Recherche fondamentale

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs organes, chacune portant sur le dos une capsule où se nourrissent jusqu'à trente tiques. Elles reçoivent neuf gavages, puis trois à quatre prélèvements sanguins dont certains par ponction du sinus de l'œil, et passent cinq jours isolées en cage individuelle pour que leurs congénères ne mangent pas les tiques. Une partie d'entre elles est génétiquement modifiée pour ne pas produire le sucre alpha-Gal, molécule sur laquelle repose la piste vaccinale testée contre la maladie de Lyme. Le porteur explique qu'il faut cinq souris par groupe parce que la plupart des tiques se détachent ou meurent avant d'avoir fini leur repas, cinq à dix seulement arrivant gorgées par animal.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de tester une stratégie visant à protéger contre la maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia, transmise par les tiques. Cette approche consiste à administrer des bactéries non pathogènes (comme E. coli) modifiées pour exprimer une molécule appelée α-gal (un type de sucre). L'objectif est d'induire la production d'anticorps spécifiques contre α-gal, qui pourraient aider à prévenir l'infection par Borrelia. Les étapes spécifiques du projet sont les suivantes : Induction d'anticorps anti-α-gal : En administrant oralement ces bactéries aux animaux, nous espérons stimuler la production d'anticorps spécifiques (IgM et IgG) contre α-gal. Évaluation de la réponse immunitaire et de la protection contre l'infection : Nous mesurerons si la réponse immunitaire induite permet de réduire la charge de Borrelia dans les tiques parasitant les animaux immunisés. Analyse de la charge bactérienne de Borrelia : Après infestation par des tiques infectées, nous analyserons la présence de Borrelia dans les tiques et dans divers tissus des animaux immunisés. Étude de la mortalité et du comportement des tiques : Nous observerons le comportement alimentaire des tiques et leur taux de mortalité afin d'évaluer si l'immunisation a un impact sur leur cycle de vie. Ce projet vise à déterminer si cette méthode peut non seulement protéger contre l'infection, mais également avoir un effet sur les tiques elles-mêmes

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris seront immunisées par voie orale. Elles recevront 9 administrations et subiront un maximum de 3 prélèvements sanguins. Aux jours 0, 14, 30 et 51, des prélèvements sanguins seront effectués par ponction du sinus, en alternant les côtés à chaque fois, sous anesthésie locale et générale. Une ponction dure 8 minutes, anesthésie comprise. L'administration des probiotiques se fera par gavage. Cette méthode sera appliquée pendant 3 jours consécutifs, avec une pause de 5 jours entre chaque session, sur une période de 3 semaines, soit un total de 3 cycles (une fois par semaine). Chaque gavage durera entre 3 et 5 minutes, anesthésie comprise. Les jours 0,14 et 30 après l’administration orale, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; ce prélèvement durera environ 8 minutes, anesthésie comprise. Le prélèvement du jour 14 permettra de suivre la production normale des anticorps induits par l’immunisation. Le jour 51, après la dernière administration orale, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie générale. Après la fixation des capsules, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une durée de 5 jours. Elles bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement que dans les cages collectives. Et afin d’atténuer les effets de l’isolement, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés pour favoriser leur bien-être

Impact sur les animaux

Les tiques sont placées sur le dos des souris au sein d'une capsule. Les souris peuvent se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. les rongeurs sont un réservoir naturel de Borrelia spp, ce qui signifie qu'ils peuvent porter l'infection sans montrer de symptômes graves ou évidents, contribuant ainsi à la transmission de la bactérie par les tiques. D'autre part, l'immunisation peut causer une inflammation et une douleur au site d'injection, ou des réactions allergiques. Le prélèvement sanguin peut provoquer du stress lié à la manipulation ou de la douleur. Pour minimiser ces effets, les procédures sont effectuées sous anesthésie et un suivi constant est assuré afin de détecter tout symptôme indésirable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l’effet protecteur des anticorps anti-α-gal contre Borrelia, en nourrissant des tiques sur des souris immunisées oralement avec différentes souches non pathogènes d'E. coli exprimant α-gal sur leur membrane. Les objectifs incluent l’évaluation de la survie des tiques et de la transmission de Borrelia, par ces dernières. Actuellement, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire avec précision la réponse immunitaire induite par voie orale chez les souris en réponse à une infection bactérienne. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal est essentiel pour analyser l’effet protecteur des anticorps et la colonisation des tiques par Borrelia.

