’un contrôle nutritionnel, il n’existe actuellement aucun traitement curatif pour limiter l’avancée de la maladie rénale. La dialyse puis la transplantation rénale sont les seules solutions lorsque l’insuffisance rénale est atteinte. Le développement de cette maladie a été reproduit chez la souris en ciblant la mutation génétique de la glycogénose de type 1 uniquement dans les reins, ce qui permet d’éviter les épisodes d’hypoglycémie car le foie peut produire du sucre dans ce modèle animal. Comme chez l’homme, l’évolution de la maladie rénale est lente et silencieuse mais irréversible et mène à une insuffisance rénale au bout de 15 mois environ, avec l’apparition de kystes. Les premiers signes cliniques (albuminurie) apparaissent entre 6 et 9 mois, et la maladie peut être suivie par le dosage des mêmes marqueurs biologiques que chez les patients. Le but de ce projet est d’identifier les cellules et les mécanismes impliqués dans le développement des kystes, voire des cancers rénaux. Pour accélérer le développement de la maladie rénale, un rein sera enlevé au cours d’une chirurgie peu invasive. Dès les premiers signes d’insuffisance rénale, les reins seront prélevés pour des études moléculaires. Cette étude sera réalisée chez des animaux des deux sexes et devrait également permettre de comprendre les mécanismes à l’origine du retard d’apparition de la maladie chez les femelles par rapport aux mâles.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe pas de traitement curatif qui permette d’endiguer la mise en place de l’insuffisance rénale sévère sur le long-terme. Cette complication est pourtant importante chez les patients atteints de glycogénose de type 1 puisque plus de 70-80% développent une maladie chronique rénale. Du fait du faible nombre de patients, nous n’avons pas le recul nécessaire pour évaluer les risques associés à l’apparition de kystes chez les patients, ni l’incidence de cancers rénaux. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l’évolution de la maladie à long-terme, permettant ainsi une meilleure prise en charge des patients. Plus précisément, identifier d’éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques est primordial pour développer des thérapies efficaces
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Les animaux subiront une intervention chirurgicale courte (durée d’environ 15 minutes) à l’âge de 2/3 mois permettant l’ablation d’un des deux reins, sous anesthésie générale (maximum 30 minutes d’anesthésie) et après injection d’analgésiques (2 injections le jour de la chirurgie et 1 injection/jour pendant les 2 jours post-chirurgie, nécessitant quelques secondes/injection). Au cours du temps, les souris vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les 3 mois à partir de 6 mois. L’animal peut subir un léger stress (qui entraine le déclenchement de la production d’urine), même si ce geste ne nécessite pas forcément la contention de l’animal. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 12 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine. La piqûre peut engendrer une faible douleur et un stress lié à l’immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, 6 prélèvements d’urine et 4 prélèvements de sang seront réalisés. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Même si la glycémie reste constante, les animaux peuvent subir un léger stress. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
A l’âge de 7-10 jours, les souris transgéniques subissent une biopsie au bord de l’oreille afin d’analyser leurs gènes. Ceci entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. À l’âge de 2 ou 3 mois, les souris subiront l’ablation d’un rein sous anesthésie générale. Après l’opération, elles peuvent ressentir un peu de douleur et d’inflammation. Dès 6 mois, les souris peuvent développer une maladie rénale sans impact sur le bien-être animal jusqu’au stade très avancé de la maladie caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois). A ce stade, les animaux commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Pour suivre le développement de la maladie, des prélèvements urinaires spontanés seront effectués, ce qui peut provoquer un très léger stress. Les animaux subiront aussi des prises de sang après leur immobilisation dans un tube de contention. Ces gestes peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. Enfin, en fin de protocole, les animaux sont mis à jeun pendant 6h ce qui peut entrainer un léger stress. Une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort. La piqure entraine une légère douleur et la contention de l’animal entraine un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin, du foie, de l’hypophyse, du cerveau (hypothalamus) et des testicules ou ovaires afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires
Remplacement
