Recherche fondamentale

Cinq ans au maximum par animal, avec des sessions d'enregistrement de une à trois heures jusqu'à cinq fois par semaine : douze ouistitis sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux chirurgies d'une journée, l'une pour implanter des électrodes chroniques dans le cerveau, l'autre pour transfecter ses neurones à ocytocine afin de pouvoir les activer ou les inhiber à distance. Le projet enregistre ensuite leurs vocalisations et leur activité cérébrale pendant qu'ils interagissent avec leurs congénères, une situation que le porteur qualifie de semi-naturelle alors qu'elle repose sur des animaux implantés et équipés d'une veste à micro. Six d'entre eux seront réutilisés dans un autre protocole et six désimplantés en vue d'un placement en retraite, la décision étant prise au cas par cas.

Objectifs

Pour les primates, humains compris, les signaux acoustiques sont essentiels pour communiquer. Grâce à leurs capacités cognitives, ils sont capables d’ajuster leur production vocale selon le contexte social, mais on ne sait pas encore comment les neurones encodent les vocalisations des congénères et produisent une réponse appropriée. Ce projet permettra d’enregistrer les neurones et d’étudier les vocalisations de singes marmoset dans différents contextes sociaux, dans des conditions semi-naturelles, les animaux se déplaçant librement dans la colonie. En parallèle, les neurones à ocytocine, neurohormone impliquée dans les comportement sociaux et espoir thérapeutique, seront stimulés pour comprendre son influence sur la communication acoustique des primates. Cette approche multidisciplinaire et multisite permettra de mieux cerner le rôle de l'ocytocine et d’en savoir plus sur le fonctionnement du cerveau des primates lors de conversations naturelles dans différents contextes sociaux.

Bénéfices attendus

Le projet produira plusieurs résultats significatifs. Sur le plan scientifique, il révélera comment le cerveau encode la communication accoustique, c'est à dire les échanges vocaux entre individus, ainsig que les liens affiliatifs entre eux. Cela apportera une nouvelle perspective au domaine, où les bases neurales de la perception et de la production vocales sont étudiées ensemble dans le cadre d'une interaction sociale naturelle : les conversations. De plus, il montrera le rôle du neuropeptide ocytocine (OT) dans ce processus. Cela est crucial car ce sera la première preuve causale que l'OT endogène module le comportement social des primates, et, indépendamment, la communication acoustique. Ainsi ce projet avancera nos connaissances sur les bases neurales et chimiques de l'affiliation entre individus.

Procédures

Les animaux seront soumis d'abord habitués à l'environnement et aux expérimentateurs du laboratoire (1 à 3 mois). Ils seront notamment entrainés à coopérer afin que les expériences se déroulent sans stress. Ensuite, des examens de neuroimagerie nous permettrons d'identifier les structures cérébrales d'intérêts (une demi journée par examen). Les animaux seront implantés avec des électrodes chroniques (chirurgie d'une journée), et leurs neurones à ocytocine seront transfectés pour pouvoir les activer ou les inhiber sur commande (chirurgie d'une journée). Enfin, nous enregistreront conjointement l'activité cérébrale et les vocalisations des sujets lors de leur comportements naturels avec leurs partenaires, directement dans la pièce d'hébergement (sessions de 1 à 3h, entre 1 et 5 fois par semaine, pendant la durée du projet). Il s'agit d'une seule procédure modérée, chaque animal participera à ce projet pendant une durée maximale de 5 ans.

Impact sur les animaux

1. Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, destinée à l'implantation d'électrodes et l'injection de virus AAV. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager (quelques jours), maitrisé par l'administration d'analgésique. Par ailleurs, une légère perte de poids et une réduction de la mobilité sont possibles selon le temps pris par l'individu pour s'adapter à son implant (quelques jours). 2. Pour les tests comportementaux, ceux-ci auront lieu directement dans la cage d'habitat ou la cage d'expérimentation (enregistrement passif de l'animal libre). Cette cage d'expérimentation sera placée soit devant la cage d'habitat ou une autre cage, face à un autre individu. L'impossibilité d'interaction tactile et la nature prosociale des marmosets préviendront l'apparition de stress fort, mais une anxiété légère est possible. De plus, la pose de l'équipement d'enregistrement (neurologger + veste avec micro et ecg) nécessite une manipulation à la main par les expérimentateurs, ce qui peut également être stressant. Ce stress et cette anxiété seront graduellement réduits avec l'habituation des individus à ces situation (quelques semaines). 3. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'IRM, de TEP (Tomographie à émission de positon), pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera un léger stress lors de l'induction ainsi qu'un inconfort (quelques heures) au réveil. 4. La désimplantation ne laisse pas de séquelle (hormis une cicatrice), la peau et l’os se cicatrisent. Comme toutes les procédures chirurgicales, elle peut comporter des risques d’infection, ou plus rarement encore, entraîner des crises d’épilepsie. Dans l’éventualité où une infection ou des crises d’épilepsie se produiraient, une médication appropriée d’antibiotiques ou d’antiépileptiques serait administrée à l’animal, sous l’avis de notre vétérinaire. De même que pour l'implantation, toute douleur post opératoire sera traitée par analgésique (quelques jours).

