Recherche fondamentale
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Étude de l’impact de la canicule sur la fonction cardiaque dans un modèle murin génétique d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteurs d'une insuffisance cardiaque qui se déclare vers vingt-quatre semaines, 228 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont exposés plusieurs jours à des conditions de canicule, obtenues par dérogation aux règles d'hébergement, avec hyperthermie et accélération cardiaque et respiratoire attendues. S'y ajoutent trois à cinq échocardiographies et trois à cinq IRM sous anesthésie, trois séjours de vingt-quatre heures en cage à diurèse, deux gavages, des mesures de pression à la queue et une chirurgie pour implanter un capteur télémétrique. Le bénéfice annoncé tient à de meilleures recommandations médicales pour les patients cardiaques pendant les fortes chaleurs, quand le stress thermique imposé aux rats est, lui, planifié.
Objectifs
Ce projet a pour but de mieux comprendre comment les fortes chaleurs, comme celles rencontrées lors des canicules, peuvent aggraver certaines maladies cardiaques. Pour cela, nous utilisons un modèle de rat qui présente naturellement plusieurs problèmes de santé similaires à ceux observés chez les patients atteints d’insuffisance cardiaque. Les animaux seront exposés à une température élevée pendant quelques jours, dans un environnement sécurisé et surveillé. Leur état de santé sera suivi à l’aide d’examens non douloureux, comme l’échographie, ou de petits capteurs mesurant la température ou la pression artérielle. Les résultats aideront à mieux protéger les personnes fragiles lors d’épisodes de chaleur extrême.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à comprendre comment la chaleur intense, comme lors d'une canicule, peut aggraver une maladie cardiaque déjà présente. Grâce à ce modèle animal, il sera possible d’observer les effets de la chaleur sur le cœur et la circulation, et d’identifier des signes d’alerte utiles pour prévenir les complications. L’étude évaluera aussi des outils permettant de surveiller les animaux de manière plus précise et moins stressante. Ces travaux pourraient, à terme, aider à mieux protéger les patients cardiaques pendant les périodes de fortes chaleurs, en améliorant les recommandations médicales.
Procédures
Les animaux sont soumis à différentes interventions tout au long de l’étude. Des échocardiographies sont réalisées entre 3 et 5 fois, pour une durée de 15 minutes, sous anesthésie. La pression artérielle est mesurée à la queue à trois reprises, sur animaux vigiles, avec une durée moyenne de 15 minutes par session. Les animaux sont également placés en cage à diurèse à trois reprises, pour des périodes de 24 heures, sans anesthésie. Deux séances de gavage sont effectuées avec contention manuelle, chacune durant seulement quelques secondes, sur animaux vigiles. Une procédure chirurgicale est réalisée une seule fois pour l’implantation d’un capteur télémétrique, sous anesthésie, avec une durée de 20 à 30 minutes. Enfin, des examens d’IRM sont effectués entre 3 et 5 fois, d’une durée de 30 minutes chacun, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
l n’est pas attendu de douleur qui ne soit pas soulagée par des traitements analgésiques appropriés. Toutefois, certaines interventions peuvent entraîner des nuisances pour les animaux. L’utilisation d’un tapis de course pour évaluer la capacité d’exercice chez des animaux vigiles (classe légère) peut provoquer une fatigue, sans douleur manifeste. La pose de capteurs télémétriques nécessite une intervention chirurgicale, susceptible d’induire des douleurs post-opératoires, qui seront prises en charge par une analgésie adaptée. Le placement en cage à diurèse peut engendrer un stress comportemental lié à l’isolement. La prise de pression artérielle peut entrainé un stress de l'animal. Le gavage, quant à lui, peut occasionner une irritation ou une gêne transitoire au niveau de l’œsophage. Enfin, les conditions caniculaires représentent un facteur de stress thermique important, pouvant se manifester par une hyperthermie, une augmentation de la fréquence respiratoire et cardiaque, ainsi qu’une altération du comportement alimentaire et de l’hydratation.
Devenir
À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés conformément aux normes éthiques en vigueur afin de permettre les prélèvements nécessaires aux analyses post-mortem (histologie, biologie moléculaire, etc.). Ces analyses sont indispensables pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour comprendre les mécanismes tissulaires associés à la décompensation cardiaque. Aucun relogement ou maintien prolongé en élevage n’est prévu, afin d’éviter toute souffrance inutile ou altération de l’état de santé des animaux au-delà de la période utile à l’étude.
Remplacement
Le projet porte sur les effets d’un stress thermique sur l’évolution de l’insuffisance cardiaque dans un contexte métabolique. Les mécanismes étudiés impliquent une réponse cardiovasculaire intégrée, thermorégulatrice et inflammatoire, impossible à reproduire in vitro ou in silico avec pertinence. Les méthodes alternatives ont été considérées pour l’optimisation des phases exploratoires (modélisation informatique, revue bibliographique, données historiques), mais les objectifs scientifiques nécessitent ici l’utilisation d’un organisme entier. Aucun modèle alternatif ex vivo ou cellulaire ne permet à ce jour de simuler la complexité des interactions physiopathologiques impliquées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été optimisé grâce à plusieurs stratégies complémentaires : la mutualisation de certains groupes entre procédures pour éviter les redondances ; la constitution de sous-groupes expérimentaux permettant de répartir les manipulations et de limiter le stress tout en assurant la robustesse statistique des résultats ; l’exploitation de données historiques internes, notamment pour les groupes témoins lorsque cela est justifié ; l’utilisation de dispositifs de suivi longitudinal (thermopuces ou télémétrie) autorisant des mesures répétées sur un même individu ; et enfin, une estimation rigoureuse du nombre nécessaire d’animaux par calcul de puissance, prenant en compte la mortalité attendue dans ce modèle.
Raffinement
Des mesures ont été mises en place pour améliorer le bien-être animal tout au long du projet : 1) Points limites clairs et validés pour prévenir toute souffrance prolongée. 2) Répartition réfléchie des examens d’imagerie, pour éviter les cumuls d’interventions stressantes ou longues sur un même individu. 3) Dérogation à l’hébergement (condition « canicule ») strictement limitée dans le temps, et aménagée en conséquence (enrichissements adaptés, monitoring renforcé, suivi clinique rapproché). L’hébergement social est maintenu selon les normes en vigueur. 4) Utilisation de thermopuces dès que cela est possible pour limiter, voire supprimer l’utilisation de la télémétrie dans ce projet 5) S’il y a chirurgie (pour la pose de l’implant de télémétrie), raffinement des méthodes d’analgésie pré et post-opératoire, et chirurgies standardisées et de courte durées, réalisées par du personnel expérimenté. Une grille de scoring clinique est utilisée pour un suivi rigoureux de l’état général des animaux, avec des points limites définis permettant une euthanasie anticipée en cas de décompensation ou de souffrance avérée. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde, par injection en surdose d’anesthésique, conformément aux recommandations éthiques en vigueur.
