Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Étude des mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets du stress de contrainte et de l’inflammation sur le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques murines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées deux heures d'affilée sans pouvoir bouger, manger ni boire, et pour certaines sept jours de suite, les souris subissent ensuite une irradiation, une injection imitant une infection virale et une greffe de cellules souches. 1 692 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 116 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur cherche à savoir si l'accumulation d'épisodes de stress vieillit prématurément les cellules souches du sang, et rapproche la contention forcée de la situation des patients placés en isolement protecteur après une greffe. Il écrit que ce temps d'immobilisation "est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques", et annonce par ailleurs perte de poids, agressivité, anxiété et dépression parmi les effets attendus.
Objectifs
5.5.2. Le processus de formation du sang, appelé hématopoïèse, repose sur les cellules souches hématopoïétiques (CSH), définies par leur capacité à se renouveler et à produire d’autres cellules sanguines. Les CSH résident dans la moelle osseuse, où elles sont protégées des influences extérieures et se trouvent le plus souvent dans un état non prolifératif. En raison du besoin constant de renouvellement du système sanguin, il est essentiel de maintenir le nombre et le potentiel des CSH tout au long de la vie. L’accumulation d’inflammation est l’un des facteurs qui poussent les CSH au repos à proliférer, ce qui altère leurs capacités, un phénomène observé dans le processus de vieillissement. Le vieillissement du système hématopoïétique peut entraîner un dysfonctionnement de l’hématopoïèse et augmenter la susceptibilité à diverses pathologies hématologiques telles que la myélodysplasie, la leucémie et le lymphome. Nos résultats précédents ont montré qu’en inhibant l’inflammation médiée par une protéine, les CSH restent dans un état non prolifératif, conservent mieux leur capacité de différenciation et présentent un effet anti-inflammatoire lié au vieillissement. Nous supposons que le vieillissement physiologique résulte de l’accumulation d’épisodes de stress. Dans ce projet, nous testerons l’hypothèse selon laquelle les signaux de stress provoquent certains changements communs constituant l’identité du vieillissement des cellules souches sanguines. Étant donné que nos souris à faible inflammation montrent des signes réduits de vieillissement, nous examinerons si cette réduction de l’inflammation peut partiellement compenser les effets du stress sur le vieillissement des CSH.
Bénéfices attendus
La croissance constante du nombre de personnes âgées est l'une des principales préoccupations socio-économiques des sociétés occidentales. Cette augmentation de la population âgée s'accompagne d'une hausse des maladies liées à l'âge. Tout au long de leur vie, les individus sont soumis à une accumulation de stress, qu'il soit physique ou mental, ce qui peut conduire au développement de diverses maladies. Cependant, la relation entre ces différents facteurs, le processus de vieillissement et le développement des maladies reste ambiguë. Ce projet vise à éclaircir un aspect de cette problématique, en se concentrant sur l'impact du stress psychologique et des infections sur la prolifération et la différenciation des cellules souches sanguines, ainsi que sur la possibilité que la réduction des niveaux d'inflammation puisse inverser ces effets, apportant ainsi des éléments de compréhension sur la manière de minimiser les effets du vieillissement sur le bien-être.
Procédures
- Stress aigu dû à la contention : 1 fois, 2 heures - Stress chronique lié à la contention : 1 fois, 2 heures par jour pendant 7 jours. - Infection : 1 fois (15 secondes), injections intrapéritonéales (polyI:C ou NaCl 0,9) - 2 irradiations à 4 et 6 heures d'intervalle pour une durée de 5 minutes. - 1 injection intraveineuse de cellules (15 secondes) - 3 analyses de sang à 4, 8 et 12 semaines après l'injection des cellules (15 secondes)
Impact sur les animaux
Un stress intense sera induit par des tests de contrainte aiguë (2 heures) ou chronique (7 x 2 heures), au cours desquels les animaux seront immobilisés et ne pourront ni bouger, ni manger, ni boire. Ce temps minimal est suffisant pour induire de la peur ou de l'anxiété, sans causer de blessures physiques. Effets secondaires liés au stress : perte de poids, agressivité, anxiété, dépression. L’injection, qui imite une infection virale, sera réalisée par injection intrapéritonéale et pourra entraîner des rougeurs ou un léger gonflement au site d’injection. Effets secondaires liés à l’affaiblissement du système immunitaire dans les 24 heures suivant l’irradiation : infections possibles. Réactions inflammatoires (rougeurs et gonflements) au site d’injection intraveineuse des CSH pour la transplantation. Possibilité de rejet de greffe après la transplantation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches hématopoïétiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les effets du stress en laboratoire, en utilisant des cultures cellulaires. Cependant, cette approche ne permettrait pas d'analyser pleinement les dynamiques complexes de l'hématopoïèse, qui se produisent à l'échelle de tout l'organisme. La réponse au stress psychologique implique une interaction complexe entre le système nerveux, le système endocrinien et le système immunitaire, avec des effets sur l’ensemble du corps. C’est pourquoi il est essentiel d'étudier ces effets chez un être vivant, et plus précisément sur les cellules souches sanguines. L'ajout d'hormones de stress dans une culture cellulaire ne suffit pas à reproduire la physiologie complète d'un organisme vivant. En outre, la différenciation des cellules souches sanguines dépend étroitement de leur environnement dans la moelle osseuse, un facteur impossible à reproduire en dehors du corps. Enfin, le stress par contrainte, comme celui subi par les patients en isolement protecteur après une transplantation, offre une meilleure modélisation de ces effets physiologiques complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé afin de limiter la variation inter-individuelle et d’atteindre un niveau statistiquement validé par une analyse prédictive. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour récupérer la quantité de matériel requise pour l'expérience et obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous réaliserons deux répétitions pour vérifier si la variation entre les conditions est significative. Si les deux premières expériences donnent des résultats identiques, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de surveiller le bien-être des animaux pendant notre procédure expérimentale et de limiter autant que possible toute douleur et/ou souffrance non nécessaire, nous avons établi une grille d'observation. Cette grille définit les points de terminaison les plus précoces et les plus précis à partir desquels des actions seront entreprises pour limiter toute souffrance et/ou douleur inutile. Elle indique également les mesures que nous prendrons dès l'apparition des premiers signes de douleur. Toutes les souris irradiées et transplantées seront traitées avec des antibiotiques afin de prévenir le risque d'infection. Elles seront contrôlées et notées pendant 5 jours après la transplantation, ainsi que pendant les jours de travail de la deuxième semaine. Au cours des semaines suivantes, elles seront notées deux fois par semaine. En cas de légère fatigue ou de difficulté à se déplacer, de la nourriture hydratée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles idéaux pour étudier la production des cellules sanguines, car leur système est très similaire à celui des humains. Le vieillissement des cellules sanguines chez les souris suit un processus bien défini, et il existe une correspondance d’âge entre les souris et les humains. Des études antérieures ont montré que le stress psychologique peut influencer les signaux chimiques dans le corps et modifier l’expression des gènes chez les souris. Nous supposons donc que le stress, qu’il soit dû à des contraintes physiques ou à une infection, pourrait également affecter les cellules souches responsables de la production des cellules sanguines chez les souris. Cela pourrait nous aider à mieux comprendre les effets du stress sur ces cellules chez les humains. De plus, l'isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) murines est bien défini, et ces cellules peuvent être conservées dans leur niche en maintenant leur quiescence. Les procédures comme la transplantation sont également bien maîtrisées chez les souris, grâce aux protocoles d’irradiation en place. Les animaux utilisés dans l'étude seront répartis en deux groupes : jeunes (4-6 mois) et d'âge moyen (10-14 mois), afin de déterminer si le stress affecte davantage les individus plus âgés. Ces âges correspondent à ceux des jeunes adultes (20-30 ans) et des adultes d'âge moyen (40-45 ans) chez l'humain. Toutes les souris recevant la transplantation auront 3 mois, un âge optimal pour une transplantation efficace. L'expérience de transplantation nous permet d’étudier la capacité des cellules souches hématopoïétiques à s'auto-renouveler et à repeupler la moelle osseuse. Cette étude porte uniquement sur les cellules, indépendamment des souris receveuses. Nous utilisons des animaux âgés de 3 mois pour garantir une transplantation réussie et efficace.
