Recherche fondamentale

Pour éprouver des moyens de maintenir l'engraissement des veaux pendant les vagues de chaleur, 192 veaux de boucherie vont être placés trois semaines dans des salles chauffées à 30 ou 32 °C le jour et 25 à 27 °C la nuit. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, le porteur ne retenant comme effet attendu qu'une "gêne" liée au stress thermique. Les veaux sont répartis en parcs de vingt-quatre, 96 subissant l'épisode de chaleur à 100 kg de poids vif et 96 autres à 200 kg, avec du lait servi à 32 °C au lieu de 45 °C pour une partie d'entre eux. Aucun n'est tué pour l'étude, chacun retournant après une semaine de transition dans le circuit d'élevage commercial d'où il vient.

Objectifs

Les veaux de boucherie sont majoritairement élevés dans des batiments fermés équipés d'une ventilation dynamique qui extrait en permanence de l'air des salles d'élevage. Cette extraction entraîne une dépression à l'intérieur de la salle, qui est compensée par une entrée d'air neuf venant de l'extérieur. Ce système de ventilation permet ainsi un renouvellement de l'air intérieur avec un système de régulation basé sur un objectif de température ambiante (plus la température monte par rapport à une température de consigne, plus les ventilateurs tournent pour augmenter le renouvellement de l'air et abaisser la température par une entrée accrue d'air frais). Ainsi, la chaleur générée par les animaux (environ 250 W par veau et par h) est compensée par une arrivée d'air neuf permettant de limiter l'élevation de la température dans la salle d'élevage. Ce système de ventilation devient ineffficace dès lors que la température extérieure est plus élevée que la température de consigne. Cette température de consigne doit correspondre à la température de thermoneutralité des veaux, qui est en moyenne de 18°C chez les veaux (donnée ancienne déterminée chez des animaux d'un poids de 200 kg). Pendant une partie de l'année (période estivale), la température ambiante dans les bâtiments d'élevage est donc plus élevée que la température de thermoneutralité, plaçant les animaux dans une situation de stress thermique, d'autant plus que la vapeur d'eau produite par les animaux entraîne conjointement une augmentation de l'humidité de l'air dans le bâtiment, à même de compliquer encore plus les conditions d'élevage des veaux. Les objectifs du projet sont de déterminer les conditions de température et d'humidité correspondant à la thermoneutralité chez les veaux afin de développer des systèmes de régulation des conditions d'ambiance plus adaptés pour ces animaux. Le projet permettra également de déterminer les leviers d'adaptation des veaux aux conditions ambiantes afin d'adapter l'alimentation des animaux lors de périodes de vagues de chaleur.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre d'acquérir des connaissances sur les moyens de lutte en élevage pour faire face à des conditions d'ambiance de stress thermique. Les résultats obtenus permettront de fournir aux éleveurs de veaux de boucherie des solutions techniques permettant de limiter l'impact des épisodes de chaleur sur les veaux (brassage de l'air, diminution des températures de buvée du lait à 32°C au lieu de 45°C).

Procédures

Les salles dans lesquelles les veaux seront élevés seront chauffées pendant 3 semaines pour simuler un épisode de chaleur (30-32°C la journée et 25-27°C la nuit). En 2025, 96 veaux seront soumis à cet épisode de chaleur de 3 semaines lorsqu'ils atteindront le poids vif de 100 kg. En 2026, 96 veaux seront soumis à cet épisode de chaleur de 3 semaines lorsque les veaux atteindront le poids vif de 200 kg.

Impact sur les animaux

Les conditions d'ambiance dans les salles pendant la phase expérimentale (température jusqu'à 30-32°C pendant 3 semaines) vont induire un stress thermique pouvant générer une gêne pour les animaux.

Devenir

Aucun animal ne sera euthanasié pour les besoins de l'étude. A l'issue de la procédure, chaque animal sera replacé en conditions d'élevage commercial après une transition d'adaptation d'1 semaine. Cette transition visera à faire baisser progressivement la température des bâtiments à raison de 1°C/heure jusqu'à l'obtention de la thermoneutralité et à revenir à une température classique de buvée du lait de 45°C (à raison d'une augmentation de 2°C/jour sur 1 semaine).