Réduction

Chaque souris peut nourrir jusqu'à 30 tiques, mais entre 20 et 25 tiques se détachent sans avoir terminé leur repas ou meurent. En moyenne, nous pouvons obtenir 5 à 10 tiques gorgées par souris. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser 5 souris par groupe pour obtenir entre 25 et 50 tiques gorgées, ce qui est le nombre requis pour nos analyses. Le nombre total d'animaux a été calculé afin de minimiser leur utilisation tout en garantissant le nombre de tiques gorgées nécessaire à la réalisation des analyses.

Raffinement

Les souris seront logées par groupes de 5 dans des conditions standards, avec l'enrichissement nécessaire à leur bien-être, notamment des carrés de coton et des maisons en plastique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter d’éventuels signes cliniques. Lorsque les souris porteront des capsules sur le dos pour nourrir les tiques, elles seront placées en cages individuelles, car elles pourraient retirer les capsules des autres souris ou manger les tiques. Malgré leur isolement, elles bénéficieront des mêmes conditions d'hébergement, avec les enrichissements nécessaires pour leur bien-être. Pour les souris hébergées en cages individuelles des mesures seront prises le temps de leur hébergement individuel afin de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter l'apparition d'éventuels signes cliniques. Des points limites ont été défini pour décider de la mise à mort des animaux en cas d'atteinte sévère de leur état de santé. Par ailleurs afin de limiter la douleur et l'anxiété des souris des protocoles d'anesthésie sont prévus pour certains actes pouvant engendrer une anxiété ou une souffrance.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui ne produisent pas le sucre α-Gal ; elles peuvent toutefois produire des anticorps spécifiques contre celui-ci. Ces lignées sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Nous utiliserons également des souris non modifiées génétiquement. Elles seront utilisées comme groupe contrôle pour comparer les résultats avec ceux des souris génétiquement modifiées et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge. Ce stade de développement (7 à 8 semaines) correspond à une maturité immunologique optimale chez la souris, ce qui est essentiel pour évaluer efficacement la réponse immunitaire induite par l’immunisation avec l’α-Gal. Il s’agit également d’un âge standard dans les modèles d’infection par Borrelia, permettant la comparaison avec des études antérieures et garantissant la reproductibilité des résultats. Par ailleurs les souris âgées de 7 à 8 semaines sont des souris adultes ce qui facilite les actes de prélèvements sanguins car elles sont plus grosses.

Tuées à l'issue du protocole pour qu'on leur prélève des tissus musculaires, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont nourries dès l'âge de six semaines et jusqu'à trente semaines avec un régime enrichi en graisse et en sucre, puis reçoivent des injections sous-cutanées, jusqu'à trois par semaine pendant six semaines, avec pesées répétées. Le porteur indique que ce régime provoque obésité, diabète et stéatose hépatique, troubles qui peuvent engendrer de la douleur, et cherche à savoir si un antidiabétique fait perdre aux souris de la force et de la masse musculaires. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études et que "seule l'expérimentation animale" permet ce suivi.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérées comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline et au diabète de type 2. L'hypothèse générale est que l'augmentation des niveaux de tissu adipeux entraîne des changements fondamentaux dans la composition et la fonction des fibres musculaires, qui à leur tour conduisent à une altération de la fonction métabolique. L'obésité est un ensemble d'altérations métaboliques associées à la sédentarité et à la redistribution du tissu adipeux qui précèdent le diabète de type 2. La résistance à l'insuline du muscle est une altération métabolique majeure associée à l'obésité et au syndrome métabolique. En effet, le muscle est le principal tissu responsable de l'élimination du glucose stimulée par l'insuline. Les muscles squelettiques jouent ainsi un rôle important dans ce syndrome et sont des régulateurs de la masse corporelle totale et également de la consommation d'énergie des muscles. Pour traiter le diabète et l'obséité, de nouveaux traitements existent en modulant la satiété et la régulation du glucose. Ces molécules peuvent avoir de multiples rôles et ainsi influer sur la masse et la fonction des muscles. L'objectif de cette étude est de déterminer chez la souris obèse l'effet d'un traitement aigu ou chronique aux molécules antidiabétiques ou anorexigènes sur la fonction et la masse musculaire.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est de déterminer si un traitement aigu ou chronique à base de molécules thérapeutiques destinées à traiter le diabète ou à contrôler la prise de poids chez la souris obèse a un effet sur la fonction et la masse musculaire. On peut ainsi s'attendre à ce que ce type de molécule induise une diminution de la force musculaire associée à une perte de masse musculaire. La mise en évidence de ce problème serait primordiale pour le patient obèse traité par cette molécule car il serait alors possible de mettre en place une action préventive telle qu'un programme d'activité physique adapté pour renforcement musculaire.

