Recherche fondamentale

Chaque souris est contenue treize fois, reçoit une injection de cellules leucémiques, subit six prélèvements sanguins, cinq injections dans l'abdomen et dix gavages consécutifs. 1 472 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des molécules censées reprogrammer les macrophages contre la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur décrit des douleurs modérées liées aux prises de sang et aux injections répétées, un inconfort au gavage avec irritation possible de l'œsophage, et une perte de poids après l'injection des cellules cancéreuses. Les calculs qu'il présente portent sur des groupes de huit à dix souris répétés trois fois, sans que le total de 1 472 animaux soit rapporté à ces effectifs.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) touchent environ 3 personnes sur 100 000 chaque année en France. Malgré les traitements comme la chimiothérapie et les greffes de cellules souches, et même si 50 à 80 % des patients entrent en rémission, des cellules cancéreuses restent souvent présentes et peuvent provoquer des rechutes plus tard. Récemment, des chercheurs ont découvert que certains types de cellules immunitaires appelées macrophages jouent un rôle important dans la progression des LAM. Selon l'environnement autour des tumeurs, ces macrophages peuvent être de deux types principaux : 1. Les macrophages M1, qui sont anti-tumorales et combattent les tumeurs. 2. Les macrophages M2, qui sont pro-tumoraux et peuvent aider les tumeurs à se développer. Les macrophages peuvent changer de fonction en réponse à leur environnement, ce qui ouvre des possibilités pour de nouvelles thérapies. Étant donné l'importance des macrophages pro-tumoraux dans la leucémie, nous souhaitons tester dans ce projet plusieurs approches pharmacologiques pour reprogrammer les macrophages en macrophages anti-tumoraux dans des souris leucémiques et ainsi améliorer le traitement de référence. Ainsi, l'ensemble des résultats obtenus nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de la leucémie aigue myéloide et par conséquent améliorer la survie des patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Grâce à ce modèle in vivo de leucémie, nous pourrons 1/ déterminer l'importance des cellules immunitaires, et notamment des macrophages, dans la physiopathologie de la leucémie aigue myéloide mais également 2/ développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires afin de les réactiver dans le but d'améliorer la prise en charge de la leucémie chez l'homme.

Procédures

1- Contentions répétées des souris (13 fois, 30 secondes / Souris) 2- Injection de cellules leucémique chez la souris (1 fois, 20 sec /souris) 4- Prélèvements sanguins avant traitement (J0 et J10) puis tous les 5 jours durant la durée du traitements (20 jours), soit 6 prélèvements/souris (30 sec / souris) 5- Injections intrapéritonéales répétées (5 injections/souris sur 5 jours, 30 sec/souris) 6- gavages répétés (10 gavages/souris sur 10 jours, 1 min /souris)

Impact sur les animaux

1/Stress légers liés à la préhension et la contention des animaux, 2/Perte de poids suite à l’injection des cellules cancéreuses et aux différents traitements, 3/Stress et douleurs modérées liées aux prélèvements sanguins répétés, 4/Stress et douleurs modérées liées aux injesctions intrapéritonéales répétées avec possibilité d'inflammations locales, 3/Inconfort et douleurs modérées liées aux gavage répétés avec possibilité d'irritation de l'œsophage.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort afin de réaliser l'ensemble des analyses biologiques et biochimiques nécessaires à l'obtention des résultats