Remplacement

Le projet porte sur la réponse des veaux en termes d'adaptation à la chaleur. Il n'existe pas de modèles mathématiques qui prennent en compte ces différentes composantes afin de prédire l'adaptation des veaux. Pour cela, le projet est basé sur l'utilisation d'animaux en vue de mesurer leur réponse aux vagues de chaleur.

Réduction

En se basant sur les données antérieures, pour être sûr de disposer d'une puissance statistique suffisante, il faut un effectif de 24 veaux par modalité mise en comparaison. Soit 96 veaux par essai comportant 4 modalités testées.

Raffinement

Les animaux sont placés en parcs collectifs de 24 veaux pendant toute la durée expérimentale. En termes de mesures de raffinement, les veaux auront libre accès 24h/24 aux différents aliments composant leur alimentation : lait, aliment solide (mélange de concentré et de fourrage) et eau. L'ensemble de ces aliments leur sera distribué ad libitum, ainsi les animaux pourront choisir librement en fonction de leurs besoins, l'aliment (ou les aliments) qu'ils souhaitent consommer à n'importe quel moment du jour ou de la nuit. Au-delà de cet enrichissement alimentaire, il sera mis à disposition des veaux des supports physiques non nutritifs tels que des chainettes en acier inoxydable, ainsi que des grattoirs.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour l'étude. Les deux gammes de poids des veaux (100 kg de poids et 200 kg de poids vif) sont considérées car la sensibilité au stress thermique est susceptible de dépendre du poids des animaux.

Pour que le personnel d'animalerie acquière et maintienne la maîtrise de gestes techniques exigée par l'arrêté du 1er février 2013, 2 772 animaux non-humains vont être utilisés et tous tués. Ce sont 817 cobayes, 690 rats, 647 lapins et 618 souris, chacun soumis vigile et sous contention à quatre gestes différents au maximum, de trente secondes à deux minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les mannequins et les simulateurs d'injection servent en amont mais ne suffisent pas à réussir le geste sur un animal vigile. Il précise que ces animaux sont des animaux de réforme "déjà destinés à l'euthanasie" ou repris d'autres protocoles, et qu'ils ne sont pas gardés en vie afin de pouvoir vérifier la qualité du geste.

Objectifs

Ce projet est dédié à l’acquisition d’une parfaite maîtrise de gestes techniques nécessaires à la bonne réalisation des procédures expérimentales par les personnels d’animalerie. Il répond aux exigences réglementaires de l'arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation de compétences du personnel des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux à des fins scientifiques. Maîtriser les gestes techniques est fondamental pour le bien-être animal (réduction au maximum du stress et de la douleur associé à ces gestes) et la reproductibilité des résultats scientifiques (exécution correcte du geste et fiabilité du résultat scientifique en découlant) lors des prochaines procédures de l’établissement. L’objectif de ce projet est d’assurer, après une première acquisition théoriques et sur modèles inertes, des compétences relatives aux gestes techniques, leur qualification et leur maintien dans le temps tout en garantissant le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la maitrise pour nos personnels travaillant avec les animaux des gestes techniques de routine dans nos activités, en respectant les bonnes pratiques actuelles et en minimisant les contraintes sur les animaux. En s’assurant que nos personnels sont à jour dans les connaissances pratiques et théoriques des gestes techniques, nous nous assurons que les procédures sont réalisées dans les meilleures conditions possibles et dans le respect du bien-être de l’animal.

Procédures

Chaque animal sera soumis au maximum à 4 gestes techniques différents, vigile et sous contention, d’une durée oscillant entre 30 secondes et 2 minutes.

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention et douleur associée aux gestes techniques (introduction d’une aiguille).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Les animaux utilisés sont des animaux de réformes déjà destinés à l’euthanasie, il a donc été décidé de ne pas les garder en vie après les procédures pour éviter tout stress supplémentaire et pouvoir, le cas échéant, vérifier la qualité du geste technique.

