Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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Thérapeutique de la cystinurie à partir d’un modèle murin
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
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- Multisystémique
- Oncologie
Les souris qui n'ont pas le génotype recherché et les couples en fin de reproduction sont tués, comme les animaux entrés en procédure, dont les reins et le cœur sont prélevés après la mort. 2 043 souris vont être utilisées, 1 443 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 600 dans des procédures modérées. Ces souris forment spontanément des calculs de cystine, et 600 mâles subissent des recueils d'urine répétés jusqu'à treize fois, seize heures en cage métabolique sans nourriture, un gavage quotidien pendant deux semaines, pour certaines l'ablation d'un rein sous anesthésie. Le porteur précise que les animaux seront utilisés entre six et dix semaines, avant l'apparition vers six mois des calculs qui rendent leur état douloureux.
Objectifs
La cystinurie est une maladie génétique responsable de lithiase récidivante. La lithiase désigne la formation de calcul/concrétion solide dans les cavités rénales (dans les voies urinaires). Cette maladie touche près d'une personne sur 7000 mais représente la principale cause de lithiase génétique chez le sujet jeune et l'enfant. Cette maladie est causée par la mutation de transporteurs rénaux d'acides aminés (tel que la cystine) qui les empêche d'être réabsorbé de l'urine. La cystine se retrouve alors en quantité excessive dans l'urine et finit par précipiter sous forme de calculs urinaires (lithiase). L'obstruction causée par ce calcul est responsable de la crise de colique néphrétique. La répétition de ces crises de colique néphrétique peut conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères. La thérapeutique actuelle est insuffisante et repose essentiellement sur l'alcalinisation des urines, l'augmentation de la diurèse et sur l'utilisation de médicaments liant la cystine (D penicillamine, tiopronine) mais exposant les patients à des effets indésirables parfois sévères. Suite à l'apparition d'une mutation spontanée sur les transporteurs d'acide aminé urinaire dans un élevage, il existe un modèle murin présentant des lithiases de cystine comparables aux lithiases décrites chez l'homme. Cependant, elles ne font pas de colique néphrétique car les calculs se trouvent dans la vessie uniquement. Notre objectif est de prouver dans ce modèle murin, que l'alcalinisation urinaire est efficace dans la prévention des récidives de calculs cystinuriques et de déterminer quel traitement alcalinisant est le plus efficace.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce travail est de montrer que l'utilisation des nouveaux traitements peut permettre de réduire l'activité lithiasique chez les patients cystinuriques. Ces traitements pourraient permettre d'améliorer significativement la qualité de vie des patients cystinuriques et réduire le risque d'insuffisance rénale voire de mise en dialyse. Les procédures permettront de déterminer quel traitement est le plus efficace pour alcaliniser les urines, pour prévenir la précipitation de la cystine chez des souris sans dégradation de la fonction rénale et chez des souris rendues insuffisantes rénales.
Procédures
Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris cystinuriques. C’est-à-dire qu’elles forment spontanément des cristaux de cystines. L'accumulation de ces cristaux peut entraîner la venue de calculs urinaires conduisant au phénotype dommageable de ces souris. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 6-10 semaines, et les protocoles durant 4-6 semaines ou jusqu'à 3 mois, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Dans le cadre du génotypage d'une partie de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. Les animaux seront soumis à des recueils urinaires soit par émission spontanée d'urine (technique du spot urinaire qui ne dure que quelques secondes), soit par recueil en cage métabolique de 16h (1 seule fois pendant la procédure). Les spots urinaires seront répétés de façon hebdomadaire : une ou deux fois par semaine durant 4 ou 6 semaines ou 3 mois, soit respectivement 4, 6, 8 ou 13 fois. Ces recueils sont effectués sur animal vigile. Certains animaux seront soumis à une chirurgie rénale réalisée sous anesthésie générale associé à une analgésie pré et post-opératoire (néphrectomie, chirurgie durant 25min). Certains animaux seront soumis à un gavage (procédure réalisée sur animal vigile, ne durant que 10 secondes) de façon quotidienne pendant 2 semaines soit 14 fois. A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin sous anesthésie générale puis d’une euthanasie, suivie des prélèvements nécessaires aux différentes analyses (rein, cœur, ...).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux n'est pas dommageable avant un âge de plus de 6 mois, lorsque les calculs sont en nombre importants. Les expérimentations seront donc réalisées avant que ce phénotype apparaisse. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d'urine en cage métabolique, et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. Concernant la chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. De plus, la chirurgie peut induire des douleurs à l'animal provoquées par la procédure (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures), des complications liées à l'anesthésie chimique (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique), une altération de l'état général de l'animal tel que la perte de poids ou la déshydratation, un stress de l'animal lié à l'hébergement individuel et privation d'aliment pendant 16 heures.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire. Les animaux qui n'auront pas le génotype requis pour les procédures ainsi que les couples en fin de reproduction seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Remplacement
Une partie des données seront obtenues par des analyses in vitro. Nous étudierons ainsi la cinétique de dissolution des cristaux de cystine in vitro en alcalinisant des urines de patients jusqu'à la disparition des cristaux. Toutefois ces données seront insuffisantes pour mener à bien le projet. En effet, chez les patients et chez les souris, la quantité d'espèce alcaline excrétée dans l'urine n'est pas le reflet direct de la quantité apportée par voie orale. Autrement dit, même si nous montrons que l'alcalinisation directe des urines permet de réduire la précipitation de la cystine, il restera à prouver que l'apport d'alcalin par voie digestive peut effectivement faire varier favorablement le pH urinaire. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable
Réduction
Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle et grâce à un calcul de puissance permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux prévu est de 600 souris mâles de 6 à 10 semaines pour les procédure expérimentales. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d'animaux prévu est de 2043 pour l'élevage, incluant les 600 souris mâles utilisés pour l'expérimentation. La production et donc l’élevage des souris sera adapté aux besoins des différents protocoles. Les souris pourront être cryo-préserver s’il n’y a plus de procédure en cours.
Raffinement
Concernant l'hébergement, le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de différentes tailles permettant aux animaux de les décompacter, et grâce à des morceaux de bois à ronger. Les animaux sont observés quotidiennement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage, notamment au décours des cages métaboliques. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les animaux seront pesés chaque semaine. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de poids. Les gestes invasifs, à l'exception du gavage qui nécessite que l'animal soit vigile pour ne pas induire de fausse route, seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Tous les autres gestes comprenant le recueil d'urine ne sont pas invasifs. Les animaux seront habitués aux cages métaboliques et aux contentions pour le gavage.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est un modèle murin de cystinurie déjà existant suite à la survenue spontanée d'une mutation dans un transporteur rénal d'acide aminé. Ces souris sont viables, n'ont pas de phénotype dommageable dans les premières semaines de vie. Un élevage de ce modèle sera mis en place et constitué exclusivement d'animaux homozygotes pour la mutation et ne présentant pas de phénotype dommageable avant l’âge de 6 mois. Nous utiliserons des souris de 6-10 semaines, âge à partir duquel des cristaux sont analysables chez les souris mutantes, mais bien avant l'apparition d'un phénotype dommageable (lithiase urinaire) qui occure après 6 mois. Nous utilisons régulièrement le modèle in vivo murin et possèdons donc tous les outils nécessaires à l'élevage et l'utilisation de ce modèle.