Choix des espèces
Le choix des rongeurs, et spécifiquement des rats est motivé par plusieurs facteurs. D’une part, ces animaux permettent de répondre aux objectifs du projet, qui incluent l’étude des mécanismes physiopathologiques de l’insuffisance cardiaque dans un contexte métabolique. D’autre part, les rats sont largement utilisés dans des études similaires au sein du laboratoire, ce qui permet de comparer et d’enrichir les résultats avec les données historiques accumulées. Leur taille, qui facilite les manipulations pratiques, ainsi que leur place intéressante dans la phylogénie, sont également des éléments importants. En outre, ces rats présentent une insuffisance cardiaque à 24 semaines, stade idéal pour étudier l’évolution de cette pathologie.
Elevage de lignées murines présentant une inflammation chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Des lignées de souris sont élevées pour développer avec l'âge une inflammation chronique, une hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmonaire : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nuisances annoncées sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Le porteur écrit ensuite que les conditions d'élevage seront adaptées pour que les animaux ne développent pas de symptômes, alors que le phénotype dommageable est précisément ce que cet élevage produit, les souris atteintes n'étant pas gardées au-delà de vingt semaines. Une partie des petits sert au renouvellement des accouplements, les autres partent vers des expériences menées sur un autre site, et tous sont tués à terme.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.
Procédures
Ces animaux developperont une inflammation chronique avec l'âge. Ces lignées murines modèles de maladies inflammatoires developpent avec le temps un hypertrophie cardiaque ou une fibrose pulmaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur un autre site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.
Remplacement
L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.
Réduction
Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).
Etude du rôle de la branche ATF6a de la réponse UPR au cours du vieillissement dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées en fin de protocole pour le prélèvement de leurs organes, 304 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six mois, sont pesées chaque semaine et passent une imagerie sous anesthésie deux fois par mois pendant les traitements, puis une fois par mois ensuite. Le porteur cherche à savoir si bloquer une voie de réponse au stress cellulaire retarde les effets du vieillissement, avec l'ambition affichée de développer des molécules anti-vieillissement. Le projet peut durer vingt-quatre mois, soit à peu près l'espérance de vie d'une souris de laboratoire, sans que cette durée soit justifiée autrement que par le suivi du vieillissement.
Objectifs
Bien que les mécanismes conduisant au vieillissement ne soient pas encore complètement connus, il est maintenant établi que les effets du vieillissement sont corrélés à une augmentation du nombre de cellules sénescentes dans les tissus. Les cellules sénescentes se distinguent par de nombreux changements morphologiques et métaboliques et leur élimination (génétiquement ou pharmacologiquement) peut prévenir ou retarder le dysfonctionnement des tissus et ainsi prolonger la durée de vie chez la souris. La sénescence a longtemps été considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs via l’arrêt permanent du cycle cellulaire. Cependant, certaines molécules sécrétées par la cellule sénescente peuvent contribuer à un microenvironnement favorable à la transformation de cellules pré-cancéreuses. Ce rôle promoteur de tumeurs est également souligné par le fait que des cellules sénescentes sont trouvées dans des tumeurs bénignes et que des cellules épithéliales en culture peuvent échapper de façon spontanée à la sénescence et ré-entrer dans le cycle cellulaire avec des caractéristiques néoplasiques. Par ailleurs, la sénescence est également associée à de nombreuses pathologies liées au vieillissement comme les fibroses tissulaires conduisant à terme à des défaillances d’organe. Ainsi, l’étude des mécanismes de sénescence au cours du vieillissement nous semble particulièrement intéressante. La modulation de ces mécanismes pourrait ainsi permettre de bloquer dans le même temps le développement de pathologies fibrotiques et/ou cancéreuses ou plus généralement des pathologies liées à l’âge. Nous avons montré dans nos précédentes études dans des modèles de cellules que l’inhibition d’un certain nombre de facteurs associés à une voie de signalisation spécifique ("voie de réponse aux protéines mal conformées") provoque un retournement des caractéristiques observées dues à la sénescence. Une étude plus approfondie de ces différents acteurs pourrait permettre de mieux comprendre l’implication de cette voie au cours de la sénescence mais surtout pourrait potentiellement aboutir au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nous souhaitons, au travers de cette étude, déterminer si le ciblage de la voie de réponse aux protéines mal conformées dans un modèle animal pourrait avoir des effets et, ainsi, retarder ou réduire les pathologies liées au vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre les mécanismes régissant le vieillissement et pouvant conduire à la mise en place de processus pathologiques. Les résultats que nous obtiendrons pourraient permettre d’envisager l’inhibition spécifique d'une branche de la voie de signalisation impliquée dans les phénomènes de sénescence dans des conditions physiologiques et pathologiques et de déterminer quels inhibiteurs présenteront le meilleur potentiel thérapeutique. A terme, nous souhaitons développer des molécules « médicaments » ayant des effets anti-vieillissement et par conséquent des effets bénéfiques sur l’apparition de maladies liés au vieillissement, y compris la fibrose et le cancer.
Procédures
Après leur arrivée, tous les animaux (304 souris) seront acclimatés à leur zone d'hébergement pendant une semaine puis seront habitués à la manipulation humaine pendant une semaine supplémentaire. Les animaux recevront ensuite une injection de traitement ou de solution contrôle (durée : 1 min) à raison de 2 fois par semaine sur une durée de 6 mois. Les animaux seront pesés une fois par semaine (durée : 1 min) tout le long de la procédure. Dès la première semaine de traitements, l'effet de ces derniers sur la sénescence des cellules sera évalué par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse, tondus pour faciliter l'imagerie (durée : 30 sec.) et l'injection d'une molécule facilitant la lecture des images sera réalisée (durée : 30 sec). Après la lecture, les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil (durée totale anesthésie : 30 minutes). Cette lecture sera réalisée deux fois par mois pendant les 6 mois de traitements puis une fois par mois jusqu'à la fin du projet. A la fin des traitements, les souris seront maintenues en hébergement pour suivre leur vieillissement (durée maximale du projet : 24 mois).
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un stress léger de courte durée au moment de la manipulation lié à la nécessité de réaliser une contention et une injection pour l'administration des traitements. Les étapes nécessitant une anesthésie gazeuse pourraient également être source d'un stress léger et de courte durée.
Devenir
Afin d'étudier les effets de nos traitements sur la sénescence des cellules de différents organes, il nous est nécessaire de pouvoir les récupérer à la fin du projet. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Avant de procéder à l'étude in vivo, nous avons évalué les différents inhibiteurs des effecteurs de la voie de signalisation qui nous intéresse ainsi que leur efficacité in vitro. Nous avons pu identifier et caractériser les cibles d'intérêt de notre projet. Ces étapes préliminaires réalisées dans des modèles n'impliquant pas d'animaux ont ainsi permis de réduire le nombre d'animaux impliqués dans cette étude. Afin de valider dans un modèle complexe les différents inhibiteurs identifiés, l'utilisation d'un modèle animal à la fois jeune et âgé demeure cependant nécessaire.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nos cibles d’intérêts ont déjà été identifiées et caractérisées et l’efficacité des inhibiteurs a déjà été évaluée dans un modèle n'utilisant pas d'animaux. Le nombre de souris par groupe a été déterminé par une approche statistique tout en se basant sur les connaissances et l'expertise du laboratoire sur la manipulation de ce type de souris dans une expérience à long terme afin d'obtenir des résultats robustes. De plus, l'utilisation d'un système permettant le suivi longitudinal par imagerie de l'expression de notre facteur d'intérêt permet de réduire le nombre total d'animaux en évitant la mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires.