Remplacement

Des méthodes alternatives comme des vidéos explicatives ou encore le recours à des mannequins ou autre support inerte (ex : simulateur d’injection intra veineuse) serviront de supports préalables lors des volets théoriques et pratiques des différents gestes techniques. Cependant, ces méthodes alternatives ne suffisent pas pour que le personnel réussisse à réaliser les gestes en conditions réelles, sur animal vigile tout en minimisant les nuisances sur cet animal lors de la réalisation du geste : cette partie ne peut être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour les procédures est composé d’un minimum et d’un maximum, afin de pouvoir vérifier que le personnel maitrise la technique. Dès lors que le nombre minimum d’animaux est atteint et que le geste est maîtrisé, la procédure s’arrête. Si le nombre maximum est atteint et que le personnel ne maîtrise toujours pas le geste, il repasse sur modèle inerte. Les animaux utilisés seront uniquement des animaux de réforme de l’animalerie de l’établissement où se déroule le projet ou des animaux réutilisés de protocoles expérimentaux (après validation vétérinaire et selon les recommandations éthiques). Lors de ces procédures et sur les conseil du vétérinaire et/ou la SBEA, il est possible d’utiliser un même animal pour plusieurs gestes techniques (selon leur caractère invasif) afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour atteindre les objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux utilisés seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge. Des points limites en fonction des spécificités des gestes seront appliqués. Une observation de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (soins locaux, ajout d’enrichissement, ajout d’aliment, ...). ...). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. La manipulation et la contention des animaux se fera par le biais de méthodes les moins stressantes possibles (creux de la main, tunnels, habituation …). Les techniciens s’entraineront d’abord à la contention avant d’effectuer le geste, pour que le geste soit réalisé de manière sécurisée et non stressante pour l’animal et la personne. Les volumes prélevés ou injectés seront basés sur les doses minimales, et avec des produits neutres comme du sérum physiologique, ceci dans le respect des volumes d’administration et de prélèvements propres à chaque espèce.

Choix des espèces

Mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis. Ces espèces ont été choisies car ce sont les espèces élevées et utilisées dans notre établissement, il est donc nécessaire que le personnel maitrise les gestes techniques sur ces différentes espèces qui ont chacune leurs particularités. Pour pouvoir être cohérent avec les conditions réelles dans laquelle ces gestes techniques vont être réalisés et minimiser ainsi l’impact sur le bien-être animal, la qualification et la requalification des gestes techniques est effectuée sur des animaux vivants dont l’espèce correspond à celle sur laquelle les gestes seront réalisés. Les mâles ou femelles peuvent être utilisés. Dans la mesure du possible, les surplus de stock comme les mâles chez l’espèce souris et lapins et les femelles chez l’espèce rat et cobayes seront choisis.

Exposées à 30 °C pendant toute leur croissance puis portées à 40 °C pendant près de quatre heures à deux reprises, 160 cailles japonaises subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont piquées pour un prélèvement de sang à cinq reprises la première année, puis tous les six mois jusqu'à leur mort, et passent une nuit entière isolées dans une chambre calorimétrique à cinquante et à cent jours. Deux sessions dans une arène circulaire d'un mètre trente mesurent leur réaction à un objet nouveau, ce que le porteur rattache à l'anticipation des effets des vagues de chaleur sur la faune sauvage. Toutes les femelles restent à l'élevage jusqu'à leur mort naturelle, les trois quarts des mâles sont proposés à l'adoption et les autres sont tués pour prélever leurs tissus.

