Recherche fondamentale
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Etude du rôle fonctionnel de CD93 dans le cadre de la réponse humorale mémoire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
702 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes subissent un prélèvement du bout de la queue pour génotypage, puis des injections intrapéritonéales et jusqu'à six prélèvements sanguins en sous-mandibulaire étalés sur cinquante jours. Un lot est infecté par un virus qui provoque une perte de poids pendant les sept jours suivants, le reste étant vacciné avec la même souche pour comparer réponse infectieuse et réponse vaccinale. Aucune analgésie n'est prévue avant l'atteinte d'un score de douleur de 10, le porteur affirmant que les analgésiques créeraient un biais expérimental et que sa table de score est "stricte pour éviter toute souffrance animale".
Objectifs
Suite à une infection ou une vaccination certains globules blancs peuvent se différencier en cellules qui produisent des anticorps, les plasmocytes (PC) de courte durée de vie ou de longue durée de vie. Dans le premier cas, les PC vont sécréter des anticorps de faible affinité pour le pathogène et ces cellules meurent dans les 3 à 5 jours après leur genèse. Dans le second cas les PC seront aptes à produire des anticorps hautement spécifiques du pathogène et pourront perdurer plusieurs années voir toute la vie dans la moelle osseuse. Depuis la moelle osseuse ils vont sécréter de grandes quantités d’anticorps qui sont essentiels pour une protection efficace et de longue durée contre les infections. Leur rôle est central dans les réponses vaccinales et l’efficacité de ces réponses est mesurée sur la base de leur production d’anticorps. Cependant il est maintenant bien établi que les PC générés lors d’une vaccination se maintiennent moins bien que ceux générés lors d’une infection. La protéine CD93 a été montré comme nécessaire pour le maintien des plasmocytes à longue durée de vie, cependant son rôle fonctionnel dans ces cellules reste à établir. L’objectif de ce projet est donc d’étudier de façon détaillée le rôle de CD93 sur la réponse immune humorale. L’étude sera réalisée sur le modèle murin délété entièrement ou pour partie de CD93 (CD93-/- et CD93+/- respectivement), ne présentant pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons ce modèle pour analyser les réponses immunes primaires et mémoires après immunisations ou vaccination dans nos deux modèles expérimentaux (souris CD93-/- et CD93+/-). In fine ces travaux permettront d’apporter de nouveaux éléments en vu d’améliorer les stratégies vaccinales.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la biologie des plasmocytes. Ces cellules encore trop considérées comme une seule et unique population souffrent de méconnaissance et d’un manque de thérapies ciblées. L’étude de ces souris permettra d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la complexité de cette population cellulaire, de leurs régulations et maintien. Cette caractérisation fondamentale est essentielle pour apporter à court terme des éléments d’améliorations aux stratégies vaccinales et appréhender l’étude des plasmocytes dans un contexte pathologique à plus long terme.
Procédures
Tous les animaux décrits dans le projet subiront un prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer le génotype des animaux. Dans la procédure 1 les animaux subiront une injection en intrapéritonéal d’une molécule non pathogène permettant de tracer les cellules spécifiques de cette molécule. Pour la procédure 2, nous comparerons réponses infectieuse et vaccinale vis-à-vis d’un même virus. Un lot de cette procédure fera l’objet d’une infection virale. Les souris restantes (majoritaires) de cette procédure seront vaccinées avec la même souche virale. Les animaux de ces différentes procédures seront également soumis à des prélèvements sanguins sur souris vigiles en sous mandibulaire. Pour la procédure 1, les souris étudiées dans le cadre d’une réponse secondaire (lot 2) seront prélevées 4 fois et celles utilisées pour une réponse mémoire (lot 3) 5 fois durant les 50 jours de la procédure. Pour la procédure 2, les souris des lots 1 et 2 seront analysées 21 jours après l’infection/vaccination et les prélèvements sanguins auront lieu à J0, J+7 et J+14. Pour la procédure 2, les souris des lots 3 et 4 seront analysées 60 jours après la vaccination et les prélèvements sanguins auront lieu à J0, J+7, J+14, J+21, J+28 et J+35.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons les animaux délétés partiellement ou totalement de CD93 ce qui nécessitera une procédure de génotypage et donc un prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux. Sur les 3 procédures engagées dans ce projet 2 sont de classe modérée et une de classe sévère. Pour les procédures de classe modérée les effets indésirables potentiels sont très restreints. Pour ces procédures la douleur maximale est le jour de l’immunisation et ne dépasse pas la douleur induite par la piqure. Pour la procédure de classe sévère, les animaux sont infectés avec un virus. Cette infection va conduire au développement de la pathologie qui va notamment engendrer une perte de poids durant les 7 jours suivant l’infection. Ce symptôme est le plus sévère de la procédure.
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes lymphoïdes seront prélevés pour analyse
Remplacement
Les réponses immunes sont des processus complexes dépendants de nombreux types cellulaires et de l’organisation tridimensionnelle des organes lymphoïdes. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude afin de reproduire toutes les interactions in vivo entre les différents types cellulaires impliqués dans ces processus. Cette approche nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de la réponse vaccinale afin de pouvoir l’améliorer chez les individus à risque (patients immunodéprimés ou atteints de cancer, population âgée, nourrissons) mais aussi de l’inhiber dans les patients atteints de maladie autoimmune.
Réduction
De façon à minimiser le nombre d'animaux utilisé nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un animal (récupération dans une seule expérience des fémurs, hanches et tibias des souris afin de réaliser des analyses en cytométrie en flux sur les fémurs, des études transcriptomiques sur les hanches et de l’histologie sur les tibias ; les rates sont coupées en 2 pour les mêmes raisons.) Afin d’obtenir des résultats statistiquement, nous avons calculé a priori l’effectif nécessaire. Dans notre cas, 9 animaux par groupe seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Afin de réduire la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé. Un suivi quotidien (par les animaliers ou les expérimentateurs au cours des procédures expérimentales) des animaux est réalisé. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir de la table de score des points limites (annexe) est supérieur ou égale à 10. Une analgésie des animaux n’est pas prévue avant l’atteinte du point limite 10. Ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale. Cependant pour les scores inférieurs à 10, différentes actions seront mises en place: 10 > score ≥ 6: nourriture humidifiée dans la cage 6 > score ≥ 4: nourriture dans la cage 4 > score ≥ 0: suivi quotidien augmenté à 2 visites journalière pour vérifier que les points limites n’évoluent pas défavorablement
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, un modèle transgénique pour notre protéine d’intérêt existant justifie encore plus le choix du modèle murin. Concernant le gène étudié ici il y a plus de 90% d’homologie de séquence entre l’homme et la souris. Les modèles d'immunisation sont bien décrits et ne nécessitent donc pas d'être ré-établis limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Enfin nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les souris seront âgées de 8 à 16 semaines, âge auquel le système immunitaire est totalement développé et fonctionnel.
Rôle des sous-populations neuronales à POMC dans la régulation énergétique et le développement de l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant jusqu'à deux fois en contention dans un tube d'IRM et donnant six gouttes de sang en deux heures après incision du bout de la queue. La moitié d'entre elles, soit 2 160 souris, reçoit un régime hyperlipidique pendant trois semaines à quinze mois pour développer une obésité, avec une prise de poids que le porteur estime pouvoir atteindre 200 % du poids initial. 2 400 subissent en plus une chirurgie cérébrale d'une heure pour injection d'un virus, et 1 920 un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq jours. Le porteur annonce à long terme de nouvelles stratégies contre l'obésité, quand l'objectif immédiat reste de cartographier des sous-populations de neurones de l'hypothalamus.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé très sérieux, souvent lié à des maladies comme le diabète ou les problèmes cardiaques. Dans le cerveau, une région appelée l’hypothalamus joue un rôle clé pour contrôler la faim et gérer l’énergie du corps. Cela se fait grâce à des cellules nerveuses spécialisées, appelées neurones, qui aident à limiter la prise alimentaire et à réguler le métabolisme. Si ces neurones ne fonctionnent pas bien, cela peut conduire à l’obésité. Cependant, tous les neurones ne sont pas identiques. Notre objectif est de mieux comprendre cette diversité pour savoir comment ces neurones influencent l'obésité. Pour cela, nous utiliserons des outils génétiques pour marquer ces neurones et suivre leur évolution dans le temps. Nous testerons également une technologie innovante pour activer ou désactiver précisément les certaines sous-population de neurones, grâce à des molécules spécifiques. Cela nous aidera à voir comment ces cellules influencent le métabolisme et le développement de l’obésité. Dans chaque modèle, nous soumettrons la moitié des souris à un régime riche en graisses pour observer l’apparition et l’évolution de l’obésité sur des périodes allant de quelques semaines à plus d’un an. Avec ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle des neurones de l’hypothalamus et leurs sous-populations, afin de trouver de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, plus d’un milliard de personnes dans le monde sont touchées par l’obésité, ce qui en fait une priorité de santé publique. Les traitements actuels s'avèrent peu efficaces, et les interventions durables se limitent souvent à des techniques invasives comme la chirurgie bariatrique (opération chirurgicale visant à réduire ou court-circuiter l'estomac), qui n'offre pas toujours de résultats garantis. Face à ce défi, approfondir notre compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’obésité devient crucial pour développer des solutions thérapeutiques plus adaptées et efficaces à l’avenir. À court terme, notre projet fournira de nouvelles informations sur les processus qui encouragent la consommation d’aliments hypercaloriques et participent au développement de l’obésité et des comorbidités associées. De plus, il s’inscrit dans un cadre de recherche international visant à déchiffrer les rôles spécifiques des différentes sous-populations de neurones. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux lutter contre l’obésité.