Le développement des lymphocytes T régulateurs dans le thymus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Comprendre pourquoi les lymphocytes T régulateurs se développent mal dans le thymus de souris diabétiques : 195 souris vont être utilisées pour cela dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre jours, puis sont mis à mort pour analyse. Des souriceaux déficients pour le gène CTLA4 sont tués au plus tard à quatre jours de vie, avant l'apparition du phénotype pathologique qui se déclare vers deux semaines, et des fœtus de seize jours de gestation sont prélevés pour mettre des thymus en culture. Le porteur affirme ne pas s'attendre à des souffrances sur une durée aussi courte, annonce une surveillance quotidienne des souriceaux et prévoit la mise à mort au moindre signe.
Objectifs
Le système immunitaire nous protège contre les maladies infectieuses et du cancer. Afin de maintenir la santé de l'organisme, le système immunitaire doit être étroitement contrôlé par un sous-type des globules blancs qu'on trouve par exemple dans le sang. Ces "lymphocytes T régulateurs" ("Treg") suppriment en effet des réponses immunitaires "inadaptée", telles que celles impliquées dans les maladies autoimmunes (ex. le diabète de type I, la sclérose en plaques). Par conséquent, ces cellules ont un potentiel thérapeutique remarquable dans le cadre du cancer, les maladies auto-immunes, la transplantation, etc. Notre compréhension du développement des Tregs dans le thymus, un organe qui se trouve sur le coeur, est essentielle pour dévoiler d'éventuels défauts sous-jacent la susceptibilité à des maladies. Notre laboratoire a effectivement démontré des anomalies importants de ces cellules chez des souris qui développent le diabète de type I. L'objectif du projet est d'étudier les mécanismes qui en sont responsables.
Bénéfices attendus
L'identification des mécanismes impliqués dans le développement anormal des Treg dans le thymus et de l'implication probable de ce phénomène dans la susceptibilité à la pathologie, ouvrent la voie au développement de thérapies visant à corriger l'anomalie et ainsi de guérir la pathologie chez les humains. Des maladies qui pourraient être traitées seraient par exemple les maladies autoimmunes (diabète de type 1, la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde, ...) mais aussi le rejet de greffons et les allergies (ex. asthme).
Procédures
Le projet concerne la manipulation de l'expression de quatre gènes potentiellement d'intérêt par administration quotidienne par voie intra-péritonéale de produits pendant quatre jours après lesquels elles seront mises à mort pour analyse.
Impact sur les animaux
Dans la procédure N°1, on pourrait avoir des nuissances inhérentes à la gestation et l'allaitement des souris. Ces nuissances éventuelles seraient identiques à celles chez des souris wt, i.e. non-mutantes. Vu que les souris CTLA4-déficientes seront mises à mort à un maximum de 4 jours, elles ne présenteront pas encore le phénotype dommageable qui se développe à partir de deux semaines de vie. Dans la procédure N°2 des nuissances légères seront causées par l'acte de piqûre nécessaire à l'administration IP des produits. La manipulation des gènes d'intérêt ne provoquera pas d'effet nuisible.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organe
Remplacement
Le développement des lymphocytes T régulateurs dans le thymus est un processus très complexe et ne peut que très partiellement être remplacé par des cultures cellulaires. Or, dans ces cultures les cellules T d'intérêt (Treg) ne se développent pas.
Réduction
Une analyse profonde de la littérature nous permet de cibler nos expériences de façon optimale. Le nombre d'animaux utilisés pour l'expérimentation est réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Afin de permettre aux femelles gestantes de faire un nid, nous mettons un enrichissement approprié dans les cages. Même si nous ne nous attendons pas à induire/observer des souffrances sur une si courte durée (quatre jours) et si tôt dans la vie des souris, le personnel surveillera les souriceaux quotidiennement afin de détecter d'éventuelles souffrances le plus tôt et le mieux possible (posture anormale, abandon par la mère, ...). En cas de souffrance, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très similaire à celui des humains. Les souris se reproduisent rapidement et une littérature très vaste est disponible sur le développement des lymphocytes T chez cette espèce. La mutation étudiée est chez la souris. Notre recherche est, depuis 30 ans, totalement basée sur cette espèce et nous avons, par conséquent, une grande expérience dans ce domaine: de nombreuses approches expérimentales ont été développées et une gamme très importante d'anticorps et d'autres réactifs spécifiques d'espèce est disponible. Pour les cultures de thymus foetaux nous utilisons des foetus de 16 jours de gestation. Chez des foetus plus précoces il est difficile d'extraire le thymus, les thymus issus de foetus/souriceaux plus avancés dans leur développement sont difficiles à cultiver in vitro. Le phénotype que nous étudions est clairement visible précocement dans la vie des souris mais pas chez des adultes.
Effet d’un traitement préalable par l’halofuginone sur l’intégrité mitochondriale musculaire chez des souris lors de l’inactivité physique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Suspendues par l'arrière-train pendant trois jours pour que leurs pattes ne portent plus leur poids, 640 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles passent quatre semaines et demie seules en cage, reçoivent un gavage trois fois par semaine pendant trois semaines, puis une injection trente minutes avant la mise à mort. Le porteur veut savoir si l'halofuginone protège les mitochondries du muscle pendant l'inactivité, et décrit comme modérés les bouchons urinaires du début de suspension et la perte de poids d'environ 15 %. Sur le remplacement, il conclut que l'animal vivant est "la seule option possible", l'expérimentation sur des humains en situation d'inactivité étant selon lui éthiquement difficile.
Objectifs
Le muscle squelettique joue un rôle central dans le mouvement, le maintien de la posture, la thermorégulation et les processus de défenses contre les agressions. Maintenir la masse et la fonction musculaire est essentiel pour préserver l'autonomie, prévenir les blessures et favoriser une bonne qualité de vie, notamment avec l'âge ou en cas de maladie. Les mécanismes impliqués dans le maintien de la masse musculaire ont été beaucoup étudié avec l’identification de nombreux processus intracellulaires, dont le maintien de l’intégrité mitochondriale. Pourtant, à l’heure actuelle, il n’existe toujours pas de traitement pour lutter efficacement contre la perte de masse musculaire (atrophie) qui s’installe dans diverses situations physiologiques ou pathologiques. La lutte contre l’atrophie musculaire reste donc un enjeu majeur de santé publique. L’halofuginone est un composé dérivé d’une plante chinoise qui inhibe la fibrose et l'inflammation dans différentes pathologies musculaires et qui peut retarder l’atrophie musculaire induite par l'inactivité physique chez des souris ayant été préalablement traitées par l’halofuginone pendant 3 semaines. Le projet a pour but d’étudier les effets de l’halofuginone sur le maintien de l’intégrité mitochondriale dans le muscle lors de l'inactivité physique, notamment sur les aspects structuraux et métaboliques d’une part et sur les conséquences sur la fonction musculaire d’autre part.