Objectifs

L’un des défis majeurs de notre époque est d’anticiper l’ampleur des changements environnementaux globaux. Ceux-ci se traduisent par une hausse des températures moyennes et une augmentation des événements climatiques extrêmes, comme les vagues de chaleur. Ces modifications affectent les écosystèmes en influençant la phénologie, la distribution des espèces et les réseaux trophiques. Elles impactent également les traits d’histoire de vie, le comportement et la physiologie des organismes. Comprendre la capacité des espèces à s’adapter aux variations de température est donc essentiel. Les organismes possèdent une plage thermique optimale pour leur physiologie. Chez les endothermes (organismes capables de maintenir une température corporelle constante), la zone de neutralité thermique représente l’intervalle où aucune production ou dissipation active de chaleur n’est nécessaire. Au-delà de cette limite, le stress thermique impose aux individus de dissiper activement la chaleur. Des températures extrêmes influencent la croissance, la reproduction et la survie. À l’échelle physiologique, ces variations peuvent modifier la production de corticostérone, une hormone de stress, dont l’élévation pourrait accélérer le vieillissement cellulaire. Notre compréhension des effets du stress thermique sur les réponses moléculaires (dégâts sur l’ADN), physiologiques et comportementales reste limitée. Explorer ces mécanismes et leurs conséquences sur la reproduction et la survie permettrait de mieux prédire l’impact des changements climatiques sur la dynamique des populations. Ce projet étudie les effets du stress thermique en analysant divers mécanismes physiologiques et moléculaires chez la caille japonaise (Coturnix japonica). L’objectif est d’évaluer l’impact d’une hausse de température sur le métabolisme, les marqueurs du vieillissement, la réponse au stress ainsi que la survie et la reproduction. Ces résultats seront essentiels pour évaluer la résilience des individus face au stress thermique et identifier les effets des modifications climatiques sur leur survie et leur reproduction, contribuant ainsi à une meilleure surveillance des réponses biologiques aux changements globaux.

Bénéfices attendus

Le projet apportera des bénéfices en termes de connaissances fondamentales concernant : - La capacité des organismes à s'adapter lors d'une exposition prénatale à une vague de chaleur - les mécanismes physiologiques sous-tendant l’effet d’un stress thermique sur le vieillissement cellulaire - l’importance des effets d’un stress thermique sur la survie et la reproduction des organismes. Ces connaissances fondamentales visant à caractériser la réponse au stress thermique et aux températures anormalement chaudes, sont notamment nécessaires dans une optique de suivi de la réponse des organismes aux changements climatiques. A long-terme, tester les conséquences du stress thermique sur la condition physique et les mécanismes physiologiques sous-jacents pourra permettre une meilleure modélisation des effets futurs de ces changements sur les réponses adaptatives des organismes.

Procédures

Voici les durées des gestes cités qui seront réalisés sur animal vigile, les 160 animaux de l’expérimentation sont concernés par ces procédures : -Exposition chronique à une température de 30±2°C lors de la croissance et exposition aigue à 40°C pendant moins de 4h lors de la mesure du métabolisme à J50 et J100. -Prélèvements de sang (30s) réalisés à J8, J20, J50, J60 et J100 puis une fois tous les 6 mois jusqu’à la mort de l’animal, -Prélèvement de plumes (≤10s) réalisés 1 fois à J20, -Analyses métaboliques dans une chambre calorimétrique (de 20h à 12h le lendemain) réalisées à J50 et J100 -Un des objectifs de l’étude etant de mesurer comment certains comportements (néophobie, exploration, etc.) peuvent être affectés par un stress thermique lors du développement et/ou de la croissance, les animaux seront placés dans une arène circulaire (1m30 de diamétre) et leurs comportements d'exploration ou d'approche d'un nouvel objet seront enregistrés durant 2 sessions de ≤30min chacune à J20 et J50.

Impact sur les animaux

La manipulation lors des différentes mesures (baguage, pesée, prise de sang, etc.) peut entrainer de la peur/de la détresse chez l’animal. Lors des prises de sang, la piqure d’aiguille entraîne un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur légère ayant pour conséquence un stress physique léger de courte durée. Le prélévement de deux plumes à J20 entraine un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur légère ayant pour conséquences un stress physique leger. Lors de l’évaluation comportementale, les animaux seront isolés ayant pour conséquence une peur/détresse légère à modérée ainsi qu’une exposition à un nouvel environnement. Lors de la mesure du taux métabolique, les animaux seront isolés au cours de la nuit puis au cours de la matinée suivante qui inclue une exposition graduelle (sur une durée de 4h) à un stress thermique. Cette manipulation peut entrainer un stress physique (isolement, mobilité réduite, environnement non adapté) et physiologique (faim, soif) modéré.