EU2/2 Evaluation par imagerie par résonance magnétique de l’efficacité de traitements innovants dans le cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiées pour recevoir une greffe de tumeur pancréatique, les souris reçoivent ensuite une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis une radiothérapie de cinq minutes par jour pendant cinq jours, avant cinq passages en IRM d'une heure trente sous anesthésie. 1 080 souris vont être utilisées dans ce volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont transportées entre deux établissements, ce que le porteur compte parmi les sources de stress, et développent des tumeurs entraînant une perte de poids. Toutes sont tuées à l'issue pour que les tumeurs soient analysées.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,
Procédures
Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées
Remplacement
Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.
Gestion de lignées de souris génétiquement modifiées par les techniques d’embryologie : congélation, revitalisation et décontamination
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 275 souris femelles reçoivent des injections d'hormones destinées à leur faire produire un maximum d'ovocytes, 875 subissent une chirurgie utérine de quinze minutes sous anesthésie pour recevoir des embryons, et 80 mâles sont vasectomisés. 3 355 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet est présenté comme un moyen de "diminuer considérablement les volumes d'élevage" grâce à la congélation d'embryons et de sperme. Produire ces embryons passe par la mise à mort des femelles donneuses au moment du prélèvement des ovocytes, et par celle des mâles vasectomisés après dix mois d'accouplements stériles, les femelles receveuses étant maintenues en vie jusqu'au sevrage des souriceaux.
Objectifs
Le projet consiste à offrir aux équipes du centre de recherche la possibilité d’arrêter l’élevage de certaines lignées de souris lorsqu’un projet est terminé ou n’est plus soutenu financièrement, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Ce procédé permet d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés est également le moyen de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires puisque la réimplantation d’embryons permet de se débarrasser d’un certain nombre d’opportunistes que de nombreuses animaleries excluent de leurs élevages. La décontamination de lignées de souris par transfert d’embryons permet également d’intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie exempte de pathogènes nuisibles pour la souris. Pour cela, nous prévoyons de réaliser en 5 ans au sein de notre animalerie : 1) 50 cryoconservations de lignées par congélation d’embryons et 50 cryoconservations de lignées par congélation de spermes pour la sauvegarde et l’arrêt des élevages. 2) 100 reviviscences de lignées pour les contrôles qualité des congélations d’embryons et de spermes et 25 reviviscences pour le redémarrage des élevages de lignées à partir d’embryons congelés ou à partir de spermes congelés par fécondation in vitro. 3) 50 décontaminations de lignées par transfert d’embryons pour intégrer des animaux de statut sanitaire non compatible dans notre animalerie. Pour le bien-être des animaux, nous respecterons les 5 libertés universelles, ils seront hébergés en groupe, disposeront de nourriture et d’eau ad libitum et d’enrichissements dans les cages. Dans le souci d’éviter et de réduire toute douleur ou souffrance animale, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et sous analgésie. La surveillance quotidienne sera effectuée, elle permettra le contrôle post-opératoire et de déceler d’éventuels signes de souffrance dont l’évaluation à l’aide d’une grille de score conduira à la mise en place d’une médication adaptée.
Bénéfices attendus
Le projet donne la possibilité d’arrêter l’élevage des lignées de souris lorsqu’un projet scientifique est terminé ou n’est plus financé, de stocker les lignées par cryoconservation, processus qui consiste à congeler et conserver des embryons ou des spermatozoïdes à ultra basse température afin de préserver leur intégrité et de les revitaliser lorsque nécessaire. Il permet donc d’assurer la sauvegarde des modèles et de diminuer considérablement les volumes d'élevage. Par ailleurs, l’échange d’embryons ou de spermes congelés et la décontamination par transfert d’embryons sont des moyens de transférer des lignées de souris entre animaleries en s’affranchissant des statuts sanitaires.
Procédures
Les animaux femelles seront soumis à des injections d'hormones, cela concernera 3275 animaux et les injections dureront quelques secondes. Les animaux mâles seront vasectomisés chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 80 animaux et l’intervention durera 15 minutes. La réimplantation d’embryons dans l'utérus des femelles receveuses se fera chirurgicalement sous anesthésie générale, cela concernera 875 animaux et l’intervention durera 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections d’hormones, anesthésiques et antalgiques, la pose de sutures et d’agrafes lors des étapes de chirurgie constitueront une nuisance pour les animaux et pourrons être source d'angoisse, de douleur ou d’apparition de lésions.
Devenir
Les animaux femelles dont le nombre d'ovules produits est augmenté par des injections d’hormones seront mises à mort pour le prélèvement des ovocytes ou des embryons. Les animaux mâles vasectomisés seront mis en accouplement pour induire un état propice à l'implantation des embryons chez les femelles receveuses pendant 10 mois puis mis à mort. Les animaux femelles dont le cycle ovarien est synchronisé par des injections d'hormones seront accouplées avec les animaux mâles vasectomisés pour induire un état favorable à l'implantation des embryons, puis ré-implantées avec les embryons et maintenues en vie jusqu’au sevrage des souriceaux.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant et entier peut produire les gamètes nécessaires à l’archivage ou à la reviviscence des lignées de souris génétiquement modifiées. Nous proposons de réaliser les contrôles qualité des lots d’embryons et de sperme congelés par des tests in vitro, en nous assurant de la bonne évolution des embryons du stade 2 cellules au stade blastocyste en milieu défini, évitant ainsi l’utilisation d’animaux avec une ré-implantation des embryons dans des femelles receveuses. Afin d’éviter de dupliquer la cryoconservation des lignées de souris génétiquement modifiées, une recherche systématique dans les banques d’archivage de lignées sera réalisée et conditionnera la réalisation de la procédure.
Réduction
Nous arrêterons les congélations d’embryons lorsque nous aurons atteint 250 à 400 embryons (en fonction du nombre de modifications génétiques et de la fertilité des modèles) congelés et validés. Nous privilégierons la congélation de sperme qui nécessite très peu d’animaux pour les lignées avec une seule modification génétique. Les expérimentations de décontamination et de revitalisation seront limitées à l’obtention des animaux porteurs du généotype d'intêret nécessaires à l’établissement des lignées. Afin de réduire le nombre d’animaux femelles à accoupler avec les mâles vasectomisés pour la production de femelles dans un état de l'utérus propice pour la réimplantation des embryons, nous réaliserons une synchronisation du cycle ovarien des femelles à l’aide d'hormones car seules les femelles en ovulation acceptent l'accouplement avec les mâles.
Raffinement
Afin d’éviter les risques de perforations suite aux injections dans le péritoine, nous réaliserons les injections d’hormones en sous-cutané car l’efficacité est équivalente pour la production d'ovocytes chez les animaux femelles. Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés. Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes afin d’éviter le stress de l’isolement. Pour la même raison, les animaux mâles devant être maintenus isolés, seront par intermittence hébergés en présence de femelles. Les procédures chirurgicales de vasectomie des mâles et de réimplantation des embryons dans les femelles receveuses seront réalisées sous anesthésie, une analgésie et un suivi seront mis en place. La réimplantation des embryons dans les femelles receveuses se fera dans une seule corne utérine et nécessitant une seule incision. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne minutieuse par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille d’évaluation du bien-être (traitement cutané avec un désinfectant en cas de signes d'infection, pose de nouveaux points de suture ou d'agrafes sous anesthésie générale en cas de perte d'agrafes ou rupture de points de suture externes, analgésie en cas d'apparition de signes de souffrance et sans amélioration, programmation de la mise à mort).
Choix des espèces
Le projet consiste à assurer la sauvegarde des modèles animaux souris et à diminuer les élevages par la cryoconservation mais aussi à décontaminer les lignées de souris pour les transférer entre animaleries de statuts sanitaires différents. La décontamination par transfert d’embryons et la congélation d’embryons nécessitent la production d'un grand nombre d'ovocytes chez les femelles donneuses, leur mise en accouplement et la récupération des embryons après mise à mort. Ces techniques nécessitent également la réimplantation des embryons dans les femelles receveuses dont l'utérus est en état propice obtenu par la mise en accouplement avec des mâles vasectomisés stériles. Le projet nécessite donc le recours aux animaux. Les femelles donneuses d’embryons seront stimulées par injection d’hormones en début de puberté (5 semaines) car c’est l’âge qui permet de recueillir le plus d’ovocytes matures. Les mâles qui seront vasectomisés seront des mâles pubères adultes (6-8 semaines) et donc capables de s’accoupler avec les femelles receveuses. Les femelles receveuses pour les réimplantations d’embryons seront des femelles pubères adultes (6-20 semaines) afin que la réimplantation soit efficace grâce à des cornes utérines fonctionnelles et une bonne imprégnation hormonale après accouplement avec les mâles vasectomisés.
Prélèvements de tissu en routine pour la caractérisation de souris génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Un à deux millimètres de queue coupés aux ciseaux, dix secondes par animal : ce geste est appliqué à 198 000 souris, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Il sert au génotypage des lignées génétiquement modifiées élevées par le laboratoire pour ses travaux sur les pathologies cardiovasculaires et rénales. Les souris porteuses du génotype recherché passent ensuite dans d'autres projets, celles qui ne l'ont pas sont tuées, et le RNT ne dit pas combien relèvent de chaque cas. Le porteur indique que son établissement développe des organoïdes et des organes sur puce "pas suffisamment au point", et ne justifie nulle part l'effectif de 198 000 animaux.
Objectifs
Nos équipes de recherche s'intéressent aux pathologies cardiovasculaires et rénales. L'objectif direct du projet est de prélever du tissu de souris afin de caractériser génétiquement les souris génétiquement modifiées élevées dans l'animalerie du laboratoire.
Bénéfices attendus
Fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour les projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d’expérimentation) et caractériser génétiquement des lignées pour optimisation de la gestion des élevages.
Procédures
prélèvement de l'extrémité de la queue (1 à 2 mm) à l'aide d'une paire de ciseaux, 1 fois (exceptionnellement 2), durée 10 secondes. Exceptionnellement, un prélèvement d'oreille (1,5 mm x 1,5 mm).
Impact sur les animaux
douleur et stress légers et de faible durée
Devenir
Les animaux du génotype d'intérêt sont utilisés dans les projets de recherche du laboratoire. Les animaux qui n'ont pas le bon génotype sont mis à mort.
Remplacement
Les équipes du laboratoire développent et utilisent des méthodes alternatives à l'utilisation des animaux (organoides, organes sur puce...) mais qui ne sont pas suffisamment au point ou élaborées pour permettre de s'affranchir complètement de l'animal modèle.
Réduction
La production des souris génétiquement modifiées est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Nous utilisons des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles ». Quand cela est possible nous utilisons des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage. Les élevages des lignées non utilisées sont arrêtées.
Raffinement
Nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions cardiovasculaires et rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. Au sevrage des animaux, entre 3 et 4 semaines de vie. A l'âge adulte si un second prélèvement est nécessaire.
1/2 Essais thérapeutiques préventifs et curatifs dans un modèle murin de la maladie génétique du Cavernomatose cérébrale familiale
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 072 souris seront tuées pour que leurs tissus cérébraux soient analysés, et 144 autres, écartées parce qu'elles portent le "mauvais génotype", partiront vers d'autres projets comme animaux témoins. Au total 1 216 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des malformations vasculaires cérébrales reproduisant les angiomes caverneux humains, reçoivent une injection quotidienne pendant trois jours, passent jusqu'à une heure sous anesthésie en imagerie, parfois après induction d'une inflammation, avant une chirurgie de quinze minutes destinée à récupérer les tissus. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne peut remplacer l'animal vivant dès lors qu'il s'agit d'un "organe entier", et qualifie le passage à la souris d'étape "indispensable".
Objectifs
L’angiome caverneux est une malformation vasculaire localisée essentiellement dans le cerveau. Cette maladie affecte 1 individu sur 200. La forme héréditaire des angiomes caverneux est souvent liée à des mutations génétiques. Cette malformation se caractérise par des amas de vaisseaux sanguins dans le cerveau qui peuvent provoquer des saignements et des problèmes neurologiques. À ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les patients. L’unique option est la suppression de la lésion par neurochirurgie, qui peut se révéler impossible selon la localisation de la lésion, en raison d’un risque vital pour le patient. Il est donc urgent de trouver des traitements empêchant le grossissement des lésions existantes, voire même de les faire disparaître et ainsi diminuer le risque de saignement. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs et a pour objectif est de tester 3 médicaments qui ont été identifiés dans des études préliminaires afin évaluer leurs capacités à arrêter la formation des lésions vasculaires dans nos modèles animaux qui présentent les caractéristiques de la pathologie humaine des angiomes caverneux.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux disponible pour les angiomes caverneux et la suppression par chirurgie n'est pas toujours possible. De plus, le risque de nouveaux saignements dans les années suivant la chirurgie est élevé. Ce projet vise à tester des traitements afin de savoir si ces derniers bloquent la formation des lésions vasculaires dans nos modèles atteints de la maladie. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à la découverte d’un traitement thérapeutique efficace sans effet secondaire.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, seule l’élevage et la reproduction des animaux sera réalisée. Dans le second établissement utilisateur, la distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Puis, l’étude impliquera une injection du traitement de 30 secondes, une fois par jour pendant trois jours suivie d’une imagerie d’une durée de 1h maximum, réalisée sous anesthésie, suite, ou non à l’induction d’une inflammation. Et enfin, une chirurgie d’une durée de 15 minutes sera réalisée afin de récupérer les tissus à analyser.
Impact sur les animaux
La distribution des médicaments dans le cerveau sera d’abord évaluée. Ces résultats permettront d’adapter le protocole d’administration sur les animaux présentant la pathologie. Ces derniers recevront un traitement administré pendant 3 jours consécutifs, pouvant induire une légère douleur, afin de tester l’efficacité de molécules candidates sur la progression de la maladie. L’évolution des lésions et la réponse au traitement sont suivies par imagerie, d’une durée de 1h maximum et peuvent engendrer un léger stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin d’effectuer les analyses sur des tissus récupérés. Les 144 animaux réutilisés correspondent aux souris de mauvais génotype, qui pourront être réutilisées pour des prélèvements ou d'autres projets comme animaux sauvages.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études réalisées sur des cellules. Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, un organe isolé ou une espèce autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer l’efficacité des médicaments candidat pour le traitement des angiomes caverneux. Le passage au modèle animaux est donc une étape indispensable afin d’observer les effets des composés administrés dans l'organisme. De plus, la souris possède toute la complexité du réseau vasculaire cérébral trouvé chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux minimum pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives a été calculé en se basant sur les études précédentes menées au laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Pour réduire les nuisances attendues, l’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées, les animaux seront maintenus en température et un suivi de la fréquence cardiaque et respiratoire sera effectué lors des séances d'imagerie. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal. Tous les croisements réalisés viseront à obtenir exclusivement des animaux viables ayant les mêmes symptômes que les patients avant déclaration de la pathologie.
Choix des espèces
Les animaux utilisés représentent le modèle le plus pertinent pour nos études, car il reproduit de manière fidèle les caractéristiques clés de la pathologie humaine des angiomes caverneux. Les animaux auront entre 6 et 12 semaines lors des expérimentations afin d’être en conditions semblables à la pathologie humaine étudiée.
Etude du rôle des convertases, Furin et PC7 dans le recrutement des cellules du sytème immunitaire par les tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 609 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges puis amputées de l'extrémité de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une implantation de cellules d'adénocarcinome suivie de chimiothérapie trois fois par semaine et d'irradiations, et 1 008 subissent une chirurgie de vingt minutes créant des métastases hépatiques. Le porteur écrit que la croissance tumorale peut provoquer perte d'appétit, perte de poids et signes moteurs, quand le débouché thérapeutique évoqué se limite à des inhibiteurs qui "pourraient" être utilisés un jour. Il conclut que la souris reste "indispensable" pour observer ces enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme".
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.
Procédures
2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine. Un prélèvement de sang par animal sera réalisé sous anesthésie et analgésie et dure en moyenne 15 min.
Impact sur les animaux
Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.
Restaurer la conscience par ultrasons focalisés ou interférence temporelle : étude combinant la neuromodulation cérébrale non invasive et l’imagerie par résonance magnétique (IRM).
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Onze macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à quarante séances sous anesthésie générale de une à six heures. Deux d'entre eux reçoivent en plus une chirurgie de quatre à huit heures pour l'implantation permanente d'électrodes intracrâniennes, avec les risques d'hémorragie et d'infection que le porteur décrit. Trois autres sont entraînés à rester éveillés, la tête fixée, dans un scanner IRM. Aucun n'est tué à l'issue, le porteur indiquant que les onze pourront être réutilisés dans d'autres projets selon la décision du vétérinaire, et justifiant le macaque comme "le meilleur compromis" entre proximité avec l'humain et adaptabilité aux conditions de laboratoire.
Objectifs
Peut-on rétablir la conscience suite à un coma par une stimulation du cerveau ? Un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral peuvent causer une perte de conscience. De nombreux patients ne recouvrent jamais un niveau de conscience normal. Ils restent dans un état chronique de troubles de la conscience, qui peut perdurer plusieurs années. Il s’agit de conditions dévastatrices, où les patients, tout en conservant les fonctions vitales comme la respiration, la digestion etc., perdent le cœur de leur identité : la conscience. Ces conditions ont un impact personnel, social et économique très lourd, et pourtant à ce jour nous ne disposons pas de traitement efficace prouvé. Des études récentes montrent que la stimulation cérébrale profonde du thalamus peut restaurer la conscience chez un primate anesthésié. Cependant cette technique nécessite une intervention chirurgicale invasive avec des risques tels que l'hémorragie cérébrale ou l’infection. En outre, le taux de réussite des études cliniques préliminaires reste modeste. Il est donc nécessaire de développer une nouvelle approche thérapeutique non invasive. Nous allons explorer l’usage de nouvelles technologies non invasives de stimulation cérébrale afin de restaurer l’état de conscience. Récemment les ultrasons focalisés de faible intensité sont apparus comme une technologie prometteuse. Il s’agit d’envoyer des vibrations non audibles (ultrasons, US) qui affectent les tissus. Combinés à une injection dans le sang, les US permettent la livraison de médicaments à des cibles spécifiques dans le cerveau, pour une thérapie plus efficace. Une deuxième technique est la TIS (stimulation électrique par interférence temporelle) qui produit un effet par l’intersection de deux courants électriques très faibles traversant le cerveau. Nous proposons donc d’étudier la possibilité de réveiller des primates anesthésiés avec une stimulation par ultrasons focalisés, associée ou non à l’injection de médicaments d’intérêt, ou par interférence temporelle. Pour suivre au cours du temps les effets de la stimulation, nous étudierons les signatures neuronales de la conscience par IRM fonctionnelle et électroencéphalogramme. Cela constituerait une première étape dans le développement d’une thérapie non invasive pour les patients dans un état de perte ou désordre de la conscience.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est le développement d’un nouveau traitement de la perte de la conscience aiguë (coma) et chronique (état végétatif, état de conscience minimale) par stimulation cérébrale non invasive. La validation préclinique est une étape importante vers la réalisation d’essais cliniques chez les patients comateux ou atteints de désordres chroniques de la conscience. Ainsi, en cas de succès, nous allons ensuite travailler pour la translation de ces techniques chez l’humain. Un deuxième bénéfice est d’ordre de la connaissance scientifique. Les ultrasons focalisés ont été développé récemment et ouvrent des voies nouvelles, impossibles avec d’autres techniques de stimulation plus traditionnelles. L’utilisation de l’imagerie cérébrale (IRM fonctionnelle) nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux précis de ces nouvelles technologies de stimulation cérébrale non invasive. Très récentes et prometteuses, elles sont encore peu étudiées, alors que leurs effets sur le cerveau sont très complexes. Notre projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces techniques, leur utilité clinique, leurs similarités et différences avec la technique plus vieille et invasive appelée DBS (deep brain stimulation, stimulation cérébrale profonde). Tout cela sera fait avec un focus sur les troubles de la conscience, mais les informations récoltées auront un impact beaucoup plus général, parce que ces deux nouvelles techniques de stimulation cérébrale pourront potentiellement être utilisées dans de très nombreuses applications médicales. À titre d’exemple, ce type de stimulation peut être bénéfique pour des troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson, ou psychiatriques comme la dépression.
Procédures
Nous aurons trois groupes d’animaux. Un premier groupe recevra des stimulations du cerveau sous anesthésie, pour voir si l’intervention peut restaurer la conscience. Les sessions sous anesthésie prévues seront jusqu’à 40 par animal et auront une durée comprise entre 1h et 6h. Le nombre exact de sessions dépendra du succès de la manipulation. La stimulation pourra être effectuée par ultrasons ou par des courants à basse intensité (1h max). Les mesures des effets seront effectuées par électroencéphalogramme (EEG) ou résonance magnétique (IRM). Les sessions de stimulation impliquent l’application d’un ou plusieurs dispositifs au contact de la peau de l’animal. Dans certains cas, la stimulation sera associée à l’injection de médicaments et de microbulles gazeuses dans le sang. Un deuxième groupe recevra ces mêmes stimulations, mais aussi une stimulation plus traditionnelle et invasive appelée stimulation cérébrale profonde (DBS, pour comparaison, toujours sous anesthésie. Les sessions prévues auront même durée (1h à 6h) et seront au plus 40 par animal. Les mesures des effets seront également obtenues par EEG et IRM. Les animaux de ce groupe subiront une chirurgie (4 à 8 h) pour installer l’équipement intracrânien. Un troisième groupe recevra les mêmes stimulations non invasives du premier groupe (au plus 20 sessions de 1h à 6h par sujet), mais réalisera aussi des sessions à l’état éveillé, et sans stimulation, comme contrôle. Ces animaux devront être entraînés par des sessions quotidiennes à rester calmes et le plus immobiles possible pendant ces sessions, à l’aide de récompenses alimentaires ; à la fin de cet entrainement les sessions de test seront acquises (jusqu’à 80 sessions de 1h à 2h, entrainement et test confondus). Les animaux de ce groupe devront avoir une chirurgie (3 à 6 h) pour recevoir un équipement extracrânien qui permet de garder leur tête immobile dans le scanner IRM.
Impact sur les animaux
● L’anesthésie peut causer des effets indésirables bien connus , Les nausées/vomissements , les lésions de la gorge/trachée dues à l’intubation , le maintien prolongé dans la même position peut causer des douleurs musculaires. Les effets indésirables graves et la mortalité restent extrêmement rares dans une anesthésie contrôlée de ce type. ● L’usage de l’agent de contraste utilisé peut causer une accumulation de fer dans les tissus, mais cela n’a pas d’impact appréciable sur la santé des animaux. ● Des stimulations trop intenses par FUS peuvent produire des lésions, donc nous en allons contrôler attentivement l’intensité. ● La DBS ne cause pas d’effets négatifs au moment de la stimulation, mais elle requiert la pose chirurgicale d’un implant permanent intracrânien. Cela entraîne des risques d’infection et d’hémorragie. Un suivi adapté est spécifiquement mis en place en post-opératoire. La chirurgie peut causer de la douleur post-opératoire. Sur le long terme, la présence de l’implant cause un inconfort minimal chez l’animal. ● L’implant extracrânien implique des effets différents. La chirurgie est moins invasive, donc le risque d’hémorragie est moindre. il peut occasionnellement produire une infection.. Si le singe exerce trop de force quand il est fixé, cela peut fragiliser l’implant et conduire à son détachement ou le casser. ● L’entraînement et l’IRM vigiles peuvent causer de l’inconfort voire du stress à l’animal à cause de la fixation de la tête, du bruit et des protections auditives, de l’espace restreint.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie en fin de procédure, car il n’y a pas d’éléments scientifiques dans ce projet qui nécessitent une mise à mort. Les animaux pourront être réutilisés pour d’autres projets selon la décision du vétérinaire.
Remplacement
Une procédure médicale comme la neuromodulation pour la restauration de la conscience doit être testée sur des organismes vivants avant d’être appliquée à l’homme. Il existe des modèles informatiques de la conscience, mais ces modèles ne sont absolument pas réalistes au point de pouvoir remplacer des études biologiques, parce que le cerveau est extrêmement complexe, et la conscience est une des facultés les plus sophistiquées du cerveau et encore très mal comprise. Au contraire, les mesures expérimentales que nous recueillerons dans ce projet pourront être utilisées pour perfectionner ces modèles informatiques. Il ne serait par ailleurs pas admissible d’appliquer directement sur des patients des techniques non testées, d’autant plus que cette population avec des troubles de conscience ne peut pas exprimer un consentement informé à la participation à une étude expérimentale. L’usage d’animaux pour cette recherche à visée médicale reste donc le choix privilégié.
Réduction
Le nombre d’animaux choisi est basé sur la littérature scientifique et nos propres expériences précédentes. Il n'y a donc pas eu d'approche statistique necessaire. Nous testerons les trois types d’interventions sur un premier groupe de 6 sujets. Cette recherche demande de nombreuses sessions sous anesthésie, nous avons donc choisi 6 sujets pour trouver un équilibre entre le nombre d’animaux, le plus petit possible, et le fait que le nombre total et la fréquence des anesthésies par animal ne soient pas trop importants. Le groupe 2, recevant une intervention chirurgicale invasive est réduit au strict minimum de 2 sujets. Le groupe 3, utilisé comme contrôle pour effectuer des sessions « éveillées » comprend 3 sujets. Ce nombre a été choisi pour être également le plus petit possible, mais à cause des contraintes dues à l’entraînement, il devra être légèrement plus large que le groupe 2. Chaque session IRM sera analysée avant d’être répétée, afin d’estimer la qualité des données et la force des résultats, pour limiter le nombre d’examens par animal au minimum nécessaire.
Raffinement
Toute mesure sera prise pour améliorer le bien-être des animaux et réduire leur souffrance. La plus grande partie des étapes de ce projet sera réalisée sous anesthésie générale. Néanmoins il est nécessaire d’avoir des sessions de contrôle dans un état éveillé, pour juger de l’efficacité des interventions expérimentales. Anesthésie - Médicament pour protéger les oreilles en cas d’utilisation d’un support de la tête incluant des barres d’oreilles. - Anesthésie locale de la glotte avant intubation de l'animal. - Surveillance en continu des paramètres physiologiques pendant toute la durée de l’anesthésie. Couverture chauffante pour le maintien de la température corporelle. Hydratation intraveineuse. - Surveillance au moment du réveil jusqu’à que l’animal se lève et isolement des partenaires jusqu’à la reprise des forces, nécessaire pour éviter des combats pour la hiérarchie. Traitement anti-douleur - Lors des chirurgies, la douleur est prise en charge par un traitement pré-, per- et post-opératoire adapté. Comportement - Différents types d’enrichissement sont utilisés - L’entraînement à tolérer des sessions dans un état éveillé dans le scanner IRM est graduel et minimise le stress. - L’entraînement se fera sur la base du renforcement positif, donc avec des récompenses alimentaires (par exemple jus de fruit ou compote) et sans punitions. IRM - Usage de protections auditives. - La durée des sessions IRM vigiles sera réduite au minimum (on vise 1h et sans jamais dépasser les 2h). Neurostimulation - Les paramètres de stimulation seront calculés de manière à éviter tout effet indésirable Surveillance L’état général de chaque animal est évalué au quotidien dans sa propre cage par les expérimentateurs ou techniciens. Sont alors vérifiés l’apparence physique, la réactivité, le comportement (changement de l’attitude). Les courbes de poids des primates sont informatisées et surveillés de prêt afin de détecter des variations du poids. Mise en place de points limite adaptés.
Choix des espèces
Le macaque est le meilleur compromis pour avoir une espèce suffisamment proche de l’être humain, adaptable aux conditions de laboratoire, sans devoir travailler directement chez l’humain. Dans ce projet nous étudions les bases neurales de la conscience et la possibilité de la restaurer en cas de perte de conscience. Or des animaux évolutivement plus éloignés de nous, comme les souris ou les non-mammifères, ont une structure cérébrale considérablement différente, en particulier en ce qui concerne la conscience, car la conscience humaine dépend des parties évolutivement plus récentes du cerveau. Pour cette raison, une technique qui affecte l’état d’éveil chez un animal qui n’est pas un primate, ne va pas forcément être efficace pour restaurer la conscience d’un être humain. Le macaque est actuellement le modèle primate non-humain le plus utilisé au monde dans le domaine des neurosciences, précisément parce qu’il correspond au mieux à tous ces critères, et il est particulièrement approprié pour une étude préclinique sur la conscience. Nous allons utiliser des primates adultes pour que le développement du cerveau soit complet avec pour but ultime de traiter les troubles de la conscience chez les patients humains adultes. Nous n’aborderons pas ici des thématiques pédiatriques.
Etudes de l’implication de la boucle fronto-pariétale au cours de la mémoire de travail 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Craniotomie, injection stéréotaxique dans le cerveau, pose d'un implant crânien de deux heures trente : 3 000 souris subissent ces interventions, 2 880 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Les animaux implantés vivent seuls pendant treize semaines au maximum pour éviter la perte de l'implant, et une restriction hydrique pouvant durer huit à douze semaines les motive à exécuter la tâche. L'objectif déclaré est de décrire l'activité du réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail, les retombées annoncées sur la schizophrénie étant renvoyées à de futures stratégies. Le RNT parle de "différentes tâches comportementales" en tête restreinte, sans jamais dire lesquelles.
Objectifs
La mémoire de travail est une des fonctions cognitives les plus importantes car elle assure la continuité entre le passé immédiat et les actions à venir en agissant comme carrefour d’échanges entre les informations sensorielles entrantes, la mémoire long-terme et la prise de décisions. Le cortex préfrontal a été proposé comme étant l’unique siège de la mémoire de travail depuis les années 70. Cependant de plus en plus d’études chez les primates non-humains et cliniques mettent en avant la nature distribuée de la mémoire de travail, notamment au niveau du cortex pariétal postérieur dans le réseau fronto-pariétal. Néanmoins, l'interaction fonctionnelle entre ces deux aires corticales au niveau des réseaux neuronaux et cellulaires a été très peu étudiée. Cette méconnaissance est principalement due aux limitations méthodologiques d'enregistrement. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’enregistrement électrophysiologique de large population de neurones permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central. De plus, le développement de nouveaux outils cellulaires permet l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses impliquées spécifiquement durant la mémoire de travail. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts. L’objectif général de notre projet, qui se déroule dans 2 établissements utilisateurs, est d’investiguer l’activité neuronale dans le réseau fronto-pariétal pendant la mémoire de travail afin d’élucider son rôle spécifique ainsi que les mécanismes généraux y orchestrant. Ceci pourrait nous éclaircir sur la physiopathologie et le développement de nouvelles cibles thérapeuthiques pour des maladies comme la dépression et les troubles de l’attention où la mémoire de travail est particulièrement affectée.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de réseaux et cellulaires qui soutiennent la mémoire de travail et ainsi la manière dont notre cerveau traite cette tâche cognitive. De par les résultats qui en découlent, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aideront donc à mieux comprendre non seulement comment la mise en place de la mémoire de travail s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liés à une altération de cette mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est d’utiliser de nouveaux outils cellulaires pour répondre directement à de nombreuses questions sur les mécanismes cellulaires mis en jeu lors de la mobilisation de la mémoire de travail en faisant le lien entre physiologie synaptique et activité de réseau. Pour cela, nous avons mis en place des approches multidisciplinaires allant de la physiologie synaptique à l’analyse d’activité de réseau. Nos données seront utilisées pour alimenter des réseaux de neurones artificiels pour mettre en lumière les mécanismes fondamentaux de la mémoire de travail afin de mettre en œuvre de meilleures stratégies pour contrebalancer son altération dans des maladies neuropsychiatriques telles que la schizophrénie.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, l’ensemble des animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour infection virale (30 min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour la totalité de l’expérimentation, soit pour une durée de 13 semaines maximum, afin d’éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Le test comportemental requiert le jeûne hydrique de 8-12 semaines maximum pour motiver les animaux à effectuer la tâche. Lors des tests comportementaux de mémoire de travail, réalisés dans le second établissement utilisateur, les animaux subiront 3 injections (30 min/injection, 1 injection/2 jours). Les animaux effectueront différentes taches comportementales se faisant sur 8-12 semaines consécutives maximum. Les animaux subiront 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant euthanasie et 1 injection (5 secondes) pour l’anesthésie avant l’imagerie intrinsèque.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entraînent des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures.L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations et lors du contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique est également induit lors des contentions et lors de la tâche comportementale en tête restreinte. L'injection dans le péritoine provoque un stress physique dû à la contention et entraîne un effet indésirable de l’injection.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques tel que le t-test, pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien-être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de réflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d’un anti-inflammatoire non stéroïdien est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra une injection quotidienne d’un anti-inflammatoire non stéroïdien jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux mâles et femelles de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Mécanismes cellulaires régissant le développement normal et pathologique des circuits sensoriels et moteurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
9 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue : 992 femelles gestantes, 3 325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4 387 embryons prélevés au dix-huitième jour de gestation. Les femelles subissent une ouverture de l'abdomen de trente minutes pour une injection d'ADN dans le cerveau ou l'œil de leurs embryons, geste dont le porteur indique qu'il peut rompre le sac embryonnaire et conduire à la mort in utero ou à la naissance d'un petit non viable. Les nouveau-nés reçoivent une injection de marqueur dans les deux yeux, ou sont anesthésiés par le froid et opérés sans réveil. 8 960 de ces animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour un travail de recherche fondamentale sur la formation des circuits visuels et moteurs.
Objectifs
Notre système nerveux est un réseau complexe au sein duquel une connectivité précise entre les neurones est essentielle au bon fonctionnement du système. Cette connectivité neuronale est établie au cours du développement embryonnaire par une succession de processus incluant : (i) la migration neuronale, une étape qui détermine la position des neurones dans le système nerveux, (ii) le guidage axonal, un processus permettant aux axones en croissance d'atteindre les cibles avec lesquelles ils doivent établir des connections, et enfin une dernière étape permettant l’élimination des connexions surnuméraires ou inappropriées. Le dysfonctionnement d’une ou plusieurs de ces étapes est à l’origine d’un spectre de maladies neurodéveloppementales allant des malformations cérébrales aux maladies psychiatriques et est à l’origine de certaines maladies neurodégénératives. Au cours du développement embryonnaire, le comportement des neurones et de leur axone en croissance est dicté par un environnement très complexe incluant des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécaniques (rigidité du tissu). Si de nos jours, ces signaux environnementaux sont pour la plupart connus, les mécanismes intracellulaires qui adaptent le comportement des axones en croissance à ces signaux restent largement ignorés. Notre projet vise à décrypter ces mécanismes en se concentrant sur deux acteurs cellulaires essentiels au développement neuronal: les molécules de signalisation et le squelette neuronal. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale combinant (i) le développement d'outils innovants pour moduler ces signaux et régulateurs du squelette neuronal, (ii) l'utilisation de systèmes biologiques complémentaires (systèmes acellulaire, cultures cellulaires et modèles murins) ainsi que (iii) des techniques de chirurgie (électroporation in utero) et d’histologie permettant étudier les conséquences sur le développement des circuits neuronaux d’une modulation de ces signaux et régulateurs du squelette. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux mécanismes essentiels à l’établissement des connectivités neuronales, d’apporter un éclairage nouveau sur l’origine de certaines pathologies visuelles (Ambliopie) et neurologiques et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour préserver ou rétablir une connectivité fonctionnelle dans certaines conditions pathologiques (glaucome).
Bénéfices attendus
En décryptant les mécanismes cellulaires qui dictent les changements morphologiques et comportementaux des neurones en développement, notre projet apportera un éclairage nouveau sur les mécanismes fondamentaux régissantla formation des circuits visuels et moteurs au cours du développement embryonnaire ainsi que sur l’origine de certaines pathologies visuelles (albinisme, Ambliopie) et neurologiques (maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives). Il devrait également fournir de nouveaux outils et nouvelles cibles thérapeutiques pour pour prévenir/freiner la dégénérescence axonale et/ou rétablir des connectivités neuronales fonctionnelles dans certaines conditions pathologiques (ex : glaucome).
Procédures
Au cours de notre projet les animaux seront soumis à différentes interventions. Parmi elles : (I) une injection unique de marqueurs neuronaux dans les deux yeux sous anesthésie et analgésie. Cette intervention concerne des nouveau-nés âgés de 3 ou 15 jours et sa durée est de 20 minutes. (II) Une Injection in utero d’une solution d’ADN dans le cerveau ou l’œil d’embryons à 18 jours de gestation. Cette injection nécessite une chirurgie abdominale (laparotomie) sur des femelles gestantes préalablement analgésiées et anesthésiés. La procédure dure 30 min. (III) Une étape de chirurgie sans réveil pour l’animal sur des souriceaux âgés de 2 à 15 jours analgésiés et anesthésiés. Cette procédure a une durée inférieure à 30 min.
Impact sur les animaux
L’anesthésie par le froid des nouveaux nés peut entrainer un stress thermique. Il existe un très léger risque de réaction inflammatoire de courte durée (48 h) suite à l’injection intraoculaire des molécules permettant de marquer les axones rétiniens. Un faible risque de détresse respiratoire et de mortalité est également associé à l’anesthésie générale. Lors de la procédure d’électroporation in utéro, la rupture du sac embryonnaire entourant l’embryon peut conduire à la naissance d’un embryon sous développé et non viable en période postnatal voir même à sa mort in utero. De plus, dans le cadre de l’électroporation in utero, la femelle gestante pourrait éprouver une gêne, des douleurs et/ou du stress suite à la chirurgie abdominale. De plus, des problèmes au niveau de la mise bas pourrait survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire et adaptée à l’âge de l’animal et ce afin de réaliser des analyses histologiques sur les embryons et nouveau-nés.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons chaque fois qu’il le sera possible des modèles cellulaires pour remplacer ou minimiser l’utilisation des modèles animaux. Notamment, nous effectuerons toutes les expériences de préselection des molécules d’interêt de notre étude sur différents modèles de cellules en culture. Seules les molécules les plus prometteuses seront ensuite analysées in vivo. Cette approche in vivo reste indispensable à la validation de l’importance des molécules étudiées pour le façonnage des connections neuronales et/ou de leur potentiel thérapeutique, les modèles in vitro ne pouvant pas récapituler la complexité des signaux chimiques (molécules de guidage), physiques (cellules et axones voisins, vaisseaux sanguins) et mécanique (rigité du tissu nerveux) guidant les axones en développement.
Réduction
La dissection des mécanismes cellulaires régissant l’établissement des réseaux neuronaux est complexe et requière grand nombre de conditions expérimentales. Afin de réduire au maximum les approches in vivo chez l’animal, nous utilisons des approches in vitro basées sur différents modèles cellulaires pour faire une pré-sélection de molécules ou gènes candidats. Sur la base de ce crible, nous avons pu réduire au maximum le nombre de lots expérimentaux nécessaires pour valider la pertinence de ces candidats pour la formation des circuits neuronaux in vivo. Ainsi, le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre de ce projet sera de 9128. Ce nombre inclus 992 femelles gestantes, 3325 nouveau-nés âgés de 2 à 15 jours et 4387 embryons à 18 jours de gestation. Cette estimation se base sur des études précédentes de l’équipe utilisant des approches expérimentales équivalentes et des tests statistiques prédictifs. Ces analyses, nous permettent de réduire et d’estimer à 10 le nombre d’animaux par condition expérimentale requit pour obtenir des résultats statistiquement robustes compte-tenu de la variabilité inter-individus. L’analyse de nos données sera faite à l’aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Pour les animaux provenant de l’extérieur 5 jours d’acclimatation seront respectés avant expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement selon les conditions respectant la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. La température (entre 20 et 24 degrés), l’hygrométrie (entre 45 et 55 pourcents) et l’éclairage sont contrôlés et conformes à la règlementation. La Structure Chargée du Bien-être Animal et le personnel qualifié de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne des animaux. Les chirurgies sont réalisées par des personnels titulaires des formations adéquates et sont réalisées sous analgésie pré et post-opératoire et anesthésie générale. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur coussin chauffant pour éviter toute hypothermie. Leurs yeux sont protégés par un gel lubrifiant pour prévenir la sécheresse oculaire. Le réveil se fait dans une chambre thermostatée à 30 degrés sous surveillance, avant le retour dans leur cage initiale. Après réveil, les animaux sont surveillés une fois par heure pendant 2 heures, puis tous les jours par les expérimentateurs ou le personnel de l'animalerie pour détecter d’éventuelles complications post-chirurgicales ( points limites) et réaliser les gestes nécessaires et adaptés (soin ou euthanasie). Une surveillance quotidienne des nouveau-nés sera également faite dès la naissance. En cas de détection de signes de souffrance, de rejet par la mère ou d’absence de lait dans l’estomac les petits seront euthanasiés. Après l’électroporation in utero, les femelles ayant subi une chirurgie au niveau de l’abdomen s’occupent moins bien de leur portée. Ainsi, des femelles gestantes sur lesquelles aucune procédure ne sera réalisée seront utilisées comme mères adoptives afin d’augmenter les chances de survie des petits électroporés. Enfin, afin de réduire le nombre d’animaux exclus des analyses statistiques pour électroporation non-optimale, une femelle gestante sauvage sera dédiée au raffinement de l’électroporation dans certains lots expérimentaux pour optimiser le ciblage des neurones d’intérêt.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’Homme génétiquement, anatomiquement et physiologiquement. De plus, l'organisation des circuits visuels et des circuits moteurs contrôlant la motricité volontaire est bien conservée entre la souris et l'humain, contrairement à d'autres vertébrés (zebrafish, poulet). La souris est aussi un modèle utilisé de longue date pour l’étude du système nerveux et visuel. De nombreuses données sont donc disponibles dans la littérature sur lesquelles notre étude peut se reposer. Encore, la souris reste le modèle de choix pour la génération d’animaux transgéniques (permettant l’étude de la fonction d’un gène dans un tissu d’intérêt ou à l’échelle de l’organisme entier) ou de modèles de pathologies humaines (visuelles, neurologiques) comme celles étudiées dans notre projet. Pour l’étude du système visuel comme pour le système moteur, nous nous intéresserons principalement aux stades embryonnaires et post-nataux afin d’étudier comment la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau ou le cerveau et la moelle épinière se met en place pendant le développement embryonnaire et se raffine en période post-natale. Nos études seront donc menées sur des embryons au 18ème jour de gestation et sur des nouveau-nés âgés de 2, 3, 8 ou 15 jours. Cette analyse temporelle, nous permettra d’identifier à quelle étape de ces processus développementaux la formation de ces circuits neuronaux, nos molécules de signalisation ou gènes d’intérêts jouent un rôle déterminant.
Etude de la physiopathologie de l’Ileus post-opératoire
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Soumises sous anesthésie à dix minutes de manipulation de l'intestin destinée à bloquer leur transit, 900 souris vont être utilisées, toutes tuées ensuite pour prélèvements. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 300 d'un niveau léger. Le transit est mesuré par gavage d'une solution de charbon, avec une attente pouvant aller jusqu'à six heures, et par l'insertion d'une bille dans le côlon, l'animal restant isolé en cage individuelle jusqu'à une heure, puis les souris sont mises à jeun quinze heures. Le porteur ramène les nuisances à un inconfort abdominal et au stress du jeûne et de l'isolement, sans jamais décrire en quoi consiste cette manipulation de l'intestin ni comment l'intestin est atteint.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques du ralentissement voire de l'arret du transit intestinal post opératoire suite à une manipulation intestinale en utilisant un modèle murin. En effet, ce ralentissement/arrêt du transit intestinal survient frequemment chez les patients ayant subit une manipulation intestinale lors d'une chirurgie.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de cette complication chirurgicale. Le bénéfice de ce projet est d'identifier des gènes impliqués dans la physiopathologie et donc des cibles thérapeutiques. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et la mortalité des patients.
Procédures
Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon (durée de l'administration : 5 secondes) qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) (durée de l'insertion : 10 secondes) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 1h pour l’animal). Lors de cette mesure l'animal sera dans une cage individuelle.La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration par voie orale d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). Les animaux seront mis à jeun (non stricte) pendant 15h pour cette mesure.
Impact sur les animaux
inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par le jeun, l’isolement pendant 1h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés en vue des réaliser des prélevements et les analyser.
Remplacement
Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motricité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Grâce au projet précédent, un modèle fiable de cette chirurgie a été mis en place. La robustesse de la chirurgie a permis de diminuer au maximum la variabilité entre les animaux et donc de réduire le nombre d'animaux par groupe. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors de l'euthanasie, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner les techniques les plus légères possible après la chirurgie.
Raffinement
Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux est vérifié quotidiennement. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post-opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes réglées à 37°C sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L'état des animaux sera relevé et scoré à chaque surveillance à l'aide d'une fiche de scoring spécifiquement adaptée à la chirurgie abdominale. Les points limites sont indiqués dans cette fiche et seront appliqués dès que nécessaire.
Choix des espèces
La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris. Des animaux adultes seront utilisés pour étudier le système digestif mature.
Détection quantitative par IRM in vivo du zinc dans le pancréas de souris : application au diabète
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles passent sept jours plus tard une séance d'IRM d'une heure au maximum sous anesthésie gazeuse, avec pose d'un cathéter et injections de glucose et d'agent de contraste. Le porteur décrit les effets attendus, hyperglycémie, urines abondantes, soif intense et perte de poids, et indique n'administrer aucun antalgique pour l'injection de l'agent de contraste, qu'il juge équivalente à une piqûre d'aiguille. Il retient le modèle diabétique pharmacologique parce qu'il est "simple de réalisation" et le plus homogène, la souris obèse n'entrant pas dans son imageur.
Objectifs
Les ions métalliques sont impliqués dans de nombreux processus biologiques fondamentaux et sont des éléments essentiels pour la croissance et le développement de tous les organismes vivants. Les cellules régulent étroitement l’accumulation, le transport, la distribution et l’exportation de métaux, et une mauvaise régulation de la quantité d’ions métalliques peut être signe de pathologie comme les maladies cardiaques, le cancer et les maladies neurodégénératives. Le zinc revêt un intérêt particulier car il s'agit d'un micronutriment essentiel requis pour plus de 300 processus cellulaires différents, notamment l'activité enzymatique, la synthèse de l'ADN et des protéines et la signalisation cellulaire. Il est connu que la carence en zinc entraîne une augmentation du stress oxydatif contribuant à des maladies telles que le diabète. La teneur en zinc est particulièrement importante dans la prostate, le sein mais surtout le pancréas. Une mauvaise régulation du zinc a été clairement associée au diabète même si son rôle n’est pas complètement compris. Dans ce projet nous nous focalisons sur la variation de contenu en zinc au niveau du pancréas en cas de diabète de type 1. L’objectif de ce projet est de valider l’efficacité d’agents de contraste IRM sensibles au zinc pour une détection précoce du diabète de type I en utilisant un modèle de souris diabétique
Bénéfices attendus
La détection du zinc in vivo par IRM est un challenge important afin de mieux caractériser et comprendre son rôle physiologique, mais également de pouvoir réaliser un diagnostic précoce dans lequel cet ion métallique est impliqué. Nous avons développé un premier agent de contraste biocompatible qui a montré son intérêt dans la détection du zinc in vivo sur des pathologies de type diabète (projet précédent 18668). Nous avons maintenant une nouvelle famille d’agents optimisés en terme d’affinité pour le zinc et de réponse IRM. Ces agents permettront une mesure très sensible de la quantité de zinc dans le pancréas dans le but d’un diagnostic précoce.
Procédures
Les souris seront imagées une fois en IRM 7 jours après induction du diabète. Cette technique est totalement atraumatique et non invasive. Les souris sont anesthésiées (par anesthésie gazeuse) pour l’ensemble des interventions prévues : injections de glucose ou d’agent de contraste ainsi que pendant la procédure d’imagerie IRM. Les injections durent quelques secondes. La pose du cathéter se fait en moins d’une minute. Les acquisitions d’images IRM durent 1 heure au maximum.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que nous avons constatés dans le précédent projet au bout de 7 jours sont liés au développement du diabète (hyperglycémie, polyurie, polydipsie, perte de poids). Par ailleurs aucun point limite n’a été atteint pendant ces 7 jours d’expérimentation. Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM. Leur respiration, rythmes cardiaque et respiratoire sont contrôlés pendant les acquisitions IRM. L’injection IV d’ agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste.
Devenir
Toutes les souris encore sous anesthésie (pour prélèvement sanguin) seront par la suite mises à mort à la fin des procédures pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude préclinique en particulier d’induction du diabète et l’étude de l’efficacité d’agents de contraste ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. De plus il est nécessaire que le pancréas soit dans un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Ce projet nécessitera 220 souris. Une seule expérience sera réalisée avec des lots de 5 souris par condition.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’expérimentation (7 jours), les souris sont hébergées par groupes sociaux de 5 dans les cages en portoir ventilé, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h. Divers objets d'enrichissement du milieu (maison transparente rouge, celluron, granulés ainsi que bâtonnets de bois à ronger) sont utilisés . Les souris auront une période d’acclimatation avant la première série d’images (avant l’injection de streptozotocine) de 7 jours minimum avant le début des études IRM. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Une grille de scoring est mise en place (aspect général, mobilité et amaigrissement) et des points limites sont définis. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler un éventuel mal être ou signe de souffrance. L’hygiène de la cage sera contrôlée en raison de la polyurie des souris diabétique (quantité d’urine et odeur particulière de l’urine). Le niveau des biberons sera contrôlé tous les jours en raison de la polydipsie des souris diabétiques.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté à notre imageur IRM (taille de l’ouverture). Le modèle de souris diabétique pharmacologique par injection est largement décrit et utilisé dans la littérature. Nous avons choisi ce modèle pour plusieurs raisons : 1) la souris obèse n’est pas adaptée à notre imageur, 2) le modèle NOD est un modèle auto immun et nous ne souhaitions pas être confronté à la complexité de compréhension de la réponse immunitaire 3) le modèle pharmacologique est simple de réalisation et 3) c’est le modèle qui est le plus homogène en terme de progression de la pathologie.
Ciblage préclinique chez la souris de nouveaux biomarqueurs d’agressivité et de résistance dans le glioblastome en place et réséqué (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Anesthésiées pour recevoir dans le cerveau une injection de cellules de glioblastome humain, parfois accompagnée de la pose d'un implant lors d'une intervention d'une heure trente, 580 souris immunodéficientes sont ensuite suivies chaque semaine par IRM. Une partie est transportée sur 95 kilomètres, une heure à l'aller et autant au retour, pour une séance de radiothérapie externe, avant de revenir subir jusqu'à deux actes intracérébraux. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et le porteur attend fatigue, stress, mauvaise cicatrisation, perte de poids et prostration. Toutes sont tuées, au motif d'éviter la souffrance liée à la pousse du glioblastome qu'il leur a lui-même implanté.
Objectifs
L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.
Choix des espèces
Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.