Remplacement

Les seuls modèles à notre disposition à ce jour sont des lignées cellulaires leucémiques de patients ou de souris isolées à partir d’animaux malades. Néanmoins, Il a été montré que les propriétés tumorales, sécrétrices et fonctionnelles de ces lignées diffèrent in vitro et in vivo d’où la nécessité d’induire la leucémie chez l’animal pour son étude. Ainsi et après avoir caractérisé et testé in vitro les meilleurs traitements ayant des effets capable de reprogrammer les macrophages en système in vitro, il est maintenant nécessaire de réaliser des expériences chez le rongeur afin d‘avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer si ces molécules peuvent améliorer les effets de la chimiothérapie dans un modèle murin de leucémie. Nous étudierons aussi le rôle de l’environnement tissulaire (interaction cellulaire, interaction cellule-microenvironnement et surtout réponse du système immunitaire) dans la réponse à ces drogues. Le passage chez l‘animal est une étape cruciale pour le développement potentiel de ces molécules chez l‘Homme afin de proposer une alternative à l'échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Nous avons décidé de réaliser deux procédures dans le but de réduire le nombre d'animaux. Ainsi, la première procédure permettra d'établir la meilleure dose à utiliser de nos traitements d'intérêt sur un nombre minimal de souris et établira la preuve de concept d'efficacité de nos molécules à potentialiser les effets de la chimiothérapie de réference. L’objectif de cette procédure est donc de démontrer un effet notable de nos molécules sur la réduction de la masse tumorale en combinaison avec le traitement de référence . L'utilisation d'un logiciel de statistique recommande des groupes de 8 souris chacun afin d'établir cette preuve de concept. La seconde procédure établira statistiquement l'intérêt de moduler la polarisation des macrophages afin d'améliorer le traitement de référence . Afin d'établir le nombre de souris à utiliser, nous avons utilisé un logiciel pour faire des prévisions statistiques. Ainsi, ce logiciel recommande des groupes de 10 souris chacun et de répéter au moins 3 fois l'expérience. Nous avons donc décidé de constituer des groupes de 10 souris et de répéter l'expérience trois fois de manière indépendante. Si les résultats s’avèrent statistiquement significatifs dès la deuxième expérience, nous stopperons l'expérimentation et nous ne ferons pas la 3ème expérience.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et matériel de nidification). Des points limites précoces et adaptés notamment appuyés sur la mesure de marqueurs sanguins qui permettent de suivre précocement de la progression de la pathologie et de limiter la gravité des procédures seront mis en place. Si les efficacités de nos molécules sont démontrées avant les 20 jours de traitements, les procédures de traitements et de prélèvements seront arrêtées.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer la capacité de molécules capables de réactiver le système immunitaire dans le but d'améliorer les traitements actuels de la leucémie aigue myeloïde. Dans cet objectif, le modèle murin est le plus à même de reproduire un système immunitaire complexe. L'injection des cellules leucémiques s'effectuera à l'âge de 6 semaines, âge correspondant à l'âge optimal de prise tumorale.

Un monofilament est poussé dans la carotide interne jusqu'à l'artère cérébrale moyenne d'une souris anesthésiée, l'obstrue pendant 45 minutes, puis une seconde chirurgie vient le retirer. Le lendemain, l'animal passe onze minutes d'IRM, avant quatorze jours de tests comportementaux nommés : force d'agrippement, reconnaissance d'objet nouveau, retrait d'adhésif, test du spaghetti. 704 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour comparer quatre stratégies thérapeutiques contre l'accident vasculaire cérébral, à deux doses chacune. Le réveil provoque une désorientation prononcée qui fait tourner les souris sur elles-mêmes, et le projet se termine par une chirurgie sans réveil au cours de laquelle le cerveau est prélevé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester quatre stratégies thérapeutiques dont leurs mécanismes d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’AVC : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris par administration intrapéritonéale (i.p), intraveineuse (i.v) ou par voie orale (per-os), pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses différentes afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit moteur ainsi que du volume lésionnel.