Devenir

Toutes les femelles seront gardées à l’élevage et suivies jusqu’à leur mort naturelle. Après la maturité sexuelle, 75% des mâles seront placés à l’adoption, et si celle-ci n’est pas possible ils seront euthanasiés pour collecter des tissues permettant des analyses physiologiques complémentaires.

Remplacement

Le projet vise à comprendre l’effet du stress sur le vieillissement cellulaire et les mécanismes physiologiques/cellulaires sous-jacents. L’exposition à un environnement stressant engendre une multitude de bouleversements physiologiques qui implique différentes cellules et différents organes, mais également les communications inter-cellulaires et inter-organes, ce qui ne peut pas être reproduit via des approches substitutives disponibles à ce jour.

Réduction

Le nombre d’individus utilisé a été réduit au minimum nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement appropriés aux objectifs. Cela est possible grâce à la réalisation de l’expérimentation en 2 sessions (une par an) qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lors de la deuxième session en fonction des résultats obtenus lors de la première session. Certaines mesures comme les prises de sang, les mesures morphologiques et celles du comportement ont été regroupées afin de réduire le nombre de manipulation des animaux.

Raffinement

Les différentes phases du protocole ont été conçues avec soin pour favoriser le bien-être des animaux pendant les procédures : - stabulation en groupes mixtes au sol en densité modérée - température optimale (pour le groupe contrôle), nourriture et eau ad libitum - enrichissement structurel : cachettes, brises-vue et capsules de bouteilles (jouets) - enrichissement alimentaire (litière dense propice au fouissage, vers de farine dispersés 1x/jour dans la litière) - Lors des différentes mesures et dans l’élevage, des points limites précoces feront l’objet d’une attention spécifique. Si un animal présente des signes de souffrance (listés dans un arbre décisionnel précis), il sera soit retiré de l’expérimentation, traité si besoin et replacé dans des conditions contrôle, soit mis à mort si les souffrances sont irréversibles et après avis du véterinaire référent.

Choix des espèces

La caille japonaise, utilisée pour ce projet, présente à la fois une sensibilité au stress thermique ainsi qu’une facilité d’incubation artificielle et la capacité de prospérer dans des environnements de laboratoire contrôlés, ce qui fait d’elle un bon modèle pour étudier les effets du réchauffement climatique. Les cailles peuvent servir d'analogues à de nombreuses espèces d'oiseaux vivant au sol ou à de petits animaux terrestres, en particulier dans les zones semi-arides ou tempérées. De plus, cette espèce est un excellent modèle aviaire dans un contexte d’étude du vieillissement. Son cycle de vie court (de 50 à 60 jours entre l’éclosion et la maturité sexuelle) permet de réaliser des études jusqu'à l'âge adulte des individus en un temps réduit. Les animaux seront utilisés au stade poussin (début de procédure à J2) afin d'étudier les effets d'un stress thermique lors de la croissance. Ils seront également suivis au stade adulte (tous les 6 mois jusqu’à leur mort) afin d’évaluer les effets à moyen et long terme du stress thermique éprouvé lors du développement embryonnaire et/ou de la croissance.

Amenés à 85 ou 90 % de leur poids initial par restriction alimentaire pour rester motivés à chercher de la nourriture, 72 rats Dark Agouti parcourent un labyrinthe à huit bras puis un labyrinthe en croix, après trois injections dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur prévoit de proposer tous les rats à l'adoption ou à la réutilisation dans un autre projet de l'unité, la mise à mort ne venant qu'en l'absence de solution. L'objectif est de voir si une molécule qui active le système histaminergique améliore l'oubli des informations inutiles et la mémoire de travail, avec en visée lointaine l'autisme, les troubles de l'attention et la maladie d'Alzheimer. Cette molécule n'est jamais nommée, pas davantage que la dose administrée aux rats.