Devenir

A la fin de la procédure, les singes seront réutilisés dans un autre protocole ou bien désimplanteés et replacés pour une mise en retraite. Cette décision sera prise par la Structure du Bien être Animal au cas par cas et avec l'accord des responsables et du vétérinaire référant.

Remplacement

Les modèles in silico du cerveau ne sont pas encore assez évolués pour simuler le comportement spontané de primates. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal. Le choix d'un modèle primate est justifié par les questions spécifiques du projet qui s'intéressent justement à la différence des effets de l'ocytocine chez le rongeur et chez le primate, ainsi qu'aux bases neurales de la communication acoustique du primate. L'OT module-t-elle le comportement social et l'activité cérébrale chez les primates comme elle le fait chez les rongeurs ? Comment les circuits cérébraux spécifiques aux primates (ACC) encodent-ils la communication acoustique ? Comment le contexte social riche et spécifique des primates influence-t-il la production vocale ? Pouvons-nous infecter et manipuler les neurones de primates en utilisant des AAV périphériques ? Nous avons sélectionné le marmoset, pour remplacer le modèle classique qu'est le macaque, en raison de sa plus petite taille, de ses capacités cognitives inférieures ainsi que par sa proximité phylogénétique plus lointaine et surtout du fait de son riche comportement acoustique et pro social.

Réduction

La principale réduction du nombre d'animaux vient des technologies utilisées, les électrodes choisies pour ce projet ont de nombreux contacts et sont implantées de manière chronique et ont une longue durée de vie, ce qui permet d'enregistrer beaucoup de neurones en peu de temps, et d'utiliser un même singe pour toutes les étapes du projet. Ainsi une grande quantité de données sera extraite de chaque session et de chaque singe impliqué, ce qui au final réduit le nombre de session et d'animaux nécessaires. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations (n =12 selon le calcul de puissance).

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Durant chaque transport, les animaux seront sédatés à la kétamine. Entrainement des singes via du renforcement positif, ce qui permet de les manipuler sans contention. De plus, l'intégralité des expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques, c’est-à-dire en conditions expérimentales où les animaux sont libres de leurs mouvements et peuvent se déplacer et interagir avec des objets ou des congénères. La différence entre conditions purement éthologiques et semi-éthologiques est que ces dernières n’adviennent pas en milieu naturel. Ces conditions sont rendues possibles grâce à notre laboratoire d’enregistrement sans fil où les animaux pourront se déplacer librement et se comporter d’une manière naturelle. Surtout, ces enregistrements se déroulent directement dans ou à côté de la cage d'hébergement, à l'intérieur de la salle de stabulation, ce qui enlève le stress d'une sortie de cage prolongée. Ces conditions expérimentales dans lesquelles les animaux sont testés constituent un élément de raffinement important. De plus l'hébergement des marmosets se fera dans de grandes cages (1.7 voir 3.4m^3 pour deux animaux) ce qui est supérieur, relativement à leur taille, à ce qu'on les macaques en laboratoire. Tous les actes chirugicaux seront fait sous anésthésie et avec un traitement analgésique. Enfin, un traitement humain des animaux sera assuré par des points limites liés à la douleur éventuelle suite à la chirurgie ou un inconfort lié à un stress chronique.

Choix des espèces

Les aires de la communication acoustique et de l'affiliation ne sont pas équivalentes entre les rongeurs et les primates. Ces derniers ont en effet développé un cortex cingulaire antérieur qui leur est unique, en terme de connectivité et de type de neurones. Par ailleurs, les primates ont une cognition sociale bien plus élaborée et complexe que celle des autres modèles. Dans l'optique de transférer les connaissances acquises par le présent projet à l'humain, et notament à des patients, il est donc crucial de réaliser ces expériences sur un primate non humain. Enfin, un des objectifs du projet est de tester si l'on peut manipuler le comportement social des primates via le système ocytocinergique, comme on a pu le faire chez le rongeur. Il est donc obligatoire d'utiliser un primate non humain pour répondre à cette question. Les animaux utilisés seront adultes. Ce stade permet de documenter les bases neuronales d’un sujet normal adulte et sain, présentant un système de communication et d'affiliation dévelopés.

Pour mesurer l'effet de composés candidats sur la mémoire, 300 souris et 300 rats sains reçoivent des électrodes implantées dans l'hippocampe ou le cortex préfrontal au cours d'une chirurgie de deux heures. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue, le sang terminal étant prélevé au sinus rétro-orbitaire. Les administrations vont jusqu'à 180 fois par voie orale ou 21 injections intrapéritonéales par animal, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins. Les composés testés ont déjà été évalués in vitro par les clients du porteur, ce projet constituant l'étape suivante d'une prestation commerciale.