Aujourd’hui, il est possible de fabriquer en laboratoire de petits modèles de reins (appelés organoïdes) qui reproduisent les différents types de cellules présentes dans cet organe. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution de la maladie rénale ni le développement de tumeurs sur une longue période. Pour cela, il est indispensable d’avoir recours à des études chez l’animal, sur plusieurs mois. Le modèle de souris utilisé dans ce projet est le seul à reproduire fidèlement tous les problèmes rénaux observés dans la glycogénose de type 1. Ce modèle a été créé grâce à une méthode spécifique à la souris. De plus, le métabolisme de la souris est très proche de celui de l’être humain. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale été faite chez la souris. Il existe donc beaucoup de données scientifiques et d’outils disponibles pour poursuivre ces recherches dans ce modèle. Enfin, il est très difficile de mener ce type d’étude chez l’humain, car la glycogénose de type 1 est une maladie très rare (environ 1 naissance sur 100 000), ce qui rend les recherches sur des patients très limitées.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances de la pathologie étudiée, des modèles animaux, du métabolisme et grâce aux connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 24 souris, permettront de réaliser à la fois les études moléculaires et histologiques. Des tests statistiques permettront de comparer les différents groupes de souris entre eux. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, les souris « contrôles » qui ne présenteront pas la perte du gène ciblé dans les reins seront issues des mêmes reproductions. Les expériences que nous prévoyons exigent de petites quantités de tissu rénal pour différentes analyses en laboratoire. Comme les échantillons disponibles sont très limités, nous devons organiser les prélèvements de manière à pouvoir réaliser toutes les analyses prévues sans gaspillage. Le protocole durera 15 mois, donc nous devons aussi anticiper la possibilité que certaines souris ne puissent aller jusqu’au bout de l’étude, en prévoyant une marge de sécurité (une souris en plus par groupe). En tout, nous aurons 4 groupes expérimentaux, chacun composé de 6 souris, soit 24 souris par série d’expérience. L’étude sera réalisée sur des souris des 2 sexes car des résultats précédents suggèrent une progression plus lente de la maladie rénale chez les femelles ; nous doublerons ces groupes, ce qui portera le nombre total de souris à 96 : 48 souris malades et 48 souris saines servant de témoins. Enfin, nous veillerons à limiter la production d’animaux en n’utilisant que les souris nécessaires, et en utilisant les animaux surnuméraires uniquement pour maintenir nos lignées. Une fois le nombre requis atteint, les reproductions seront arrêtées. Nos lignées de souris sont d’ailleurs conservées à long terme par congélation, ce qui nous évite d’avoir à produire des animaux en continu. Au total, ce projet réalisé sur 3 ans nécessitera au maximum 96 souris, incluant l’obtention de 48 souris transgéniques atteintes de la maladie rénale de la glycogénose de type 1 et de 48 souris contrôles, sans signes de maladie.
Raffinement
Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10 jours après la naissance, un âge où les nerfs ne sont pas encore complètement développés. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et au contact avant le début des procédures. Un petit tunnel sera aussi utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. La glycogénose de type 1 sera déclenchée uniquement dans les reins, ce qui permet aux souris de continuer de produire du sucre normalement grâce au foie, et ainsi d’éviter de baisses de sucre dans le sang. Lors du retrait d’un rein, les souris recevront un médicament contre la douleur avant et après l’opération. Une crème analgésiante sera aussi appliquée sur la peau, et la température corporelle sera maintenue pendant la chirurgie grâce à une plaque chauffante. Les interventions se feront dans des conditions stériles pour éviter les infections. Après l’opération, les souris seront isolées au chaud et surveillées pour s’assurer qu’elles se réveillent bien et sans souffrance. Elles retrouveront leur groupe au réveil. Pour les prises de sang, la veine sera dilatée par le chaud pour faciliter le prélèvement. Le volume de sang prélevé sera très limité selon les recommandations. Les souris seront habituées aux tubes dans lesquels elles seront placées pendant ces prélèvements, pour réduire leur stress. Les analyses d’urine se feront sans manipulation forcée : nous attendrons que les souris urinent spontanément, ce qui évite de les isoler dans des cages spéciales. Concernant la maladie elle-même : Les premiers signes ne provoquent pas de souffrance visible (c’est une maladie dite « silencieuse »). Les symptômes graves, comme une forte perte de poids ou une dégradation de l’état général, apparaissent tardivement, et indiquent la fin du protocole. La mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés a permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude, ou plus tôt si leur état de santé se détériore, afin de prélever les différents organes dont les reins.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans le corps. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, ce modèle de souris est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatale. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement puisque la perte de la fonction rénale qui est progressive. Voici comment se dérouleront les principales étapes du suivi : • Un prélèvement de tissu sera réalisé entre 7 et 10 jours après la naissance pour sélectionner les souris porteuses de la maladie. • À l’âge de 2 à 3 mois, une intervention chirurgicale peu invasive (le retrait d’un rein) sera réalisée. • Ensuite, nous effectuerons des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole.