Objectifs

Le projet vise à mieux comprendre comment un composé qui stimule le système histaminergique influence la mémoire. Plus précisément, il s'agit d'étudier son impact sur l'oubli nécessaire lors de tâches de mémoire spatiale et sur l'efficacité de l'apprentissage dans ces tâches. Pour cela, nous utilisons des rats dans des expériences qui créent différents niveaux de confusion entre anciennes et nouvelles informations. Cela nous aide à voir comment ils gèrent l'oubli et la mémorisation à court terme, ainsi que l'apprentissage à long terme. Nous allons évaluer leurs performances dans un labyrinthe à 8 bras après leur avoir administré un composé qui active le système histaminergique. En activant ce système, nous espérons améliorer leur attention, ce qui pourrait les aider à mieux accomplir les tâches et à mieux mémoriser et/ou oublier des informations.

Bénéfices attendus

Cette étude va examiner si un composé qui stimule le système histaminergique aide à mieux se concentrer et à mieux oublier des informations inutiles. Cela pourrait améliorer la façon dont nous traitons les informations à court terme et renforcer notre mémoire à long terme. Le but final est le traitement des déficits de mémoire de travail qui sont visibles dans des pathologies telles que l’autisme, les troubles de l’attention ou encore la maladie d’Alzheimer.

Procédures

3 piqures (10 secondes chaque) avec administration intrapéritonéale de ringer (J1) et d’un composé activant le système histaminergique (J2), le matin juste avant les deux jours (J1 et J2) de test comportemental en labyrinthe à 8 bras (test de mémorisation) et une un semaine plus tard avant le test en labyrinthe en croix (test d’anxiété).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 3 administrations intraperitonéales (douleur liée à la piqure). Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront pendant le test du labyrinthe à 8 bras : les rats seront amenés à 85-90% de leur poids initial durant la semaine d’habituation.

Devenir

Tous les rats (72 au total) seront proposés à l'adoption (interne ou externe = GRAAL) et/ou proposés pour une réutilisation dans un autre projet au sein de notre unité à la fin du projet. La mise à mort pourra être effectuée si aucune solution de replacement n'a abouti.

Remplacement

La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux. Le rat sera préféré à la souris puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche, des études pilotes ont été conduites au sein de l’équipe avec des souris et se sont révélées non concluantes pour les tâches comportementales nécessaires à ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 12 pour chaque groupe, soit 72 animaux) en se basant sur les études précédentes. Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leurs contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). Le calcul de puissance avec les chiffres connus d’une étude précédente nous indique un nombre d’animaux nécessaires de 11 minimum nous élargissons ce chiffre à 12 dans le cas ou un animal présente des difficultés dans la réalisation des tests (ce qui est probable et connu de part nos précédentes études)

Raffinement

Les animaux seront hébergés en binômes. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10-15% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). Nous adaptons ensuite chaque jour l’apport d’aliments pour que l’animal reprenne un peu de poids chaque jour (2 à 3 g) et reste motivé pour autant. Cela implique un contrôle strict du poids de l’animal chaque matin et adaptation de la dose de nourriture chaque soir. Nous utilisons une grille de suivi avec des points limites adaptés aux tâches comportementales et à la restriction alimentaire, nous permettant d'arrêter l'expérience si l'animal présente un mal-être. L'expérience comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement des labyrinthes. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.

Choix des espèces

Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 7 semaines lors de leur réception et effectueront les test comportementaux à l'age de 10-11 semaines (repos post-transport, habituation a la manipulation, restriction alimentaire, habituation au labyrinthe), ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.

Les souris qui font plusieurs hypoglycémies avant de recevoir la thérapie génique sont mises à mort. 58 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude pour prélever leur foie. La maladie leur est induite par cinq injections quotidiennes, puis viennent l'injection du vecteur viral dans la circulation, deux semaines de régime riche en sucres et en graisses pour une partie d'entre elles, une incision du bout de la queue et six prélèvements de sang par test de glycémie. Le porteur cherche lequel de deux vecteurs dérègle le moins la glycémie, et espère en tirer des recommandations alimentaires pour des patients dont la maladie touche environ 150 personnes en France.