Procédures

Les animaux sont nourris à partir de l'âge de 6 semaines chez le fournisseur avec un régime riche en graisse et sucre puis tout au long du protocole. Il y a une étude aigue où l'animal reçoit une injection sous-cutanée et sera pesé chaque jour pendant 3 jours. Dans une deuxième étude, l'animal reçoit trois injections sous-cutanées par semaine et sera pesé trois fois par semaine pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 30 semaines d’âge au maximum) avec des régimes enrichis en graisse et en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les pesées peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère au moment de l'injection.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissus musculaires.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse pathophysiologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et musculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé en fonction de la littérature et à l’aide d'un logiciel d'analyse statistique. Il est ainsi nécessaire d’inclure 10 animaux par groupe en tenant compte du risque d'échec à la dissection et aux mesures de contractilité musculaire. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. Nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel et la prise alimentaire seront mesurés afin de s'assurer de leur bien-être 3 fois par semaine pour le protocole long. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge. Des soins tels que l'hydratation et la mise en place de nourriture dans la litière, si nécessaire, seront effectués.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal parfaitement caractérisé et validé pour l'étude du diabète, de l'obésité et de la dysfonction musculaire, par la communauté scientifique en général et par notre laboratoire. Les animaux sont traités avec un régime riche en gras et sucre à partir de 6 semaines d’âge, pendant 16 semaines, chez le fournisseur afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique). Ils arriveront au laboratoire à l'âge de 22 semaines. Les tests démarrent 2 semaines après, soit au stade adulte, pour une durée de 3 jours ou de 6 semaines.

Pour étudier comment le stress rend certaines souris vulnérables à l'anxiété, un lot est immobilisé jusqu'à deux heures par jour pendant six jours, à trente jours de vie puis une seconde fois à l'âge adulte. 1 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses du cerveau. Un second volet porte sur la démence liée à l'âge, avec des injections dans l'abdomen, quotidiennes pendant deux semaines, puis des tests comportementaux que le porteur décrit comme sans douleur ni stress. Les souris dont le score dépasse 6 sur la grille d'évaluation sont sorties du protocole.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment le vieillissement et l’anxiété peuvent modifier le fonctionnement des cellules du cerveau, en particulier les neurones. L’anxiété touche près de 20% de la population française. Comprendre ses mécanismes au niveau cérébral est crucial pour améliorer son diagnostic et son traitement. De récentes études ont montré qu’un stress peut rendre certaines souris plus vulnérables à l’anxiété en modifiant l’activité de circuits cérébraux bien précis. Ce projet vise à comprendre la modification de ces circuits au niveau des cellules, de leur fonction et leur morphologie à l’origine de cette susceptibilité au cours du développement. Le projet s’intéresse aussi à la démence liée à l’âge, une autre maladie qui touche de plus en plus de personnes. Elle se traduit par des pertes de mémoire et des difficultés à penser clairement, causées notamment par la disparition progressive de neurones. Ces dommages sont en partie liés à un déséquilibre dans les mécanismes naturels de protection contre les agressions chimiques dans le cerveau. Une molécule importante pour ces défenses est produite naturellement dans le cerveau. Lorsqu’elle est dégradée, elle forme des petites molécules appelées dipeptides, qui jouent un rôle dans la communication entre les neurones. En cas de démence, ces dipeptides semblent s’accumuler, ce qui pourrait favoriser l’apparition des troubles. En mesurant la quantité de ces dipeptides et leurs effets sur le cerveau, le projet espère identifier des signes précoces de la maladie et mieux comprendre comment ces déséquilibres contribuent aux symptômes.