Bénéfices attendus

Chez l’Homme, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir insérer un monolfilament dans la carotide interne puis poussé jusqu’à la base de l’artère cérébrale moyenne (ACM) provoquant ainsi une occlusion. Cet acte chirugical durera 15 minutes. 45 minutes plus tard, une seconde chirurgie sur le même site sera réalisée afin d’extraire ce monofilament. Cet acte chirugical durera 10 minutes. La pose d’un cathéter en veine caudale sera nécessaire pour l’infusion des traitements. Une moyenne de 5 minutes est à prévoir pour cette pose. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes et suivront une série de test comportementaux s'étalant de J+1 à J+14 post AVC. Nous comptons un total de 25 à 30 minutes pour la réalisation du test de force d’agrippement. La première séance d’acquisition du test NOR durera 8 minutes. 3 heures plus tard une seconde acquisition de 8 minutes est prévue. La mesure de la sensibilité digitale par le test de retrait d’adhésif durera 10 minutes puis les mesures du spaghetti dureront en moyenne 5 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sans réveil. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. L’embolisation de l’ACM provoque une désorientation prononcée au moment du réveil post-chirurgical (phénomène de circling). Les fonctions motrices peuvent également être altérées durant les premières heures après l’ischémie-reperfusion.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 10 sauf pour les SHAM au nombre de 20. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le devenir des lésions induites par un AVC ainsi que la récupération fonctionnelle. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

Tuées après anesthésie à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient prélevés, 5 274 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les mères gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive, trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leur descendance devenue adulte reçoit sous la peau une injection de cellules tumorales, dont la croissance provoque une douleur locale et une détresse décrites comme modérées. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"incontournable" au motif que la réponse antitumorale engage "l'organisme entier", puis énumère parmi les raisons du choix de la souris ses "coûts réduits", ses cycles de reproduction courts et sa "facilité de transport".

Objectifs

Le stress prénatal (PS) est provoqué par des événements traumatisants (comme le décès d’un proche, la dépression, une agression, une infection, etc.) survenant pendant la grossesse. Il a été observé que le stress prénatal entraîne chez les enfants diverses psychopathologies (telles que la dépression, l'anxiété, l'autisme, la schizophrénie, etc.), des troubles neuro-développementaux, ainsi que des dysbioses intestinales. Le PS peut également avoir divers effets sur le système immunitaire des enfants, notamment en augmentant leur susceptibilité à développer des dermatites et des allergies telles que des inflammations pulmonaires et de l’asthme allergique. L'impact du PS sur le développement du cancer demeure largement inexploré et les mécanismes impliqués restent à élucider. Une étude portant sur une cohorte humaine de 6 millions d’enfants a révélé que les enfants nés de mères ayant subi la perte d'un bébé ou de leur conjoint pendant la grossesse présentaient un risque accru de développer certains cancers liés aux fonctions immunitaires et endocriniennes, comme la leucémie, le cancer des testicules et du foie. Cependant, cette étude n’a pas établi de lien de causalité entre le PS et le cancer. Ainsi, notre projet vise à étudier, à l'aide d'un modèle de stress prénatal développé par notre équipe, les mécanismes par lesquels le PS influence la réponse immunitaire anti-tumorale chez la progéniture. Pour ce faire, nous analyserons l’impact du PS sur la réponse immune antitumorale dans trois modèles murins complémentaires.

Bénéfices attendus

Les facteurs environnementaux peuvent influencer le développement du système immunitaire et avoir un impact durable sur la progéniture, ce qui peut ultérieurement influencer les réponses immunitaires normales et pathologiques. Cette étude sur l'effet du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes, en mettant l'accent sur le microbiote. Cela pourrait permettre d'identifier des souches bactériennes ou des métabolites du microbiote qui pourraient être ciblés thérapeutiquement pour traiter les pathologies cancéreuses.

Procédures

Les souris gestantes seront soumises au stress du 13ème au 18ème jour de gestation en utilisant un tube de contention sous une lumière vive pendant 30 minutes, trois fois par jour. La progéniture adulte recevra une injection en sous-cutanée des cellules tumorales. Le modèle implique l'injection sous-cutanées de cellules tumorales murines présentant le même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes. Ces modèles sont couramment utilisés pour évaluer l'efficacité des thérapies car ils reproduisent la complexité de la physiopathologie observée chez l'homme En cas d’apparition de phénotypes dommageables, notamment des signes d’inflammation excessive ou de dérèglement immunitaire, une intervention rapide sera mise en place. Cela inclut des soins vétérinaires pour évaluer l’état de santé des animaux, ainsi que la mise en œuvre de protocoles d’euthanasie en cas de souffrance excessive ou de détérioration clinique significative. Les signes à surveiller incluent l’amaigrissement, les comportements anormaux (comme la posture courbée ou le poil éparse), ainsi que tout signe de détresse respiratoire ou inflammatoire.