Etude de l’inhibition de l’inflammation sur un modèle d’ossification chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des injections de biomatériaux ensemencés de cellules musculaires humaines, puis des injections d'anticorps, sous anesthésie générale : 414 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour qu'on récupère les biomatériaux et les tissus. Une partie d'entre elles sont des souris Nude, dépourvues de système immunitaire, que le porteur signale comme plus exposées aux infections aux points d'injection. L'objet est de vérifier si des cellules prélevées sur le muscle de patients paralysés fabriquent bien l'os anormal qui se forme dans leurs muscles, et si deux anticorps l'empêchent. Le suivi clinique annoncé court jusqu'à 28 jours, sans que le RNT dise ce que devient sur cette durée la gêne à se déplacer qu'il attribue aux injections, ni quelle taille atteint l'os produit.
Objectifs
Les patients polytraumatisés paralysés présentent de nombreuses complications qui impactent leur récupération et leur qualité de vie. Parmi ces complications, les paraostéoarthropathies neurogènes (POAN) sont un développement anormal de tissu osseux au sein du muscle, à proximité des articulations (hanche, coude, genou et épaule). Ces ossifications entraînent des douleurs, des raideurs articulaires et des compressions des nerfs et des vaisseaux qui ont des conséquences majeures chez ces patients déjà lourdement handicapés. A ce jour, il n’existe aucun traitement médical efficace et la seule option thérapeutique est de retirer chirurgicalement le tissu osseux anormal. Ce traitement tardif et palliatif expose ces patients fragiles à de nombreux risques anesthésiques et opératoires. Du fait de son mécanisme d’apparition inconnu, il est impossible actuellement de proposer des thérapeutiques préventives. Nos travaux de recherche ont permis de caractériser une population cellulaire du muscle (FAPs) à l’origine de ce développement osseux et le rôle clef de deux protéines. Ce projet vise à étudier le rôle des FAPs dans le développement de tissu osseux. Pour cela nous étudierons notre modèle murin d’ossification ectopique par biomatériaux. Ces biomatériaux sont ensemencés avec des FAPs humains isolés à partir de résidus opératoires de muscle de patients. Ils sont ensuite injectés en sous-cutané ou en intramusculaire chez des sourisdes souris immunodéficientes ou immunocompétentes puis prélevés afin d’analyser les marqueurs d’ossification. Enfin, nous étudierons l’effet d’un traitement avec des anticorps neutralisant ces deux protéines.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ce modèle in vivo d’ossification ectopique par biomatériaux est indispensable pour caractériser et étudier le devenir des FAPs humains en modélisant un système biologique. Nous pourrons ainsi confirmer leur capacité à générer un tissu osseux pathologique et mettre en évidence les mécanismes impliqués. L’objectif est ensuite de pouvoir évaluer une approche thérapeutique préventive par l’utilisation d’anticorps neutralisants et de documenter leur potentiel intérêt dans la prise en charge des patients.
Procédures
Les deux interventions comprennent des injections de biomatériaux et des injections d’anticorps qui seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions dureront 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent présenter une gêne passagère à se déplacer due aux injections des biomatériaux. De part leur état d'immunodeficience, les souris Nude peuvent être plus sensibles au risque biologique notamment aux sites d'injection.
Devenir
Les souris seront euthanasiées pour prélever les biomatériaux pour étudier leur structure par coloration et réaliser des analyses moléculaires des tissus.