Bénéfices attendus
L’halofuginone est une molécule utilisée dans des études cliniques (notamment dans le cadre du traitement de dystrophies musculaires, ou de la malaria…) et possède diverses propriétés. Son rôle potentiel sur la préservation de l’intégrité mitochondriale dans le muscle en situation d’atrophie n’est pas cependant pas documenté. Ce projet apportera donc des connaissances sur des mécanismes additionnels par lesquels l’halofuginone exerce ses effets bénéfiques sur la préservation de la masse musculaire, et pourrait donc permettre à terme d’élargir son utilisation en clinique humaine.
Procédures
4 types d'intervention: (1) Hebergement individuel : durée = 4,5 semaines. (2) Suspension anti-orthostatique : durée = 3 jours. (3) Gavages : 3 fois par semaine ; durée = 3 semaines. (4) injection : 1 seule fois. 30 min. avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
(1) Protocole de suspension anti-orthostatique (3 jours) : les animaux peuvent présenter des bouchons urinaires surtout au début de la suspension. Les animaux sont donc observés deux fois par jour pendant les 3 jours de suspension. Si un bouchon est observé, l’expérimentateur l’élimine à l’aide d’une compresse humide. La suspension des animaux entraine de fait un stress lié à la restriction de leur mobilité. Cependant, les effets sur la prise alimentaire et sur le poids corporel restent modérés avec une baisse de l’ordre de 15% les 2-3 premiers jours sont normalisés ensuite. (2) Administration par gavage (3 fois par semaine pendant 3 semaines) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention avec une irritation et/ou un incorfort. Les animaux seront observés quotidiennement pour évaluer tout comportement pouvant témoigner de douleur et la prise alimentaire mesurée tous les jours pour s'assurer qu'elle reste stable. (3) Injection (1 fois) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque protocole expérimental, les prélèvements nécessitant une procédure terminale sans réveil.
Remplacement
Les fontes musculaires lors de pathologies sont caractérisées par une atteinte simultanée de plusieurs tissus et/ou fonctions. Cette complexité des interactions entre tissus et organes n’existe que chez les animaux vivants. L’inactivité physique est impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples (culture de tissus ou de cellules, organoïdes). Enfin, les situations d’inactivité physique chez l’Homme sont retrouvées lors de maladies ou de grande fatigue rendant éthiquement difficile ce type d’expérimentation chez l’Homme. L’utilisation d’animaux vivants placés en situation d’inactivité physique est la seule option possible.
Réduction
Nous avons planifié le nombre d'animaux nécessaires afin de garantir une puissance statistique adéquate tout en anticipant les éventuelles exclusions de certaines souris. Les procédures seront chacune réalisées en 2 étapes. Un premier protocole expérimental sera réalisé avec un effectif de 10 animaux par groupe, puis répété pour valider les observations dans 2 expériences indépendantes. Ces protocoles ne seront répétés que si les données initiales le justifient, dans le but de limiter autant que possible le nombre de souris utilisées dans chaque procédure.
Raffinement
Les contraintes que les animaux subissent au cours des procédures seront prises en compte par la mise en place de différentes mesures : (i) aménagement du milieu est prévu notamment par des ouates de cellulose pour augmenter le bien-être des souris pendant l’expérimentation. (ii) suivi quotidien des souris pour identifier des signes de stress ou de souffrance, caractrisés par l'état du pelage, le comportement de la souris (agressivité/apathie), mobilité, alimentation... Le poids corporel et la prise alimentaire seront donc mesurés tous les jours. (iii) soins spécifiques pendant la période de suspension (elimination des bouchons urinaires) (iv) mise en place de points limites. En cas d'atteinte d'un point limite l'animal sera exclu des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Choix de l'espèce : Nous avons choisi d'utiliser des souris . La souris nous permet d'étudier les mécanismes par lesquels l'halofugionone permet de retarder l'atrophie musculaire lors de l'inactivité physique car cette espèce montre une bonne concordance avec l'atrophie musculaire observée chez l'homme en situation d'inactivité physique (bed rest, immobilisation), rendant les données obtenues particulièrement pertinentes pour une transposition potentielle des résultats. De plus, nous étudions ces phénomènes à un stade dé développement adulte pour s'affranchir des facteurs confondants liés à la croissance des animaux. Choix du stade de développement : Les souris seront matures âgées de 8-12 semaines, afin qu'elles soient matures d’un point de vue sexuel, ce qui permet d’éviter les modifications hormonales observées durant la croissance. De plus, la croissance musculaire est stabilisée ce qui permet d’observer les pertes de masse musculaire per se en réponse à la suspension, indépendamment d’un effet éventuel lié à un retard de croissance.
Etude d’un gène impliqué dans la régulation de la thermogenèse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
27 jours seules en cage, dont cinq jours à 14 °C après cinq jours à 30 °C : c'est le protocole imposé à des souris porteuses d'une mutation qui les rend résistantes à la prise de poids. 96 souris vont être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère. Le porteur qualifie pourtant ses mesures de non invasives et affirme qu'elles se font "sans impact négatif sur les animaux", ne retenant comme nuisances que l'isolement social et un stress physiologique transitoire au passage au froid. Toutes seront tuées pour les prélèvements.
Objectifs
L'obésité et le surpoids ont atteint des proportions épidémiques dans le monde, touchant 1,9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Des études montrent que l'immunité innée, activée par les bactéries du microbiote intestinal, joue un rôle clé dans ces troubles. Une nouvelle voie impliquant un récepteur a récemment été découverte. Des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l'obésité et au diabète de type 2. Pour mieux comprendre cette voie, une lignée de souris mutées a été développée. Ces souris prennent moins de poids sous régime riche en graisses et expriment davantage de gènes liés à la régulation de la température corporelle. Nous émettons donc l'hypothèse que ces souris ont une capacité adaptative accrue à un changement de température qui expliquerait leur phénotype de résistance à l'obésité. Cependant, l'effet de la température et du type de régime sur leur balance énergétique reste à étudier. Afin d'obtenir ces données, des mesures précises seront collectées de manière non invasive grâce à des cages de calorimétrie indirecte dans un environnement à température contrôlée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment le corps régule son équilibre énergétique et sa température, des processus essentiels dans le développement de l'obésité, un problème de santé majeur avec des conséquences médicales et socio-économiques importantes. En étudiant un récepteur dont les mutations sont associées à l'obésité et au diabète de type 2 chez l'homme, cette recherche pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques. L’analyse de souris mutées pour ce récepteur, résistantes à la prise de poids sous régime riche en graisses et présentant une activation accrue des gènes liés à la production de chaleur, permettra d'explorer l'impact des régimes alimentaires et des variations de température sur le métabolisme. Des mesures non invasives, comme la calorimétrie indirecte et l'imagerie thermique, fourniront des informations précises sur l’équilibre énergétique et la composition corporelle. Les résultats obtenus pourraient ouvrir la voie à des stratégies innovantes pour prévenir et traiter l'obésité et les troubles métaboliques associés.
