Recherche fondamentale

Jusqu'à trente injections intrapéritonéales, une par jour, sur des souris éveillées : 646 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent une à deux instillations intranasales sous anesthésie, trois prises de sang, une injection intraveineuse, une chirurgie de vingt minutes, puis un lavage broncho-alvéolaire et une perfusion intracardiaque terminale. Le travail cherche à comprendre comment se forment dans le poumon des cellules immunitaires résidentes, étape présentée comme utile à de futurs vaccins contre le cancer du poumon. Sur les alternatives, le porteur avance que les modèles in vitro ne miment pas les réponses immunitaires, que l'expérimentation animale est "indispensable" et qu'"aucune méthode alternative n'existe".

Objectifs

Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).

Devenir

mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires

Remplacement

L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Pour savoir si les lipides de la salive de moustique facilitent l'infection par les flavivirus, 397 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent en intradermique, sous anesthésie, des produits que le porteur décrit lui-même comme pouvant être irritants, puis une partie est tuée dans la foulée pour biopsie cutanée. Les autres sont infectées et suivies quinze jours, avec une prise de sang à la veine mandibulaire tous les trois jours, l'infection pouvant provoquer perte de poids, immobilité, troubles neurologiques et convulsions. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou montrent des signes de souffrance sont tuées par dislocation cervicale sous anesthésie.

Objectifs

L'objectif du projet est de déterminer le rôle des lipides de la salive de moustique dans les infections par les flavivirus pour développer une nouvelle méthode de lutte ciblant les lipides de la salive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible pour bloquer la transmission de tous les flavivirus au niveau de la peau, ii) Comprendre l’effet des lipides de la salive de moustique sur l'infection. A long terme, les résultats permettront le développement d’un médicament préventif ou curatif contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250 000 par an.

Procédures

Dans toutes procédures, nous injecterons les souris avec des produits qui peuvent être irritants, mais cela se fait sous anesthésie. L'injection intradermique se fait en 2- 3 min. Nous collecterons, sur une partie des souris dans toutes les procédures, des biopsies de peau sur des animaux anesthésiés qui seront euthanasiés juste après. L‘autre partie des souris seront suivies pendant 15 jours pour la survie et les signes cliniques suite aux infections et nous réaliserons des prélèvements sanguins tous les 3 jours. Les biopsies et l'examen clinique prennenent environ 3- 5 min/ animal, le prélèvement sanguin prend 2- 3 min. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Impact sur les animaux

-Douleur passagère dans le site de l’injection lors de l’inoculation des virus avec les lipides. Nuisances suite aux prélèvements sanguins sur la veine mandibulaire qui se traduisent par une lésion et douleur passagères après la ponction. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques (dépression, excitation ou convulsions), liés à l’infection par les virus.

Devenir

Dans toutes les procédures, les souris seront euthanasiées sous anesthésie : après la réalisation des biopsies cutanées, si elles développent des signes de souffrance et à la fin des expériences.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet des lipides de la salive de moustique sur la transmission des flavivirus. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro. Nous identifierons les lipides impliqués dans l'augmentation de l'infection virale sur des modèles in vitro en utilisant des cellules humaines avant de confirmer l’effet avec le modèle animal.

Réduction

Pour réduire le nombre des souris à utiliser, nous faisons toutes les optimisations sur les modèles in vitro. Nous avons étudié l'effet des lipides sur les différents flavivirus in vitro, et sur les souris nous validerons l’effet observé pour seulement deux espèces de flavivirus pour limiter l'utilisation des souris. De plus, nous testerons différentes doses sur des souris males et puis nous validerons la dose ayant un effet sur des souris femelles. Dans nos expériences, nous utiliserons dans chaque condition le minimum des souris nécessaire pour avoir des données statistiquement analysables (10 souris/ condition dont 3 seront utilisées pour la collecte de la peau à 24h post infection pour étudier la transmission, et le reste des souris seront suivies pour la survie, les signes cliniques et la virémie).

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avec le mélange kétamine/xylazine avant l’inoculation intradermique des produits et les biopsies cutanées. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à l'anesthésie : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. -Nous ajouterons un gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. -Les souris infectées seront euthanasiées après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. -Les souris seront aussi euthanasiées si elles développent des signes de souffrance ou perdent >20% de poids corporel et à la fin des expériences, par dislocation cervicale sous anesthésie.-Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser dans ce projet des souris immunocompétentes, contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, qui utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier l'effet des lipides salivaires sur la transmission des flavivirus et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions sur les souris. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 5 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate nécessaire pour l'étude de la transmission, l'inoculation en intradermique, et leur manipulation.