Remplacement
Une grande partie de nos travaux de recherche sont réalisés sur des modèles de remplacement in vitro par culture cellulaire et ont fait l'objet de publications. Néanmoins, cette approche présente des limitations et ne peut pas rendre compte de la complexité des processus pouvant s’établir dans un organisme entier notamment la réponse inflammatoire qui est primordiale dans le développement des ossifications pathologiques. Les modèles de culture in vitro des biomatériaux ensemencés avec les FAPs seront toujours réalisés en parallèle de ce projet, nos dernières études . A notre connaissance, la modélisation in silico ne peut pas être utilisée.
Réduction
Ce projet nécessite un nombre maximal de 414 souris. Les protocoles expérimentaux seront réalisés de manière séquentielle dans le but d’optimiser les temps de prélèvement des biomatériaux et appliquer le principe de réduction et limiter le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux a été calculé par un logiciel adapté pour réduire le nombre d’animaux tout en permettant d’obtenir des résultats significatifs. Chaque souris contribuera à des analyses histologiques et immunohistochimies ou des analyses moléculaires et protéiques.
Raffinement
Les procédures d'anesthésie générale, d'injections et le suivi des souris seront réalisées par du personnel habilité. Afin de raffiner nos procédures et réduire au maximum le stress et la douleur, nous utiliserons des protocoles établis d’anesthésie et de prise en charge de la douleur (analgésie) en respectant les points limites d’arrêt du protocole. Les souris anesthésiées seront placées sur tapis chauffant durant les procédures d'injections. Le suivi post-injections associé à une surveillance clinique rapprochée à 24h, 48h, J7, J14 et J28 seront strictement réalisés et retranscrits dans une fiche de scoring. Enfin, les conditions d’hébergement des animaux sont contrôlées avec le respect d’une période d’acclimatation et la mise à disposition d’un enrichissement adéquat.
Choix des espèces
La souris est un modèle in vivo communément utilisé dans l’étude du métabolisme osseux et de la physiologie musculaire. Les gestes chirurgicaux sur ces animaux sont parfaitement maîtrisés par les personnels impliqués qui sont par ailleurs formés pour évaluer et prendre en charge la douleur. Les souris seront utilisées au stade jeune adulte pour un âge compris entre 8 et 10 semaines. Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée lors de l’injection des biomatériaux.
Etude des réseaux de gènes impliqués dans la comorbidité entre la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant une chirurgie de 45 minutes qui installe une douleur neuropathique durable, sept tests comportementaux, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le protocole consiste précisément à produire une douleur chronique doublée d'un état anxio-dépressif et à la laisser durer. L'effectif de 1 440 animaux est rapporté à la littérature, à l'expérience de l'équipe et à la variabilité entre individus, sans qu'aucun calcul soit donné.
Objectifs
La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la principale cause d’invalidité, impactant de manière significative la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur pour la société, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des patients souffrant de douleur chronique développent des troubles anxio-dépressifs. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette comorbidité. À travers une étude transcriptomique, nous avons identifié une liste de gènes potentiellement impliqués dans cette pathologie. Pour valider ces cibles, nous prévoyons de manipuler leur expression sur un modèle murin in vivo à l’aide d’une approche virale, afin d’évaluer leur impact sur la chronicisation de la douleur et le développement du phénotype anxio-dépressif.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider les réseaux de gènes impliqués dans la chronicisation de la douleur neuropathique et de ses conséquences anxio-dépressives et donc éventuellement la mise en place d'une stratégie thérapeutique permettant de soulager et prévenir la douleur et les troubles émotionnels associés.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirugie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Dissection de la connectivité entre le thalamus de la ligne médiane et le cortex préfrontal chez le rat et la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 20
200 souris et 20 rats subissent une craniotomie de trente minutes à une heure pour recevoir une injection de virus dans le cerveau, puis sont exsanguinés une semaine à dix mois plus tard. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et aucun animal n'est gardé vivant. Le porteur qualifie pourtant l'ensemble de "courte chirurgie" "minimisée", tout en décrivant par ailleurs une chirurgie invasive et des souris porteuses d'une mutation Alzheimer qui développent des troubles de la mémoire dès huit mois et, parfois, des crises d'épilepsie. La mise à mort sert à prélever les cerveaux pour des enregistrements sur tranches, dans un projet dont le porteur reconnaît que l'impact pour les patients "ne sera pas immédiat".