Raffinement
Afin de limiter au maximum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 6 animaux par cage dans un environnement enrichi (carré de coton pour la nidification) et dans des conditions classiques d'hébergement (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés avant la mise en place de l’expérimentation afin de procéder à une habituation. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant les procédures pouvant induire un stress ou une angoisse ainsi qu’avant la mise à mort. Des points limites ont été définis préalablement à l’expérience et un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance excessive nécessitant l’arrêt de la procédure et leur mise à mort (qui sera réalisée à distance des autres animaux). Les souris vieillissantes risquant de développer des pathologies non rencontrées chez des souris jeunes, nous apporterons des points de vigilance supplémentaires à leur suivi. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparence permettant la réalisation d’un score basé sur ce qui a été décrit dans la littérature
Choix des espèces
L’utilisation de souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques préexistants de manière à suivre l’évolution de la sénescence. De plus, la souris est un modèle largement étudié par la communauté scientifique ce qui permet de comparer les résultats avec les autres laboratoires et d’utiliser certaines conditions comme témoin de la validité de nos résultats. Les procédures expérimentales étant très encadrées, les paramètres de douleur ou de souffrance éventuelle sont plus facilement contrôlables. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (2 mois), c’est-à-dire après la phase de croissance ainsi que des souris adultes âgées (9 mois), âge auquel l’accumulation de cellules sénescentes devient détectable.
Exploration du rôle des macrophages dans l’homéostasie du fer chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injections de fer, molécule déclenchant une anémie hémolytique, irradiation en boîte de contention, injections de globules rouges ou de bactéries : 1 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant anesthésiée et tuée avant tout réveil. Un groupe reçoit six injections en douze jours, un autre passe cinq à dix minutes immobilisé pour l'irradiation avant une injection sous anesthésie. Toutes finissent anesthésiées pour une prise de sang terminale puis tuées, afin de prélever foie, rate et moelle osseuse. Le porteur affirme que la complexité d'un "organisme entier" ne peut pas être recréée in vitro et conclut que l'animal "dans son intégrité" est nécessaire pour étudier le recyclage du fer par les macrophages.
Objectifs
Le fer est essentiel pour de nombreuses fonctions physiologiques, comme la synthèse de l'ADN, la production de l'hémoglobine (indispensable au transport de l’oxygène dans les globules rouges), et la production d'énergie. Il existe sous deux formes principales, à savoir le fer ferrique, peu soluble mais stable, et le fer ferreux, plus soluble mais réactif. En excès, le fer peut générer des espèces réactives de l'oxygène qui peuvent créer des dommages aux cellules et déclencher une forme de mort cellulaire appelée ferroptose. Chez l’Homme, des mutations dans un certain nombre de gènes conduit à des surcharges sévères en fer dans l’organisme induisant des lésions tissulaires. Les manifestations de cette pathologie peuvent inclure des symptômes systémiques, des dysfonctions hépatiques (pouvant favoriser le développement d’un cancer du foie), une cardiomyopathie, un diabète, ainsi que des arthropathies, parmi d’autres complications. Ces maladies héréditaires sont appelées hémochromatoses et peuvent concerner environ 1 personne sur 1000 en France. Les concentrations de fer dans le sang et les organes sont strictement régulés pour limiter sa toxicité. Les macrophages, notamment dans la rate et le foie, contribuent à recycler le fer en éliminant les globules rouges vieillissants. Les cellules de Kupffer, des macrophages (globules blancs qui ont une fonction de nettoyage et de surveillance immunitaire) situés dans le foie, sont essentielles dans ce processus de recyclage. Dans certaines pathologies, comme l’anémie hémolytique, ces cellules de Kupffer peuvent souffrir et être remplacées par des macrophages d'une autre origine. Ce remplacement a des conséquences potentielles sur l'accumulation de fer dans certains organes, pouvant entraîner des dommages aux reins. Cette étude explore le rôle d'une molécule exprimée par les cellules de Kupffer (mais également d'autres types de macrophages) pour déterminer si celle-ci contribue à la survie et au maintien de ces macrophages dans le foie en condition normale et en cas de surcharge en fer.
Bénéfices attendus
Le fer est un composant essentiel de l'hémoglobine (une protéine des globules rouges) et est essentiel au transport de l'oxygène chez les vertébrés. À l'état stable, la production de globules rouges est en équilibre avec leur élimination. Cependant, dans diverses conditions physiopathologiques, la durée de vie des globules rouges est gravement compromise, ce qui menace l'organisme d'anémie et d’une toxicité au fer. Ces anémies dites hémolytiques peuvent avoir plusieurs origines et notamment être d'origine métabolique, génétique comme pour la drépanocytose ou bien encore relever de désordres auto-immuns. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation, fonction) et en particulier ceux qui sont présents dans le foie, mais aussi dans la rate ou la moelle osseuse, dans le recyclage du fer et l’équilibre production-élimination des globules rouges.
Procédures
Un premier groupe d’animaux recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention). Un deuxième groupe recevra une administration (injection unique, animal vigile, quelques secondes de contention) d'une molécule favorisant une anémie hémolytique. Un troisième groupe d’animaux recevra deux injections sous anesthésie générale (durée de quelques minutes) dans la journée, puis le lendemain une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention) suivie de deux prises de sang (animal vigile, durée 1-2 minutes) à quelques jours d'écart. Un quatrième groupe recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention) puis 2 semaines plus tard une administration de globules rouges ou de bactéries par une injection unique sous anesthésie générale. Un cinquième groupe recevra une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention), puis des traitements par injection (animaux vigiles, quelques secondes de contention) de molécules tous les deux jours, 6 fois. Pour le dernier groupe, les animaux seront placés dans des compartiments (mouvements limités) d’une boîte transparente en même temps que d’autres congénères (contact visuel et olfactif) pour subir une irradiation de faible dose (5 à 10 mins) suivie d'une injection sous anesthésie générale. 2 semaines plus tard, une prise de sang sera effectuée (animal vigile, durée 1-2 minutes) avant une administration de fer par injection unique (animal vigile, quelques secondes de contention). En fin de procédure, tous les animaux seront anesthésiés pour permettre une prise de sang terminale puis euthanasiés (toujours sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les administrations pourront induire une brève et légère douleur au point d’injection. Les injections répétées peuvent induire un risque d'infection (cas rare). Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée ainsi qu’un risque faible d’hématome ou d’hémorragie. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par le maintien de courte durée (5 à 10 mins) dans une petite boîte (mais sans perte visuel ni olfactive de leurs congénères). Ils pourront aussi être plus sensibles aux infections pendant quelques jours. Les courtes anesthésies générales pour les injections pourront engendrer un stress thermique et l’injection une douleur temporaire au réveil. Certains traitements pourront induire une inflammation temporaire, ou une anémie de transitoire et être source d’inconfort et être associée à une perte de poids temporaire des animaux.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux (1360 total) à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Il n’est aujourd’hui pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement tissulaire en condition saine ou pathologique. Dans le cas présent, l’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier l’impact de l’inactivation de notre gène d’intérêt dans les macrophages (présents dans tous les organes) sur leur homéostasie mais également sur les répercussions systémiques telles que l’homéostasie du fer.