Bénéfices attendus

Ce projet constitue une étape essentielle dans la compréhension des circuits neuronaux responsables du contrôle de l'anxiété liée au stress et à la démence liée à l'âge, ainsi que des mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement de la susceptibilité ou de la résilience face aux troubles psychiatriques. Les découvertes qui en découleront pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches de prédiction et de traitement des maladies psychiatriques, bénéficiant ainsi à la société humaine.

Procédures

Pour la partie du projet liée à l'anxiété, un lot d'animaux va subir un protocole de stress consistant en des stress psychologiques par contention d'une durée maximale de 2h par jour pendant 6 jours et cela deux fois dans leur vie, pendant l'enfance et au stade de jeune adulte. A la fin de chaque période de stress des prélèvements de feces seront réalisés en laissant l'animal produire naturellement ces excrétas qui seront collectés. Un autre lot d'animaux subira les mêmes procédures que citées ci-dessus mais sans stress de contention effectué, ce sera notre lot contrôle. La plupart des animaux auront leur comportement testé à travers divers tests de comportement non invasifs. Ces tests durent chacun une dizaine de minutes et ne dépassent jamais 1 test par jour et 3 tests par semaine. Ils seront espacés de cinquante jours. Pour le projet lié à la démence, les animaux seront soumis à des injections dans l’abdomen de substances testées. Deux types de traitement seront réalisés : un traitement aigu, avec une seule injection (une injection dure au maximum 10 secondes), et un traitement chronique, avec une injection par jour pendant deux semaines. Les souris recevront soit une injection contenant les substances testées, soit une injection témoin. Par la suite, des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin de tester l’effet des substances sur l’apprentissage et la mémoire. Ces tests sont non invasifs et sont basés sur le comportement naturel des animaux à observer ou retrouver un lieu dans un environnement inconnu. Ils seront espacés d’au moins 24 heures pour limiter la fatigue des animaux et les biais expérimentaux. A la fin de l’expérience, des analyses des tissus neuronaux seront réalisées. Elles permettront de mieux comprendre l’effet des substances testées sur le fonctionnement des cellules nerveuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables seront principalement liés au stress provoqué par des contentions physiques. Ce type de stress de contention n'entraine pas de douleur mais provoque un stress psychologique. Les tests de comportement seront non invasifs et sans douleur, basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone anxiogène sans contrainte. Les fécès seront prélevés. Les nuisances prévues dans le second axe sont limitées à des injections de degré léger (10 secondes), qui ne provoquent qu’une gêne passagère comparable à une piqûre. Les tests comportementaux réalisés sont non invasifs et n’induisent pas de stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre des études moléculaires, d’activité électrique et histologiques post-mortem du cerveau.

Remplacement

Notre projet repose sur différentes approches telles que l’étude du comportement et l’étude du développement et de la plasticité du système nerveux. Nous voulons comprendre le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Actuellement, il n’y a pas de méthode substitutive qui pourrait remplacer le recours à l’animal dans nos travaux.