Procédures
Administration orale (1920 animaux) : Chaque souris recevra un médicament par voie orale une fois par jour pendant 5 jours. Cette procédure est rapide, ne durant que 15 secondes par animal, et ne nécessite pas d’anesthésie. Nous manipulons les souris avec soin pour éviter tout stress. Chirurgie cérébrale (2400 animaux) : Une intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale pour garantir l’absence de douleur. Chaque souris ne subira qu’une seule opération d’une heure maximum au cours de sa vie. Analyse de la composition corporelle (4320 animaux) : Pour mesurer la composition corporelle (graisse, muscles, etc.), une IRM est utilisée. Cette méthode est rapide (moins de 5 minutes) et réalisée en maintenant l’animal en contention pour réduire tout inconfort. Une même souris peut passer cette analyse au maximum deux fois dans sa vie. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline (4320 animaux) : Ces tests, réalisés une fois par animal, consistent à mesurer la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. La moitié des souris (2160) seront sous un régime hyperlipidique afin de mimer l’obésité.
Impact sur les animaux
Les souris du premier objectif recevront une administration orale de tamoxifène, un agent pharmacologique qui peut provoquer des effets secondaires. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Bien que l'administration par gavage oral soit indolore, elle nécessite une immobilisation complète de l’animal, générant un certain niveau de stress. Les souris du deuxième objectif, subissant une injection dans le cerveau à des endroits précis de virus, pourraient également ressentir des douleurs post-opératoires liées à la neurochirurgie. Ces douleurs sont principalement dues à l’incision cutanée du crâne et à la déshydratation associée à l’anesthésie, mais elles devraient diminuer dans les jours suivant l’intervention grâce au traitement analgésique mis en place. Lors du suivi du développement de l’obésité : Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Prise de poids consécutive au régime gras. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline : Mesure de la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. Ces tests reproduisent les conditions physiologiques suite à un repas. Les hyperglycémies et hypoglycémies sont monitorées mais n’induisent aucun mal-être.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem. Toutes les souris sont classées sans réveil.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la fonction et le mécanisme de développement de ces sous-populations de neurones associés à un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
La composition corporelle de tous les animaux adultes sera analysée in vivo par résonnance magnétique nucléaire. Ce type d’analyse permet de vérifier les changements de composition corporelle des animaux dans le temps et en fonction des différents régimes alimentaires. Cette approche permet d’éviter de sacrifier plusieurs lots d’animaux à des temps différents pour vérifier les changements de composition corporelle.Nous avons réalisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires dans les deux sexes afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Pour l’analyse des données, nous comparerons les différents groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux demandé correspond au maximum estimé pour le projet. Si, en cours d’étude, nous constatons qu’il est possible de le réduire, nous le ferons bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement pour les pièces d'hébergement. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise), qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise) (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales et seront soumises soit à un régime hyperlipidique induisant l’obésité ou un régime standard pendant 3 semaines, 3 mois, 6 mois, 9 mois ou 15 mois et 2 semaines (en tenant compte des 5 jours de tamoxifène et l’attente d’une semaine). Les souris sont donc utilisées jusqu’à un âge de maximum 17 mois et 2 semaines.
Etude de la neurodégénérescence dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Prise de sang sur animal vigile maintenu en contention deux minutes, puis anesthésie par injection pour la moitié d'entre elles : 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris portent une modification génétique reproduisant les dépôts cérébraux observés dans la maladie d'Alzheimer, et arrivent par cohortes de trois, six et neuf mois d'âge pour suivre la progression des lésions. Le porteur affirme que la pathologie n'est modélisable que dans un "organisme complet" et que seule une approche sur un mammifère fournira ces premières données. Les atteintes décrites se limitent au stress de contention et à la douleur de la piqûre, sans un mot sur ce que la neurodégénérescence elle-même inflige aux animaux pendant qu'elle s'installe.
Objectifs
Cette étude s'inscrit dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, une pathologie qui se caractérise par l'apparition de dépôts anormaux dans le cerveau, perturbant le fonctionnement des neurones et entraînant des troubles de la mémoire et du raisonnement. Les mécanismes exacts à l'origine de ces dépôts restent encore mal compris, bien que leur accumulation soit considérée comme un élément clé du développement de la maladie. Pour mieux les étudier, nous utilisons un modèle de souris spécialement conçu pour reproduire certains aspects de cette pathologie. Grâce à ce modèle, nous pourrons analyser en détail l’évolution de ces anomalies cérébrales et mieux comprendre leur impact sur le fonctionnement du cerveau.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment et pourquoi ces dépôts anormaux se forment dans le cerveau et quel impact ils ont sur la destruction progressive des neurones. Grâce à l’utilisation de notre modèle de souris, nous pourrons aussi mieux distinguer le rôle de ces dépôts de celui de l’inflammation, un facteur souvent impliqué dans la maladie. Enfin, les connaissances acquises pourraient aider à mettre au point de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir l’accumulation de ces dépôts et ainsi ouvrir la voie à de futurs traitements.
Procédures
Les animaux seront soumis à une prise de sang sur animal vigile par contension (2 minutes maximum par animal). La moitié des animaux seront anesthésiés par une injection médicamenteuse (1 minute maximum par animal).
Impact sur les animaux
La contension peut induire un leger stress et la prise de sang une légère douleur au niveau de l'aiguille. L'injection de l'anesthésique peut induire une leger stress et une légère douleur au point d'injection.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de la procédure afin de collecter et d'analyser différents organes.
Remplacement
Cette étude vise non seulement à approfondir nos connaissances sur la maladie d'Alzheimer, mais aussi à ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre cette pathologie. Celles-ci n'est modélisable que dans un organisme complet, à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques. Par ailleurs, seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Un effectif de 6 animaux par sexe et par condition a été choisi pour visualiser un effet statistiquement significatif et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adaptés
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, permettant une meilleure transposition des résultats vers des applications cliniques. Nous allons recevoir 3 cohortes de 3 âges différents : 3 mois, 6 mois et 9 mois dans le but de suivre la mise en place de la maladie sans laisser les animaux atteindre un stade critique.
Capacité régénérative des cellules satellites après dénervation.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Section définitive du nerf sciatique pour une partie, pincement du nerf par mini clamp pour l'autre : 54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération vise à savoir si le stress oxydatif lié à la dénervation altère la capacité des cellules satellites à régénérer le muscle. Le porteur décrit cette chirurgie comme "modérément invasive" comparée à une chirurgie abdominale, et souligne que les souris, quadrupèdes vivant à ras du sol, sont peu invalidées par la perte d'usage d'une patte arrière. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable", la mise en culture des cellules satellites leur faisant perdre l'état de quiescence qu'il veut étudier.
Objectifs
Il a été décrit que pendant la dénervation, les cellules musculaires subissent un fort dommage oxydatif et nous avons récemment montré que le dommage oxydatif peut modifier les capacités régénératives des myoblastes. Notamment, un dommage oxydatif chimiquement induit diminue la capacité de fusion et d’accrétion de cellules dérivant des cellules satellites musculaires. Les cellules satellites sont quiescentes in vivo et elles peuvent être isolées du muscle adulte. Une fois en culture, elles perdent leur statut quiescent pour proliférer en myoblastes. Actuellement les conséquences sur les cellules satellites du stress oxydatif lié à la dénervation sont peu connues. Nos travaux sont destinés à comprendre si et comment l’activité régénérative des cellules satellites est altérée pendant le processus de dénervation. La base du matériel biologique étudié correspond aux muscles innervés par le nerf sciatique. Notre projet a donc 3 objectifs principaux : 1. Évaluer l’ampleur du dommage oxydatif dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation par marquage des espèces réactives de l’oxygène (ROS), mais aussi à l’aide de marquages fluorescents spécifiques visualiser les modifications chimiques de l’ADN, et les modifications des protéines impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN en particulier au niveau des nucléoles lieu de synthèse des ARN ribosomiques. 2. Évaluer la réparation des dommages oxydatifs dans les cellules satellites et les myotubes après dénervation à différents temps après la dénervation. La réparation sera évaluée par la disparition des signaux observés dans le point 1 3. Mesurer l’index de fusion des cellules satellites après dénervation, par mise en culture et différentiation. 4. Mesurer l’accrétion des cellules satellites après dénervation, par marquage fluorescent de leur ADN et co-culture avec des myotubes non marqués. L’ensemble des tissus prélevés seront soumis à des analyses, en imagerie à fluorescence, éventuellement biochimiques par extraction de protéines et d’extraction/isolement des cellules satellites pour leur mise en culture in vitro
Bénéfices attendus
Ce projet a deux volets qui ont un intérêt scientifique général : Tout d’abord nous allons évaluer comment le dommage oxydatif conséquence de la dénervation va affecter les fibres musculaires et les cellules satellites. Nos résultats dans les cellules en culture nous laissent présager que ce dommage va impacter la capacité régénérative des cellules satellites et contribuer au processus d’atrophie musculaire post-dénervation. Une étude aussi complète de l’effet des dommages oxydatifs dans la problématique de la dénervation n’a jamais été effectuée. Quelques études montrent que le nombre de cellules satellites musculaires ne change pas après dénervation, néanmoins il n’y a aucune étude qui montre que leur capacité à fusionner ou à accomplir l’accrétion est la même. Cette investigation est d’autant plus importante car ses conclusions pourraient être applicables aux accidents de dénervation ou pincements des nerfs qui peuvent survenir chez l’humain. Il est important de connaitre les conséquences du dommage oxydatif induit par la dénervation pour pouvoir chercher des thérapies adaptées pour soulager la conséquente atrophie musculaire (détoxification des ROS, thérapies anti-oxydants, lignes directrices nutritionnelles). De plus, il est essentiel de vérifier si l’activité de régénération des cellules satellites est conservée après dénervation et comprendre comment la préserver pour limiter l’atrophie musculaire. Au vu des bénéfices attendus en termes scientifiques et médicaux et de l’impact très limité sur les souris, nous estimons que cette étude sera extrêmement rentable pour la société.