Réduction
Un total de 1360 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, et quand cela est techniquement possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions réglementaires d'hébergement avec respect des cycles jour/nuit, un contrôle de l’hygrométrie et de la température. Les changes litière/nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite), le recours à l'anesthésie si nécessaire et la mise en place de soins adaptés. Les points limites prennent en compte des critères variés tels que l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé. Avant début des expérimentations les animaux seront habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées et notamment pour l'études des macrophages. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. Les animaux utilisés devront avoir atteint l'âge adulte au début des expérimentations pour avoir un système immunitaire mature. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.
Etude du microenvironnement tumoral et de l’immunosurveillance du carcinome hépatocellulaire dans le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
4 032 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection destinée à déclencher un cancer du foie, d'un volume équivalant à environ 9 % de leur poids corporel, qui dilate le foie et augmente le volume sanguin, puis jusqu'à quinze échographies hépatiques sous anesthésie et huit injections de traitements immunomodulateurs sur trois à six mois. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut dégrader l'état général des animaux, fatigue et perte de poids comprises. Les retombées annoncées se limitent à de futurs outils de diagnostic et de pronostic, le porteur affirmant que la souris est le "seul modèle préclinique" permettant d'éteindre ou d'activer des gènes tissu par tissu.
Objectifs
Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC, Carcinome Hépato-Cellulaire) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent à caractériser fonctionnellement les populations immunitaires notamment celles impliquées dans la réponse anti-tumorale. Ce projet sera axé sur les cellules lymphocytes. La compréhension de la fonctionnalité des cellules immunitaires servira de bases fondamentales pour le développement d’immunothérapie pour combattre le cancer du foie. Ce projet sera mené pour une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle d’acteurs clés de la réponse immunitaire, lors du développement du cancer du foie. Ces travaux pourraient ainsi permettre le développement de nouveaux outils diagnostic/pronostic pour ce cancer grave sans traitement effectif.
Procédures
Des animaux recevront une injection unique visant à mimer le cancer du foie (1 fois, 10 secondes/animal vigile). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 15 échos maximum) jusqu’à euthanasie à la fin de la procédure expérimentale (3-6 mois) par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer l’initiation tumorale (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs (4 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire. Des animaux recevront une injection unique visant à mimer la progression du cancer du foie (1 fois, 5 minutes/animal anesthésié). Une partie de ces animaux recevra des traitements immunomodulateurs hebdomadaire dès l’apparition de tumeurs (entre 5 et 8 injections, 2 minutes/ animal vigile). L’ensemble de ces animaux seront suivis par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 2 à 4 semaines ou toutes les semaines selon les conditions expérimentales (entre 2 échos minimum et 10 échos maximum) jusqu’à l’euthanasie à la fin de la procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons une injection qui peut provoquer un léger inconfort de courte durée, lié au passage de l’aiguille à travers la peau. De plus, le fait de maintenir l’animal pendant l’injection peut entraîner un stress temporaire. L’injection intra-veineuse comporte des risques de saignement local et/ou d’hématome. L’injection correspond à un volume de liquide équivalant à environ 9 pourcents du poids de l’animal. Elle peut provoquer une douleur passagère et entraîne une dilatation importante mais temporaire du foie (moins de 30 minutes), ainsi qu’une augmentation du volume total de sang. Lors de l’anesthésie par gaz utilisée pour l’échographie du foie, une baisse de la pression sanguine et de la température corporelle peut survenir. Enfin, la croissance prévue de la tumeur au niveau du foie pourrait entraîner une dégradation de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids, etc.).
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire de l’ensemble des animaux).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant le carcinome hépatocellulaire.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 4032 animaux seront étudiés. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les souris utilisées dans ces procédures seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche, nous avons choisi la souris du fait de la disponibilité de modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 à 8 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans le développement tumoral. Une souris trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.
Développement d’un paradigme comportemental pour l’étude de la généralisation de la peur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune testée deux fois par jour pendant quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie d'une heure trente pose des électrodes intracérébrales, puis chaque animal vit seul en cage pour éviter que ses congénères n'arrachent l'implant. Les tests appliquent des stimulations aux pattes et aux paupières afin d'installer une mémoire de peur, puis de mesurer à quel point elle se généralise à des contextes ambigus. Les troubles anxieux touchent 15 à 20 % de la population selon le porteur, mais les stratégies thérapeutiques annoncées relèvent du long terme, quand l'isolement et les stimulations sont, eux, immédiats.
Objectifs
Le cerveau utilise un mécanisme pour déterminer si une situation ressemble à une expérience connue (complétion de motif) ou si elle est perçue comme nouvelle (séparation de motif). Ce processus a été principalement étudié dans une région du cerveau appelée l’hippocampe dorsal. En revanche, une autre région, l’hippocampe ventral impliquée dans la régulation de l’anxiété reste encore peu explorée dans ce contexte. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que, dans des contextes flous, le cerveau tend à « combler les vides » en associant la situation à des souvenirs de peur. Ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi certaines personnes généralisent leur peur à des situations qui ne présentent pourtant aucun danger réel. L’objectif de ce projet sera de développer une tâche comportementale chez la souris permettant d’évaluer comment la généralisation de la mémoire de la peur peut être modulée par l’information contextuelle présentée.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pour cent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention dure environ 1h30, et chaque animal bénéficie ensuite d’une période de récupération post-chirurgicale de 7 jours. À l’issue de cette période de récupération, les animaux commencent le protocole de comportement qui s’étend sur environ quatre semaines. Chaque souris vigile est testée deux fois par jour, dans des sessions de 30 minutes, séparées par une récupération de 3 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances induites par la procédure comprennent, en lien avec la chirurgie, une légère perte de poids, des difficultés de cicatrisation et une douleur post-opératoire durant environ 48 heures, ainsi que des risques anesthésiques tels que l’hypothermie, la détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. L’hébergement individuel est susceptible d’induire un stress social. Dans le cadre des tests comportementaux, les stimulations appliquées au niveau des pattes et des paupières peuvent engendrer un stress modéré accompagné d’une douleur transitoire.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses nécessaires post-mortem).