Impact sur les animaux

Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris consiste à injecter des cellules tumorales murines génétiquement compatibles dans des souris immunocompétentes, permettant d'étudier l'efficacité des thérapies dans un contexte physiopathologique proche de l'humain. Ce modèle peut provoquer une douleur légère à modérée au site d'injection, suivie d'une inflammation locale liée à la croissance tumorale. La progression de la tumeur entraîne un stress physique prolongé et une détresse modérée due à des altérations physiologiques et comportementales, telles qu'une perte d'appétit

Devenir

À la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés après anesthésie. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire.

Remplacement

L'évaluation du statut immunitaire de l'animal est souvent peu représentative de la pathologie humaine. Par conséquent, ces limitations rendent le recours à l'expérimentation animale incontournable, car le stress, la réponse immunitaire et la croissance tumorale sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une revue de la littérature sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été développées. L'utilisation de l'espèce animale choisie pour ce projet (la souris) permet de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. De plus, cette espèce présente certains avantages pratiques décisifs justifiant son utilisation dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De surcroît, notre recherche repose sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés, ce qui nécessite l'utilisation des souris. Aucune autre espèce animale n'est disponible à cet effet. Il est également important de souligner que chez la souris, nous disposons d'outils précieux tels que des anticorps et des protéines recombinantes indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans notre étude.

Réduction

Le nombre de souris utilisées dans chaque expérience a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variance biologique des résultats obtenus dans des expériences réalisées au laboratoire. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, tous les échantillons prélevés sont stockés à -80°C et dans une banque de données, où ils peuvent être réutilisés ultérieurement ou servir de témoins dans d'autres expériences. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience étaient nécessaires. Pour les modèles utilisés, les animaux seront régulièrement suivis dans le temps par des techniques non invasives telles que le suivi du poids et la mesure de la croissance tumorale. L'utilisation de ces techniques non invasives permet d'observer l'évolution d'un seul animal au fil du temps, là où auparavant l'information devait être obtenue par l'euthanasie et l'autopsie de multiples individus à chaque étape d'une seule étude, permettant ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Une analyse rétrospective sera réalisée à la fin de chaque expérience afin de déterminer les possibilités de diminution supplémentaire du nombre d'animaux.

Raffinement

Dès le début de la période d'acclimatation, une surveillance quotidienne des animaux (poids, désydratation, température, respiration, état générale...) ainsi qu'un contact humain quotidien sont assurés. Les conditions expérimentales font l'objet d'un suivi rigoureux du bien-être animal. Des points limites (perte de poids >20%, activité extreme, hypotherlmie, ...) ont été définis pour chaque procédure afin de limiter la souffrance ou l'angoisse des animaux, et toute atteinte à ces limites entraînera l'euthanasie de l'animal. Des mesures seront mises en place pour réduire l'anxiété et l'impact environnemental sur les souris, telles que l'enrichissement de l'environnement avec des cachettes et des objets à ronger. Les animaux seront maintenus dans leur cage avec leurs congénères habituels et auront un accès libre à l'eau potable. Une surveillance quotidienne par le personnel animalier ou l'expérimentateur permettra de détecter toute éventuelle souffrance chez les animaux, comme spécifié pour chaque expérience. À la fin de chaque expérience, une étude rétrospective sera menée afin d'identifier les possibilités d'amélioration des procédures pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles de l'espèce humaine. De plus, notre projet de recherche repose sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées. En outre, cette espèce présente divers avantages pratiques essentiels justifiant son utilisation comme modèle dans ce type de projet : coûts réduits, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, manipulation aisée et adaptation adéquate aux conditions expérimentales. Les mères seront soumises au stress du 13e au 18e jour de gestation, conformément à la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite, les progénétures utilisées seront âgées d'au moins 6 semaines, car nous visons à utiliser des animaux adultes et matures. De plus, cet âge est communément utilisé dans la littérature pour ces modèles.