Procédures
La mesure de la balance énergétique sera effectuée durant 20 jours et donc les animaux seront individualisés pendant 27 jours. La température d'hébergement variera entre 30°C (5 jours) et 14°C (5 Jours) avec une transition à 22°C (5 jours).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels liés à ce protocole concernent principalement l’hébergement individuel, les manipulations ponctuelles lors de l’analyse corporelle, ainsi que l’exposition à des températures non standard, en particulier en raison de l’alternance des conditions environnementales. Les animaux seront placés en cage individuelle, ce qui peut générer un stress modéré, notamment lié à l’absence d’interactions sociales. Ce stress est susceptible de persister tout au long de la période d’isolement, qui n’excèdera pas 27 jours. Enfin, les animaux seront soumis à une alternance de conditions environnementales : une phase à 30 °C (température de thermoneutralité) suivie, après une période de transition de cinq jours à 22 °C, d’une phase à 14 °C (froid modéré). Ce changement de température, nécessaire pour étudier les capacités adaptatives des souris, nécessitera une adaptation de la souris à ce nouvel environnement, il peut entraîner un stress physiologique transitoire, notamment lors du passage au froid.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est justifié, car il est impossible de modéliser in vitro ou in silico les interactions complexes entre le régime alimentaire, l’immunité innée, la dépense énergétique, la composition corporelle et l’effet de la température ambiante. L’étude du métabolisme énergétique et des comportements associés nécessite un organisme entier, où les tissus métaboliquement actifs coopèrent de manière intégrée pour réguler ces processus.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, cette étude combine l’analyse du comportement alimentaire, de la dépense énergétique, de la composition corporelle et des paramètres d’exposition à différentes températures sur les mêmes individus pendant 5 jours par palier. Douze souris par groupe expérimental sont nécessaires pour garantir des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité connue des paramètres mesurés. Les relevés métaboliques réalisés sur plusieurs jours réduisent cette variabilité intrinsèque et interindividuelle. De plus, les méthodes, non invasives utilisées, permettent d’obtenir des données précises sans impact négatif sur les animaux. L’évaluation des capacités adaptatives sera également optimisée par le changement de régime sur les mêmes souris. Enfin, des analyses statistiques adaptées permettront de maximiser la robustesse des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux requis.
Raffinement
Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. La mesure de la balance énergétique et de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. L’animal est hébergé dans une cage classique au sein des dispositifs de mesure de la dépense énergétique. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, avec un abri en plastique rouge, deux carrés de coton, et une nacelle pour construire leur nid. Les capteurs, encastrés dans le couvercle de la cage, ne perturbent pas l'animal. Les mesures de la balance énergétique sont effectuées automatiquement, de jour comme de nuit, sans intervention de l’opérateur. Une attention particulière est portée afin que les animaux aient suffisament de matériel de nidification pour s'adapter à la baisse de la température ambiante. Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole afin de détecter et signaler rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis. En cas d'anomalie comportementale et/ou de détérioration de l'état de santé des souris, le protocole sera interrompu.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour l’étude de la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. C’est également un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l’homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus. Enfin, la souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude des intéractions entre la réponse immunitaire et le métabolisme énergétique. Pour cette, les souris seront utilisées à l’âge adulte. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.
Etude du comportement et de l’activité cérébrale dans des modèles de souris pour l’étude d’un syndrome de retard mental d’origine génétique – EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris du projet subissent une biopsie de la queue avant le sevrage, un geste qui entraîne une douleur aiguë et un stress de contention. 1 282 souris vont être utilisées, 754 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 528 dans des procédures sévères, toutes tuées à l'issue, une partie par perfusion intracardiaque sous anesthésie terminale. L'objectif est de cartographier l'activité cérébrale de trois lignées porteuses de mutations liées aux troubles du neurodéveloppement et de mesurer leurs déficits de comportement. Quatre tests comportementaux sont annoncés par animal, qualifiés de non invasifs et non douloureux, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND) concernent près d’une naissance sur 10 dans les pays développés. Ils constituent un groupe hétérogène d’atteintes du développement du système nerveux qui regroupe des maladies souvent invalidantes et avec peu de perspectives thérapeutiques, tels que des syndromes de retard mental, ou des déficits musculo-squelettiques. Ce projet a pour finalité l’étude en parallèle de trois gènes impliqués dans les TNDs. Notre objectif est 1) d'étudier les déficits comportementaux dans une lignée de souris porteuse d'une mutation inactivant un de ces gènes, pour mimer la pathologie humaine, et 2) de réaliser une cartographie de l’activité cérébrale dans les souris modèles pour ces trois gènes, au moyen de marquages histologiques validés lors d'une étude préalable. Cela nous permettra d’identifier les convergences de mécanismes pathologiques dans trois modèles de TND et donc de mieux comprendre la pathologie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces travaux permettront dans un premier temps de mieux comprendre les fonctions des gènes de notre étude, ce qui renforcera la connaissance des liens entre des perturbations au niveau cellulaire et les altérations comportementales chez la souris. En particulier, ce projet sera la première étude visant à étudier en profondeur les altérations cérébrales liées à un nouveau gène associé aux troubles du neurodéveloppement, imitant ce qui se passe chez les patients atteints d'un syndrome de déficience intellectuelle et autisme. Cette étude permettra également de mieux comprendre les troubles du neurodéveloppement et d'améliorer le conseil génétique aux familles.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie avant le sevrage pour le génotypage (une seule fois, durée 1 minute environ). Les animaux seront soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux (4 tests prévus par animal, chaque test dure quelques minutes, les tests sont étalés sur plusieurs semaines). Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certains animaux subiront une procédure sans réveil, sous anesthésie générale, d’une durée de 5 minutes environ.
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une biopsie à la queue qui entraine une douleur aiguë et un stress au moment de la contention. Certains animaux reproducteurs pourront être isolés pour éviter les bagarres, entraînant un stress d’isolement social. Certains animaux seront soumis à des tests de comportement non invasifs mais qui entraînent un stress lié à la contention et la manipulation répétée. Certaines souris subiront une mise-à-mort par perfusion intra-cardiaque. Cette procédure est faite sous anesthésie gazeuse terminale, et est sans réveil.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser les altérations comportementales dans des modèles animaux mimant un trouble du neurodéveloppement d'origine génétique, et d’identifier des égions différentes du cerveau qui répondent de façon anormale à la stimulation. En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro validant notre hypothèse sur les gènes impliqués ce qui permet de nous assurer que l’étude est pertinente. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. Nos modèles permettent de réaliser des expériences qui ne peuvent pas être reproduites in vitro telles que des tests des fonctions cognitives ou du comportement social.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux et dans la mesure du possible pour que tous les génotypes puissent être utilisés dans les études ultérieures, soit dans le groupe expérimental, soit dans le groupe contrôle. Il y a toujours une possibilité que certains génotypes soient retrouvés en excès, dans ce cas les animaux pourront être utilisés pour maintenir la colonie ou pour d’autres projets avec les mêmes lignées. Nous pourrons utiliser certains animaux qui ont subi uniquement des tests de comportement non invasifs pour réaliser une autre procédure, complémentaire, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans les procédures est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été choisi par un test de puissance statistique sur la base de notre expérience préalable. Pour le test de sociabilité, utilisant en plus des congénères étrangers, nous aurons recours si possible à des animaux déjà présents dans l’animalerie, dans le but de ne pas utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
Le cerveau de la souris est très proche du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Les tests seront réalisés chez des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes. En effet, cet âge correspond à l’âge auquel nous avons préalablement identifié des altérations du comportement des souris dans d'autres lignées.