Remplacement
Un impératif majeur des études portant sur les récepteurs naturels du cerveau est de préserver l’intégrité des réseaux neuronaux, afin de maintenir leurs connexions synaptiques. À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative à l’utilisation du modèle rongeur pour répondre à cette condition. Les techniques d’enregistrement chronique sont invasives et ne peuvent pas être réalisées chez l’humain ni chez le sujet sain. Elles sont réservées à des patients épileptiques, dont l’activité cérébrale est déjà altérée, et ne permettent pas de mener des études systématiques, car le placement des électrodes dépend des besoins médicaux. Par ailleurs, les connaissances actuelles et les capacités technologiques ne permettent pas encore de reproduire avec précision le fonctionnement de ces réseaux neuronaux à l’aide de modèles informatiques.
Réduction
Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Les statistiques utilisés sont des tests paramétriques et non paramétriques classiques ainsi que des tests en lien avec les analyses de réseaux neuronaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 3 ans, ce projet de recherche impliquera 84 animaux
Raffinement
Après leur réception, les animaux commerciaux sont habitués à l’animalerie pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Durant la chirurgie, la température corporelle des animaux est maintenue constante à l’aide d’un tapis chauffant, afin d’éviter toute hypothermie liée à l’anesthésie. Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés (suivi à l’aide d’une grille post-opératoire) seront maintenus en hébergement individuel : la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour éviter que les souris ne s’arrachent mutuellement leurs implants, permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel les animaux implantés sont maintenus dans de grandes cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal isolé d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Lorsqu’un animal est implanté, pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture ne sera plus placée dans la mangeoire au niveau de la grille de la cage, mais sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une surveillance sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé.En cas de signe de douleur (échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central (SNC) développé. Il s’agit également d’un animal qui se prête aux modifications génomiques. Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. Il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de l’animal. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifie comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Etude pilote pour la réalisation d’approches thérapeutiques en neurologie chez la souris EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes au dernier tiers de la gestation sont opérées sous anesthésie pour une injection dans le cerveau de leurs embryons, d'autres souris recevant un vecteur viral. Cent souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet sert de test préliminaire pour sélectionner un sérotype de virus et une dose en vue d'un futur essai de thérapie génique, sans tester de traitement à ce stade. Le porteur indique qu'il n'y aura ni analyse statistique ni test de puissance, annonce deux souris par condition chirurgicale et trois par dose de virus, et ne précise pas comment ces chiffres aboutissent à un effectif de cent.
Objectifs
La connaissance des mécanismes impliqués dans le développement de réseaux neuronaux fonctionnels est essentielle pour comprendre l’origine des troubles du neurodéveloppement (TDNs), des atteintes du développement cognitif ou fonctionnel du cerveau ayant un impact important sur la vie des patients. Il est estimé que près d’une naissance sur 6 est concernée par un trouble du neurodéveloppement, et les options thérapeutiques restent dans la majorité des cas limitées. Ce projet, qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche translationnelle, conduit chez la souris, qui constitue des essais préliminaires à visée thérapeutique. D’abord, nous testerons les fonctions neuronales d'un gène identifié comme un régulateur du trafic de membranes intracellulaires. In vitro, ce gène a un effet sur la pousse neuronale, dont la prédiction serait qu'elle module la connectivité cérébrale. Dans le cadre d’une approche translationnelle, il a développé des molécules interférantes qui bloquent la fonction de ce gène in vitro. Nous testerons l'effet de ces molécules in vivo. Dans un second temps, nous ferons la mise au point de virus vecteurs pour un futur projet de thérapie génique. Notre objectif sera de tester des virus contrôle, afin de sélectionner le sérotype et la dose de virus adaptés à de futurs essais thérapeutiques. A terme, le sérotype de virus sélectionné nous permettra d’exprimer les molécules d’intérêt dans des populations de neurones ciblées.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces travaux permettront de comprendre les fonctions d’un gène impliqué dans le développement cérébral. Les outils développés dans ce projet seront la base d’études précliniques qui à terme pourront aboutir à la composition de thérapies ciblées pour le système nerveux.
Procédures
Dans l'EU1 : Les animaux inclus dans ce projet subiront entre une et trois injections d’analgésiques (durée contention/injection : 10 secondes par animal par injection). Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Des animaux subiront une injection d’un vecteur de thérapie génique, une seule fois, sous anesthésie. Dans l'EU2 : Certains animaux seront mis à mort par injection d'un fixateur, sous anesthésie et analgésie (durée 3 minutes).
Impact sur les animaux
Certains animaux subiront une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, qui peut entraîner une douleur le temps de la cicatrisation. Certains animaux subiront une injection au stade embryonnaire qui n'entraine aucune lésion ou nuisance chez les embryons à cet âge. Certains animaux recevront une injection de virus, une seule fois, qui entraînera un léger stress au moment de l’injection.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques
Remplacement
Ce projet a pour objectif de caractériser les changements de connectivité cérébrale lors de la modulation d'un gène dont les fonctions ont été étudiées au préalable in vitro. Il est à présent nécessaire de tester l’effet de ce gène in vivo afin de valider les conséquences sur le ciblage des connexions neuronales, qui ne peut être reproduit in vitro en raison de la complexité cérébrale et de la diversité des types neuronaux impliqués. Dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cortex cérébral et la mise en place des circuits neuronaux ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré. De même, nous souhaitons tester la distribution d’un virus pour la thérapie génique, ce qui ne peut être reproduit fidèlement in vitro (effet de la circulation et des barrières sang-cerveau, entre autres).
Réduction
Dans ce projet, nous limiterons le nombre d’animaux au strict minimum pour atteindre les résultats scientifiques et faire la preuve de concept de l’efficacité de nos approches en vue d’applications précliniques ultérieures. Il n’y aura pas d’analyse statistique et pas de test de puissance réalisé au préalable. Les chirurgies seront réalisées sur deux souris par condition, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de la reproductibilité des résultats sur deux expériences indépendantes. Les injections de virus seront réalisées sur des groupes de trois souris, ce qui est le nombre minimum pour nous assurer de résultats interprétables (en cas de variabilité d’un animal à l’autre). Nous commencerons par la dose la plus faible de virus, si celle-ci donne satisfaction, nous n’aurons pas besoin de réaliser la dose la plus importante.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur. Les mises à mort pourront se dérouler dans un autre EU, dans ce cas le transport des animaux est rapide puisque les deux établissements utilisateurs sont dans le même bâtiment. Les animaux seront placés dans une cage de transport adaptée et pris en charge immédiatement à leur arrivée afin de limiter le stress lié à un nouvel environnement. Les animaux seront traités individuellement, pendant que le reste de la portée sera isolée dans un portoir ventilé qui procure une isolation visuelle, acoustique et olfactive.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les outils moléculaires que nous allons tester sont adaptés à la souris. La chirurgie se fera chez des femelles au 3ème tiers de la gestation chez la souris, qui est le stade auquel le développement cérébral a lieu chez la souris. Cette procédure est parfaitement standardisée au laboratoire. L’injection de virus sera faite dans des animaux jeunes adultes, entre 8 et 14 semaines. Il n’est pas attendu d’incidence de l’âge sur la distribution des virus. Le stade jeune adulte correspond à une cible thérapeutique potentielle à terme pour les maladies neuropsychiatriques.