Réduction

Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre. Le nombre d'animaux par groupe a été évalué statistiquement, ce qui permet d'avoir une bonne estimation des effectifs suffisants pour l'obtention de données statistiquement fiables tout en s'assurant d'une utilisation des animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en œuvre durant la durée du projet. Le contenu de l’expérience intègre les impératifs éthiques, les modalités d’hébergement, d’enrichissement du milieu, de prévention de toute douleur, inconfort, stress, détresse chez l’animal. Les animaux seront placés en cage de maximum 5 individus avec maisonnette en carton plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé à l’expérimentation animale et aux connaissances spécialisées dans les procédures décrites. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés toutes les semaines. Enfin nous utiliserons une grille détaillant l'état des animaux pour s'assurer qu'ils ne souffrent pas afin de leur fournir les meilleurs soins le cas échéant. Les animaux manifestant au moins un des points limites ( critère prédéfini utilisé dans l’expérimentation animale pour interrompre ou modifier une procédure expérimentale afin d’éviter ou de limiter la souffrance, la douleur ou la détresse inutile chez l’animal) identifiés ou un score supérieur à 6 (grille) seront systématiquement sorti du protocole.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car ressemblant à l'homme concernant les mécanismes à l’œuvre dans le développement et les fonctions des systèmes de contrôle des émotions. Enfin, il existe des tests du comportement chez la souris permettant d'identifier des symptômes psychiatriques se manifestant de la même manière chez l'homme. Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude du fonctionnement du cerveau surtout concernant les circuits neuronaux qui contrôlent les émotions car ils sont similaires à ceux du cerveau humain, en particulier pour l’anxiété et la démence. Pour toutes ces raisons, ce choix d’espèce constitue un excellent modèle pour nos études. Dans le cadre des troubles anxieux, le stress de contention précoce commencera lorsque les animaux auront 30 jours. Les stades d'études moléculaires et histologiques sont justifiés par le fait que nous étudions les effets du stress de contention pendant la période où la aprtie du cerveau responsable du contrôle des émotions continue de maturer. Les paramètres biologiques seront donc étudiés après le premier stress de contention mais aussi après un second stress de contention à l'age adulte qui provoquera l’apparition de symptômes d’anxiété chez les animaux ayant subis les deux stress de contention. Les tests de comportement permettant de contrôler les niveaux d'anxiété seront réalisés sur des animaux adultes. Concernant la démence, les injections de substances se feront sur trois périodes vie : Jeune (1 mois), adulte (6 mois) et âgée (12 mois). Ces périodes sont justifiés par le vieillissement naturel et l’installation progressive de la démence avec l’âge. L’étude sur des souris jeune est essentielle pour identifier à quel stade les substances testées commencent à s’accumuler et comment elles peuvent avoir un impact sur l'apparition des troubles cognitifs

Génétiquement modifiées pour développer une myopie forte ou syndromique, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'implantation chirurgicale d'un casque sur le crâne, une heure d'opération, puis jusqu'à dix anesthésies gazeuses en trois semaines pour le nettoyage des lentilles et des yeux, avec le port prolongé d'un cadre à lunettes. Le porteur signale que l'hébergement individuel peut provoquer apathie et agressivité, et que l'enrichissement sera réduit pendant tout le projet. Toutes sont tuées et leurs yeux prélevés, le porteur indiquant qu'en tant qu'animaux OGM elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à l'accouplement.

Objectifs

La myopie est causée par une croissance anormale de l’œil. Ceci implique des questions optiques, génétiques, mais aussi neuronales. La myopie peut exister seule, ou associée à un syndrome oculaire plus vaste, on parle alors de myopie « syndromique ». Différents mécanismes mènent à l’apparition de la myopie, soulignant la nécessité de personnaliser les traitements en fonction des causes de la myopie. Plusieurs solutions thérapeutiques sont déjà proposées, sous forme de collyre (exemple : l’atropine) ou optiques (exemple : thérapie à lumière rouge ou verres de freination). Ces solutions présentent des effets secondaires conséquents (gêne et assèchement oculaire, photophobie, effet rebond) et une efficacité variable liée à divers facteurs. Notamment, de nombreux patients ne répondent pas ou peu à ces traitements. Il est donc nécessaire de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Au cours de ce projet, nous allons tester différentes voies thérapeutiques : 1) Il existe une molécule, formulable sous forme de collyre qui, d’après nos expériences passées, pourrait être prometteuse. Nous allons donc tester cette hypothèse dans divers modèles animaux de myopie forte et syndromique. 2) Différents verres de lunettes ont un impact sur la croissance de l’œil. Les modes d’action de ces verres sont variables et leur efficacité peuvent varier suivant la génétique et l’âge du patient. Ce projet vise à tester différentes solutions thérapeutiques dans différents modèles animaux de myopie forte et syndromique afin de proposer une preuve de concept et valoriser certaines de ces solutions.