MOTORHEAD2 1/2
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Un à deux mois de restriction d'eau, la tête maintenue par une barre en titane vissée sur le crâne pendant des séances quotidiennes d'une heure : 750 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope où les virus ont été injectés. Toutes reçoivent une injection virale dans le cerveau, 250 une fenêtre crânienne, 500 un implant, puis sont transportées vers un second établissement. L'objet est fondamental, comprendre comment le cortex moteur secondaire arbitre entre exploiter ce que l'animal sait déjà et explorer autre chose. Le porteur décrit la pose de l'implant comme "non invasive et non douloureuse" tout en la réalisant sous anesthésie générale avec couverture antalgique.
Objectifs
La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un noeud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet qui se déroule dans deux établissements utilisateurs vise donc à éclairer le rôle du le cortex moteur secondaire pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.
Bénéfices attendus
Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants.Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux comme la schizophrénie, les troubles de l’attention et de l’hyperactivité et la depression. En conséquence, ces patients ont moins de flexibilité d’apprentissage, ils s’adaptent moins aux nouveaux environnements, utilisent des strategies habituelles et présentent une extinction plus rapide des apprentissages. Notre projet permet d’étudier ces paramètres chez l’animal lors d’une tâche comportementale pour comprendre le rôle des régions cérébrales impliquées.
Procédures
Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 semaines. Puis les animaux seront soumis à une chirurgie avec injection d’un virus puis pose d’une fenêtre crânienne ou pose d’un implant. Ces chirurgies se feront sous anesthésie, tous les animaux auront une injection de virus, 250 animaux auront une chirurgie avec pose d’une fenêtre crânienne et 500 animaux la pose d’un implant. Après 3 à 4 semaines de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 7 jours. Ensuite, les animaux auront une anesthésie pour permettre la pose d’une barre en titane nécessaire au comportement qui se fait en « tête restreinte», ils seront soumis à contrôle hydrique qui durera entre 1 et 2 mois. Pendant cette période, les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (7 jours), l’apprentissage (10 jours) et le contrôle (au minimum 1 mois). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 20 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront au maximum une session d’une heure par jour. Les chirurgies pour l'injection du virus puis la pose d'une fenêtre cranienne ou la pose d'un implant se feront dans le premier établissement utilisateur. La pose de la barre en titane, le contrôle hydrique ainsi que le comportement auront lieu dans le second établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux : ● Le risque de douleur durant la chirurgie● Le risque de douleur aiguë liée à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le contrôle hydrique ● Contention "tête restreinte"
Devenir
A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.
Remplacement
L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.
Réduction
La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certaines tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groups expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.
Raffinement
Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique grâce à la buprénorphine injectée avant et après la chirurgie. Une injection de Mélloxicam en sous cutanée sera réalisée après la chirurgie pour augmenter la durée de la couverture analgésique. La couverture antalgique agira dès le réveil de l’animal et sera maintenue avec une injection de Buprénorphine et de Méloxicam 24h post chirurgie. Si l’animal montre des signes de souffrance de nouvelles injections seront réalisées toutes les 24h. La procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase sombre, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après le contrôle hydrique. Les animaux sont transférés entre les deux EU qui sont situés dans le même bâtiments dans leurs cages d'hébergement avec des chariots spécifiques. Les cages sont placées dans des sacs en kraft pour les isoler de la lumière et de tout contact visuel. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’obésité et/ou diabète EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 300
Jeûnes répétés jusqu'à douze heures, six tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, 72 à 120 heures enfermés seuls en cage de calorimétrie : 600 souris et 300 rats vont subir ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modérée, tous tués ensuite pour prélèvement d'organes. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis reçoivent des molécules par gavage, par injection intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intradermique. Le porteur ramène l'effet de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité en cage. Le laboratoire est un organisme de recherche contractuelle qui teste ici les molécules de ses clients, et le résumé ne nomme ni les composés ni le nombre de prélèvements sanguins prévus.
Objectifs
Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé, qui, par l’ajout d’un établissement utilisateur (EU), devient multisite (EU 2/2 et EU 1/2).
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ) (EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.
Remplacement
Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.
Réduction
La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.
Raffinement
Les souris et les rats seront hébergés en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/12h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal. Le transport des souris entre les établissements se fera avec une société spécialisé, et se déroulera selon les mesures de raffinement suivantes: Personnel qualifié aux bonnes pratiques de manutention animale et de transport inter-établissements seront mobilisés.Distance du trajet maîtrisée : le transport couvrira une distance d’environ 9 km entre les établissements, ce trajet étant court pour minimiser le stress et la fatigue liés au déplacement.Conditions de transport optimisées : caisses homologuées dotées d’un environnement stable — aérées, obscurité partielle, température contrôlée. Enrichissement et confort : maintien des repères olfactifs grâce à une litière propre et du matériel de nidification issu de leur cage d’origine. Hydratation adaptée : dispositif d’accès à l’eau valide pour le transport (gel hydratant) pour éviter le jeûne prolongé. Minimisation de la durée : en plus d’une courte distance, le trajet sera rendu le plus rapide possible, y compris au niveau de la planification logistique (horaires, conditions de circulation). Suivi avant/après transport : observation systématique de l’état des animaux au départ et à l’arrivée pour détecter tout signe de désordre physiologique ou comportemental.
Choix des espèces
L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.
Développement d’une nouvelle méthode non invasive d’évaluation de la sensibilité colique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une distension nocive de la paroi intestinale, quatre fois de suite, vingt secondes à chaque fois : 112 souris vont subir cette série dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Douze d'entre elles reçoivent en plus des électrodes implantées dans l'abdomen sous anesthésie, vingt minutes d'opération, pour comparer la méthode existante à celle que le porteur veut mettre au point. Cette nouvelle méthode consiste à filmer la posture des souris pendant la distension, et le porteur la présente comme une avancée de raffinement. La distension reste infligée, décrite comme une source d'inconfort voire de douleur aiguë, et toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever des échantillons.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer une nouvelle technique d'évaluation de la sensibilité colique chez la souris de laboratoire. Les standards actuels font appel à des gestes chirurgicaux invasifs associés à des nuisances pour les animaux. Dans ce projet, nous souhaitons entrainer, valider et utiliser des algorithmes permettant d'évaluer la force des contractions abdominales en réponse à une stimulation de la paroi intestinale uniquement au moyen de l'enregistrement vidéo de la posture des animaux. Ce procédé, s'il est validé au cours de ce projet, s'intégrerait parfaitement dans une stratégie de raffinement pour l'étude de la sensibilité colique de l'animal de laboratoire.