Objectifs

La mémoire est une fonction essentielle du cerveau, souvent perturbée dans de nombreuses maladies neurologiques ou psychiatriques. C’est pourquoi elle représente une cible importante pour développer de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier, chez des rongeurs sains (souris ou rats, selon les besoins), l’effet de nouveaux composés sur le fonctionnement du cerveau lié à la mémoire, et plus particulièrement sur la façon dont les connexions entre les neurones peuvent se renforcer ou s’affaiblir. La mémoire repose en grande partie sur ces modifications durables des connexions, appelées plasticité synaptique, comme la potentialisation à long terme (LTP) — un renforcement durable de la transmission entre deux neurones après leur activation répétée — ou la dépression à long terme (LTD) — une diminution prolongée de cette transmission synaptique. Ces mécanismes permettent au cerveau d’apprendre et de stocker des informations. Pour étudier ces mécanismes, nous utilisons une méthode appelée électrophysiologie in vivo, qui consiste à enregistrer l’activité électrique du cerveau chez des animaux éveillés. Concrètement, nous implantons de petites électrodes, avec une grande précision, dans des régions clés impliquées dans la mémoire, comme l’hippocampe ou le cortex préfrontal. Cela nous permet de mesurer l’activité des neurones et de voir comment les signaux entre eux changent après l’administration des composés testés. Les composés seront donnés par voie orale ou injectés, selon ce qui est le plus adapté, et nous mesurerons leurs effets à différents moments. En observant comment ces substances influencent l’activité des réseaux de neurones, nous espérons mieux comprendre leur impact potentiel sur la mémoire. Les résultats obtenus serviront de base pour des recherches futures dans des modèles animaux reproduisant des troubles de la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment de nouveaux composés agissent sur les mécanismes qui permettent au cerveau de renforcer ou d’ajuster les connexions entre neurones, un processus essentiel à la mémoire. En étudiant leur effet sur l’activité des réseaux de neurones dans un cerveau vivant, nous pourrons mieux cerner l’impact de ces candidats médicaments sur la plasticité cérébrale. Les données obtenues, issues d’un modèle préclinique dans des conditions proches du fonctionnement normal du cerveau, représenteront une étape clé avant de tester ces composés dans des modèles de maladies. Elles poseront ainsi les bases pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les dysfonctionnements des circuits neuronaux impliqués dans les troubles cognitifs liés à différentes maladies neurologiques ou psychiatriques.

Procédures

Sous analgésie anésthésie une seule étape de chirurgie (2 heures). Administrations : sous cutanée 1 à 14 fois max 5 sec ou Intrapéritonéale 1 à 21 fois max 5 sec ou 1 à 14 fois max 1 minute ou voie orale 1 à 180 fois max 5 sec. Prélèvements sanguins maximum 8 fois sur animal vigile ou anesthésiés (5 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements sanguins peuvent induire un stress, dont l’intensité et la durée dépendent du type d’administration et de sa répétition. Les administrations uniques provoquent un stress aigu et transitoire, tandis que les administrations répétées, même sur une période prolongée, ne génèrent pas de stress prolongé si les techniques sont maîtrisées. Pour les administrations aiguës, les signes d’inconfort restent limités. Cependant, des administrations répétées peuvent entraîner une sensibilisation locale ou des modifications comportementales, telles qu’une réduction de l’activité spontanée ou des altérations dans l’interaction avec l’environnement. La toxicité des composés administrés a été évaluée en amont, de manière à minimiser les risques d'effets indésirables. Les produits administrés peuvent induire des modifications dans la consistance des selles, ainsi qu’une baisse de la prise alimentaire transitoire. Une irritation ou une inflammation locale peuvent persister plusieurs minutes selon le composé administré au lieu d'injection. Une injection provoque un inconfort temporaire et une douleur légère. Une rougeur peut persister plusieurs minutes selon le composé administré. Un prélèvement sanguin entraîne une douleur légère au moment de la piqûre et un stress transitoire lié à l’immobilisation. Les prélèvements terminaux de sang par la méthode du sinus rétro-orbitaire sont réalisés sous anesthésie. Un stress temporaire peut être associé à l’anesthésie. Les enregistrements électrophysiologiques in vivo réalisés sur animal vigile, dans leur cage habituelle, limitent considérablement le stress et les perturbations comportementales. L’implantation d’électrodes lors de la procédure chirurgicale peut provoquer une douleur au site d'incision ou des saignements. En post chirurgie, un risque inflammatoire ou infectieux est présent.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