Étude de la libération prolongée de leuprolide à partir d’hydrogels implantables et de son effet sur les concentrations plasmatiques de testostérone chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
144 rats vont être utilisés, tous tués à cinquante-six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit un implant de gel sous la peau, puis onze ponctions de 200 microlitres de sang dans la veine de la queue et onze échographies, toutes sous anesthésie volatile, réparties sur ces cinquante-six jours. L'objet est de mesurer combien de temps un implant de leuprolide fait chuter la testostérone, dans la perspective d'un traitement humain espaçant des injections aujourd'hui mensuelles. Le porteur retient le rat comme "l'espèce animale la moins évoluée" de taille suffisante pour recevoir l'implant et fournir assez de sang.
Objectifs
Le leuprolide est un médicament utilisé chez l’homme pour agir sur les hormones. Il est notamment employé dans certaines maladies où il est utile de bloquer la production de testostérone (par exemple dans le cancer de la prostate) ou d’autres hormones sexuelles (dans l’endométriose ou les fibromes utérins). Actuellement, le traitement doit être administré sous forme d’injection environ toutes les quatre semaines. Les implants en gel représentent une nouvelle façon d’administrer ce type de médicament. Ils permettent de diffuser le produit de manière régulière et prolongée, sans avoir besoin de répéter les injections trop souvent. L’objectif de ce projet est de tester, chez le rat, l’efficacité d’implants en gel contenant du leuprolide. Leur capacité à diminuer la production de testostérone sera évaluer, ce qui permettra de mieux comprendre l’intérêt de cette approche avant d’envisager d’éventuelles applications médicales.
Bénéfices attendus
L'administration de leuprolide sous forme d'implants d'hydrogel chez l'homme, permettrait une libération prolongée du médicament, réduisant la fréquence des administrations et améliorant ainsi la qualité de vie du patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ponction de 200 uL de sang complet dans la veine caudale (11 fois réparties sur 56 jours) sous anesthésie volatile (durée environ 2min, 144 animaux au maximum). Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie volatile (environ 3 min, 144 animaux au maximum). Les animaux seront soumis à une anesthésie volatile pour l'imagerie par échographie (environ 5 min, 11 fois réparties sur 56 jours, 144 animaux au maximum).
Impact sur les animaux
Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : erythème de différents grades en fonction de la réponse, démangeaisons.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à 56 jours post implantation afin de prélever le site d'injection qui sera étudié lors d'analyses anatomopathologiques.
Remplacement
Les tests in vitro ont permis de réduire le nombre de composés à tester. Les informations de biocompatibilité et de réduction de la production de testostérone sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.
Réduction
Afin de limiter le nombre de lots expérimentaux et compte tenu que les expériences ne sont pas de classe sévère, des cohortes d’animaux pourront être utilisées pour répondre à plusieurs objectifs (informations sur la biocompatibilité, informations sur l’efficacité de réduction de production de téstostérone). Ce projet a déjà été accepté, ainsi les gestes sont bien maitrisés et dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Si, lors de la procédure 1, certaines combinaisons hydrogel/concentration présentent des interactions défavorables avec les tissus biologiques, elles ne seront pas retenues pour la procédure 2. Cela permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre de prélever le minimum de sang pour réaliser les dosages de testostérone et de leuprolide circulant. Les injections des implants d’hydrogel, l'imagerie ultrasonore et les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile). Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les injections. Parmi ceux-ci l’aspect de la peau, le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (analgésique, application de crème hydratante sur la peau), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Ce projet a déjà été accepté, ainsi les effets secondaires sont connus et pourront être anticipés plus rapidement. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.
Choix des espèces
Le rat est l’espece animale la moins evoluée et de taille suffisante pour permettre l'injection d'implants d'hydrogel et de prélever suffisement de sang afin de réaliser les dosages de testostérone et de leuprolide. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte (3 mois), afin que la production de testostérone soit maximale.
Thérapie oncolytique dans un modèle de glioblastome orthotopique chez la souris. Etude en imagerie TEP/TDMX
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant huit anesthésies gazeuses totalisant quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées dans le cerveau au cours d'une intervention de trente-cinq minutes, suivies de deux injections d'un virus modifié et de trois séances d'imagerie nucléaire avec produit radioactif. Le porteur retient la souris parce que sa petite taille permet de réduire les quantités de radioactivité injectées. Il annonce comme bénéfice attendu une régression tumorale sans perte de poids ni effet secondaire notable, alors que les nuisances listées dans le même document comprennent une perte de poids, une encéphalite induite par le virus et des troubles de l'équilibre.
Objectifs
Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes (tumeur cérébrale) repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales. L’objectif du projet est de montrer que l’utilisation de ce vecteur viral conduit à l’élimination ou la régression de tumeurs obtenues par l’injection des cellules tumorales directement dans le cerveau via une administration intraveineuse. Ceci représenterait une avancée importante pour le traitement des patients. Le suivi de l'effet théraputique ce traitement sera réalisés en imagerie nucléaire avec l'injection de molécules radio-actives ciblant spécifiquement la tumeur.
Bénéfices attendus
Le traitement standard du glioblastome en clinique n’a pas évolué depuis 2005 avec un taux de survie à 5 ans qui n’excède pas 5%. Il est donc indispensable d’améliorer la prise en charge de cette maladie. Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus testé (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable lors d'une administration systémique.
Procédures
Chaque animal sera sourmis à 1) 8 anesthésies gazeuses d'une durée de 3 à 30 minutes soit un total de 90 minutes sur la durée de l'étude, 2) une intervention chirurgicale (injection de cellules cancéreuses ) d'une durée de 35 minutes maximum, 3) 3 séances d'imagerie sous anesthésie d'une durée de 14 minutes chacune, 4) 2 injections de virus d'une durée de 4 minutes maximum
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection (72h maximum) , - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus, - trouble de l’équilibre induit par la tumeur grossissante
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.
Remplacement
Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus utilisés a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le virus non modifié n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus modifié permet une infection 210 fois plus sélective des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des 2 virus à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire
Réduction
L’imagerie TEP (Tomographie à Emission de Positon) est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.
Raffinement
Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie générale. Une analgésie pré et post opératoire est également administrée lors de la chirurgie. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.