Objectifs

La glycogénose de type I est une maladie génétique rare causée par un défaut dans un gène qui joue un rôle clé dans la production de sucre (glucose) par le foie. Lorsqu'il ne fonctionne pas correctement, le corps ne peut pas produire de glucose en interne, ce qui entraîne de graves baisses de sucre dans le sang (hypoglycémies). De plus, des accumulations de glycogène (polymère de glucose) et de graisses se forment dans le foie, ce qui peut provoquer des problèmes hépatiques à long terme, allant jusqu’au développement de tumeurs pouvant nécessiter une greffe du foie. Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour cette maladie. Les patients doivent suivre un régime alimentaire très strict pour éviter les hypoglycémies, en mangeant régulièrement des sucres lents (Maïzena crue). La thérapie génique est une piste prometteuse ; elle consiste à introduire un gène fonctionnel dans le foie à l’aide de virus modifiés qui servent de « transporteurs » du gène médicament. Une étude sur un modèle viable de souris atteintes de glycogénose de type I a montré que l’injection unique de ce traitement permettait de restaurer la production de glucose par le foie et d’éviter l’apparition de tumeurs. Deux types de vecteurs ont été testés. Le premier est plus efficace et nécessite l’injection d’une dose plus faible, mais l’expression du gène médicament n’est pas régulée par l’insuline. Le deuxième, bien que moins efficace, est sensible aux régulations hormonales. Ces régulations sont importantes car l’insuline est une hormone qui contrôle le taux de sucre dans le sang. Elle est produite par le pancréas après un repas pour éviter que les taux de glucose dans le sang soient trop élevés. L’absence de régulation hormonale de l’expression du gène médicament pourrait dérégler l’équilibre de glucose dans le corps, et potentiellement favoriser une résistance à l’insuline, surtout en cas d'alimentation déséquilibrée, voire une hyperglycémie, qui sont les caractéristiques du diabète. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la thérapie génique sur l’équilibre du glucose et la réponse à l’insuline chez des souris atteintes de glycogénose. Ces souris suivront deux types d’alimentation : • Un régime normal • Un régime riche en sucre et en graisses (favorisant le diabète) Cela permettra de s’assurer que le traitement ne provoque pas de complications métaboliques, quelles que soient les habitudes alimentaires du patient.

Bénéfices attendus

Le taux de sucre dans le sang (glycémie) doit être très bien régulé. Si le foie produit trop de glucose, cela peut entraîner un risque de diabète, surtout chez les personnes ayant une alimentation déséquilibrée et un excès de poids. Les patients atteints de glycogénose de type I ne produisent pas de glucose eux-mêmes, donc ils doivent manger régulièrement des sucres lents tout au long de la journée et même la nuit. Ce régime constant peut les rendre moins sensibles à l'insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. La thérapie génique pourrait leur permettre de produire du glucose, mais selon la méthode utilisée, elle pourrait aussi modifier l’équilibre glycémique et, à long terme, augmenter le risque de diabète, surtout si leur alimentation n’est pas adaptée. Ce projet vise à mieux comprendre comment la thérapie génique influence la régulation du glucose chez des souris atteintes de glycogénose, en particulier après les repas. L’objectif est de trouver la meilleure approche pour optimiser ce traitement et, si nécessaire, donner des recommandations alimentaires aux patients pour éviter d’éventuels effets secondaires.

Procédures

Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes. La durée du geste est de quelques secondes. Toutes les souris subiront une injection tous les jours pendant 5 jours (quelques secondes/souris) pour induire la glycogénose. Toutes les souris transgéniques seront traitées par thérapie génique par une injection unique du vecteur dans la circulation sanguine. Pour cela, les souris seront immobilisées dans un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (durée d’environ 1 minute). Une partie des souris seront nourries en régime riche en sucres et en graisse pendant 2 semaines après la thérapie génique. Ce régime pourrait favoriser le développement d’un état prédiabétique chez certains lots de souris, sans conséquence sur le bien-être animal (asymptomatique). Pour analyser la régulation de leur glycémie, les souris recevront une injection de glucose ou d’insuline et leur glycémie sera mesurée régulièrement. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 6 fois au cours de chaque test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Au total, 3 prises de sang seront aussi réalisées avant et après l’injection du glucose pour suivre la sécrétion d’insuline. En fin de procédure, une prise de sang sera réalisée juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : -l’induction de la glycogénose de type I qui est une maladie entrainant des hypoglycémies sévères quand les animaux ne mangent pas (entre les repas). Le développement des hypoglycémies entraine un mal-être qui peut être important, voire le décès de l’animal s’il n’est pas pris en charge. -la biopsie de tissu et les injections peuvent entrainer une légère douleur. L’immobilisation de la souris pour réaliser ces gestes induit un léger stress. -la prise de sang peut entrainer une légère douleur.