L’étude des réseaux neuronaux et de l’activité cellulaire est réalisée chez l’animal vigile à l’aide de techniques d’électrophysiologie in vivo. Ces approches permettent d’enregistrer l’activité neuronale dans un environnement physiologique préservé, en tenant compte des interactions complexes entre différentes structures cérébrales et des influences de l’état de vigilance ou du comportement spontané. Les approches non animales, telles que les modélisations in silico, les cultures cellulaires ou les modèles in vitro, apportent des informations précieuses en phase exploratoire, notamment sur les mécanismes moléculaires et cellulaires. Dans ce projet, les composés testés ont d’ailleurs déjà été évalués par nos clients sur des modèles in vitro, ce qui a permis d’identifier des effets initiaux sur l’activité neuronale à un niveau cellulaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’intégration de ces effets dans un réseau cérébral fonctionnel et intact. C’est pourquoi l’expérimentation in vivo s’avère nécessaire dans ce contexte, afin de caractériser l’impact des composés sur l’activité neuronale dans des conditions physiologiques réalistes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des tests statistiques.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages adaptées, enrichies avec des éléments favorisant leur bien-être, comme des bûchettes de bois à ronger, de la frisure de papier et des carrés de coton. Des tunnels en carton faciliteront les transferts entre cages tout en limitant le stress. Des interactions régulières avec le personnel, ainsi qu’une transition progressive de la lumière, contribueront à améliorer leur acclimatation. Une période d’adaptation d’au moins 10 jours est prévue afin de permettre aux animaux de récupérer du transport et de s’habituer à leur nouvel environnement. Ils seront surveillés quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Après chaque intervention technique, leur comportement et leur état général seront observés avec attention pour détecter rapidement toute réaction anormale ou signe de douleur. Si nécessaire, une surveillance renforcée sera mise en place, en lien avec le responsable du bien-être animal. Les fiches d’observation et les seuils définis dans le cadre du projet seront scrupuleusement respectés pour assurer une détection précoce de toute souffrance. Les animaux seront pesés au moins deux fois par semaine après le début des traitements, afin d’adapter précisément les volumes administrés. Pour les injections répétées (intrapéritonéales ou sous-cutanées), les sites d’administration seront régulièrement changés pour limiter les réactions locales. Concernant les interventions chirurgicales, les animaux seront placés sous anesthésie générale / analgésie pendant toute la durée de l’opération. Une analgésie locale préventive sera administrée, avec une injection 10 minutes avant l’incision, ainsi qu’une application locale d’un mélange anesthésique au niveau du site opératoire. Le maintien de la température corporelle (tapis chauffant), le suivi pendant l’opération (monitoring) et des techniques chirurgicales stériles seront appliqués pour limiter les complications. Une solution ophtalmique sera appliquée sur les yeux pendant l’anesthésie pour éviter leur dessèchement, et une injection de solution saline tiédie à la fin de la chirurgie permettra d’assurer l’hydratation. Enfin, une analgésie post-opératoire sera assurée par l’ajout d’un traitement antidouleur dans l’eau de boisson pendant deux jours.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées sur la souris et le rat, deux modèles couramment utilisés en neurosciences pour étudier les mécanismes cérébraux. Ces espèces présentent des similitudes majeures avec le cerveau humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des circuits neuronaux et les mécanismes synaptiques. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés pour explorer les bases du fonctionnement normal du cerveau ainsi que les processus altérés dans les maladies affectant la mémoire. Grâce à un cerveau moins complexe tout en restant suffisamment proche de celui de l’humain, les souris et les rats permettent d’étudier des fonctions essentielles telles que la plasticité neuronale, l’apprentissage et la mémoire, souvent perturbées dans les pathologies du système nerveux central. Ces modèles offrent ainsi la possibilité d’observer et de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux du fonctionnement cérébral, fournissant des données précieuses pour le développement de traitements ciblés contre ces maladies. Les animaux seront utilisés du jeune l’âge adulte, c’est-à-dire à partir de 4 semaines. Ils seront suivis jusqu’à environ 8 mois, ce qui couvre la période d’âge adulte sans atteindre le stade de vieillissement avancé soit avant l’apparition des altérations liées à l’âge ou à d’éventuelles pathologies. Les données obtenues chez ces animaux fourniront une base fiable pour la comparaison avec des modèles pathologiques plus avancés.

Un lupus provoqué par une injection unique dans le péritoine, une arthrite par deux injections intradermiques, une colite chimique : 540 souris sont soumises à ces modèles inflammatoires puis à des séances d'imagerie de trente minutes, cathéter posé sous anesthésie profonde, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue. Le porteur veut valider un agent de contraste couplé à un anticorps pour visualiser sans biopsie les agrégats immunitaires qui se forment dans les tissus enflammés. Il décrit pourtant, pour la colite, une diarrhée, des saignements et une souffrance de durée possiblement prolongée sur plusieurs jours, et fixe la mise à mort à plus de 20 % de perte de poids ou à un score de grimace supérieur à 1,5.

Objectifs

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats immunitaires de quelques centaines de micromètres qui se développent dans les tissus sous l'effet d'une inflammation chronique. En temps normal, ces TLS possèdent probablement de nombreux avantages en permettant de générer une réponse immunitaire locale. Néanmoins, dans des situations d'inflammation chronique ces structures entretiennent la pathologie présentée. Il a ainsi pu être démontré chez l'homme que la présence de TLS était associé à un mauvais contrôle de la pathologie au cours de rhumatismes inflammatoires, de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin ou de pathologies auto-immunes. Afin de visualiser l'inflammation en imagerie, il est possible d'utiliser des agents de contraste magnétiques pouvant être détectés par des techniques d'IRM ou d'imagerie à particules magnétiques (une modalité d'imagerie récemment introduite qui repose sur la détection du signal émis uniquement par les microparticules d'oxyde de fer, et qui permet la réalisation d'une étude corps entier, contrairement à l'IRM) et sélectivement dirigées contre un marqueur inflammatoire spécifique de la structure d'intérêt. Les TLS sont entourées de cellules vasculaires très spécialisées, qui expriment un motif appelé PNAd. Ce motif est reconnu par un anticorps spécifique, qu'il est alors possible de coupler à l'agent de contraste afin de permettre la visualisation des TLS par une approche d'imagerie. Un nouvel agent de contraste biocompatible a récemment pu être développé, ouvrant ainsi la voie à une translation à l'homme. Nous souhaitons donc valider cette approche d'imagerie moléculaire des TLS en utilisant ce nouvel agent de contraste couplé à un anticorps dirigé spécifiquement contre PNAd dans différents modèles précliniques de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Ceci permettrait de valider la possibilité d'une imagerie moléculaire de l'inflammation chez l'homme, par l'utilisation de ce nouvel agent de contraste.

Bénéfices attendus

La présence de TLS au sein des sites inflammatoire a pu être démontrée comme associée à un mauvais pronostic, y compris sous traitement immunomodulateur. L'évolution de la présence et du nombre de TLS a également pu être associée à la réponse thérapeutique. Actuellement, l'identification des TLS au sein d'un organe d'intérêt repose sur l'analyse microscopique du tissu après réalisation d'une biopsie. Cette technique présente de nombreuses limites. Il s'agit en effet d'un examen invasif, avec un risque de complication (hémorragie du site de ponction, perforation...) non négligeable, ce d'autant plus si l'on souhaite évaluer l'évolution des TLS au cours du temps et donc répéter les examens. De plus, l'analyse d'une biopsie n'apporte qu'une information parcellaire et ne permet pas une analyse complète de l'organe d'intérêt. Outre l'absence de vision d'ensemble, le risque de faux négatif est donc important. Enfin, la réalisation d'une biopsie est un examen destructeur, qui empêche donc le suivi d'une structure donnée au cours du temps. Pour toutes ces limites, il apparaît aujourd'hui nécessaire de développer une technique non invasive permettant l'étude, le suivi et la caractérisation des TLS. Le développement et la validation de notre agent de contraste utilisable en IRM dans différents modèles de pathologies inflammatoires permettrait ainsi d'ouvrir la voie de l'imagerie non invasive de l'inflammation en pratique clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront suivis aux interventions suivantes : induction d'un modèle de lupus par injection intra-péritonéale unique (30 secondes) ou induction d'un modèle d'arthrite par deux injections intradermiques sous anesthésie profonde (5 minutes chaque) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (environ 15 minutes) ; réalisation d'examens d'imagerie avec injection de l'agent de contraste (environ 30 minutes) ; injection d'un traitement par voie intra-péritonéale (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ce modèle et des données de la littérature, nous savons que le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des des saignements. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours). Le modèle de lupus est susceptible d'entraîner une ascite, puis l'apparition de douleurs articulaires. L'effet le plus sévère de ce modèle rapporté dans la littérature est la survenue d'un saignement pulmonaire. Néanmoins, les souris utilisées ici, ne présentant pas ce type d'évènement. Le modèle de polyarthrite est susceptible de produire des douleurs et gonflements articulaires. La réalisation de l'imagerie, accompagnée de la pose d'un cathéter veineux peut se traduire par une douleur au point d'injection, une inflammation, une infection du site, une perte de poids.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer l'affinité de l'agent de contraste ciblant PNAd sur des cultures de cellules endothéliales. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales décrites ci-après sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures utilisant le même type d'animaux et les mêmes modèles de colite, ainsi que selon les données de la littérature et la sensibilité/spécificité des méthodes utilisées. En fonction de l'expérimentateur (expérience, habitilité) et du taux de mortalité obtenu (notamment pour les modèles de colite), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. Enfin, l'utilisation de techniques non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en répétant les analyses d'image à différents temps. Pour le modèle de colite, un calcul du nombre de sujets nécessaire a pu être réalisé à partir des données antérieures de l'équipe (8 sujets par groupe, inflaté à 12 pour tenir compte de pertes potentielles ; 16 sujets pour la modulation par un traitement) pour une puissance de 80% et un risque de première espèce de 5%. Concernant les autres modèles, l'utilisation d'une telle modalité d'imagerie n'y a jamais été réalisée. Nous considérons donc qu'il s'agit d'une étude pilote, et qu'il n'est pas possible de réaliser un calcul du nombre de sujets nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel ou igloo, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge (points limites cités plus loin). La douleur sera évaluée par utilisation de la par l'utilisation de la mouse grimace scale. Les animaux seront pesés quotidiennement (points limites cités plus loin). Les animaux des groupes colites ou présentant des arthrites bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture ad libitum. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort si : perte de poids > 20% ; le score moyen de la mouse grimace scale est supérieur à 1.5 ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Les animaux présentant une déshydratation seront réhydratés. Les animaux présentant des signes de douleur ou d'inconfort (mouse grimace scale > 0.5, isolement, horripilation, respiration rapide) recevront une antalgie. Au cours des différentes procédures expérimentales, les animaux recevront une antalgie, une anesthésie générale, une anesthésie locale.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des TLS en conditions inflammatoires. Il faut également noter que la cible de notre traceur (PNAd) est un motif conservé entres espèces, autorisant une translation rapide des résultats obtenus de la souris à l'homme. Dans les modèles de colite, les souris utilisées seront des souris mâles âgées de 8 semaines, stade optimal pour l'induction du modèle. Le modèle de lupus utilisera des souris femelles de souche BALB/c ou C57BL6/J âgées de 8 semaines. En effet, les souris mâles ne présentent pas de phénotype lupique. Le modèle d'arthrite fera appel à des souris DBA/1 de 8 semaines, selon les données de la littérature. Le modèle de vieillissement fera appel à des souris Swiss âgées de 68 semaines, et de 8 semaines pour les contrôles.

36 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit d'entre eux étant tués pour le prélèvement d'organes et vingt-huit réutilisés dans d'autres procédures du projet ou d'autres études. Chacun subit jusqu'à huit prises de sang dans une même journée, vingt-cinq au total sur douze semaines, trois prélèvements de ganglions de trente minutes, et pour certains un prélèvement de moelle osseuse. Les anesthésies s'enchaînent sur vingt-quatre heures, dont une de deux heures et, pour une seconde procédure, une de huit heures, que le porteur reconnaît inconfortables. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace un système immunitaire complet, ce qui rend selon lui l'usage d'animaux non-humains "indispensable".

Objectifs

Les immunothérapies sont des traitements qui agissent sur le système immunitaire du patient pour lutter contre la pathologie. Dans le cadre du cancer, les immunothérapies ont pour objectifs de réactiver le système immunitaire affaibli par la tumeur. Dans le cadre des maladies auto-immunes ou maladie inflammatoire chronique, les immunothérapies ont pour but d’inhiber ou de réguler le système immunitaire. Malgré des avancées et plusieurs immunothérapies efficaces, les patients non-répondeurs/en rechutes sont nombreux. Il est donc essentiel de continuer de chercher d’autres combinaisons de thérapie pour améliorer les soins actuels dans le cancer ou maladies inflammatoires chroniques ou aigues.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’une part d’évaluer la pharmacocinétique/pharmacodynamique d’un produit destiné à la médicamentation humaine permettant ainsi d’anticiper un schéma d’administration, valider l’intérêt thérapeutique et d’estimer d’éventuels effets secondaires liés à l’injection de ce médicament. La biodistribution de la molécule thérapeutique d’intérêt dans les tissus permettra de renforcer ces données.

Procédures

Les animaux seront soumis à des anesthésies pour effectuer une injection intraveineuse de la molécule thérapeutique d’intérêt, à plusieurs prélèvements : - sanguins (au maximum 8 dans une même et seule journée, 25 sur la totalité de la procédure expérimentale sur 12 semaines maximum) durée 15 min -de ganglions (3, avant et pendant le traitement,) durée 30 min. Des animaux pourront avoir un prélèvement de moelle osseuse (durée 30 min). Des anesthésies prolongées seront effectuées (maximum 2 heures pour une procédure et 8h pour une seconde) lors de l’injection intraveineuse et le prélèvement de ganglions.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’anesthésie répétés sur 24h, et notamment une anesthésie prolongée de 2h, lors de l’injection de la molécule pour évaluer la pharmacodynamique seront inconfortables et à ce titre, les animaux spécifiquement lors de cette journée seront suivis de manière accrue et l’inconfort le plus adéquatement maîtrisé. Une légère douleur peut être induite par le prélèvement de moelle osseuse, qui sera traitée par antalgique.

Devenir

Les protocoles utilisés dans cette étude permettent une réutilisation de 28 des animaux dans ce projet après accord du vétérinaire et du SBEA pour une nouvelle procédure. Effectivement, un même animal pourra être réutilisé dans une autre procédure de cette même étude, mais également dans un protocole d'une autre étude. Les 8 animaux (ré-)utilisés pour évaluer la biodistribution de la molécule seront mis à mort pour permettre le prélèvement de différents organes, ces animaux auront pû précédemment étre utilisés dans une procédure expérimentale légère ou modérée.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires, sur des lignées cellulaires, sur des cellules et biopsies humaine (ex vivo) ont permis d’identifier une activité biologique du médicament et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule. Des analyses computationnelles de banques de données humaines et animales ont également permis de confirmer la cohérence des traitements étudiés. Les résultats obtenus lors d’études préliminaires in vivo chez la souris nous permettent maintenant d’étudier la molécule de façon plus précise chez le primate non humain.

Réduction

Ce genre de protocole chez le macaque ne peut être réalisé comme une étude statistique, en effet, dans le respect de la règle des 3R et d’un point de vue éthique, nous limitons le nombre d’animaux au strict minimum,. Cependant, compte tenu de la variabilité individuelle, un nombre minimal d’animaux est essentiel pour obtenir une relevance scientifique quant à l’interprétation des résultats obtenus et l’identification d’un éventuel effet thérapeutique tout en réalisant de manière fiable une étude Pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule. Dès que cela est possible, les animaux seront réutilisés entre les différentes procédures expérimentales de la même molécule ou d’une autre molécule, cela permettra de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé dans ce projet. Lors de l’étude, les animaux seront leur propre contrôle. Si une dose testée répond à toutes les attentes, les autres doses ne seront pas étudiées. Une étude bibliographique approfondie de l’art antérieur sera effectuée pour espère trouver cette dose. Si une molécule n’a pas un profil satisfaisant pour passer en essai clinique chez l’homme, l’étude complémentaire au niveau tissulaire ne sera pas effectuée.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées chez le macaque sous anesthésie. La douleur sera dans la mesure du possible évitée par injection d’analgésique Les animaux sont hébergés avant et après protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de mouvements.

Choix des espèces

Les primates non humains, et plus précisément les macaques dans cette étude, représentent l’espèce animale de choix comme modèle préclinique étant donné leur morphologie, leur proximité phylogénétique et leur similitude avec le système immunitaire de l’Homme. La constitution du système immunitaire est dépendante de l’âge des animaux donc il s’agira de préférence d’animaux jeunes adultes dont le système immunitaire est alors mature.

Choisies adultes pour que leurs reins soient matures, 108 souris subissent une heure de chirurgie destinée à interrompre puis rétablir la circulation sanguine dans un rein, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux à trois prélèvements de sang et l'administration du produit testé, un ARN non codant censé protéger les vaisseaux rénaux, complètent le protocole. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs pendant jusqu'à soixante-douze heures et une perte de poids, réduites par des antalgiques. Toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, qui rejoignent une banque de tissus destinée à d'autres projets.

Objectifs

La transplantation rénale est considérée comme une thérapie de choix pour l’insuffisance rénale terminale. Cependant, le nombre de patients en attente de greffe rénale est en constante augmentation alors que le nombre de greffes réalisées reste inchangé. Afin de remédier à cette pénurie d’organes, les critères de sélection des greffons ont évolué et incluent le prélèvement d’organes provenant de donneurs dit marginaux (âge avancé, historique d’hypertension). Cependant, les organes issus de ce type de donneurs sont plus sensibles au stress subi lors de la séquence délétère d’ischémie reperfusion qui entraîne des lésions sur le futur greffon et peut induire une reprise de fonction retardée, réduisant la survie du greffon sur le long-terme. L’ischémie reperfusion est inévitable en transplantation, l’ischémie commence lors de l’arrêt de la circulation sanguine ce qui entraîne l’arrêt de l’apport en oxygène et en nutriment dans le futur greffon. La phase de reperfusion commence lors de la transplantation lorsque la circulation est rétablie au sein de l’organe. Lors de l’ischémie reperfusion rénale, le système vasculaire est endommagé et il est ainsi nécessaire de développer des thérapies afin de préserver la vascularisation et permettre ainsi une meilleure survie du greffon Il a été démontré qu’une molécule d’acide ribonucléique spécifique appelée ARN non codant, était fortement exprimée dans le système vasculaire et a un rôle essentiel dans la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et leur intégrité. Ce projet cherche à évaluer l’effet protecteur de cette molécules d’acide ribonucléique sur les lésions du système vasculaire rénal dans un modèle d’ischémie reperfusion chez la souris.

Bénéfices attendus

A cout terme, ce projet permettra une avancée des connaissances sur la protection du système vasculaire rénal. A moyen terme, ce projet permettra de définir une cible thérapeutique dans l’ischémie reperfusion rénale rénales. A long terme, ces résultats pourront être étendus à d’autres organes, tels que le foie, le coeur, le pancréas. Ce projet vise à améliorer la qualité, la fonction et la survie des greffons après transplantation chez l’humain.

Procédures

Sur tous les animaux anesthésiés : 2 à 3 prélèvements de sang chacun d'une durée de 2 minutes pour des dosages ultérieurs, une administration (durée de 2 minutes) du produit dont on teste l'effet protecteur et une chirurgie d'une durée de 1 heure pour provoquer l'ischémie-reperfusion.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie générale, l’effet attendu est un léger inconfort au réveil d’une quinzaine de minutes. Les injections en intraveineux et les prélèvements sanguins sous anesthésie (acte de moins de 2 minutes) induisent une douleur faible minorée par l'utilisation d'un analgésique local. En post-opératoire, la chirurgie peut entraîner une mobilité réduite de quelques heures , des douleurs jusqu’à 72 heures post-chirurgie minorées par l’administration d’antalgiques . L’autre effet indésirable pouvant être observé post-chirurgie est une légère perte de poids dont l’effet sera reversée sous 72 heures.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de prélever les organes nécessaires pour effectuer différentes analyses moléculaires et tissulaires.

Remplacement

Notre molécule d’acide ribonucléique a déjà été testé sur des modèles cellulaires, cependant les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire fidèlement l'architecture rénale qui organise les relations entre les différentes populations cellulaires, entre les vaisseaux et le reste du rein et qui ne permettent pas d'apprécier la fonction rénale. A ce stade du projet, seul le modèle animal permet d'évaluer l'effet du produit d'intérêt sur l'architecture du rein et la fonction rénale dans son ensemble.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, des résultats préliminaires ont été obtenus à partir de tissus murins rénaux conservés dans une biobanque qui ont permis de déterminer les temps de reperfusion d’intérêts. Le nombre d'animaux requis par condition expérimentale pour obtenir des résultats fiables malgré la variabilité du vivant a été calculé à l'aide d'un outil statistique. Le projet sera fait en plusieurs étapes ; le résultat de certaines étapes conditionnera la réalisation d'étapes ultérieures, ainsi le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Les organes prélevés seront placés dans une banque d'organes pour être mutualisés avec d'autres projets.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (grille de suivi individuel), les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (enrichissement du milieu, hébergement en groupe). Des points limites gradés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de la souffrance seront mis en place à chaque étape de la procédure. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et locale en asepsie stricte. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées en asepsie stricte, sous anesthésie générale avec une régulation de la température de l’animal contrôlée par un tapis chauffant. Les animaux bénéficieront également d’une analgésie adaptée en pré, per et post opératoire

Choix des espèces

Des études sur l’état de la vascularisation rénale après ischémie reperfusion ont déjà été réalisées chez la souris et concordent avec la physiopathologie de l’ischémie reperfusion chez l’homme. Des souris adultes de plus de 8 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris auront des reins matures et fonctionnels ainsi qu’un poids approprié pour l’expérimentation.

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune gavée et injectée dans le péritoine une fois par jour, cinq jours sur sept, pendant un à deux mois. Une chirurgie leur greffe d'abord une tumeur du rein, de la prostate, de la vessie ou du testicule directement dans l'organe concerné, puis une échographie hebdomadaire sous anesthésie suit la croissance tumorale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les bénéfices annoncés, un nouveau traitement et une survie allongée pour les patients, sont énoncés sans étape intermédiaire, quand les atteintes, elles, durent un à deux mois par animal. La mise à mort permet de prélever les tumeurs pour des analyses histologiques, biochimiques et immunologiques.

Objectifs

Les cancers urologiques englobent la prostate, le rein, la vessie et le testicule. En 2018, près de 82 000 nouveaux cas de cancers urologiques ont été diagnostiqués en France. À eux seuls, ces cancers représentent plus de 36 % des tumeurs masculines, mais seulement 4,2 % des tumeurs féminines. Si certains se soignent aujourd’hui très bien, d’autres développent des résistances aux traitements et nécessitent de nombreuses recherches afin d’améliorer la prise en charge des malades. Nous avons identifié de nouvelles cibles potentielles impliquées dans la résistance aux chimiothérapies. Nous souhaitons démontrer que la combinaison des chimiothérapies avec des inhibiteurs de ces nouvelles cibles présenterait un effet anti tumoral synergique en favorisant le stress réplicatif, l’apoptose mais aussi en stimulant l’immunité anti-tumorale. Le but de notre recherche étant d’obtenir de nouveaux traitements pour le cancer, il nous faut donc valider l’efficacité mais aussi la « non dangerosité » du traitement chez l’animal. C’est pourquoi, nous utilisons des souris syngéniques ou immunodéprimées greffées en orthotopique avec respectivement des cellules murines ou humaines de cancer urologique et nous les traitons avec cette nouvelle combinaison. Nous évaluons la croissance tumorale par mesure du volume tumoral par échographie. Nous traitons les animaux par une combinaison de chimiothérapie + inhibiteur. Si notre nouveau traitement est efficace, nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète de la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet apporteront de nouvelles connaissances fonctionnelles des résistances aux traitements des cancers urologiques ainsi qu'un nouveau traitement pour les patients atteints de ces cancers, augmentant ainsi leurs survies.

Procédures

Les souris subiront une chirurgie pour réaliser la greffe (EU1), sous anesthésie et analgésie (10-15 min) puis un traitement, par gavage (20s) et injection intra-péritonéale (10s) une fois par jour 5j/7j (EU2) pendant une durée d’un à deux mois et une échographie hebdomadaire sous anesthésie (5min) (EU2) pendant 1 à 2 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux, sont : les risques et les nuisances liés à toute intervention chirurgicale (fatigue, hypothermie, infection) ; une gêne liée la présence et la croissance d'une tumeur ; les traitements quotidiens (gavage ou intra-péritonéal) et les nuisances (fatigue, hypothermie) liées aux anesthésies hebdomadaires pour les échographies.

Devenir

Nous avons besoin de prélever la tumeur à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à des analyses histologiques, biochimiques et immunologiques. Ainsi, tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’alternative possible à l’utilisation d’animaux est l’utilisation de cellules en culture. Cependant cette alternative ne permet pas de connaitre les effets de nos traitements sur un organisme complexe vivant. En effet, il ne permet pas ni de déterminer le rôle du système immunitaire dans le traitement du cancer (analyser l’infiltration lymphocytaire ainsi que la prolifération et la mort cellulaire), ni de mimer la pathologie existante chez l’homme. Ainsi, l’utilisation d’animaux est le seul moyen de répondre aux questions scientifiques de notre projet.

Réduction

Après consultation des données de la littérature sur des expériences similaires, le nombre d’animaux a été réduit au maximum. De plus, nous réaliserons une étude préliminaire de toxicité afin de réduire le nombre d’animaux. Concernant l’approche statistique, chaque lot sera constitué de 8 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse et la contrainte des animaux, nous mettons en place un cadre de vie accueillant, enrichi en coton et de petites maisons pour permettre aux souris de créer des nids. Une observation quotidienne de l’état clinique des animaux sera assurée. La sévérité des signes sera déterminée selon une grille d’évaluation qui permettra la mise en place de soins adaptés éventuels (administration d’anti-douleurs, soins cutanés, nourriture enrichie) ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les conditions d’hébergement enrichi en coton et en petites maison permettra un cadre de vie accueillant. Les cages seront disposées sur des portoirs adaptés permettant le suivi du statut sanitaire des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle permettant de mimer au mieux la pathologie existante chez l’homme et d’étudier les interactions entre la tumeur, le système immunitaire, le traitement et un organisme vivant complexe. Nous souhaitons des animaux adultes car les cancers urologiques sont présents principalement chez des patients adultes.