Bénéfices attendus

La myopie présente une prévalence déjà élevée (plus d'un adulte sur 3 actuellement, 1 adulte sur 2 en 2050). La rétinopathie pigmentaire et la cécité nocture congénitale stationnaire sont des maladies génétiques rares (1/ personne sur 3500 et 1 personne sur 400000, respectivement), mais toutes trois peuvent mener à une cécité complète des patients affectés. S’il existe des stratégies de correction de la myopie, peu de réels traitements existent et ceux existant présentent une efficacité limitée et de nombreux effets secondaires. Ce projet permettra de fournir des preuves de concept pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de la myopie.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie ainsi que son traitement, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne des animaux est nécessaire, 1 fois par animal. La chirurgie dure 1 heure maximum par animal. Pour mesurer le degré de myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux : 3 fois par animal, 5 minutes à chaque fois. - Anesthésies gazeuses répétées : 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux et 1 examen des yeux. Soit 10 anesthésies maximum sur 3 semaines d’une durée de 15 minutes maximum/animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées, entrainant un stress. Les animaux seront soumis à une chirurgie : Les techniques chirurgicales peuvent mener à une perte de sang durant l’opération et à des pertes de poids, infections, douleurs durant la période post-opératoire. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette : le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Les traitements médicamenteux peuvent aussi engendrer une gêne et un assèchement oculaire. Les animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales caractérisées par de l’apathie et de l’agressivité. L’enrichissement sera réduit pendant ce projet, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés selon la procédure réglementaire car il s'agit d'animaux OGM ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir un oeil en 3D. L'utilisation de certaines des molécules testées ici est déjà reconnue comme efficace in vitro, dans les modèles animaux et chez les patients, mais n'a jamais été testée sur des modèles animaux avec les modifications génétiques que nous proposons. Afin de valider (ou invalider) l'usage des molécules que nous testons, pour le traitement de la myopie syndromique et non syndromique, la prochaine étape est donc un usage sur modèle in vivo.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. La myopie n’est pas connue pour impacter un sexe plus que l’autre. Nous testerons donc des mâles et femelles sans distinction. Nous avons optimisé le nombre et nature des accouplements d’animaux pour réduire le nombre d’animaux à générer. Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (taux de réussite estimé des procédures). Les données issues de conditions contrôles sont réutilisées pour réduire le nombre d’animaux à générer. Nous aurons besoin de générer 480 animaux pour ce projet

Raffinement

Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin de modèles génétiques particuliers qui n’existent que dans cette espèce. Nos expériences visent à étudier la myopie, qui survient durant la croissance de l’œil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’oeil est trop petit. Nos expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’oeil y est encore en phase de croissance critique.

Jusqu'à cinq chocs électriques par séance, une séance de trente minutes par jour pendant neuf jours: 2 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi cinq injections dans l'abdomen, un gavage cinq jours sur sept pendant dix semaines, et passent des séries de quatre tests cognitifs, certaines étant isolées en cage pour la mesure de leur rythme circadien. Le porteur qualifie ces chocs de désagréables mais non douloureux, et écrit par ailleurs que l'usage d'analgésiques centraux est à proscrire pour des raisons scientifiques. Toutes sont tuées et leurs cerveaux prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés. L'ajout d'une intervention (gavage) nécessite une deuxième modification du projet initiale sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

MODIFICATION: 1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer 3. Valider l'efficacité d'un traitement pharmaceutique, une molécule ciblant les cellules immunitaires, contre le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

MODIFICATION: Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; administration d'une substrance pharmacologique par gavage 5j/7 pendant 10 semaines, durée de la manipulation environ 30sec; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.

Impact sur les animaux

MODIFICATION: Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress et inconfort de l'introduction de la sonde de gavage; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.