Greffées d'une tumeur sous la peau sous anesthésie gazeuse, puis piquées jusqu'à quatorze fois par des micro-aiguilles chargées d'immunothérapie, 3 974 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs tissus. Le porteur signale une gêne au site d'implantation de la tumeur, avec difficulté à se déplacer dans la cage. L'objet est de produire les données précliniques d'un essai clinique sur le mélanome localisé de stade IIB et IIC, dont la prise en charge actuelle laisse un fort risque de rechute. Le RNT annonce des lignées "génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale", puis affirme que ces mêmes modèles permettront de valider les observations "dans un système immunocompétent".

Objectifs

En 2020, 1,5 million de cancers de la peau ont été diagnostiqués dans le monde, dont environ 325 000 mélanomes. En France, on dénombre 18 000 nouveaux cas par an, avec un pic d’incidence entre autour de 50 ans, avec 2 000 décès enregistrés en 2018. Les stades localisés IIB et IIC, caractérisés par un mélanome épais et/ou ulcéré sans métastase, affichent des taux de survie à 10 ans de 82% et 75%, mais présentent un risque de rechute élevé, comparable à celui des stades IIIB avec métastases ganglionnaires. Le traitement repose sur la chirurgie, complétée par des thérapies adjuvantes. L'immunothérapie néo-adjuvante (donnée avant la chirurgie) est maintenant couramment utilisée chez les patients ayant des métastases régionales (ganglions envahis) macroscopiques car elle a démontré une efficacité supérieure aux thérapies adjuvantes (mêmes traitements mais données en post-opératoire avec un nombre de récidive significativement diminué versus les traitements adjuvants). Un essai clinique évalue actuellement l'efficacité d'une immunothérapie systémique en néo-adjuvant pour les stades IIB/IIC. Une technologie innovante et prometteuse, non encore utilisée en clinique consisterait à utiliser des micro-aiguilles pour administrer localement des anticorps bloquant les points de contrôle immunitaires, stimulant une réponse immunitaire dirigée contre les antigènes tumoraux sein des ganglions de drainage du mélanome, tout en limitant les effets indésirables systémiques. Ce projet vise à produire des données précliniques pour un essai clinique sur l’utilisation des micro-aiguilles comme traitement local pour les mélanomes de stades IIB/IIC. La recherche fondamentale (in vitro) et préclinique (modèles animaux) évaluera l’efficacité de cette stratégie sur les réponses immunitaires et biologiques. Les résultats attendus incluent une réduction de la masse tumorale, une meilleure stimulation des lymphocytes infiltrant les tumeurs et au sein des ganglions de drainage, une rétention prolongée des anticorps au site tumoral et une diminution des effets indésirables systémiques par rapport aux traitements conventionnels, administrés par voie systémique. Les modèles souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, les mélanomes de stades IIB/IIC sont pris en charge par la chirurgie (exérèse large) puis par un traitement adjuvant par immunothérapie et biopsie des ganglions sentinelles. Cette prise en charge entraine de nombreuses récidives à plus ou moins long terme ainsi que des effets indésirables parfois irréversibles. L’un des objectifs de ce projet serait d’ajouter une immunothérapie néo-adjuvante à la prise en charge de ce type de mélanomes localisés en identifiant dans un même temps les réponses immunitaire et biologique secondaires à l’administration par micro-aiguilles (en péri- ou intra-tumoral). Les objectifs secondaires sont multiples et impliquent la caractérisation du microenvironnement tumoral, le profil de toxicité (local et systémique) et la distribution tissulaire/ganglionnaire des administrations péri- et intra-tumorales par rapport à l’administration conventionnelle en IP chez le modèle animal. A plus long terme, ces travaux pourront servir de base à une nouvelle approche thérapeutique chez l’Homme, dans la prise en charge du mélanome localisé et améliorer ainsi leur espérance de vie.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse (durée de 15 minutes, n=1). Injections directes (2 minutes) ou via les micro-aiguilles (5 minutes) de molécules d’immunothérapie (n maximal=14). Prélèvement de sang sous anesthésie générale (n=1 ou 2 pour certains animaux, durée de 10 minutes).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne modérée au niveau du site d’implantation de la tumeur (difficulté à se déplacer dans la cage, douleur à l’injection) ; les greffes sous-cutanées et les injections peuvent induire une douleur localisée légère de courte durée ; la contention lors des mesures des tumeurs peuvent induire du stress léger et transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro modélisant de manière suffisamment robuste pour analyser les effets de ces traitements par différentes voies d’administration ainsi que sur le devenir de molécules au sein du modèle rongeur. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendant l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostic et thérapeutiques. L’utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet nécessite également de travailler sur un modèle animal qui permet de maintenir les interactions immunitaires entre les différents organes.

Réduction

Les études préliminaires vont permettre d’identifier les toxicités ou résistances éventuelles, ce qui permettra de tester nos hypothèses dans les meilleures conditions en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les techniques d’imagerie utilisée dans ce projet vont permettre un suivi longitudinal sur le même individu, sans passer par l’autopsie de l’animal et permettant donc une réduction du nombre d’animaux utilisé. Pour les procédures expérimentales, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence une différence significative sur les paramètres étudiés. Le nombre d’animaux à utiliser dans chaque procédure dépendra des résultats d’expériences précédentes sur les mêmes immunothérapies.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours. Les injections de cellules tumorales se feront sous anesthésie générale tandis que les injections d’immunothérapie se feront à l’aide d’un anesthésique locaLes souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus précocement possible l’apparition de problèmes de santé. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées. Des points limites stricts et suffisamment précoces seront appliqués. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasie seront réalisées dans une troisième pièce. Les souris sont hébergées en groupes sociaux pour respecter leur caractère grégaire et réduire leur angoisse.

Choix des espèces

Bien que pertinentes, nos approches in-vitro, à savoir les cellules en cultures, sont le fruit d’un système « isolé ». Ils ne sont, de ce fait, pas extrapolables à la réalité de la clinique et nécessitent pour cela d’être confirmés in-vivo sur le modèle animal le plus adapté. En effet, il est nécessaire de vérifier cet effet dans un organisme entier incluant les interactions avec le microenvironnement tumoral et le devenir des molécules à l’intérieur d’un organisme vivant. La souris représente l’animal classiquement décrit dans la littérature, pour ce type d’expérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiées et immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale. L’utilisation de ces modèles nous permettra de valider nos observations dans un système immunocompétent, ce qui est essentiel pour envisager un développement chez l’Homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans la littérature pour ce type d’expérimentations, les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines, âge auquel apparait cette maladie.

Greffées de cellules leucémiques puis traitées par des chimiothérapies choisies pour leur toxicité cardiaque, 392 souris reçoivent jusqu'à huit injections par semaine et une échographie sous anesthésie chaque semaine, pendant quatre semaines. Toutes sont déclarées en souffrance modérée et toutes sont tuées, un prélèvement sanguin terminal précédant le prélèvement de leurs organes. Le porteur écrit que les souris ne subiront de leur vivant que des "interventions d'intensité légère à modérée", puis signale, en majuscules, que la greffe de cellules leucémiques peut provoquer paralysie de l'arrière-train, fatigue sévère et amaigrissement. Le projet vise à décrire le métabolisme du cœur soumis à ces traitements, une étape de connaissance dont les patients ne verraient le bénéfice qu'à long terme.