Choix des espèces
Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 semaines conformément à la littérature et aux protocoles expérimentaux déjà réalisés dans les projets précédents pour valider l'efficacité de ces virus dans le traitement du glioblastome
Etude du rôle des récepteurs astrocytaires dans la mémoire.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une perte de poids de 5 à 12 % est planifiée et un score de souffrance égal ou supérieur à 7 déclenche la mise à mort : 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacune subit une chirurgie cérébrale avec implantation d'une lentille ou d'une fibre optique, puis reste isolée en cage pendant les tests. Quatre-vingts souris reçoivent des chocs électriques aux pattes lors d'un conditionnement de trace, cent autres passent douze jours consécutifs de labyrinthe à raison de quarante minutes par jour, sous restriction alimentaire. Le projet relève de la recherche fondamentale sur le rôle des astrocytes dans la mémoire, les retombées annoncées pour la maladie d'Alzheimer restant au conditionnel, tandis que le porteur écrit qu'il est "indispensable" de déterminer la contribution de ces récepteurs.
Objectifs
Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte, une cellule support des neurones, joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la transmission synaptique via la libération de transmetteurs. L’astrocyte est capable de réguler l’efficacité de la transmission synaptique lorsqu’un récepteur astrocytaire est activé. En retour cette cellule libère des transmetteurs qui pourraient jouer un rôle clé dans la mémoire. Dès lors, il est indispensable de déterminer la contribution des récepteurs astrocytaires dans la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 4 : - Chirurgie : les animaux seront anesthésiés durant toute la chirurgie (soit environ 30min par animal, ou 1h pour les études nécessitant l’implantation de la lentille ou de la canule optique). Les animaux subiront au total 2 injections (2min30 chacune). La totalité des animaux seront concernés, soit 180 animaux; - Implantation des lentilles ou fibres : 20min. Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux. La totalité des animaux est concernée, soit 180 animaux; - Test comportemental de conditionnement de trace : les animaux seront testés sur 3 jours consécutifs (8 minutes par jour). 80 animaux sont concernés; - Test comportemental en labyrinthe : les animaux seront testés pendant 12 jours consécutifs (environ 40min par jour de test). 100 animaux sont concernés par ce test comportemental.
Impact sur les animaux
Les effets stressants chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une privation alimentaire - une mise en cage individuelle pour les tests comportementaux - l'application de chocs électriques. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90 min après le début du test comportemental). Concernant les procédures chirurgicales, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Si tel est le cas, une injection d'antalgiques sera réalisée pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons un spray désinfectant et cicatrisant à base de cire d’abeille quotidiennement, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort. Concernant les chocs électriques, lors de la phase de conditionnement (un seul jour), l’animal ressentira une douleur peu intense et très brève au niveau de ses pattes suite aux chocs électriques. Après l’application de ces chocs, aucun autre effet indésirable n’est attendu. En effet, les diverses expériences réalisées précédemment ont montré qu’il n’y avait aucune augmentation de bagarres ou de comportements anormaux des animaux (prostration, freezing). Si au cours de l’expérience, les lentilles se détachent, ce qui arrive très rarement, l’animal sera aussitôt exclu de l’expérimentation et mis à mort. Si l’animal présente des signes de douleur suite aux chirurgies, nous injecterons immédiatement un antalgique pour calmer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.
Remplacement
Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires dans le contexte de la mémoire, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront classiquement hébergés dans des cages enrichies, en petits groupes sociaux de 8 individus. Ils auront accès à l’eau et nourriture ad libitum jusqu’au début des tâches comportementales. Les animaux seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée. Un changement de litière sera effectué une fois par semaine. Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux seront isolés dès le début de la restriction, et ce pendant toute la tâche comportementale, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux seront en restriction alimentaire et la quantité quotidienne de nourriture sera adaptée en fonction de leur poids. Leur perte de poids (5 à 12 % de leur poids de base) sera ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmentera la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoutera de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci sera considéré comme un point limite et l’animal sera mis à mort. Pour le test de conditionnement de trace, les animaux seront isolés 3 jours avant le début de la tâche, pendant une durée totale de 5 à 6 jours. Lors de l’isolement, un tube en carton sera rajouté dans la cage pour augmenter l’enrichissement. De plus, on vérifiera tous les jours que les cages avec des animaux seuls seront collées les unes aux autres pour augmenter les interactions olfactives et visuelles. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation). Au cours de l'expérimentation, si l'animal présente des signes de douleur, nous injecterons immédiatement un antalgique pour calmer la douleur. Les injections seront répétées si besoin toutes les 24h jusqu'à amélioration de l'état de l'animal. En revanche, si le score obtenu après évaluation de l'état de l'animal est égal ou supérieur à 7 (annexe 2), il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont les comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des cellules gliales dans la communication neuronale et les processus de mémoire. Enfin, la souris offre une possibilité plus grande de manipulations génétiques. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 16 à 20 semaines.
Etude d’innocuité et d’efficacité de molécules destinées au traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’AVC hémorragique chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
De la collagénase bactérienne est injectée dans le striatum de 1 188 rats pour provoquer une hémorragie cérébrale, au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes. Ces rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec IRM sous anesthésie jusqu'à six fois et batteries de tests sensorimoteurs répétées jusqu'au vingt-et-unième jour. Le porteur qualifie les déficits fonctionnels de légers à court et moyen terme tout en décrivant des pertes d'équilibre et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. À la fin, la cage thoracique de chaque animal est ouverte pour une ponction cardiaque, suivie d'une perfusion du cerveau avant prélèvement.
Objectifs
En clinique, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS) ou AVC hémorragiques, non traumatiques, résultent d'une irruption plus ou moins importante de sang dans le tissu cérébral faisant suite à la rupture d'un vaisseau cérébral. À ce jour, aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d'un hématome sur le parenchyme cérébral n'est disponible. L'objectif de ce projet préclinique longitudinal est de tester des stratégies thérapeutiques innovantes dans un modèle d'AVC hémorragique chez le rat afin d'étudier leur impact sur les volumes hémorragiques et lésionnels grâce à l’IRM, ainsi que sur la récupération fonctionnelle. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d'AVC hémorragique consistant en l'injection latéralisée de collagénase bactérienne dans le striatum. Cette chirurgie, bien documentée, reproduit fidèlement la physiopathologie de l'AVC hémorragique, permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. L'AVC sera induit sur des rats adultes d’environ 300 g (environ 8 semaines), chez des individus femelles et mâles, afin de reproduire la diversité clinique.
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie ne repose sur aucun traitement pharmacologique. Ainsi, il est indispensable depuis des décennies de développer des stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de l’AVC hémorragique. C’est l’objectif fondamental de ce projet qui consiste en l'exploration de diverses approches thérapeutiques, en employant différents modes d'administration distincts, afin d'évaluer leur incidence sur les aspects cruciaux de l’AVC explicités dans les paragraphes précédents. En cas de résultats défavorables, les différents tests thérapeutiques auront contribué à élargir le champ des connaissances scientifiques dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral hémorragique, offrant des enseignements précieux pour orienter de futures recherches et guider le développement de stratégies thérapeutiques novatrices. En présence de résultats encourageants, les molécules fournies par les partenaires industriels seront soumises à des essais cliniques, avec pour objectif ultime la mise sur le marché dans les années à venir. Ces résultats auront également un impact sur la communauté scientifique, stimulant la collaboration entre le secteur public et privé. Les résultats bénéfiques permettront non seulement d'offrir un nouvel espoir aux patients victimes d'AVC, mais également d'encourager la poursuite des travaux de recherche sur des axes thérapeutiques spécifiques. Cette collaboration renforcée entre public et privé favorisera un échange continu d'idées et d'expertise, créant ainsi un environnement propice à l'innovation et à la progression des connaissances dans le domaine. Pour finir, en obtenant l'approbation réglementaire, certaines des thérapies que nous souhaitons tester pourront donc bénéficier à un grand nombre de patients, marquant ainsi une avancée importante dans la prise en charge de l'AVC hémorragique.