Procédures
Une partie des souris subira par chirurgie une dénervation définitive par section du nerf sciatique et une autre partie un pincement du nerf permettant une dénervation réversible.
Impact sur les animaux
La technique de dénervation définitive, par section du nerf sciatique présente l’avantage d’être une intervention chirurgicale modérément invasive si on la compare par exemple à une chirurgie abdominale. Les conséquences de la dénervation permettent une vie quasi-normale en captivité des animaux traités, la cage d’élevage comprenant de la litière adaptée ainsi qu’un enrichissement sous forme de petite cabane. La technique microchirurgicale de dénervation est effectuée avec le maximum de précautions pour limiter les douleurs post-opératoires des animaux (anesthésie générale et locale du nerf et administration d’antalgique en pré-opératoire et anti-inflammatoire en post-opératoire). La dénervation est effectuée sur l’une des pattes arrière de la souris et ne concerne pas tous les muscles, d’autres afférences nerveuses permettent à la souris de se relever ainsi que ses déplacements sans difficulté sur la litière de la cage. La dénervation par pincement du nerf sciatique reprend les éléments de chirurgie de la dénervation définitive, la section du nerf étant remplacé par son pincement à l’aide d’un mini clamp hémostatique. 15 jours après pincement du nerf les souris commencent à retrouver une mobilité quasi normale qui est complète à 30 jours, seule persiste une atrophie musculaire comme observée lors de la dénervation définitive. Il est par ailleurs à considérer que les souris étant quadrupèdes et vivant à ras du sol, elles sont par conséquent peu invalidées par cette opération pour une vie en captivité.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le recours à des souris est indispensable parce que la dénervation induit des modifications physiologiques sur l’ensemble du muscle qu’il est impossible de reproduire sur des cellules en culture. De plus, la mise en culture des cellules satellites modifie leur état de quiescence, ce qui peut modifier leur réponse au stress et aux dommages à l’ADN. En effet, la réparation de l’ADN n’est pas la même dans des cellules qui se divisent, des cellules qui ne se diviseront plus ou des cellules quiescentes qui ont toujours une possibilité de se diviser. Nous avons réalisé, en amont de ce projet, des tests préliminaires sur cellules en culture pour certaines mises au point de nos analyses (Immunofluorescence, colorations, traitement aux agents oxydants) permettant de ne recourir aux animaux que lorsque c’est absolument nécessaire.
Réduction
La première phase du projet portant sur le comportement des cellules souches musculaires à fusionner ou s’agréger in vitro après dénervation a pu être réalisée en limitant à 18 le nombre de souris initialement prévu et a permis une bonne robustesse de nos observations. Dans la deuxième phase, où nous nous sommes rendu compte de la faible durée de conservation des muscles fixés pour des signaux histologiques de qualité, nous estimons nécessaire l’utilisation de 36 souris pour satisfaire l’ensemble des analyses à réaliser comprenant des analyses histologiques en immunofluorescence sur des fibres musculaires isolées. Ces considérations nous permettent de maintenir à 54 le nombre de souris.
Raffinement
Grâce aux précautions prises lors de l’anesthésie générale ainsi que les mesures médicamenteuses analgésiques et anti-inflammatoires pratiquées en pré et post-opératoire, les souris traitées retrouvent très rapidement un comportement similaire à leur congénère non traités Les animaux seront élevés en groupe avec une litière adaptée et quelques éléments d’enrichissement avec pas plus de 5 individus par cage aux dimensions adaptées, et observés quotidiennement par les personnels de l’établissement utilisateur de façon à pouvoir intervenir le plus rapidement possible pour limiter la douleur ou souffrance e. Par ailleurs, pour faciliter l’alimentation des souris dénervées qui pourraient présenter une difficulté en raison de l’absence temporaire de réactivité de la patte dénervée, la nourriture sera placée de façon plus accessible dans la cage. Pour respecter le mode de vie grégaire de l’espèce, des souris compagnons de même lignée, âge et sexe seront ajoutés quand ce sera nécessaire pour éviter l’isolement des souris en expérimentation.
Choix des espèces
La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Nous avons choisi le stade jeune adulte de 8 semaines pour notre étude car la croissance musculaire est terminée et les cellules satellites ne se divisent plus dans les conditions d’élevage pratiquées.
Exploration de la contribution des fibres du toucher social dans la modulation de la douleur post lésionnelle. #1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement privées d'une sous-population de neurones du toucher, 40 souris reçoivent un traitement quotidien pendant cinq jours, deux injections espacées de 72 heures, puis pour une partie d'entre elles quatre injections supplémentaires, avant neuf séances de stimulation mécanique de la patte arrière étalées sur quarante jours. La moitié d'entre elles est utilisée dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'autre moitié dans des procédures modérées. Toutes sont tuées pour prélever les tissus, après un transfert vers un second établissement où l'activité électrique de leur moelle épinière est explorée pendant trois semaines au maximum. Le porteur conclut que ses données antérieures "ne montrent aucun effet délétère" et ramène les nuisances à un isolement en box de deux heures et à la stimulation de la patte, alors que la moitié des souris est déclarée en souffrance sévère dans le même document.
Objectifs
Cette étude a pour but de comprendre le rôle d’une sous-population spécifique de neurone dans la modulation de la douleur. Pour ce faire, nous utilisons une souris génétiquement dépourvue de cette sous-population de neurone. Nos données démontrent, pour la première fois, un rôle majeur de cette sous-population dans la modulation de la douleur. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à ce nouveau rôle anti-douleur de cette sous-population neuronale, nous souhaitons, dans cette étude (impliquant 2 établissements utilisateurs), explorer l’activité électrique mise en jeu au niveau de la moelle épinière. Les données émanant de cette nouvelle étude offriront une nouvelle base pour le développement de nouveaux traitements adaptés à différents types de douleurs, dont souffrent notamment les patients atteints de cancer.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une sous-population spécifique de neurone ayant un rôle majeur dans la modulation de la douleur. A court terme, ce projet permettra donc d’accroitre nos connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les douleur chronique. Ainsi, nos travaux offriront à long terme une nouvelle base pour le développement de nouveaux traitements adaptés à différents types de douleurs, dont souffrent notamment les patients atteints de cancer.
Procédures
Au sein de l’établissement utilisateur 1, l’ensemble des animaux recevront, premièrement un traitement une fois toutes les 24h, pendant 5 jours consécutifs. 1 semaine plus tard, l’ensemble des souris recevront deux injections espacées de 72h. Ensuite, et seulement une partie des souris, recevront, 4 semaines minimum après l’injection, quatre injections espacées de 48h. Les animaux mentionnés dernièrement feront l’objet d’une étude comportementale sur une durée de 40jours pour un total de 9 sessions de stimulations mécaniques de la patte arrière. Chaque session est composé d’un maximum de 7 stimulations mécaniques espacées sur une durée d’une heure. Cette étude a pour but d’évaluer la sensibilité mécanique de l’animal. L’ensemble des animaux de ce projet seront ensuite transférés de établissement utilisateur 1 à l’établissement utilisateur 2 pour l’exploration de l’activité électrique mise en jeu au niveau de la moelle épinière, pour une durée n’excédant pas 3 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances du test comportemental sont l'isolement de l'animal en box individuel pendant une durée maximale de 2h ainsi que la stimulation mécanique de la patte arrière. Ces nuisances sont susceptibles de générer du stress mais le personnel est formé à la réalisation de ces actes. Nos données, issues d’études précédentes, ne montrent aucun effet délétère.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans chaque procédure seront euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Sur la base d’études pilotes, nous avons réduit au minimum nos effectifs permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. L’optimisation de notre plan expérimental (enchaînement de différents tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, partage de tissus) permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. L’utilisation d’outils informatiques prenant en compte la variabilité liée au traitement, aux tests comportementaux ainsi que le nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable, nous permettent de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement, ainsi que dans les analyses électrophysiologiques prévues dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.
Raffinement
Les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire au mieux voir supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité de locaux d'expérimentation, de matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) limitant le stress des animaux et favorisant la validité des expériences ; b) recours à l'anesthésie/analgésie ; c) établissement d’une grille de score et des points limites les plus précoces possibles. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs est assuré par un transporteur agréé (température et hygrométrie contrôlée pendant le transport). Les animaux arrivant à destination font l'objet d'une période d'acclimatation de 3 jours (au minimum) avant toute utilisation, afin de limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Notre sous-population neuronale d’intérêt étudiée chez la souris est similaire à celle décrite chez l'homme. Les animaux utilisés dans cette étude seront utilisés à partir de 3semaines d’âge, tel qu'il a été décrit dans la littérature.