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer la mise en place de la connectivité thalamocorticale au cours du développement, 2- de comparer les projections de deux populations thalamiques distinctes dans le cortex chez l’adulte, 3- d’évaluer l’évolution de la transmission thalamocorticale au cours du vieillissement dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 4- de comparer ces résultats obtenus chez la souris avec la connectivité thalamocorticale chez le rat.
Bénéfices attendus
Ce projet est principalement un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, ce projet comporte des aspects translationnels car nous cherchons à comprendre comment évolue la boucle thalamocorticale dans un modèle de souris transgéniques récapitulant des aspects de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, ce projet s’inscrit dans un projet plus large visant à comprendre l’importance de cette boucle dans la régulation du sommeil, qui est crucial pour la consolidation de la mémoire et pour l’évacuation des déchets du métabolisme. Enfin comprendre comment cette boucle se met en place pendant le développement pourrait permettre de mieux appréhender d’un point de vue thérapeutique la prise en charge des problèmes de sommeil dans des pathologies du neurodéveloppement qui sont très fréquents par exemple chez les enfants atteints de troubles du spectre autistique. Ces travaux permettront donc de mieux comprendre les fonctionnements du sommeil en contexte physiologique pathologique et pourraient permettre d’identifier des nouvelles pistes thérapeutiques pour améliorer la qualité du sommeil.
Procédures
Les animaux subissent une chirurgie invasive nécessitant une craniotomie pour permettre l’injection de virus qui dure entre 30 minutes et une heure ; suivi par une exsanguination 1 semaine à 10 mois plus tard. Cette deuxième étape dure 15 minutes.
Impact sur les animaux
Certaines souris utilisées pour ce projet seront un modèle génétique de la maladie d’Alzheimer. Ces animaux présentent des troubles de la mémoire à partir de 8 mois ainsi que dans de rares cas des crises d’épilepsie. Si tel est le cas, il est préconisé de leur permettre de récupérer dans un environnement enrichi et calme. C’est pourquoi ces animaux seront hébergés avec des enrichissements supplémentaires (grande roue et tunnel) et leur cage sera placée dans le bas du portoir afin de leur assurer le plus de calme possible. Toutes les procédures faites sur ces animaux seront de degré de sévérité modéré du fait de la chirurgie. Cette chirurgie peut entrainer des douleurs post-opératoires qui sont minorées par les antalgiques.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure pour prélever leurs cerveaux afin de faire des enregistements sur tranche de cerveau.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet nécessite le maintien intégral de deux structures le thalamus et le cortex ainsi que leur communication, ce qui n’est pas encore possible dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales. De plus, ce projet vise à évaluer l’évolution de la connectivité au cours du vieillissement ce que les modèles in vitro ne permettent pas de faire.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées, dans notre cas le nombre de neurones enregistrés par animal. Les enregistrements électrophysiologiques sur tranche de cerveau permettent d’optimiser le nombre de neurones enregistrés et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour mener à bien cette étude. Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été évalué d’après notre expérience lors de projets impliquant des techniques similaires.
Raffinement
Cette étude consiste en une courte chirurgie suivie après un délais de 1 semaine à 10 mois du sacrifice et du prélèvement du cerveau. La chirurgie est minimisée pour diminuer le niveau de souffrance et améliorer la récupération. Les souris ont des enrichissements supplémentaires par rapport aux autres animaux de l'animalerie : grande roue et tunnels. La mise à mort sera précédée d’une analgésie et anesthésie profondes avec des antalgiques et anesthétiques très puissants.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution de la connexion thalamocorticale chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, l’utilisation de rats dans la procédure 4 nous permettra de comparer les résultats obtenus chez les souris dans la procédure 3 et les rats, permettant de soutenir le caractère translationnel entre espèces de nos résultats. Finalement, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez les rongeurs ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Les animaux seront utilisés à partir de 1 jour pour les injections puis ils seront sacrifiés entre 14 jours et 12 mois en fonction du groupe auquel ils seront assignés. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours développement jusqu’au vieillissement de la connectivité thalamocorticale chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.