Devenir

Afin de caractériser l’effet des traitements, en particulier le pourcentage de cellules du foie guéries et le nombre de particules virales, le foie sera prélevé en fin d’expérience. Pour cela, tous les animaux devront être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui, on sait fabriquer en laboratoire de mini-foies appelés organoïdes, qui contiennent différents types de cellules du foie (comme les hépatocytes, les cellules biliaires ou encore les cellules immunitaires). Cependant, la thérapie génique ne peut pas être testée uniquement sur ces mini-foies, car elle repose sur l’injection de virus modifiés dans le sang pour transporter le gène médicament. Pour fonctionner, ces vecteurs doivent atteindre les cellules du foie (hépatocytes) en traversant les petits vaisseaux sanguins. Or, toutes les cellules du foie ne seront pas forcément corrigées. L’efficacité du traitement dépend donc de la quantité de cellules qui reçoivent le gène. C'est pourquoi il est essentiel de tester cette thérapie dans un organisme entier, où la circulation sanguine et le fonctionnement du foie sont aussi proches que possible de la réalité.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour cette étude a été calculé avec précision, en tenant compte des connaissances actuelles sur la maladie, du modèle animal choisi, du fonctionnement du métabolisme du sucre et de l’énergie, des résultats d’expériences précédentes et d’une approche statistique. Au total, ce projet réalisé sur 2 ans nécessitera 58 souris mâles, dont 50 souris atteintes de la maladie et traitées par thérapie génique et 8 souris saines servant de groupe témoin.

Raffinement

-Pour éviter les inflammations des organes causées par les injections dans l’abdomen, l’induction de la maladie sera réalisée par une injection d’un produit sous la peau à différents endroits. -La maladie étudiée ne se développe que dans le foie des souris adultes, ce qui évite des complications comme des hypoglycémies graves et protège les souris pendant leur développement. - Avant que la maladie n’apparaisse, les souris seront habituées à boire du glucose à la pipette. Ainsi, si leur taux de sucre baisse légèrement, elles accepteront plus facilement cette solution. - Pour éviter les hypoglycémies, les souris auront un accès facile à la nourriture (croquettes dans la cage, biberons adaptés). En cas d’hypoglycémie sévère, une injection de glucose sera réalisée, et une partie de la cage sera placée sur une plaque chauffante pour maintenir leur température. Une grille d’évaluation permettra de surveiller les signes d’hypoglycémie. L’apparition de plusieurs hypoglycémies avant la thérapie génique constitue un point limite nécessitant l’euthanasie de la souris pour raison éthique. -Les souris seront manipulées avec un tunnel pour limiter leur stress. -Pour réduire la douleur, une crème anesthésiante sera appliquée sur les zones de ponction du sang et d’incision. -Une grille de score aidera à prendre des décisions en cas d’observation d’un mal-être et décrit les points limites au-delà desquels les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations de la production de glucose par l’organisme ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. De plus, le modèle de souris transgéniques utilisé n’a été réalisé que dans cette espèce grâce à la transgenèse ciblée. Enfin, les outils d’analyses moléculaires, comme des anticorps, spécifiques de la souris sont disponibles en laboratoire. La biopsie de tissu pour caractériser les gènes des souris sera réalisée chez les nouveau-nés âgés de 7-10 jours. La maladie sera induite à l’âge de à 5 semaines. Une période de 5 semaines suivant ces injections permet la disparition des effets potentiels sur le métabolisme du produit injecté lors de l’induction de la maladie. Les souris seront traitées par thérapie génique à l’âge de 10 semaines. Les souris saines témoins seront commandées dès l’âge de 4 semaines.