Rôle des molécules S100A dans la pathogenèse du diabète de type 2 EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Gavées jusqu'à quinze fois un jour sur deux, saignées seize fois par la queue, entraînées sur tapis roulant cinq fois trente minutes par semaine pendant six semaines, les souris subissent aussi la pose d'une pompe osmotique sous la peau, des tests de force et un isolement de 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. 1 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur reconnaît que les gavages répétés peuvent blesser l'œsophage et réduire la prise alimentaire, que la pompe provoque des douleurs plusieurs jours, que la course cause des blessures aux pattes et qu'une des molécules injectées est toxique pour les cellules du pancréas, avec crampes abdominales. Toutes sont tuées et nécropsiées en fin de procédure, sans qu'aucune soit réutilisée, l'objet étant le rôle d'une protéine dans le diabète de type 2 et la fonte musculaire.
Objectifs
L'obésité est un facteur de risque majeur de diabète de type 2 (DT2) qui représente un fardeau de santé publique et diminue l’espérance de vie en bonne santé. Ces deux pathologies sont également associées à une insulino-résistance et une sarcopénie, i.e. perte progressive de masse et de force musculaire. Nous avons mis en évidence une surexpression marquée d’une protéine d’intérêt. Cette protéine peut s’hétérodimériser avec une autre protéine de la même famille pour former un complexe multi-protéique. Ces protéines jouent un rôle clé dans l’inflammation et l’immunité. Cependant leur rôle dans la pathogenèse du DT2 reste incertain. Nous émettons l’hypothèse que cette protéine pourrait jouer un rôle causal dans les altérations métaboliques et fonctionnelles du muscle squelettique dans un contexte d’obésité et de vieillissement. L’objectif de ce projet est de : 1) démontrer un rôle causal de notre protéine d’intérêt dans le développement de l’insulino-résistance et de la sarcopénie ; 2) évaluer si l’inhibition de l’action de cette protéine prévient au moins en partie du développement de l’insulino-résistance et/ou de la sarcopénie associée à l’obésité et à l’âge. Ces questions exigent le recours au modèle animal pour se placer dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet visant à étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie promet de générer des bénéfices substantiels tant au niveau scientifique que clinique. En premier lieu, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ces pathologies métaboliques et musculaires, en étudiant spécifiquement le rôle de notre protéine d’intérêt. Une connaissance plus détaillée de l'implication de cette protéine pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, offrant ainsi des perspectives innovantes pour le développement de traitements spécifiques et efficaces. Sur le plan clinique, l'identification de la protéine comme un biomarqueur clé dans l'inflammation chronique associée à l'obésité, l'insulino-résistance et la sarcopénie pourrait améliorer le diagnostic précoce et la stratification des patients. Les praticiens pourraient ainsi mieux évaluer le risque de complications métaboliques et musculaires chez les patients obèses et ceux présentant une résistance à l'insuline, permettant une intervention préventive plus rapide et personnalisée. De plus, cibler cette protéine dans des approches thérapeutiques pourrait offrir une nouvelle avenue pour réduire l'inflammation et améliorer la sensibilité à l'insuline, atténuant ainsi les effets délétères de ces conditions sur la santé des patients. L'impact potentiel sur la gestion de la sarcopénie est également significatif. En étudiant les mécanismes par lesquels notre protéine d’intérêt contribue à la perte de masse musculaire et à la dysfonction métabolique, ce projet pourrait mener à des stratégies visant à préserver la masse et la fonction musculaire chez les personnes âgées et les patients atteints de maladies chroniques. Cela pourrait améliorer considérablement la qualité de vie et l'autonomie des individus affectés, tout en réduisant les coûts de santé associés aux complications liées à la sarcopénie. En somme, ce projet offre une opportunité de faire progresser notre compréhension des maladies chroniques liées à l'obésité et au vieillissement, tout en ouvrant la voie à des interventions thérapeutiques novatrices et personnalisées pour améliorer la santé et le bien-être des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 15 gavages (1 jour sur 2) et/ou à 7 injections sur 5 jours consécutifs seulement ainsi que 16 prélèvements sanguins à la queue (4 séquences de 7 prélèvements consécutifs). Tous les actes précédemment cités ne durent qu’au maximum 30 secondes chacun. Certains animaux auront une injection unique sous anesthésie générale. D’autres animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale une fois au cours de leur vie pour la pose de mini-pompe osmotique. Certains animaux auront une alimentation enrichie en lipides pendant un maximum de 12 semainesou encore deux tests d’effort et de préhension au maximum. Un nombre limité d’animaux sera entrainé sur tapis roulant 5 fois 30 minutes maximum par semaine pendant 6 semaines consécutives. Certains animaux subiront au maximum deux isolements de 3 minutes pour mesures de composition corporelle et d’autres subiront un isolement pour mesure de dépense énergétique pendant un maximum de 48h. Dans le second établissement utilisateur, un nombre restreint d’animaux subira une injection de traceur radioactif pendant 15 minutes avant mise à mort et l’ensemble des animaux seront mis à mort et nécropsiés.
Impact sur les animaux
Le régime hyperlipidique induit une obésité chez les animaux pouvant créer un inconfort. Le gavage répété peut causer du stress et des blessures oesophagiennes (entrainant une diminution de la prise alimentaire) abolis après arrêt des gavages. La pose d’une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie gazeuse peut provoquer des douleurs quelques jours après l’opération. La surexpression de notre protéine peut entraîner une inflammation associée à l’obésité et engendrer l'aggravation de l'insulino-résistance ainsi qu’une diminution des fonctions musculaires. Les prélèvements répétés de sang lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer du stress et des douleurs légères pendant 120 minutes au maximum. Les mesures de composition corporelle occasionnent un léger stress dû à l’isolement des animaux dans un tube de contention pendant 2 à 3 minutes seulement. Les tests de force provoquent un stress pendant 120 minutes au maximum. La course provoque un stress pendant 120 minutes au maximum et peut provoquer des blessures légères aux pattes. La mesure de calorimétrie provoque un stress dû à l’isolement visuel et olfactif pendant 48h au maximum. Le transfert adoptif de cellules immunitaires peut provoquer une inflammation de bas grade. L’injection de certaines molécules est cytotoxique pour les cellules pancréatiques et peut engendrer des crampes abdominales.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort de manière réglementaire en fin de procédure et sont nécropsiés pour récolte d’organes et analyses ex vivo. Aucun animal de ce projet ne sera ré-utilisé.
Remplacement
Nous avons effectué des travaux préliminaires sur des modèles in vitro de myotubes humains montrant des effets de notre protéine d’intérêt sur la sensibilité à l’insuline et l’atrophie des myotubes. Le recours au modèle animal est indispensable pour évaluer les effets de cette protéine dans un contexte organismal complexe et intégré. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.
Réduction
Des études in vitro sont réalisées en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur les animaux. Des études pilotes permettront d'ajuster le protocole expérimental pour minimiser le nombre d'animaux utilisés dans les études principales ; ces études pilotes permettront aussi de s’assurer de la fiabilité du modèle. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats significatifs sont effectués.
Raffinement
Les animaux auront une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le responsable de la mise en oeuvre sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Lors des actes chirurgicaux ou injections douloureuses des anesthésies gazeuses sont prévues avec utilisation d’antalgiques en périopératoire. Lors des injections de produits provoquant des douleurs nous administrerons des antalgiques en amont. Pour les tests d’exercices physiques les animaux seront préalablement acclimatés et surveillés afin de détecter d’éventuelles blessures aux pattes. Pour les manipulations nécessitant l’isolement des animaux pendant 48 heures maximum, une surveillance accrue sera appliquée lors de leur retour en groupe afin de détecter des comportements agressifs. Nous pourrons alors ajouter des enrichissements dans les cages voire séparer les individus trop agressifs. Pour les animaux spontanément diabétiques nous réaliserons un change de litière plus fréquent et des contrôles de la glycémie. Pour l’expérimentation terminale dans l’établissement n°2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles de souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies métaboliques. Le modèle de souris choisi se prête bien aux phénotypage métabolique en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes moléculaires des maladies et de sa bonne susceptibilité aux régimes obésogènes. De plus, l’utilisation de souris spontanément obèses et diabétiques et leurs contrôles non-diabétique permettent une étude plus fine des mécanismes moléculaires. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 8 semaines. L’intérêt est ici d’étudier l’obésité, son développement et ses complications chez l’individu adulte.
Exploration de nouveaux agents radiopharmaceutiques couplant le diagnostic et la thérapie pour contourner la résistance des cancers aux traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Rats : 256
Pour tester des médicaments radioactifs censés à la fois repérer et détruire des tumeurs, 1 536 souris et 256 rats reçoivent deux injections de cellules cancéreuses, puis jusqu'à quatre injections de traceurs ou de traitements. Tous vont être tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, leurs organes étant prélevés pour vérifier au microscope ce que l'imagerie a montré. Ils passent jusqu'à huit sessions d'imagerie sous anesthésie, de 15 à 70 minutes chacune, subissent des prélèvements sanguins et parfois une ablation chirurgicale de la tumeur de vingt minutes, avec radiothérapie, chimiothérapie ou immunothérapie associées. Le protocole se déroule sur deux sites, ce qui impose à ces animaux porteurs de tumeurs un transport d'une heure au maximum, suivi d'une journée de récupération.
Objectifs
Aujourd'hui, de nombreuses résistances aux traitements conventionnels contre le cancer surviennent. La radiothérapie interne, qui utilise un atome radioactive pour cibler et détruire les cellules tumorales, a récemment montré des résultats impressionnants pour certains types de cancers, comme ceux de la prostate et les cancers neuroendocriniens. Néanmoins, cette nouvelle voie prometteuse est limitée par des phénomènes de résistances et l’apparition d’effets secondaires. Ces défis justifient l'exploration de nouvelles générations de médicaments radiomarqués plus attractifs, capables d’être utilisés en thérapie mais aussi en diagnostic. En combinant ces deux aspects , le radiopharmaceutique a ainsi le potentiel pour : - améliorer le ciblage des cellules tumorales et ainsi limiter les effets indésirables ; - suivre en temps réel les effets de la thérapie pour l’ajuster et ainsi diminuer les phénomènes de résistance . Notre projet vise à développer une nouvelle génération de médicaments radiomarqués qui se lieront spécifiquement à des marqueurs tumoraux via des ligands à base d’anticorps et de peptides. Nous testerons nos ligands sur des modèles tumoraux chez des rongeurs. Nous tirerons partie de l’utilisation combinée de plusieurs types d’imagerie pour affiner la sélection des ligands les plus intéressants pour cette stratégie. Nous souhaitons également étudier l’effet de la combinaison de notre approche de radiothérapie interne avec d’autres modalités thérapeutiques susceptibles de renforcer son action et/ou de minimiser les effets secondaires. Ainsi, nous combinerons l’utilisation de nos radioligands à : - des ultrasons thérapeutiques, permettant de minimiser les effets indésirables sur les tissus sains ; - des nanoparticules radioamplificatrices, pour augmenter l'efficacité de la radiothérapie, tout en minimisant les effets secondaires ; - des immunostimulateurs, pour renforcer la réponse immunitaire contre les tumeurs ; - de la chirurgie, afin de retirer un maximum de tissus tumoraux et d’éliminer les cellules tumorales infiltrantes ne pouvant difficilement être réséquées. Le projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la radiothérapie interne (Site Imagerie) et l’imagerie et un site pour la radiothérapie externe (site IR).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant des biomarqueurs prédictifs de l’efficacité des traitements, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés avec des thérapies comme l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (qui bloquent des mécanismes spécifiques des tumeurs), seuls certains patients en bénéficient pleinement. Plusieurs facteurs influencent l’efficacité des traitements, notamment le type de tumeur, le stade de la maladie, le système immunitaire du patient et des facteurs génétiques. Pour traiter efficacement le plus grand nombre de patients, il est crucial de les regrouper en sous-groupes homogènes afin de prédire quelle thérapie leur conviendra le mieux. Cette stratification améliorée des patients repose sur l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la détection de ces biomarqueurs se fait principalement par des techniques invasives comme l’immunohistochimie sur des biopsies. L’imagerie offre une alternative moins invasive, permettant une évaluation dynamique et quantitative à l'échelle du corps entier. L'objectif de notre projet est de valider des couples biomarqueurs-radioligands (basés sur des anticorps ou des peptides) pour l’imagerie. Cette approche vise à prédire l’efficacité thérapeutique et de proposer un traitement adapté, fournissant ainsi aux oncologues un outil complémentaire aux biopsies pour personnaliser davantage les traitements. Ainsi, ce projet aspire à offrir un outil décisionnel puissant. Cela permettra une meilleure personnalisation des traitements en fonction des caractéristiques spécifiques de chaque patient, améliorant ainsi les résultats et la qualité de vie des patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o La mise en place d'un modèle tumoral dans ce projet est essentielle pour reproduire les caractéristiques de la maladie et évaluer l'efficacité des nouveaux traitements dans un environnement contrôlé. Pour la mise en place de ce modèle tumoral, des cellules tumorales seront injectées (5 minutes d’intervention, deux injections par animaux). (Site Imagerie) o L’injection des traitements et d’agents d’imagerie radioactifs (pour l’imagerie ), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 4). (Site Imagerie) o Une anesthésie lors des différentes sessions imageries et de l’application des traitements (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie au cours de l’étude pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). (Site Imagerie et site IR) o Un prélèvement sanguin sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie). (Site Imagerie) o La chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésiant (maximum 20 minutes de chirurgie). (Site Imagerie)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : • Le développement de la tumeur peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. • L’injection des radioligands ou de médicaments peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Lors du réveil en fin de session d’imagerie, les souris peuvent être désorientées et stressées. • Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines et sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature. • La résection tumorale peut induire une inflammation.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci. Cela permet tout d'abord de valider, à un niveau microscopique, des éléments observés par imagerie à une échelle plus large, tout en approfondissant notre compréhension des mécanismes impliqués, notamment le rôle du système immunitaire et l'identification de différentes populations cellulaires, dont certaines ne peuvent pas être visualisées par imagerie.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires 3D impliquant les lignées testées ensuite comme modèle tumoral chez l’animal afin de déterminer la pertinence des stratégies thérapeutiques et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro permettent d’éviter l’utilisation d’animaux en validant des paramètres qui ne seront plus nécessaires de valider dans le modèle animal. Cependant, le microenvironnement tumoral global avec la complexité immunitaire est difficilement reproductible in vitro et la pharmacocinétique des traitements injectés ne peut être déterminée qu’in vivo.
Réduction
Différentes utilisations de systèmes d’imagerie seront mises en place pour réduire de manière conséquente le nombre d’animaux nécessaires pour l’évaluation thérapeutique en suivant de manière individuelle des paramètres cliniques tels que la taille de la tumeur, l’apparition de métastases mais également l’apparition d’inflammation telle que les colites. Les données obtenues permettront de manière individuelle de définir une biodistribution des biomarqueurs dans une continuité temporelle. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte nos résultats préliminaires et des données publiées concernant l’efficacité thérapeutique attendue (écarts-types et variations observés).
Raffinement
Les injections de cellules tumorales et de produits d’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Leur suivi régulier assurera de mettre en place des réponses adaptées devant tout signe de souffrance. Des points limites ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance. Le suivi régulier du poids des animaux favorise leurs interactions régulières avec le personnel et limite ainsi le stress durant les sessions d’imagerie. Pour le transport des animaux entre les deux sites, d’une durée maximale d’une heure, il sera réalisé suite à l’accord vétérinaire donné en fonction des statuts sanitaires et réalisé dans des cages de transport avec de l’eau en gelée et la nourriture en gelée dans un véhicule climatisé. Une journée de récupération entre chaque lieu de transport est prévue.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont des animaux de choix pour la mise en place de modèles tumoraux, pour les lignées cellulaires tumorales qui sont utilisées dans ce projet. Leur taille est adaptée pour la manipulation et l’imagerie de tout le corps. Les études seront menées soit sur des rongeurs immunodéficients afin d’évaluer l’impact du traitement sur des cellules humaines, soit sur des modèles de rongeurs immunocompétents pour analyser son effet sur des cellules tumorales de rongeurs dans un contexte immunitaire préservé. Les souris et les rats utilisés dans ce projet auront atteint un stade de jeune adulte (5 semaines) à adulte (8 semaines), une tranche d’âge représentative des cancers chez les patients adultes. Cela nous permettra de mieux simuler les conditions cliniques et de développer des thérapies qui pourront être rapidement appliquées en clinique pour offrir de meilleures options de soins aux patients.
Etablir une horloge épigénétique chez la poule pondeuse
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Issues de la réforme des poules d'un sélectionneur, 48 poules pondeuses de 68 semaines entrent dans une station expérimentale, rejointes par 48 poules de 18 semaines de la même population. Ces 96 poules vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur foie. Chacune subit entre une et quatre prises de sang de 2 ml au sinus occipital, entre 20 et 130 semaines d'âge, et 12 poules sont tuées à chacun des huit âges retenus. L'horloge épigénétique visée doit aider à repérer les poules qui vieillissent moins vite et à relier cet écart au taux de ponte ou à la solidité de la coquille, et le porteur écrit que ces travaux pourraient déboucher sur "de nouveaux marqueurs à prendre en compte dans la sélection des animaux".
Objectifs
Le présent projet entre dans un projet plus large visant à mieux comprendre comment les poules pondeuses vieillissent mais pas juste en comptant les semaines de vie mais en regardant l’ADN des tissus. Pour ça, on utilise une sorte de "montre biologique" appelée horloge épigénétique. La 1ère étape consiste à identifier les marques chimiques dans l’ADN permettant de prédire/estimer l’âge biologique des poules, ceci en utilisant une cohorte de poules d’âges variés dont la mise en place fait l’objet de ce présent projet. En effet ces marques appelées méthylations sont connues pour s’accumuler avec l’âge. La 2nde étape consiste à analyser ces marques sur des poules d’un âge donnée et de comparer leur âge biologique avec leur âge réel. On peut alors identifier des poules qui vieillissent "plus vite" que prévu ou "plus lentement". Enfin, la 3ème étape est d’évaluer si ces écarts entre âge biologique et âge réel peuvent prédire des écarts de performances pour des caractères d’intérêt tels que le taux de ponte, poids ou qualité des œufs, présence d’ascites, …. De telles prédictions ont été déjà obtenues chez l’humain pour différentes maladies. Concernant l’étape 1, différentes horloges épigénétiques ont été développées chez des espèces variées comme le poulet de chair mais jamais encore chez la poule pondeuse. Aussi ce projet a pour objectif de créer 2 horloges pour ce type de poules : une qui regarde l’ADN des cellules du sang (collecte non invasive), et l’autre qui regarde l’ADN des cellules d’un tissu métabolique, le foie, fortement impliqué dans la production d’œufs et maladies métaboliques. Par ailleurs, on souhaite qu’elles fonctionnent que les poules vivent en cage ou au sol. Aussi on prendra des poules issues des 2 systèmes avant leur entrée où elles seront toutes mises au sol.
Bénéfices attendus
Comme indiqué plus haut, grâce aux 2 horloges épigénétiques ‘sang’ et ‘foie’ développées dans le présent projet (étape 1), nous pourrons alors analyser les différences entre âge réel et âge biologique de centaines de poules (étape 2) pour lesquelles nous avons déjà les données de méthylation sang et foie. nous pourrons alors évaluer le pouvoir prédicteur de ces différences pour des phénotypes d’intérêt majeur en filière œuf comme le taux de ponte et la solidité de la coquille qui diminuent avec l’âge (étape 3). Autrement dit, y-a-t-il des poules à 70 ou 90 semaines qui ont vieilli moins vite que d’autres et si oui ont-elles tendance à avoir des performances meilleures ? ». De tels travaux pourraient alors déboucher sur de nouveaux marqueurs à prendre en compte dans la sélection des animaux.
Procédures
Les prélèvements sanguins seront effectués au sinus occipital entre 1 et 4 fois aux âges indiqués ci-dessous: 1) 48 poules seront prélevées aux âges de 70 , 90, 110 et 130 semaines d'âge soit toutes les 20 semaines . 2) 48 poules seront prélevées aux âges de 20, 30, 50 et 70 semaines d’âge soit entre 10 et 20 semaines . Le prélèvement sera réalisé en quelques secondes.
Impact sur les animaux
La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome.
Devenir
Suite à la procédure des prises de sang ultimes, les 96 animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements des foies.
Remplacement
Les deux horloges épigénétiques seront ainsi utilisées dans le cadre de l’étude de la longévité fonctionnelle. Il est inenvisageable d'utiliser un autre modèle pour analyser les différences entre âge chronologique et âge épigénétique et évaluer leur pouvoir prédicteur pour différents phénotypes d’intérêt chez la poule pondeuse à un âge avancé.
Réduction
Ainsi, deux lots de poules vont entrer à la station expérimentale : 1) un premier lot de 48 poules dites « vieilles » arrivera à l’âge de 68 semaines en mai 2024. Nous profitons ainsi de la réforme des poules d’un sélectionneur. Ces poules seront alors prélévées aux âges de 70 , 90, 110 et 130 semaines d’âge 2) un second lot de 48 poules dites « jeunes » arrivera à 18 semaines mi-août, ce lot issu de la même population que le lot précédent et fourni par le même sélectionneur, sera alors etudié aux âges de 20, 30, 50 et 70 semaines d’âge. Par ailleurs, afin que l’horloge soit utilisable pour des poules au sol ou en cage, nous analyserons à chaque âge 12 poules dont 6 poules issues de chacun des 2 systèmes d’élevage. Il en résulte un total de 12 poules x 8 âges qui 1° feront l’objet d’une prise de sang de 2 ml à chaque âge mentionné et/ou 2) qui seront sacrifiées à chacun des 8 âges afin de collecter le foie.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets où ils resteront en groupe. La taille du parquet est suffisante (3 m²) pour permettre aux poules pondeuses de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire, abreuvement et nid. Les animaux auront à disposition plusieurs enrichissements leur permettant de grimper et de se cacher. Toute manifestation de symptômes persistants définis par un point limite entraînera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Les prises de sang seront effectuées dans un lieu différent des espaces d’hébergement.
Choix des espèces
La poule pondeuse a été choisie comme modèle, car il s’agit de l’espèce agronomique cible du projet. Concernant les différents âges retenus (20, 30, 50, 70, 90, 110 et 130 semaines), ils ont été choisis de manière à inclure les âges de 70 et 90 semaines, pour lesquels des données sont déjà disponibles par ailleurs et seront ici re-analysées sous l’angle de l’horloge épigénétique. Autour de ces deux âges clés, nous avons intégré au moins deux autres classes d’âge espacées d’environ 20 semaines en amont et en aval, pour la raison suivante : ces differents ages permettent, par exemple, de détecter d’éventuelles poules âgées de 70 semaines qui seraient plus jeunes biologiquement avec un âge biologique non pas de 70 sem. mais de 50 voire 30 semaines ; Ou encore des poules de 90 semaines qui seraient, au contraire, biologiquement plus âgée jusqu’à 20 à 40 semaines de plus par rapport à leur âge réel. Grâce à cet étalement progressif de 20 à 130 semaines, l’horloge épigénétique que nous développons pourra ainsi capter finement les écarts entre âge biologique et âge réel.
Impact des fongicides sur le neurodéveloppement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris gestantes sont gavées de fongicide une fois par jour pendant 7 semaines, et 72 souris âgées de 7 semaines sont opérées sous anesthésie pour l'implantation d'une puce sous la peau, avant une série de tests comportementaux. 126 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques et moléculaires. Les tests portent sur l'anxiété, les fonctions sensori-motrices, la coordination motrice, la force musculaire, les interactions sociales, l'activité circadienne pendant 32 heures, l'apprentissage et la mémoire, dont un test de moins d'une heure par jour pendant deux semaines, une accumulation que le porteur dit susceptible d'induire un "stress léger". Il ne nomme ni les fongicides testés ni les doses, et ne dit pas combien de femelles gestantes sont gavées.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons leur comportement, leur motricité et leurs capacités cognitives, tout en analysant les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées.
Bénéfices attendus
L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de comportement, de motricité et de cognition, dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). 72 animaux seront soumis à une chirurgie mini-invasive à l’âge de 7 semaines pour l'insertion d’une puce radio-fréquence sous la peau (5 min sous anesthésie gazeuse avec un anti-douleur local). Ces animaux seront également soumis à des tests comportementaux permettant d’évaluer l’anxiété (5 minutes, deux fois par animal), les fonctions sensori-motrices (30 minutes, deux fois par animal), la coordination motrice (deux tests de 5 minutes chacun, deux fois par animal), l’apprentissage et la mémoire (un test de 30 minutes, une fois par animal, ainsi qu’un test de moins d’une heure par jour pendant deux semaines), la force musculaire (5 minutes, une fois par animal), l’activité circadienne (32 heures, une fois par animal) et les interactions sociales (50 minutes, une fois par animal).
Impact sur les animaux
Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'oesophage. La chirurgie mini-invasive entrainera une légère douleur. L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi qu'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Les animaux seront anesthésiés et analgésié lors de l'implatation sous la peau d'une puce.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques et comportementales pertinentes pour évaluer la toxicité. Une partie des animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation et seront utilisés à 8 semaines. Les souris issues de cette gestation seront analysés à partir de 3 semaines d'âge jusqu'a 18 semaines.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement de maladies auto-immunes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une injection hydrodynamique de plasmides dans la veine peut provoquer chez des souris un hématome, des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de leur état général dans les minutes qui suivent. 3 220 souris immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour y induire des maladies auto-immunes comme le lupus et tester des candidats médicaments, avec en outre des implants posés sous anesthésie, des prises de sang répétées et des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours. Le porteur annonce que ces injections "dureront entre 10 et 15 secondes". Les points limites retenus sont une perte de 25 % du poids de référence et le score clinique maximal. La plupart des souris sont tuées et 770 sont déclarées réutilisées : le porteur écrit que les souris en surnombre ou sans maladie induite peuvent être réaffectées à de la formation, et que celles qui ne développent pas la pathologie peuvent être réutilisées dans le même projet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments pour des maladies auto-immunes telles que le lupus. Pour ce faire, nous induirons à l’aide de molécules des maladies auto-immunes sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes, ou humanisées à l’aide cellules souches humaines et leurs dérivées provenant par exemple de sang de cordon ombilical, de moelle osseuse ou de sang périphérique humains ou murins. Différentes stratégies d’inductions pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament (biologiques, immunomodulateurs…) sur la progression de la maladie auto-immune mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans cet effet, dans le but de mieux prédire la réponse humaine aux traitements. Des souris sans maladies induites pourront également être utilisées comme contrôles négatifs dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques des maladies auto-immunes comme le lupus et à soutenir le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblées. L’utilisation de modèles murins immunodéficients, immunocompétents ou humanisés permet de modéliser différentes pathologies humaines, dans un contexte in vivo contrôlé, tout en tenant compte des spécificités du système immunitaire humain. Ainsi, ce projet permettra : -d’étudier la progression du lupus dans des modèles bien caractérisés, -d’évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action de candidats médicaments à différents stades de développement, -de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des environnements immunitaires humanisés pertinents, -d’identifier des biomarqueurs de réponse ou de toxicité, -et de contribuer à une meilleure prédictibilité des résultats précliniques avant la transposition vers l’humain.
Procédures
Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Concernant les chirurgies (implants) la durée n’excédera pas 10 minutes. Elles seront réalisées sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. En parallèle, les candidats médicaments et molécules / cellules pour l'induction des maladies seront administrés afin d’évaluer leurs effets thérapeutiques. Les injections dureront quelques secondes et la fréquence sera définie selon le protocole d’étude. Des prises de sang pourront être réalisées pour évaluer les effets des traitements et caractériser la réponse immunitaire. Les fréquences de prélèvements seront définies dans le protocole d’étude. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Des prélèvements vaginaux pourront également être réalisés. Ils seront effectués quotidiennement pendant un minimum de cinq jours consécutifs, et si nécessaire, prolongés sur plusieurs semaines pour une évaluation complète du cycle œstral, notamment si les souris ne sont pas synchronisées. Ce prélèvement, très rapide, dure seulement quelques secondes. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues dans le cadre de ce projet peuvent entraîner diverses nuisances ou effets indésirables chez les animaux. Ces effets varient selon les modalités expérimentales, la nature des composés administrés et le statut immunitaire des souris (immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées). -Injection hydrodynamique intraveineuse de plasmides : peut engendrer un hématome et des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une légère irritation locale transitoire, une inflammation minime ou du stress. -Implantation de capsules / implants : douleur, complications en lien avec la chirurgie. -Administration de traitements et induction des maladies : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées), amaigrissement progressif, troubles moteurs, lésions cutanées, atteinte des organes, altérations comportementales, œdèmes, douleurs articulaires ou encore altération de l’état général. - Prélèvements sanguins : hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû à la contention. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés dans la majorité des cas. Les animaux supplémentaires ou sur lesquels la maladie n’a pas été induite pourront être réallouer à de la formation.
Remplacement
Lorsque cela est scientifiquement pertinent, des alternatives in vitro seront envisagées afin de limiter l’utilisation d’animaux. Néanmoins, dans le cadre des pathologies auto-immunes, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro capable de reproduire fidèlement la complexité du système immunitaire humain ni ses interactions avec des composés thérapeutiques. L’utilisation de souris immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées demeure essentielle pour modéliser l’implication du système immunitaire, évaluer les effets des traitements et garantir la transposabilité des résultats. Ces modèles in vivo constituent donc un outil robuste, indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques et thérapeutiques du projet.
Réduction
Un total de 3220 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 70 études précliniques de 46 souris. Ce nombre de souris utilisées sera limité au strict nécessaire, en se basant sur l’expérience acquise dans les études antérieures et sur des considérations statistiques. Les effectifs par groupe seront déterminés selon la variabilité attendue des réponses, notamment immunitaires, et adaptés en fonction des objectifs : caractérisation phénotypique, réponse au traitement, suivi de biomarqueurs ou évaluation de la toxicité. En fonction des modèles pathologiques et de l’effet attendu, le nombre de souris par groupe pourra varier de 4 à 8. Certains animaux ne développant pas la pathologie attendue (groupe contrôle par exemple) pourront être réutilisés dans ce même projet ou utilisé en formation. Des études pilotes permettront également de valider certains protocoles ou dosages, avant d’engager des cohortes plus larges.
Raffinement
En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (ex : Diet Gel). La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti- douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie suivi d’une euthanasie sans réveil (prélèvement terminal). Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue à partir d’un certain seuil. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie, une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites sont : -Perte de poids supérieur ou égale à 25 % du poids de référence (induction de la maladie) -Score clinique maximal atteint.
Choix des espèces
La souris constitue le modèle préclinique de référence pour l’étude des maladies auto-immunes en raison de sa proximité génétique avec l’Homme (plus de 90 % de gènes orthologues), de sa physiologie bien caractérisée et de la disponibilité de lignées spécifiques adaptées à chaque pathologie. Selon les besoins, il est possible d’utiliser des modèles spontanés, chimiques ou humanisés via greffe de cellules sanguines humaines de patients atteints de maladies auto-immunes. Les lignées immunodéficientes permettent de reconstruire un système immunitaire humain chez la souris, pertinent pour évaluer la réponse à des traitements immunomodulateurs. Ces modèles sont essentiels pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, évaluer de nouvelles approches thérapeutiques, et anticiper les effets secondaires immunitaires de façon prédictive. Les souris non humanisées seront incluses dans les études à partir de 6 semaines d’âge, âge correspondant à une maturité immunitaire et physiologique suffisante pour l’induction de pathologies et l’évaluation de traitements. Les souris humanisées seront quant à elles incluses à partir de 8 semaines, seuil à partir duquel une reconstitution immunitaire humaine stable et mesurable est généralement observée dans le sang périphérique.
Effets bénéfiques de la nutrition sur la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris obèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Un jeûne de 12 heures puis un gavage d'huile, un jeûne de 6 heures puis un gavage de sucre, une incision au bout de la queue avant chaque test pour prélever le sang : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 90 d'entre elles reçoivent 20 semaines d'alimentation riche en graisses, pour tester si des aliments enrichis en oméga-3 et en extraits de plantes renforcent l'immunothérapie contre le cancer du sein triple négatif chez des souris obèses. Identifiées par un poinçon à l'oreille, toutes reçoivent ensuite sous anesthésie une injection de cellules tumorales dans la glande mammaire, puis 6 à 7 injections de traitement en 21 jours et une mesure de la tumeur tous les trois jours sous anesthésie. Le porteur retient des souris de 7 semaines parce que ce cancer "est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes", et écrit que l'étude "pourrait poser les bases de futures recherches chez l'Homme".
Objectifs
Lorsqu’un cancer se développe, le système immunitaire réagit en envoyant des signaux pour combattre la tumeur, comme des substances inflammatoires. Mais les cellules cancéreuses ont trouvé un moyen de tromper ce système en utilisant ces signaux pour activer des "freins" qui empêchent le système immunitaire d'attaquer la tumeur. L’immunothérapie fonctionne en bloquant ces "freins", ce qui permet au système immunitaire de mieux lutter contre le cancer. Cette approche est particulièrement prometteuse pour des cancers agressifs, comme le cancer du sein triple négatif, qui peut être aggravé par l’obésité. En effet, chez les personnes obèses, les cellules graisseuses se gonflent et libèrent des signaux inflammatoires qui activent en permanence le système immunitaire. Ces signaux peuvent aider les cellules cancéreuses, proches du tissu graisseux, à échapper à la surveillance du système immunitaire et à se développer. Des recherches, y compris des travaux de notre équipe, suggèrent que les acides gras oméga-3, présents dans certains aliments, pourraient réduire cette inflammation liée à l’obésité et rendre l’immunothérapie plus efficace contre le cancer du sein triple négatif. Pour mieux comprendre ce lien entre obésité, nutrition et immunothérapie, nous devons aller au-delà des études théoriques et mener des expériences concrètes sur des souris. Cela nous permettra de mieux identifier les mécanismes en jeu et d’explorer de nouvelles pistes pour améliorer les traitements. Les objectifs de notre étude sur les souris sont : 1. Comprendre l’impact de l’obésité sur la défense du corps contre une tumeur agressive du sein. 2. Tester l’effet de l’alimentation sur cette défense, en introduisant des aliments riches en oméga-3 et des extraits de plantes aux propriétés bénéfiques. 3. Vérifier si ces changements alimentaires peuvent aider à renforcer l’effet des traitements d’immunothérapie contre ce type de cancer du sein. Notre objectif est donc d’identifier de nouvelles stratégies basées sur la nutrition pour améliorer la lutte contre le cancer, en tenant compte du rôle de l’obésité et du système immunitaire.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’alimentation peut influencer la santé. Il pourrait montrer qu’un régime riche en oméga-3, avec ou sans extraits de plantes bénéfiques, aide à réduire l’inflammation causée par l’obésité. Cette diminution de l’inflammation pourrait alors améliorer l’efficacité des traitements contre le cancer. À plus long terme, ces résultats pourraient mettre en évidence le rôle clé de la nutrition dans la protection du corps contre la maladie, en particulier chez les personnes obèses. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles approches pour renforcer l’action des traitements contre le cancer. Enfin, cette étude pourrait poser les bases de futures recherches chez l’Homme, afin de voir si des ajustements alimentaires permettent d’optimiser les traitements et d’améliorer la lutte contre le cancer.
Procédures
• Une identification indivuelle par poinçonage de l’oreille sera appliquée aux 120 souris. • Trois groupes de 30 souris (90 souris) recevront une alimentation riche en graisses pendant 20 semaines. • Deux mesures de la composition corporelle seront réalisées sur les 120 souris éveillées et placées brièvement dans un tube (moins de 2 min/souris). Les deux mesures seront réalisées à 16 semaines d’intervalle. • Tests du métabolisme : - Du sucre : toutes les souris seront à jeun pendant 6 heures (le matin) avant le test puis un petit volume d’une solution sucrée sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 6 prélèvements d’une goutte de sang (quelques secondes/souris). - Des graisses : toutes les souris seront à jeun 12 heures (toute la nuit) avant le test puis un petit volume d’huile sera administré par gavage à toutes les souris éveillées (moins d’1 min/souris, contention incluse). Une petite incision à l’extrémité de la queue (moins de 1 mm) sera réalisée avant le test pour permettre 4 prélèvements de quelques gouttes de sang (30 sec/souris, sans contention). - Ces deux tests seront effectués avec une semaine d’écart. • Injection des cellules tumorales et suivi du cancer : - Avant l’injection des cellules cancéreuses, une injection du mélange d’anesthésiques sera réalisée dans l’abdomen de toutes les souris (30 sec/souris, contention comprise). L’injection des cellules tumorales se fera donc sous anesthésie générale dans la glande mammaire (injection < 30 sec/souris, anesthésie 45 min, toutes les souris). - Palpation de la zone d’injection tous les jours pour détecter la tumeur le plus précocément possible (toutes les souris vigiles, environ 30 secondes par souris contention comprise, 5 jours de suite maximum soit entre J3 post injection des cellules et J7) - Traitement : 6 à 7 injections des traitements auront lieu sur une période de 21 jours (30 sec/souris, contention comprise, toutes les souris sont concernées). - Surveillance de la tumeur pour toutes les souris : Une mesure tous les trois jours pendant 21 jours sous anesthésie gazeuse (30 sec/souris). • A la fin de l’étude : - Une injection unique d’anesthésique pour toutes les souris (quelques secondes/souris). - Un prélèvement sanguin final sous anesthésie profonde pour toutes les souris (30 sec/souris).
Impact sur les animaux
La pesée des souris peut être une source de stress temporaire. L’alimentation riche en graisses entraînera une prise de poids importante, sans impact sur la mobilité. Le bref placement dans un petit tube (moins de 2 minutes) pour la mesure de la composition corporelle cause un stress. Les périodes de jeûne avant les tests métaboliques peuvent être inconfortables pour les animaux. L’administration par voie orale de la solution sucrée et de l’huile est une source de stress transitoire et d’inconfort pour les animaux. La petite incision au bout de la queue réalisée avant les deux tests métaboliques peut provoquer une douleur passagère. Le fait que pendant le test sur les sucres, les souris soient placées seules dans une cage pendant deux heures peut générer un léger stress. Les différentes injections (anesthésiques, antidouleurs, traitements, cellules tumorales) réalisées vont provoquer du stress et une légère douleur transitoire. La palpation des glandes pour détecter l’apparition des tumeurs va générer un inconfort transitoire chez les animaux. Le développement de la tumeur peut générer un inconfort et une légère douleur pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort à l’issue du dernier prélèvement sanguin afin de collecter les tissus d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet fait suite à des recherches déjà réalisées en laboratoire, où des expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ont permis d’étudier l’influence de la graisse corporelle sur l’évolution du cancer du sein. Ces travaux ont montré que les oméga-3 et certains extraits de plantes pourraient avoir des effets bénéfiques. Cependant, ces expériences ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le cancer et son environnement dans un corps vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’utiliser un modèle avec des organismes complets, comme la souris, pour observer l’impact global de l’alimentation sur l’inflammation, les déséquilibres liés à l’obésité et la manière dont le corps se défend contre la tumeur. Ce type d’étude nécessite un modèle vivant, car il n’existe actuellement aucune alternative qui permette d’obtenir ces résultats uniquement avec des cellules en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement calculé pour limiter leur utilisation tout en garantissant des résultats fiables. D’après les informations existantes dans la littérature scientifiques et les échanges avec des experts, chaque groupe doit contenir 30 souris, réparties ensuite en deux sous-groupes de 15. Cela permet d’assurer que les résultats seront suffisamment solides et exploitables. Au total, 120 souris seront utilisées. Pour éviter de multiplier les expériences, un maximum de prélèvements de tissus sera effectué et mis à disposition pour d’autres recherches.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : Pour éviter d’avoir à recourir aux gavages quotidiens, les oméga-3, antioxydants et extraits de plantes sont directement ajoutés à la nourriture. Seules deux personnes expérimentées manipuleront les souris dès leur arrivée et tout au long de l’étude pour qu’elles s’habituent à leur présence.Une surveillance de tous les animaux sera mise en place deux fois par semaine avant l’injection des cellules cancéreuses puis 7 jours sur 7 après leur injection. A chaque passaque une vérification de l’état général des souris (apparence (pelage, posture, yeux, oreilles), comportement (activité, interactions, agressivité, réaction au toucher)) sera réalisée. De plus, un suivi du poids des souris serait réalisé une fois par semaine. L’évaluation de la prise alimentaire sera faite deux fois par semaine. En ce qui concerne les tests pour évaluer le métabolisme les quantités de solution sucrée et d’huile ont réduites au minimum pour éviter l’inconfort, une seule petite incision au bout de la queue (1 mm) sera réalisée par test pour prélever du sang, une semaine d’intervalle sera respectée entre les tests pour limiter le stress. Les prises de sang seront faites sans immobilisation forcée des animaux. Enfin, si le taux de sucre ne revient pas à la normale en 90 min, il sera surveillé à 240 min et, si besoin, à 360 min. L’injection des cellules cancéreuses sera réalisée sous anesthésie générale avec ajout d’un médicament contre la douleur. Ensuite,une palpation quotidienne sera faite pour détecter la tumeur dès son apparition. Concernant le suivi de la croissance de la tumeur et les traitements : une mesure de la tumeur sera faite tous les trois jours sous anesthésie dès que la tumeur est détectée, l’injection du traitement contre le cancer sera réalisée en même temps (volume d’injection réduit au strict nécessaire et changement de site d’injection à chaque fois pour limiter l’inconfort). L’expérience durera quatre semaines maximum afin d’éviter que le volume de la tumeur ne devienne trop important. Des aménagements seront mis en place pour faciliter l’accès à la nourriture. A la fin de l’étude : les souris seront anesthésiées avant un dernier prélèvement de sang puis mises à mort rapidement et sans douleur. Des points limites précis ont été définis pour stopper immédiatement l’étude si un seuil critique est atteint, afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris repose sur plusieurs raisons : • Elle peut développer une obésité comparable à celle de l’humain en suivant un régime riche en graisses. • Son métabolisme des graisses est similaire à celui de l’Homme, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les effets protecteurs des oméga-3 et des composés naturels contre l’obésité et le cancer. Les souris seront intégrées à l’étude à l’âge de 7 semaines. À cet âge, elles tolèrent bien une alimentation riche en graisses, et les modifications métaboliques qui en découlent sont bien documentées et maîtrisées. Nous avons choisi des souris jeunes, car le cancer du sein triple négatif est souvent diagnostiqué chez des patientes jeunes.
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées à l'issue de chaque expérimentation pour le prélèvement de leurs organes de l'immunité, dont les ganglions et la rate, 450 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des lymphocytes B humains génétiquement modifiés ou leurs précurseurs, par la veine de la queue chez les adultes ou par injection dans le cœur chez des souriceaux de 2 jours, puis une prise de sang toutes les deux semaines, et éventuellement des immunisations et des greffes de cellules tumorales. Une mère peut refuser de récupérer un souriceau trop manipulé, et la taille des tumeurs greffées fait l'objet de points limites. Le porteur justifie le passage aux nouveau-nés par une meilleure prise de greffe, qui rend selon lui ses expérimentations "plus faciles à réaliser" et ses résultats "plus faciles à analyser".
Objectifs
L'objectif de ce projet est la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B humains ou leurs précurseurs puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer la capacité antitumorale de nos anticorps.
Bénéfices attendus
L'utilisation des souris immunodéficientes est un excellent modèle pour notre projet. En effet, ces souris ne possèdent plus de lymphocytes et ne peuvent alors plus détruire les cellules étrangères injectées. Elles sont donc capables de recevoir différentes cellules humaines, comme des lymphocytes B qui produiront des anticorps ou même des cellules précurseuses des lymphocytes, qui pourront alors produire des lymphocytes B humains dans les souris. Avec ce projet, nous testerons donc la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé (essai clinique de phase I) et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
La greffe des cellules sera unique et se fera soit par injection intraveineuse dans la veine de la queue chez les souris adultes soit par injection intracardiaque chez les souriceaux nouveau-nés. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 2 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations et des greffes de cellules tumorales pourront être appliquées sur les animaux si la reconstitution immunitaire a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse de cellules. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les autres nuisances attendues viendront de l'injection intracardiaque du nouveau-né. En effet, la mère pourrait ne pas vouloir récupérer son souriceau si celui a été trop manipulé. Des efforts afin de masquer les odeurs liées à la manipulation seront réalisés pour favoriser la réadoption des souriceaux par leur mère. Des effets indésirables pourront également survenir après les greffes de tumeurs, des points limites concernant la taille des tumeurs seront mis en place afin d'éviter trop d'inconfort et de souffrance aux souris.
Devenir
A l'issue de chaque expérimentation, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution du système immunitaire humain dans la souris ainsi que sur le développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules précurseuses du système immunitaire. Ces dernières sont en effet capables de se différencier dans la moelle osseuse de la souris après injection et de fabriquer dans ces souris diverses populations immunitaires humaines, dont les lymphocytes B. Il est actuellement possible de différencier ces précurseurs in vitro mais uniquement vers quelques voies données, et non vers la différenciation en lymphocyte. Aucun modèle in vitro ne permet une différenciation complète vers toutes les lignées du système immunitaire. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon des critères généraux permettant de quantifier le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour ce projet sont complètement dépourvues de lymphocytes, ce qui permet donc d'éviter le rejet des cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé de prise de xénogreffes, que ce soit des lymphocytes B humains ou leurs précurseurs. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de contamination par divers pathogènes car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Dans un premier temps, l’expérimentation sera commencée chez des animaux de 4 à 6 semaines. En effet, une meilleure prise de greffe des cellules humaines a lieu chez les animaux jeunes, en particulier pour les lymphocytes. Dans un second temps, l’expérimentation sera commencée chez les souriceaux nouveau-nés de 2 jours. En effet, il est maintenant démontré que la prise de greffe des cellules humaines est meilleure quand les cellules sont injectées chez les nouveau-nés, ceci rendant nos expérimentations plus faciles à réaliser et nos résultats plus faciles à analyser (plus de cellules humaines dans la souris donc des effets plus facilement monitorables).