Procédures
Les 1188 animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin d’injecter de la collagénase dans le cerveau des rats dans le but d’obtenir un AVC hémorragique. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 30 minutes. La pose d’un cathéter dans la veine de la queue sera nécessaire pour certains animaux afin d’administrer un traitement en intraveineux. La pose de cathéter à travers la peau prendra moins d’une minute. À J0, J1, J5, J7, J14 et J21 en fonction des sous-groupes, les animaux seront soumis à l'IRM sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 40 minutes. Tous les animaux ne passeront pas chaque jour. Les animaux passeront également une batterie de tests comportementaux ayant pour but de contrôler les déficits sensorimoteurs après AVC et la récupération fonctionnelle au cours du temps. Ces tests se dérouleront jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 ou J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, afin d’éviter que chaque animal ne participe à l'ensemble des jours d'acquisition et à l’ensemble des tests. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une ouverture de la cage thoracique pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales due à l’hématome et à l’œdème au niveau cortical et striatal. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Les tests comportementaux réalisés par du personnel entraîné ne sont pas destinés à induire de la souffrance animale, mais leur répétition fréquente au fil du temps peut engendrer du stress chez les animaux. Un animal trop stressé et incapable de réaliser un test particulier sera exclu de celui-ci. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation ou frais pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font du rat le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : des tunnels en carton et briques aspen, ainsi qu’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale conduisant à l’AVC hémorragique, l’animal sera et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée (entre 30 minutes et 1h avant) avant la première incision expérimentale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles proches du conduit auditif du rat, une anesthésie locale sera appliquée. De plus, chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage, d’une désinfection ainsi que de l’injection d’un anesthésiant local en sous-cutané. Les yeux de l’animal seront protégés avec du gel ophtalmique pendant toute la durée de la chirurgie. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Des injections d’analgésique seront réalisées dans les premières heures suivant la chirurgie (relais de l’injection pré-opératoire) puis le lendemain de la chirurgie afin de maintenir une couverture analgésique post-chirurgicale. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par injection léthale de pentobarbital. Enfin, une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivants l’opération.
Choix des espèces
Le rat (Rattus Norvegicus) occupe une place importante dans la recherche en neurosciences et plus particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prépondérance découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font du rat un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC hémorragique, l'utilisation du rat devient incontournable. En effet, il offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront adultes le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen d’environ 300 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponibles dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Effet de la température sur la spermatogenèse du médaka et transmission multigénérationnelle – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Cinq semaines à 32 °C pendant tout un cycle de spermatogenèse : 903 médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles sont anesthésiés, sortis de l'eau et pressés sur le ventre pour recueillir un à deux microlitres de sperme, opération répétée sur plusieurs générations. Les poissons exposés à la chaleur et leurs descendants sont tous tués, et parmi les témoins 214 seulement pourront être réutilisés, les autres étant tués pour prélever leurs testicules. Le médaka est retenu pour son court temps de génération et parce que son spermatozoïde à histones le rapproche des modèles mammifères, l'objectif étant de savoir si la chaleur modifie ce que le père transmet à sa descendance.
Objectifs
Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites «méthyle » (groupements CH3), constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. On appelle méthylome l'ensemble des groupes méthyle pour une cellule ou pour un tissu donné. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Dans un contexte de réchauffement climatique, ces résultats soulignent la nécessité de tester comment des variations épigénétiques du spermatozoïde induites par une augmentations de température peuvent impacter les performances des descendants de première (F1), voire puis seconde (F2) génération. L'objectif de ce projet est donc d'aborder le rôle de la méthylation de l'ADN dans la transmission paternelle inter et transgénérationnelle des effets de température chez le poisson. Pour ce type d'étude, l'espèce modèle médaka (Oryzias latipes) est parfaitement adaptée, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Notre première hypothèse de travail : le méthylome de l'ADN du sperme de médaka est sensible à la température d'élevage au cours de de la spermatogenèse. La deuxième hypothèse : le méthylome de l'ADN du sperme contribue au développement embryonnaire et adulte et module les phénotypes. La troisième hypothèse : les altérations du méthylome de l'ADN sont transmises de génération en génération à travers la ligné germinale mâle et persistent même lorsque les individus ne sont plus exposés à la température élevée.
Bénéfices attendus
Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaître les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.
Procédures
Les interventions prévues sont des prélèvements de sperme. Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela,après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 µL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Pour cette procédure, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.
Impact sur les animaux
Une première expérience a permis de déterminer la température et la durée d’exposition. La température d’exposition à 32°C pendant 5 semaines a été validée : les poissons médaka élevés à 32°C pendant un cycle de spermatogénèse présentent une forte diminution de la motilité des spermatozoïdes, mais néanmoins, les mâles testés étaient toujours capables de féconder des œufs et de produire une progéniture, (embryons éclos). D'après la littérature et nos premières observations, l'exposition à 32 °C pendant 5 semaines pendant la spermatogenèse ne produit pas de phénotype dommageable chez la descendance. De plus, aucun comportement de type pathologique n'a été observé après exposition à 32°C lors de notre expérience précédente. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergétique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.
Devenir
Les animaux élevés à 32°C et leurs descendants ne pourront être réutilisés. En effet nous suspectons que ce dispositif expérimental affecte un certain nombre de paramètres biologiques, dont l'épigénétique des poissons. Ils seront euthanasiés. Parmis les animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C), certains devront être euthanasiés afin de prélever leurs testicules pour des analayses moléculaires ou cellulaires. En revanche, 214 animaux contrôles ou issus de contrôles (élevés à 25°C) pourront être réutilisés après avoir participé au test de fécondance ou à la génération suivante (procédure ne nécessitant pas de prélèvement).
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus. En outre, nous organisons l'emploi des animaux et les méthodes de manière à réutiliser les animaux pour plusieurs approches : les femelles utilisées pour les tests de motilité du sperme seront également utilisées pour la génération des F1, les mâles analysés en motilité du sperme permettront également de réaliser les analyses moléculaires (méthylation ADN et transcriptomique), et les mâles étudiés au niveau histologique seront également testés pour la qualité mitochondriale de leur sperme.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’oeufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (moins de deux minutes par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).
Choix des espèces
Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 4.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois).