Recherche fondamentale

Anesthésiés cinq minutes, munis d'une puce d'identification implantée, mesurés, puis enfermés en cage trois semaines ou placés soixante-douze heures en respiromètre. 780 bars européens et soles communes juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, 420 bars et 270 soles tués pour prélèvement d'organes, 30 bars et 30 soles relâchés après leur passage en respiromètre. Certains sont transportés moins de quatre heures hors de l'établissement pour être placés près d'une éolienne en mer, d'autres subissent deux mises à jeun de douze puis soixante-douze heures et six jours cumulés de bruit, l'enjeu étant de documenter les effets du bruit des parcs éoliens sur le comportement et la physiologie des poissons. Sur la réduction, le porteur écrit seulement que les effectifs tiennent compte de la variabilité individuelle, sans justifier le nombre retenu.

Objectifs

La France montre des ambitions importantes en matière d’éolien en mer, et souhaite développer massivement cette énergie. Face aux enjeux environnementaux, une meilleure compréhension des mécanismes d’impacts est essentielle pour améliorer la prise en compte du milieu marin dans le développement de cette activité. Aujourd’hui, on ne connaît pas encore très bien tous les effets du bruit sur les poissons. On sait que des bruits de très fortes amplitudes peuvent leur causer des problèmes de santé, comme des pertes d’audition ou des blessures. Mais avant de provoquer de blessures, le bruit peut déjà déranger les poissons : il peut les empêcher de bien communiquer, les stresser ou les forcer à changer de comportement. Par exemple, un poisson peut fuir une zone où il trouve habituellement de la nourriture ou où il se reproduit. Ces effets peuvent ensuite avoir des conséquences plus larges sur la santé et la reproduction de ces animaux. Il faut donc s'intéresser non seulement aux blessures visibles, mais aussi à ces effets indirects. Il est aussi possible que certains poissons s’habituent au bruit avec le temps, mais cela reste à étudier. Ce projet de recherche veut mieux comprendre les effets des éoliennes en mer sur les poissons, en étudiant deux espèces présentes dans les zones côtières où les éoliennes se développent beaucoup : le bar européen (Dicentrarchus labrax) et la sole commune (Solea solea). Le réchauffement climatique ajoute un autre problème : la température de l’eau augmente. Or, chez les poissons, la température environnementale influence leur température corporelle, et donc l’ensemble des processus physiologiques y compris leur fonction auditive. Plusieurs études suggèrent ainsi que la sensibilité auditive pourrait augmenter avec la température, mais cela reste encore peu étudié, surtout chez les espèces marines. C’est pourquoi ce projet va aussi s’intéresser à l’effet de la température sur l’audition du bar.

Bénéfices attendus

Les résultats à courts termes permettront de mieux évaluer les impacts de l'environnement sonore émanant de l'activité de l'éolien offshore sur la faune marine. Ces impacts sont généralement établis au travers des lésions physiologiques qu'ils génèrent sur la fonction auditive. Or, d'autres types d'effets qualifiés d'indirects, comme des modifications du comportement, des déséquilibres cellulaires en lien avec une situation de stress, ..., peuvent aussi être déclenchés. C'est sur ce type d'impacts que le présent projet est centré, en s’intéressant à deux espèces: le bar et la sole. Les résultats permettront d'établir à moyens termes des mesures de type 'Eviter, Réduire, Compenser' afin de réduire les effets néfastes sur les écosystèmes marins et la biodiversité.

Procédures

1/ 60 soles et 60 bars seront anesthésiés 1 fois pendant 5 minutes pour implantation d'une puce d'identification active et pour des mesures biométriques (poids, taille). Parmi eux, 30 soles et 30 bars seront ensuite exposés, de manière vigile et pendant 12 jours, à des enregistrements sonores (bruits éoliens). 2/ 240 soles et 240 bars seront anesthésiés 1 fois pendant 5 minutes pour implantation d'une marque d'identification active et pour des mesures biométriques (poids, taille). Les 480 poissons seront mis en cage 3 semaines (dont une semaine d'acclimatation), et parmi eux, 120 soles et 120 bars seront mis à proximité d'une éolienne offshore 2 semaines (donc exposés à du bruit). Transport de ces 480 poissons, en condition vigile, durée inférieure à 4 heures, une fois. 3/ 30 soles et 30 bars seront placés, en condition vigile, dans un respiromètre pendant 72 heures une fois. Ils seront soumis à 2 mises à jeun, l'une de 12 heures et l'autre de 72 heures et exposés à du bruit pendant 24 heures. Chaque individu sera anesthésié 1 fois pendant 5 minutes pour des mesures biométriques (poids, taille). 4/ 120 bars auront une mise à jeun de 12 heures une fois puis seront placés, en condition vigile, dans des arènes pendant 9 jours. Parmi eux, 60 seront, en plus, exposés à 6 jours cumulés de bruit en alternance avec 48 heures cumulées de silence pendant 8 jours consécutifs. Chaque individu sera anesthésié 1 fois pendant 5 minutes pour des mesures biométriques (poids, taille).

Impact sur les animaux

Un stress de très faible intensité et de très courte durée (moins de 5 minutes) pourrait être déclenchés par les manipulations associées aux biométries. Une angoisse de faible intensité (moins de quelques minutes) pourrait avoir lieu lors du réveil suite aux évènements d’anesthésie. Un stress modéré, une douleur et un prurit localisé de faible intensité durant les deux premiers jours pourraient être provoqués par l’injection des puces d'identification. Un stress de faible intensité et un risque faible de blessures mineures pourraient être provoqués lors de la manipulation et du déplacement des animaux hors de l'établissement utilisateur (durée d’environ 4 heures). Un stress de faible intensité lié à une limitation modérée de la mobilité des animaux lors de leur placement en respiromètre (72 heures) pourrait être observé. Une sensation de faim de faible intensité pourrait être induite par la mise à jeun des animaux pendant 84 heures, soit 12 heures avant transfert plus 72 heures en respiromètre. Un stress et une angoisse de faible intensité, voire une faible baisse d’appétit pourrait être induite en présence de bruit représentatif de l’environnement sonore produit par une éolienne en fonctionnement sur la durée de l’exposition (d’une durée variant entre 1 et 15 jours), ou de manière temporaire en cas de phénomène d’habituation.

Devenir

420 bars et 270 soles seront mis à mort pour effectuer le prélèvement de différents organes en vue d’une étude moléculaire complémentaire des paramètres de comportement mesurés sur les poissons vigiles exposés au bruit. 30 bars et 30 soles seront relâchés après le passage dans le respiromètre. Ce replacement sera effectué en accord avec le vétérinaire référent de l'établissement.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de l’environnement sonore produit par l’activité de l’éolien offshore en conditions thermiques stables ou variables au travers d’analyses écophysiologiques et comportementales chez le bar et la sole. Aux vues des phénomènes biologiques étudiés (comportement) et de l’approche visée (écophysiologie intégrative) le projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Le recours à d’autres stratégies d’expérimentation telles que des études in vitro ne s’avère pas pertinent. Il n'existe pas encore de modèle in vitro ou in silico permettant d'évaluer l'impact sonore sur le développement des poissons

Réduction

Le nombre d’animaux par condition expérimentale a été évaluée de façon à prendre en compte la variabilité individuelle.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de score qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Pour les anesthésies, l’utilisation d’un linge humide permettra de limiter la dessication et maintenir le poisson au calme et immobile. Un suivi sera effectué au réveil avec vérification de la reprise de la fréquence operculaire. Les volumes des diverses structures d’hébergement (bassins, claires, arènes, respiromètres) sont adaptés à la morphologie et à taille des individus ce qui leur permet de s’y mouvoir. Les biomasses sont largement inférieures à celle des milieux d’élevage dont sont issus les animaux. Ce sera également le cas pour les bidons utilisés pour le transport des animaux. L’oxygénation de l’eau pendant ces phases de transport sera assurée par un aérateur sur batterie. La teneur en oxygène sera vérifiée toutes les 2 heures. Les amplitudes sonores auxquelles seront exposés les animaux sont en deçà des seuils sonores connus pour engendrer des désordres physiologiques chez le bar et la sole.

Choix des espèces

Le bar européen a été ciblé du fait de son importance écologique et économique, et de sa dépendance vis à vis des habitats littoraux au vu de son cycle de vie qui en dépend en totalité ou en partie. Dans le souci d’une meilleure compréhension des effets, et d’une approche intégrée encore plus avancée, une espèce benthique (c'est à dire vivant sur le fond plutôt que dans la colonne d'eau) sera également considérée sur certaines des procédures, afin de transposer et de valider les approches et les effets qui auront pu être mis en évidence sur le bar. Il s’agira de la sole Solea solea. En effet, au vu de son écologie et sa tolérance au stress différentes, des stratégies de réponses variées et complémentaires sont attendues chez cette espèce benthique en comparaison des observations qui pourraient être faites chez le bar européen. C’est le stade juvénile qui sera ciblé. C’est à ce stade que ces 2 espèces se distribuent principalement dans les zones côtières, terrain d’installation privilégié des champs d’éoliennes.

Une chirurgie d'amincissement du crâne ouvre la voie à l'imagerie du cerveau au microscope biphotonique à travers l'os, pendant quatre-vingt-dix à cent quatre-vingts minutes. 984 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur cerveau. Il s'agit de suivre les contacts entre astrocytes et vaisseaux sanguins corticaux à cinq stades, de 7 à 60 jours après la naissance, une des lignées présentant un retard de développement pouvant aller jusqu'à des calcifications cérébrales et des troubles moteurs. Le RNT chiffre à 864 les souriceaux d'un ou quatre jours recevant une injection sous-cutanée et à 864 les souris subissant l'amincissement du crâne, pour un effectif total déclaré de 984.

Objectifs

Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiels à la physiologie cérébrale et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent notamment avec les vaisseaux sanguins où ils participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Ils forment ainsi avec les vaisseaux l’unité gliovasculaire (UGV), qui est perturbée dans l’ensemble des maladies touchant le cerveau. Parmi les déficits actuels en santé publique, les pathologies liées au développement du cerveau et à l’établissement de ses capacités plastiques, comme les troubles du spectre autistiques, les maladies neurodéveloppementales ou psychiatriques, ont une place importante. Cependant les étiologies de ces maladies sont encore largement méconnues. En particulier, un possible rôle des astrocytes reste à démontrer. Une des raisons pour cela est le manque de connaissance sur les dynamiques de l’unité gliovasculaire au cours de la vie et les interactions entre les astrocytes et le système vasculaire cérébral. Cette étude permettra de caractériser les mécanismes de plasticité des contacts astrocytaires sur les vaisseaux sanguins corticaux dans de multiples conditions de développement physiologiques et pathologiques à l’aide d’analyses histologiques et d’enregistrements dynamiques en temps réel par vidéomicroscopie. Cela permettra une meilleure compréhension des dynamiques de l’unité gliovasculaire et du rôle des astrocytes au cours de la vie. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Cette étude nécessite l’utilisation de 984animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les dynamiques et les fonctions de l’unité gliovasculaire, dont les défauts sont un facteur important des pathologies neurodéveloppementales et neuropsychiatriques.

Procédures

2 types d’interventions sont prévues dans ce projet : 1. Injection en stade périnatal : un réactif est injecté en voie sous-cutanée chez des souriceaux nouveau-nés de 1 ou 4 jours. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois. Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est effectuée dans l'EU1.Nombre d’animaux concernés : 864 (durée : 1min). 2. Procédure d’amincissement du crâne et imagerie in vivo au microscope biphotonique : Les souris subiront une intervention chirurgicale d’amincissement du crâne pour permettre l’enregistrement du signal fluorescent par microscopie biphotonique à travers l’os. L’intégralité de la procédure est faite sous anesthésie et analgésie. Elle est effectuée dans l'EU2. Nombre d’animaux concernés : 864. (durée : 90 à 180 min).

Impact sur les animaux

Une des lignées de souris présente des caractéristiques dommageables pouvant entrainer des nuisances, notamment un léger retard de développement pouvant aboutir sur des altérations du système visuel et cardiovasculaire ainsi que l’apparition de calcifications cérébrales pouvant engendrer des problèmes moteurs chez certains individus. Certains lots de souris subiront des interventions chirurgicales qui peuvent entrainer des effets modérés (douleurs post-opératoires) qui seront minorées par l'administration d'analgésiques.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés après chaque procédure afin de récupérer leur cerveaux pour faire les analyses.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les nouveau-nés subissant une injection feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants . Dans le cas des pups remis en cage avec leur mère, les manipulations des animaux seront limitées autant que possible afin d’éviter leur rejet par la mère. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance chez l’animal. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites).

Choix des espèces

La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Les différentes étapes du développement cérébral et sa plasticité chez la souris étant bien décrites et similaires à l’humain, ce modèle est approprié à la recherche neurodéveloppementale. Les animaux seront utilisés à 5 stades développementaux postnataux : 7, 15, 21, 30 et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moment clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.

76 souris seront transférées vers un autre projet, le porteur estimant le stress subi ici négligeable, et les autres seront tuées pour analyse de leurs tissus. 166 souris vont être utilisées au total, 52 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 114 dans des procédures modérées. Certaines sont opérées pendant deux heures à deux heures trente puis reçoivent trois injections, d'autres tiennent le rôle de souris stimulus et restent enfermées sous une coupelle pendant quatre séances de dix minutes, immobilisées, pendant qu'une congénère est observée. L'objet déclaré est de comprendre les bases neurobiologiques des difficultés sociales dans un modèle murin d'autisme, un travail que le porteur relie à l'inclusion des personnes neurodivergentes dans la société.

Objectifs

L’autisme est une condition neurodéveloppementale qui touche environ 3 % des enfants. Les déficits de la cognition sociale en constituent l’une des caractéristiques fondamentales et incluent, par exemple, une difficulté à accorder une importance appropriée aux signaux sociaux. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les bases neurobiologiques de ces altérations, afin de favoriser une compréhension approfondie de ces troubles et de proposer des approches thérapeutiques susceptibles d’améliorer la cognition sociale ainsi que l’intégration des personnes autistes dans la société.

Bénéfices attendus

L’autisme touche environ un enfant sur 31. Il s’agit d’une condition permanente ayant un impact significatif sur l’intégration sociale, professionnelle et éducative tout au long de la vie des personnes concernées. Une meilleure compréhension des modifications neurobiologiques à l’origine des difficultés spécifiques rencontrées par les personnes autistes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques visant à atténuer les symptômes ou à en améliorer la prise en charge. Ces interventions pourraient avoir un effet positif sur la qualité de vie des personnes autistes ainsi que sur celle de leurs familles. Ce projet s’intéresse aux déficits en communication sociale, qui constituent l’une des caractéristiques diagnostiques principales de cette condition. Il offre ainsi l’opportunité de mieux comprendre l’autisme et de contribuer à l’enrichissement des connaissances sur la manière dont notre société peut devenir plus inclusive et accueillante envers les personnes neurodivergentes.

Procédures

Les animaux seront soumis à un test comportemental d’une durée de 22 minutes. Certains d’entre eux subiront une intervention chirurgicale d’une durée comprise entre 2 heures et 2 h 30, ainsi que des injections répétées (trois injections d’environ 20 secondes chacune). Par ailleurs, certains animaux seront confinés dans une coupelle pendant le test, pour un maximum de quatre séances de 10 minutes chacune, soit un temps total maximal de 40 minutes.

Impact sur les animaux

Certains animaux subiront une intervention chirurgicale susceptible d’entraîner une altération temporaire du bien-être dans les heures ou les jours suivant l’opération. Les effets indésirables potentiels incluent un inconfort, une fatigue, une douleur transitoire, un risque d’infection et une perte de poids. Ces animaux recevront également trois injections, chacune impliquant une contention de courte durée (20 secondes). Cette contention peut induire un stress modéré. Par ailleurs, certains animaux seront utilisés comme souris stimuli dans le cadre du test de préférence sociale. Cela implique leur confinement dans une zone restreinte à l’intérieur d’une coupelle pendant toute la durée de chaque session (10 minutes). Ce confinement limite leur capacité à se déplacer librement, ce qui peut également constituer un facteur de stress modéré.

Devenir

Certains animaux seront réutilisés dans le cadre d’un autre projet, le niveau de stress engendré par la procédure étant considéré comme négligeable. D’autres seront mis à mort, et leurs tissus seront utilisés pour des analyses anatomiques.

Remplacement

Notre projet porte sur les altérations des circuits neuronaux affectant la communication sociale dans un modèle de maladie neuropsychiatrique. Pour cela, nous avons besoin d’un organisme intact, capable de riches échanges sociaux tels qu’on les observe chez les espèces mammifères. Nous avons également besoin de circuits neuronaux fonctionnels et d’une organisation cérébrale comparable à celle des sujets humains. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences sur des organoïdes ou des cellules isolées. Il n’est pas non plus possible de mener ces études chez une population clinique, en raison de la nécessité d’approches invasives. Les rongeurs sont évolutivement proches des humains, et les souris, en particulier, sont largement utilisées en neurosciences car elles sont sensibles aux modifications génétiques. De plus, il existe des paradigmes comportementaux bien établis qui nous permettent de comparer notre travail à celui d’autres laboratoires. Nous ne pouvons pas non plus utiliser des animaux d’une sensibilité moindre (comme les mouches), car ils ne possèdent pas la complexité des réponses comportementales sociales requises pour explorer cette problématique.

Réduction

La conception expérimentale rigoureuse de notre projet permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Pour estimer ce nombre de manière précise, nous avons sollicité l’avis d’experts et consulté la littérature scientifique dans le domaine. Par ailleurs, nous avons intégré des études pilotes dans notre plan expérimental, afin d’évaluer la faisabilité technique de certains aspects du projet.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l’état de l’animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire les risques de douleur ou de souffrance : utilisation d’un gel oculaire pour prévenir le dessèchement des yeux, et d’un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle. Utilisation systématique d’anesthésiques et d’analgésiques lors de chaque intervention chirurgicale. iv) Mise en place de soins préventifs en post-opératoire : administration de sérum physiologique, distribution de nourriture humide déposée au sol de la cage. v) Habituation préalable à la salle de comportement. vi) Hébergement en groupe avec mise à disposition de matériel de nidification. vii) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatoires pour chaque phase de la procédure. viii) Intégration continue des techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de ressources pédagogiques en bien-être animal, et sollicitation d’experts du domaine.

Choix des espèces

Notre projet porte sur les altérations des circuits neuronaux affectant la communication sociale. Pour cela, nous avons besoin d’une espèce capable de riches échanges sociaux, tels qu’on les observe chez les mammifères. Nous avons également besoin d’une espèce présentant une organisation cérébrale similaire à celle des sujets humains. Les rongeurs sont évolutivement proches des humains, et les souris, en particulier, sont largement utilisées en neurosciences car elles sont sensibles aux modifications génétiques. De plus, il existe des paradigmes comportementaux bien établis qui nous permettent de comparer notre travail à celui d’autres laboratoires. Âge des animaux utilisés : Pour le test de préférence sociale : des animaux adultes (8 à 10 semaines) seront utilisés. Cet âge a été choisi afin d’assurer la cohérence avec les études antérieures, et parce que les circuits neuronaux sont matures à ce stade. Pour les interventions chirurgicales : les animaux seront opérés entre 5 et 7 semaines, afin de permettre une récupération complète avant les tests comportementaux, et pour des raisons techniques liées à la manipulation des circuits neuronaux.