Remplacement

Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.

Nourries pendant seize à vingt-quatre semaines avec un régime destiné à leur provoquer obésité, foie gras et inflammation hépatique, une partie des souris reçoit en plus deux injections par semaine pendant douze semaines pour induire une fibrose du foie. 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du sang, du foie, du tissu adipeux et du nerf sciatique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un gavage quotidien pendant douze à vingt-quatre semaines, des jeûnes de six heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures, et le porteur décrit une neuropathie allant jusqu'à la perte de la sensibilité. L'objectif est de tester un médicament déjà développé pour limiter l'accumulation d'un lipide, sans que les trois analyses neurologiques annoncées soient nommées.

Objectifs

La neuropathie diabétique est une complication fréquente du diabète qui touche environ 40 pourcents des patients. Elle provoque une perte de sensation, en particulier dans les pieds, ce qui peut entraîner des blessures et, dans les cas graves, des amputations. Actuellement, il n'existe pas de traitement permettant de restaurer la sensibilité perdue. En plus du diabète, d'autres facteurs comme l'obésité et le syndrome métabolique peuvent aussi causer des atteintes nerveuses similaires. Des recherches ont montré qu'un certain type de graisse pourrait jouer un rôle important dans ces dommages nerveux. Un médicament a été développé pour limiter l'accumulation de ces lipides. Ce projet de recherche veut tester si le traitement employé pour limiter cette graisse particulière pourrait aussi être utile contre la neuropathie diabétique en réduisant la synthèse de ces dérivés lipidiques et en protégeant les nerfs. Si cela fonctionne, cela pourrait ouvrir une nouvelle piste de traitement pour améliorer la qualité de vie des patients diabétiques.

Bénéfices attendus

La neuropathie liée au diabète peut entraîner de graves complications, comme des plaies aux pieds pouvant aller jusqu’à l’amputation. En France, environ 8 000 amputations par an sont dues à cette maladie. Ce projet de recherche s’intéresse à certains lipides et à leur rôle potentiel dans ces atteintes nerveuses. Un médicament agit justement sur la synthèse de ces mdérivés lipidiques. L’idée serait d’explorer s’il pourrait aussi aider les patients diabétiques en réduisant le risque de complications graves, comme les amputations.

Procédures

Les animaux seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, un gavage par jour sera réalisé pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h, après une mise à jeun de 6h) ainsi que des analyses neurologiques (2 tests sur animal vigil (2 et 10 min respectivement et 1 test sous anesthésie, 30min; chaque test étant espacé de 2 jours, 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) risque de réduction de la prise alimentaire lié à la néophobie des souris au changement de régime, 2) la maladie hépatique induite par régimes spéciaux ou par injection bihebdomaire intrapéritoneale d'un traitement (douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille) et ses conséquences métaboliques avec insulinorésistance provoquant un diabète (polyurie-polydipsie) et une obésité et les conséquences sur le nerf (neuropathie périphérique avec troubles de la sensibilité ou perte de la sensibilité) 3) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie 4) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose) 5) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques et durant les tests de sensibilité et de conduction nerveuse. 6) risque de perte de poids, d’hémorragie lié au prélèvement et risque d’hypoglycémie ainsi que la mise à jeun de 6h avec sensation de faim pour les tests métaboliques. 7) irritation oesophagienne liée au gavage quotidien du médicament testé

Devenir

A la fin de la période de maintien des animaux, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt (sang, tissus adipeux, foie et nerf sciatique) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme lipidique en cas de MASLD (maladie métabolique du foie) sur la neuropathie périphérique. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre d'animaux pour notre étude est calculé pour avoir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 960 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. En cas d'obésité avec difficulté à se mouvoir, la nourriture sera déposée en fond de cage. Le change de la cage augmenté si necessaire pour s'adapter à la diurèse induite par le diabète et permettre aux souris de rester au sec. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les points limites sont évalués par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. De plus sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et/ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Dans les protocoles, les souris seront mises en conditions expérimentales à partir de l'âge de 6-8 semaines afin que le métabolisme des animaux soit stabilisé.