Bénéfices attendus
Si cette nouvelle méthode de mesure apporte des résultats satisfaisants, les autres méthodes actuellement employées pourraient être remplacées par un protocole beaucoup moins invasif. Ce protocole d'étude pourrait par la suite permettre l'évaluation de candidats médicaments chez l'Homme pour le traitement de la douleur colique qui demeure, encore à l'heure actuelle, difficile à prendre en charge du fait de la faible efficacité des molécules actuellement disponibles et/ou des effets indésirables gastro-intestinaux associés aux antalgiques classiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une distension nocive de la paroi intestinale, procédé indispensable à l'étude de la sensibilité colique. Chaque lot d'animaux sera soumis à une série de 4 distensions coliques, chaque stimulation durant 20 secondes. De plus, afin de comparer cette nouvelle méthode d'étude aux standards actuellement employés, il sera nécessaire de réaliser des chirurgies d'implantation d'électrodes abdominales chez certains animaux. Douze animaux seront utilisés pour cette partie du projet et l'acte chirurgical dure une vingtaine de minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
L'implantation d'électrodes au niveau abdominal réalisée sous anesthésie générale, peut induire un stress chez l'animal au moment de l'induction de l'anesthésie. La distension colorectale, source d'inconfort voire de douleur aiguë pour les animaux, est nécessaire afin d'évaluer efficacement la sensibilité des animaux. Le modèle d'hypersensibilité proposé induit une inflammation transitoire de la paroi intestinale dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par les expérimentateurs.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures dans le but de collecter des échantillons biologiques afin de mettre en relation le niveau de sensibilité colique des animaux avec des marqueurs biochimiques et moléculaires de l'activation des voies nerveuses transmettant l'information douloureuse.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexes impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier que l’impact de ces traitements peut être évalué. En régle général, la sensation douloureuse fait intervenir des processus complexes et des interactions multiples entre différents grands systèmes de l'organisme qui sont impossibles à appréhender uniquement in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par le soin apporté à chaque expérience conjugué à plus de 15 ans de pratique dans le domaine d'étude de la sensibilité viscérale par le personnel du laboratoire limitant ainsi les pertes liées à l'acte chirurgical. Afin d'assurer la qualité scientifique du projet le nombre d'animaux sera calculé selon le test présentant la plus grande variabilité et qui est la mesure de la pression intracolique en réponse à la distension colorectale.
Raffinement
Afin de déceler l'apparition de souffrance ou de comportements anormaux, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si l'un des points limites mis en place est atteint pour un animal, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles). De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements structurels de type petite maisonnette ainsi que du coton pour la nidification. La manipulation des animaux sera réalisée selon les protocoles de contention "low stress" auxquels les personnels impliqués dans ce projet ont été récemment formés.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse développés pour cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés au cours de toutes les expérimentations. Il est impossible de réaliser des distensions colorectales sur des animaux plus jeunes au risque de léser la paroi intestinale.
Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Placées sur le dos et incapables de se retourner en moins de dix secondes, ou après avoir perdu 20 % de leur poids en 48 heures, les souris sont mises à mort. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 576 d'entre elles reçoivent une injection dans le cerveau à la naissance, puis une injection entre les plèvres vers 30 à 50 jours, avant une perfusion intracardiaque à 60, 90 ou 120 jours selon le stade de paralysie atteint. L'objectif est de compter les motoneurones du diaphragme après traitement par une protéine du virus Borna, pour savoir si la survie allongée déjà observée chez ces souris tient à ces neurones.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective et progressive des neurones cortico-spinaux (neurones du cortex moteur) et des motoneurones bulbaires et spinaux (neurones innervant les muscles). L’atteinte de ces neurones aboutit à raideurs musculaires involontaires et des faiblesses musculaires évoluant vers une paralysie complète du patient. Une insuffisance respiratoire entraine la mort du patient 3 à 5 ans après le diagnostic. Aucun traitement curatif n’existe à ce jour, seul le riluzole augmente l’espérance de vie des patients d’environ 90 jours. Parmi les nouvelles pistes thérapeutiques investiguées, une stratégie consiste à détourner une protéine virale à des fins neuroprotectrices. Cette protéine appelée protéine X est une petite protéine du virus Borna. Nous avons récemment montré l’intérêt thérapeutique de cette protéine dans un modèle murin de SLA (une souche de souris génétiquement modifié). Dans ce modèle, la phase symptomatique débute vers l’âge de 90 jours par une faiblesse des membres postérieurs et évoluant vers une paralysie des membres postérieurs. L’étude in vivo menée sur ces animaux a mis en évidence un rôle de préservation des capacités motrices de ces souris, une diminution de la neurodégénérescence des motoneurones de la moelle epinière lombaire et une augmentation de l’espérance de vie des souris. Afin de déterminer si l'augmentation de l'espérance de vie est due à une augmentation de la survie des motoneurones respiratoires nous proposons ici de marquer spécifiquement les motoneurones du diaphragme afin de les identifier et de les quantifier après traitement avec la protéine X.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l'augmentation de la survie des souris observée apres traitement avec la protéine X est lièe a une diminution de la dégénérescence des motoneurones innervant le diaphragme.Par consequent, ce projet permettra de montrer l’efficacité de la protéine X sur les capacités respiratoires des animaux et donnera des pistes thérapeutiques pour les patients qui meurent de déficience respiratoire. Par ailleurs l'effet du traitement sera egalement observé sur les capacites motrices des animaux .
Procédures
576 souris du projet seront soumises à 3 procédures chirurgicales : 1) Injection cérébrale (à la naissane) sous anesthésie générale , durée 10 minute par animal 2) Injection intrapleurale (entre 30 et 50 jours), sous anesthésie générale durée 30 min 3) Euthanasie pour prélevement d’échantillons à 3 stades symptomatiques (60 jours ; 90 jours ou 120 jours) durée de la perfusion 5 min . 24 souris du projet seront soumises à une injection intrapleurale à un âge compris entre 30 et 50 jours. Parmis ces 576 souris , 144 animaux effectueront des test moteurs au cours de la maladie afin d'évaluer les deficits moteurs.
Impact sur les animaux
1) Injection cérébrale : bien que cela soit très peu observé au cours de ces procédures, les nouveau-nés présentant une absence de poche de lait, une hypothermie ou peu de mobilité seront sacrifiés 2) Injection intra-diaphragmatique, si les souris développent une infection post-opératoire ou présentent un état létargique ou une perte de poids, les animaux seront traités en conséquence avec des traitements médicamenteux. La grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et determiner un sacrifice de l'animal si son état l'impose. 3) Perfusion intracardiaque : Concernant les animaux vivant jusqu'à des stades symptomatiques avancés (jusqu'à l’âge de 120 jours) : à partir des premiers signes de paralysie (membres posterieurs) les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée selon la grille d’évaluation), organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement naturel, évolution de la maladie, comportement provoqué, et changement de poids corporel. L’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités avec des doses de DietGel placées dans la cage. Le réflexe de retournement et le poids seront également determinés quotidiennement. Lorsque ces animaux placés sur le dos ne seront plus capables de se retourner en moins de 10s (score 4 - comportement provoqué) ou lorsque 20% de leur poids sera perdu en 48 heures, ils seront sacrifiés.
Devenir
Afin de préléver les tissus et de pouvoir identifier la survie des neurones respiratoires les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives telles que les cultures de lignées cellulaires ne permettent pas d’appréhender un système aussi complexe que le système moteur. Le recours à l’animal entier est déterminant dans les études précliniques, en effet, seule une approche intégrée peut rendre compte de l’efficacité de la molécule sur le retard de l’apparition et de la progression de la maladie ou encore sur la prolongation de la survie des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique. Ce nombre est par ailleurs à mettre en rapport avec le nombre de conditions et les différents stades de la maladie. La dégénérescence des motoneurones respiratoires sera d'abord confirmée pour chaque stade chez les animaux contrôles. Si la dégénérescence n'est pas révélée à des stades précoces par exemple (souris agées de 60 jours), l'effet du traitement sur ces stades ne sera pas étudié.
Raffinement
Une étude pilote sera réalisée sur une douzaine de souris anesthésiée afin de limiter la douleur en testant deux protocoles medicamendateux analgésiques pré et post-opératoire. Le protocole le plus adapté sera ensuite celui appliqué dans le projet. Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Une grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et déterminer une mise à mort de l'animal si son état l'impose.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisée est un modèle d’étude classique de la Sclérose Latérale Amyotrophique. Les injections des différentes constructions génétiques seront réalisées chez les souris à la naissance. Ces injections précoces augmenteront les chances de couvrir la fenêtre temporelle à laquelle la protéine du virus Borna aura potentiellement un effet. Les animaux recevront ensuite des injections dans le diaphragme entre 30 et 50 jours puis les expériences d’immunohistochimie seront réalisées chez des animaux adultes à 60, 90 ou 120 jours. Ces différentes périodes ont été choisi afin de suivre l’évolution de la maladie. 60 jours correspondent à un stade asymptomatique, 90 jours à un stade symptomatique débutant et 120 jours à un stade symptomatique avancé. Un groupe d'animaux servira egalement a suivre l'evolution des deficits moteurs au cours de la maladie et evaluer l'effet du traitrement sur ces symptomes moteurs .
Étudier le rôle des récepteurs immunitaires dans le développement des cellules souches sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
2 580 poissons zèbres vont être utilisés pour fabriquer six lignées génétiquement modifiées, 430 individus par lignée dont 30 seulement seront gardés au terme de la sélection. Les autres sont tués. Le génotypage passe par la coupe d'un morceau de nageoire, et le porteur envisage des conséquences allant de légères à graves : nage, alimentation ou respiration anormales, saignements, ulcères, inflammations. 840 poissons subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 740 un niveau léger. Les 180 poissons gardés en vie ne seront pas relâchés, ils resteront dans l'élevage pour entretenir les lignées.
Objectifs
Notre corps produit les cellules sanguines grâce à un processus appelé hématopoïèse. Tout commence avec des cellules très particulières : les cellules souches sanguines. Comprendre comment ces cellules se développent dès le début de la vie est essentiel pour progresser dans la recherche sur les maladies du sang. Des études ont montré que certains capteurs immunitaires jouent un rôle important dans ce développement. Ces capteurs fonctionnent de la même façon chez le poisson zèbre, la souris… et probablement aussi chez l’être humain. C’est pourquoi nous créons des poissons zèbres dont ces capteurs immunitaires sont modifiés. Cela nous aide à mieux comprendre leur rôle et à avancer dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
En effectuant deux étapes de sélection, ainsi que trois cycles de reproduction, nous serons en mesure de créer six lignées stables de poissons modifiés par des capteurs immunitaires d'ici la fin du projet. Une fois ces lignées de poissons prêtes, nous pourrons poursuivre les expériences pour étudier comment ces capteurs affectent le processus de fabrication des cellules sanguines, sans ajouter d'autres modifications génétiques aux animaux. Nous espérons que cela nous aidera à mieux comprendre comment les cellules sanguines sont fabriquées et comment cela pourrait aider à traiter les maladies du sang.
Procédures
La biopsie sera réalisée avec un temps opératoire de 5 minutes maximum, et le poisson sera placé dans un aquarium isolé pendant un maximum d’une journée afin d’obtenir les résultats du génotypage.
Impact sur les animaux
Lors de la création d'un nouvel animal transgénique ou lors d'une procédure invasive telle que la coupe des nageoires pour le génotypage, nous envisageons toutes les conséquences possibles, de légères à graves, y compris un comportement anormal en matière de natation, d'alimentation ou de respiration, une modification de la morphologie, des saignements, des ulcères ou des inflammations, qui sont des signes de stress.
Devenir
Pour chaque lignée, un total de 430 poissons sera utilisé pour les processus de sélection. Après 2 tours de sélection et 3 générations , seuls 30 poissons seront conservés pour maintenir la stabilité de la lignée, tandis que les autres seront mis à mort. Avec un total de 6 lignes de poissons, nous avons 30 x 6 = 180 poissons qui seront conservés à la fin du projet. Ils seront utilisés pour entretenir la ligne de pêche.
Remplacement
Nous voulons étudier le processus de formation des cellules souches hématopoïétiques au cours du développement embryonnaire. Il n’existe pas de système in vitro approprié pour cette étude intégrative. De plus, le poisson-zèbre s’avère être un très bon modèle vertébré pour étudier le processus d’hématopoïèse
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé sur la base du nombre minimum de poissons transgéniques réussis requis pour l'étude. Pour mener l'expérience avec 6 lignées de poissons transgéniques, au moins 30 poissons transgéniques par lignée doivent être utilisés pour poursuivre l'expérience avec leur progéniture.
Raffinement
Le poisson zèbre aime vivre en groupe. C’est pourquoi nous les gardons par groupes de 10 poissons par litre d’eau, afin qu’ils se sentent en sécurité et moins stressés. Nous prenons soin de leur environnement pour qu’il ressemble à ce qu’ils vivraient dans la nature. Par exemple, la lumière s’allume et s’éteint lentement, comme un lever ou un coucher de soleil. Chaque jour, ils reçoivent une nourriture vivante et équilibrée, pour rester en bonne santé et se comporter naturellement. Des personnes formées contrôlent les poissons tous les jours. Leur état de santé est évalué grâce à un système de notation allant de 0 (poisson en pleine forme) à 3 (problème grave). On observe leur façon de nager, de manger, de respirer, ainsi que tout signe de stress. Ce même système est utilisé pour suivre leur rétablissement après certains soins, comme lorsqu’un petit morceau de nageoire est retiré pour une étude
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal très utile pour étudier comment se forment les cellules du sang. En effet, son corps fabrique ces cellules de la même manière que chez l’être humain. Les gènes et les mécanismes responsables de cette production sont presque identiques. Ce petit poisson peut aussi développer des maladies du sang similaires à celles de l’homme, comme l’anémie ou la leucémie. Cela permet aux scientifiques d’étudier ces maladies plus facilement et de tester de nouveaux traitements.
Evaluation de nanothérapies dans un modèle de tumeur pulmonaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dépourvues de système immunitaire fonctionnel, des souris nude sont utilisées pour qu'elles acceptent une lignée de cancer du poumon humain. 1 008 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements et dosages. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le poumon gauche sous anesthésie, puis jusqu'à dix séances d'imagerie de trente minutes espacées d'une semaine, et pour certaines deux à trois anesthésies supplémentaires pour la nébulisation des nanothérapies. Le porteur ramène les effets indésirables attendus au stress des manipulations, qu'il juge comparable à celui d'un change de cage, sans revenir sur la tumeur pulmonaire qui se développe pendant ces dix semaines.
Objectifs
Avec presque 30000 décès par an en France, le cancer du poumon est le cancer le plus mortel. Les options thérapeutiques actuelles ne sont pas encore optimales et nécessitent de proposer de nouvelles options. Notre objectif est donc d’évaluer dans un modèle murin de tumeurs pulmonaires de nouveaux nanosystèmes permettant l’administration optimisée de chimiothérapies par adressage avec des peptides ayant une action positive sur la pénétration intracellulaire des vecteurs.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est de documenter l’apport de nanovecteurs porteur de peptides pénétrant sur la limitation de la croissance de tumeurs pulmonaire implantées chez la souris.
Procédures
Tous les animaux de cette étude recevront une injection de cellules tumorales au niveau du poumon gauche. Ce geste sera réalisé sous anesthésie qui ne durera pas plus de 5 minutes. Pour les animaux traités par nébulisation ou par injection intraveineuse, 2 ou 3 anesthésies gazeuses supplémentaires, d’une durée de 10 min maximum seront réalisées. Concernant les imageries, elles seront également réalisées sous anesthésie et seront au nombre de 10 maximum, espacées d'une semaine, et d'une durée maximale de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés au stress induit par les manutentions lors de la piqure pour l’injection des cellules tumorales, de la nébulisation des thérapies ou du contrôle IRM. Le niveau de stress généré par ces gestes sera comparable à celui induit par les changes.
Devenir
A la fin de chacune des procédures les animaux sont euthanasiés pour prélèvements et dosages.
Remplacement
Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les nanothérapies que nous allons évaluer. Les objectifs du projet étant d’évaluer leur efficacité thérapeutique dans un contexte complexe où le devenir des nanomédicaments peut être impacté par le microenvironnement de l’hôte, l’utilisation d’animaux est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante pour valider les résultats expérimentaux.
Raffinement
Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie (système de chauffage asservi à la température rectale) pendant toutes les procédures avec une attention particulière lors des examens IRM - où un accès visuel à l'animal n'est pas possible – par un suivi complémentaire du rythme respiratoire afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Afin de réduire l’inconfort de l’animal un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué à chaque phase des protocoles.
Choix des espèces
La lignée tumorale de cancer du poumon étant humaine, des souris nude (mâle et femelle) seront utilisées, cette espèce est retenue car le modèle ainsi obtenu est un modèle de référence. Les animaux inclus dans l’étude sont des animaux adultes âgés de 8-10 semaines ayant attient la maturité sexuelle.
Isolement de cellules stellaires et d’hépatocytes à partir de foie de souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Prises parmi les animaux de réforme de l'animalerie, 250 souris vont être opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. Chaque intervention dure quinze à vingt-cinq minutes : ouverture de l'abdomen, puis perfusion du foie avec des solutions enzymatiques pour en détacher les cellules. Le porteur cherche à isoler des cellules stellaires et des hépatocytes vivants, destinés à tester en culture des molécules contre la fibrose du foie avant tout essai sur animal entier. La mort survient au cours de la procédure elle-même, par l'ouverture de l'abdomen et l'exsanguination liée au lavage du foie.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de récupérer des cellules primaires (stellaires et hépatocytes) à partir de foies de souris. Ces cellules sont impliquées dans le développement de tissu cicatriciel dans le foie, une complication fréquente des maladies chroniques du foie comme la MASLD. Elles seront utilisées pour évaluer les effets de vésicules extracellualire d’origine bactérienne sur le développement de la maladie et tester l’efficacité de nouvelles molécules en culture cellulaire, avant d’envisager des essais sur l’animal entier. Cela permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de préparer le développement de futurs traitements.
Bénéfices attendus
L’utilisation de cellules primaires (directement isolées du foie) permet une évaluation plus fiable et pertinente que les lignées cellulaires immortalisées, souvent utilisées en laboratoire mais altérées sur le plan génétique et fonctionnel. Ces cellules serviront notamment à réaliser un premier tri des molécules thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, puis une chirurgie sera pratiquée pour accéder au foie. Une perfusion de solutions enzymatiques permettra de détacher les cellules. La mise à mort est réalisée à la suite de la procédure, sans réveil. La durée prévue de cette procédure est de 15 à 25 minutes
Impact sur les animaux
La procédure inclut une anesthésie générale, une laparotomie (ouverture de l’abdomen), une perfusion hépatique. Les douleurs liées à la chirurgie sont anticipées par l’administration d’analgésiques avant l’intervention.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en cours de la procédure, du fait de la réalisation d'une laparotomie et de l'exanguination du au lavage du foie et la récupération du foie.
Remplacement
À ce jour, il n’est pas possible d’obtenir des cellules stellaires et hépatocytaires primaires autrement qu’à partir de tissus hépatiques frais. Les modèles in vitro existants (cellules immortalisées ou cultures artificielles) ne permettent pas de reproduire fidèlement les fonctions et réponses de ces cellules. L’extraction directe reste donc indispensable pour les objectifs scientifiques de ces projets.
Réduction
Seules des souris de réforme issues de l’animalerie seront utilisées, ce qui évite l’élevage d’animaux supplémentaires. La méthode d’extraction choisie permet un rendement cellulaire élevé à partir de peu d’animaux, limitant le recours à des prélèvements multiples. Par ailleurs, le recours à des phases de test en culture cellulaire en amont des essais in vivo permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à moyen terme.
Raffinement
La douleur et le stress sont pris en charge à chaque étape : analgésie préventive, anesthésie générale, anesthésie locale aux points d’incision. La procédure est courte, réalisée par du personnel expérimenté. Les souris sont hébergées en groupe, dans un environnement enrichi (cabanes, papier, tubes…), respectant les besoins comportementaux de l’espèce.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence pour l’étude des maladies du foie, en raison de ses similarités physiopathologiques avec l’humain. Les animaux utilisés seront des souris adultes de plus de 12 semaines, issues des lots de réforme de l’animalerie. Ce choix permet de disposer de foies matures tout en valorisant des animaux qui ne sont utilisés dans d’autres projets.