Objectifs

Un grand nombre de traitements utilisés en oncologie sont cardiotoxiques et peuvent aboutir à l’émergence de maladies cardiovasculaires (MCV). Celles-ci peuvent contraindre le corps médical à diminuer voire arrêter le traitement de patients et sont à l’origine de nombreux décès à court et moyen termes. L’amélioration remarquable de la prise en charge thérapeutique de certains cancers a permis une augmentation significative des chances de survie de ces patients. Cela a conduit, pour certains cancers, à ce que les décès liés à la maladie soient dépassés par les décès causés par la cardiotoxicité des traitements. Pour ce projet, nous nous intéresserons à différentes chimiothérapies particulièrement cardiotoxiques utilisées dans de nombreux cancers (leucémies aigues myéloïdes (LAM), pancréas, sein et mélanome). Depuis quelques années, de nombreuses combinaisons thérapeutiques à base de chimiothérapies et d’inhibiteurs métaboliques ont passés le cap des essais cliniques, en particulier dans le cadre des LAM. Ces combinaisons prometteuses semblent permettre une sensibilisation des cellules cancéreuses aux traitements antitumoraux. En parallèle, la recherche sur l’insuffisance cardiaque et les MCV à aussi progressé dans la caractérisation des dépendances métaboliques liés à ces pathologies. Dernièrement, des approches d’inhibition de certaines enzymes du métabolisme ont permis d’obtenir une amélioration des capacités cardiaques dans plusieurs modèles de pathologies aigues ou chroniques. Ce projet a aussi pour objectif de dresser une carte métabolique de la réponse du tissu cardiaque aux traitements antitumoraux afin d’en détailler les dépendances précises. L’objectif final de ce projet est de déceler les dépendances métaboliques communes des cellules cancéreuses et cardiaques afin de sensibiliser les premières au traitement et de protéger les secondes. Pour cela, il est important de comprendre et d’identifier les mécanismes mis en jeux afin de rendre plus favorables la balance bénéfices/risques des traitements antitumoraux. NOUS PRÉCISONS QUE L'AJOUT DE LA SECONDE PROCÉDURE NÉCESSITE LA MISE À JOUR D'UN PROJET DÉJÀ AUTORISÉ AINSI QUE LA MODIFICATION DU NOMBRE TOTAL DE SOURIS QUI PASSE À 392.

Bénéfices attendus

Ce projet mêlant la cardiologie à la cancérologie aura plusieurs objectifs susceptibles de bénéficier à long terme aux patients atteints par ces maladies. Dans un premier temps, ce projet a un intérêt fondamental de par la description et la compréhension du métabolisme cardiaque dans le cadre de l’utilisation de ces thérapies cardiotoxiques. Ces traitements entrainent des mécanismes de toxicité pour les cellules cardiaques connues mais dont on ne sait quasiment rien en termes de perturbation du métabolisme. En décrivant les modulations et régulations du métabolisme des cellules cardiaques nous pourrons aussi mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’émergence de stress (induit ou non par une chimiothérapie) pouvant aboutir à une insuffisance cardiaque. Deuxièmement, nous étudierons les effets bénéfiques potentiels des combinaisons thérapeutiques associant chimiothérapies et inhibiteur métabolique. Ces nouvelles associations de molécules thérapeutiques sont actuellement très étudiées et pourraient fortement modifier les schémas thérapeutiques utilisés en oncologie. Si à travers ce projet nous pourrions montrer un potentiel bénéfice de cardioprotection, nous appuierions alors l’utilisation de ces combinaisons et accélèrerions possiblement leur utilisation en routine. En effet, la validation in vivo de nos hypothèses pourrait bénéficier à de nombreux domaines de la recherche médicale comme en cancérologie ou en cardiologie.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront manipulées de la même manière et uniquement pour des interventions d'intensité légère à modérée de leurs vivant. Un prélèvement de sang sera effectué en terminal (1 minute), directement suivi par la mise à mort des souris. Toutes les interventions que subiront les souris de leur vivant seront des interventions courtes de types injections (8 par semaine maximum, durée quelques secondes) sauf pour l'échographie sous anesthésie (1 par semaine, 10 min). Au total les souris seront manipulées de 1 a 5 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

L’objectif même du projet est de travailler sur la toxicité des chimiothérapies et de leurs combinaisons sur le cœur dans des modèles murins porteur de tumeurs. Il y aura donc des évènements indésirables, que nous chercherons à réduire à travers l’utilisation des inhibiteurs métaboliques. Ces évènements indésirables, suivis grâce à un scoring rigoureux des souris, peuvent prendre la forme de douleur, de perte de poids, d’inactivité, de stress à la suite des traitement chimiothérapeutiques. LA GREFFE DE CELLULES LEUCÉMIQUES PEUT ENTRAINER DES ÉVÈNEMENTS INDÉSIRABLES SUR LES DERNIÈRES ÉTAPES DE LA MALADIE ; À SAVOIR PARALYSIE DE L'ARRIÈRE TRAIN, FATIGUE SÉVÈRE ET AMAIGRISSEMENT.

Devenir

La mise à mort des souris est nécessaire pour obtenir les résultats voulu pour ce projet. Un grand nombre d'organe seront prélevés à la suite de l'euthanasie pour étudier les mécanismes déclanchés par les traitements anticancéreux toxiques.

Remplacement

Une phase in vitro d’expérimentation a eu lieu avant d’envisager les expériences in vivo. Ces expériences, même si partielles, sont prometteuses et nous motivent à poursuivre nos hypothèses grâce à l’utilisation de modèle murin de cardiopathie induite par des chimiothérapies. Les modèles murins permettent d’avoir un niveau de preuve supérieur de par la complexité d’un organisme vivant en comparaison d’une culture cellulaire maintenue en vie en flasque plastique. Les données que nous mesurerons par échocardiographie sur les souris ne sont pas remplaçables et nécessaires pour démontrer une amélioration des fonctions contractiles du cœur après traitements. De plus, notre projet s'intéressant à l'interraction entre coeur et cancer, cela nous oblige à procéder à des expériences in vivo.

Réduction

Pour chaque combinaison, nous utiliserons un nombre limité de souris (392 au total). Ce nombre reste pourtant élevé de part le domaine de recherche auquel nous appartenons, la cardiologie. En effet, les mesures fonctionnelles faites en échocardiographie nécessitent un nombre assez élevé de souris pour obtenir des résultats robustes et significatifs (8 souris par groupe). En effet, les variations fonctionnelles des paramètres cardiaques mesurés en échocardiographie sont légères (+/-10% parfois) mais ont des conséquences fortes sur l’organisme et peuvent entrainer la mort. Ce nombre de souris necessaire au bon déroulement du projet à été calculé avec l'utilisation d'un logiciel de calcul de cohorte et en utilisant des paramètres rigoureux et des tests statistiques utilisés aussi en clinique. Notre projet vise à étudier l’ajout d’inhibiteurs métaboliques à des traitement chimiothérapeutiques cardiotoxiques. Ces combinaisons sont utilisées dans différents projets d’autres équipes avec qui nous sommes en collaboration. Nous chercherons à mettre en commun certaines expériences pour réduire le nombre de souris engagées dans ce projet. Nous utiliserons au maximum chaque souris et réduirons le nombre de manipulation au strict nécessaire. Chaque souris apportera des données d’échocardiographie, d’histologie mais aussi une analyse complète du sérum et une extraction des cardiomyocytes après traitements. Pour les souris xénogreffées avec des cellules cancéreuses, nous récupérerons aussi les organes touchés par la maladie. Ces analyses s’ajouterons aux expériences initialement prévues par nos équipes collaboratives, permettant d’extraire le plus de données possibles à partir d’un nombre limité de souris.

Raffinement

L’environnement des animaux assurera des conditions d’hygrométrie et de température constantes. Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Des lanières de papier cartonné sont ajoutées pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les cages possèdent des dômes transparents dans lesquelles les animaux peuvent se cacher et exprimer un comportement propre à leur espèce. Les cages sont teintées en rouge de manière à apaiser les animaux. La surveillance quotidienne permettra de s'assurer que les animaux ne présentent pas des douleurs ou détresses dépassant les points limites ou nécessitant le recours à un traitement antalgique. L'hydratation et l'alimentation seront disponibles ad libitum. Le protocole d’expérimentation sera adapté afin de minimiser la morbidité et la douleur

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris (392), d'une souche très étudiée en cardiologie et idéale pour l’étude du cancer de par l’existence de modèles in vivo utilisés couramment à l'internationnal. Nous utiliserons uniquement des souris adultes de 8 à 10 semaines. Ces souris présentent toutes les caractéristiques nécéssaires à l'étude des fonction cardiaque chez l'adulte et ne necessitent pas d'hébergement longue durée que l'on pourrait avoir pour l'étude de souris agées.

Toute souris qui perd du poids ou montre un signe de maladie est soignée ou mise à mort sur décision du vétérinaire. 1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre, cinq ou neuf injections dans l'abdomen, dont un agent inflammatoire pour certaines, et passent une batterie de huit épreuves : locomotion en milieu nouveau pendant quarante minutes, reconnaissance d'objets, coordination motrice, trente-deux heures d'enregistrement de l'activité nuit et jour, six minutes de nage, une semaine de test de préférence pour une boisson sucrée. Le porteur écrit que "les expériences menées ici sont indolores" et qualifie les tests de non aversifs, sur un projet déclaré en souffrance modérée pour la totalité des animaux.

Objectifs

La vitamine A est une molécule très importante impliquée dans diverses fonctions vitales chez les vertébrés, notamment le développement, la croissance et l'homéostasie. La perturbation de la signalisation de la vitamine A chez l’humain ou dans les modèles murins entraîne un comportement de type dépressif et pourrait être associée à la neurodégénérescence. Bien que plusieurs études montrent que les cellules microgliales (MGC), cellules immunitaires résidentes du cerveau, sont impliquées dans les comportements dépressifs et les troubles neurologiques qui y sont associés, aucune étude n'a établi le lien entre la signalisation par la vitamine A et les MGC. Afin de combler cette lacune, nous avons développé des lignées de souris génétiquement modifiées qui nous permettent de perturber la signalisation de la vitamine A spécifiquement dans les MGC. Ce projet vise à comprendre l'importance de la signalisation de la vitamine A dans le développement des MGC et ses fonctions dans le cerveau de la souris adulte. Les résultats du projet ouvriront de nouvelles voies en matière de thérapeutique pour différents troubles neurodégénératifs en ciblant spécifiquement les MGC et leur capacité à sauver les fonctions cérébrales.

Bénéfices attendus

Les données de la recherche ont montré que certains récepteurs de la vitamine A se trouvent dans des types spécifiques de cellules microgliales - des cellules immunitaires qui vivent dans le cerveau - à différents stades du développement. D'autres études ont suggéré que les cellules microgliales sont impliquées dans les comportements liés à la dépression, et nous avons constaté que lorsque certains récepteurs des rétinoïdes sont inactivés chez les souris, les animaux présentent des comportements similaires à la dépression ou des signes de neurodégénérescence. S'il est prouvé que ces récepteurs jouent un rôle important dans d'autres cellules immunitaires (comme les macrophages), peu de recherches ont été menées sur la façon dont ils affectent directement les cellules microgliales, qui sont essentielles à la santé du cerveau. Au début de la vie, les cellules microgliales contribuent au développement du cerveau et à la formation de différents types de cellules cérébrales, tandis qu'à l'âge adulte, elles protègent le cerveau et aident à maintenir l'équilibre des fonctions cérébrales. Ce projet vise à explorer le rôle et la chronologie de ces récepteurs dans le développement et la fonction microgliale, à la fois pendant la croissance du cerveau et dans le cerveau adulte. Les résultats pourraient nous aider à mieux comprendre comment la vitamine A pourrait être utilisée dans le traitement des maladies neurodégénératives, où les cellules microgliales jouent un rôle clé dans la réponse aux lésions cérébrales et à l’évolution de la maladie.

Procédures

Injections intra-péritonéales : selon le groupe expérimental, 4 injections ou 5 injections (1 injection par jour successif). L'injection ne dure qu'une dizaine de secondes entre le moment où l'animal est saisi et le moment où le produit est injecté. Seul un sous-groupe d’animaux recevra en tout 9 injections (4 injections successives à 8 semaines d’âge, 5 injections successives à 12 semaines d’âge). Tests comportementaux non aversifs que chaque animal passera une seule fois : test 1 : 40 minutes, évaluation de la locomotion induite par la nouveauté, test 2 : 2 x 20 minutes, reconnaissance d’objets nouveaux, test 3 : 5 minutes, évaluation de la capacité d’exploration, test 4 : 3 x 5 minutes, coordination motrice, test 5 : 32 heures, mesure de l’activité spontanée nuit/jour, test 6 : 6 minutes, activité natatoire, test 7 : 1 semaine, évaluation de la préférence à une boisson sucrée, test 8 : 5 minutes, activité de toilettage.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux à effectuer ne sont pas susceptibles de causer des souffrances mais certains peuvent occasionnellement causer du stress. Dans ce but, l’ordre des tests est établi du moins stressant au plus stressant et certains tests nécessitant une isolation temporelle ou du contact avec de l’eau seront effectués à la fin de la batterie de tests comportementaux. Les effets stressants de l’isolation seront négligeables grâce à la réduction de temps d’isolation à la nuit, et le temps limité de durée du test de préférence à la boisson sucrée. Les injections peuvent provoquer une légère douleur et un stress chez l'animal et seront minimisées par utilisation d’aiguille très fines. Dans les cas d’injection d'agent inflammatoire, un état d'inflammation légère et transitoire sera provoqué.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés afin de collecter du matériel biologique pour des analyses cellulaires et moléculaires qui complèteront les résultats obtenus à partir du comportement.

Remplacement

Le modèle murin ne peut être remplacé, et reste indispensable pour évaluer l'impact des mécanismes biologiques sur les cellules microgliales, et pour étudier leurs effets sur le cerveau dans son ensemble. La complexité biologique du cerveau et de son environnement ne permet pas de le remplacer par des modèles mathématiques ou in vitro, car ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, la taille des groupes expérimentaux (n=6/condition) correspond au nombre minimum d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les exigences de réduction. De plus, nous utilisons les deux sexes pour éviter de produire inutilement des femelles. En l'absence de différences, nous regrouperons les données des deux sexes pour une même condition expérimentale. Ces effectifs ont été déterminés en fonction des données de la littérature et des procédures en vigueur dans l'animalerie.

Raffinement

Les injections seront réalisées par un manipulateur expérimenté et avec une aiguille fine. Les expériences menées ici sont indolores et réalisées par un personnel compétent et qualifié. Elles consistent uniquement en des études comportementales qui servent à mettre en évidence des dysfonctionnements d’origine neurologique. Les animaux seront méticuleusement surveillés quotidiennement, et leur poids sera vérifié une fois par semaine ou sur une base quotidienne si un signe de mal-être était detecté. Tout animal présentant une perte de poids ou des signes de pathologie ou de lésion sera traité selon décision du vétérinaire, ou mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de la signalisation de la vitamine A dans les cellules microgliales et ses implications neurologiques, la souris est un modèle optimal en raison de la similitude des génomes de la souris et de l'homme et de la disponibilité de différentes lignées de souris portant des mutations génétiques ciblées qui couvrent tous les processus physiologiques, en particulier le développement neurologique et la neurodégénérescence. De plus, les mécanismes d'action de la forme bioactive de la vitamine A sont très bien caractérisés chez la souris et divers traitements pharmacologiques sont déjà disponibles pour évaluer son mode d'action. Afin d'obtenir des résultats comparables et fiables, nous utiliserons des animaux d'âge similaire au moment des tests, à savoir 12 semaines d’âge post-natal, âge minimal reconnu par la communauté scientifique comme un stade « adulte » permettant d’obtenir des résultats fiables dans les études comportementales.

Tatouées, amputées du bout de la queue pour être identifiées, puis injectées chaque jour pendant vingt et un jours dans l'abdomen : les souris de ce projet enchaînent des gestes que le porteur qualifie de douleur légère et de courte durée. 1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus à analyser, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est d'identifier les protéines dérégulées dans le cerveau d'un modèle de trouble du spectre de l'autisme, avec l'espoir de pistes thérapeutiques. Les tests comportementaux, cœur du dispositif puisque le porteur affirme qu'une approche comportementale n'est possible qu'à l'échelle de l'"organisme entier", ne sont à aucun moment nommés.

Objectifs

Les troubles du spectre de l’autisme sont des troubles du neurodéveloppement qui touchent 1 à 2% de la population. Ils sont caractérisés, entre autres, par des altérations dans le développement des capacités cognitives, de communication et d'interaction sociales. Ils constituent un véritable handicap pour le patient et malheureusement, à ce jour, il n’existe aucun traitement curatif car les causes de cette pathologie restent encore mal connues. Les progrès récents ont permis d’identifier plus de 200 gènes de risque liés aux troubles du spectre de l’autisme. Notre travail vise à identifier, dans le cerveau, les mécanismes de régulation qui sont à l’origine de ces troubles. Les protéines identifiées pourront être ciblés à l’avenir pour le développement de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des données cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans les troubles du spectre de l’autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.

Procédures

Injections intra-péritonéales et sous-cutanées. Identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue: stress et douleur légère de courte durée (1 fois, durée 30 seconds). Amendement 1: Injections quotidiennes intra-péritonéales pendant 21 jours: stress et douleur légère de courte durée (une fois/jour, durée 30 secondes)

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux utilisés peuvent induire un stress léger. Injections intra-péritonéales et sous-cutanées, identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue : stress et douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour le prélèvement du tissu à analyser.

Remplacement

Cette étude nécessite une approche comportementale qui n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier, nous devons donc faire appel à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les souris seront observées quotidiennement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car ces animaux présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés uniquement chez la souris. Pour toutes maladies neurodéveloppementaux il est important de comparer des animaux adolescents avec des animaux adultes car certains symptômes se manifestent différemment. Donc, nous utiliserons des animaux au stades adolescents (4 semaines) et adultes (4 mois). L’identification des animaux sera réalisée à l'âge de 7-10 jours.