Pour mesurer le rôle d'une hormone du métabolisme du fer dans l'arthrite, 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 320 d'entre elles reçoivent deux injections dans l'abdomen à 72 heures d'intervalle qui déclenchent une arthrite, 70 sont gavées deux fois par jour pendant dix jours. Le porteur décrit une inflammation et des douleurs articulaires du septième au onzième jour, terme du protocole, puis un prélèvement de sang par ponction dans le cœur sous anesthésie avant la mise à mort. Il indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % arrête l'expérimentation et déclenche la mise à mort des souris concernées.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique touchant 0,5 à 1% de la population. Cette pathologie dépend du développement d’auto-anticorps et d’un recrutement de cellules inflammatoires dans les articulations, menant à une destruction des os et du cartilage. Des molécules activées par l'inflammation perturbent le métabolisme du fer en régulant l’expression de l’hepcidine. L’hepcidine est un petit peptide circulant, il réduit le fer sanguin en inhibant son absorption par l’intestin et sa libération des tissus de stockage. L’hepcidine est principalement exprimée par le foie, mais des études ont montré une synthèse extra-hépatique de l’hepcidine dans plusieurs organes périphériques. Dans un contexte inflammatoire, l’hepcidine aurait un rôle délétère dans ces tissus puisque localement, elle peut augmenter la rétention du fer toxique et accentuer l’inflammation. En effet, l’hepcidine est une protéine inflammatoire de phase aigue. Cependant, le rôle de l’hepcidine dans la PR, reste à ce jour non élucidé. L’équipe a montré que l’hepcidine est produite au niveau de l’articulation de manière significativement supérieure chez des patients atteints d’arthrite comparés à ceux atteints d’arthrose (maladie articulaire non inflammatoire). Des inhibiteurs d'une des voies de régulation importante de l’hepcidine représentent une nouvelle classe thérapeutique capable de cibler l’inflammation des patients atteints d’arthrite. Ainsi nos objectifs dans ce projet sont d’évaluer d’une part l’implication de l’hepcidine locale dans l’exacerbation de l’inflammation et dans les mécanismes de destruction ostéo-articulaire, et d’autre part, d’évaluer ses consequences sur le métabolisme du fer et sur le développement de la pathologie dans un modèle murin d’arthrite.

Bénéfices attendus

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire touchant les articulations qui affecte actuellement en France 0.5 à 1% de la population, ce qui représente plus de 300 000 personnes. De ce fait, une meilleure compréhension de cette pathologie et le développement de traitements ciblés représentent un enjeu de santé publique majeur. Nos données récentes chez les patients ont montré que l’hepcidine, un peptide qui régule le métabolisme du fer, était présente au niveau de l’articulation en conditions d’arthrite et qu’elle pouvait jouer un rôle important dans la pathologie. Ce projet permettra d’apporter de nombreuses connaissances sur le métabolisme du fer local dans la polyarthrite rhumatoïde, un domaine non étudié à ce jour. Parmi les derniers traitements développés, le filgotinib montre des résultats encourageants chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde modérée à sévère. Ce projet nous permettra d’apporter plus de connaissances concernant les mécanismes d’action de ce traitement dans la polyarthrite rhumatoïde. De plus nous apporterons des résultats sur l’impact de ce traitement sur le métabolisme du fer qui intervient dans de nombreux processus physiologiques.

Procédures

320 animaux subiront 2 injections intrapéritonéales réalisées à 72h d’intervalle. Ce geste, rapide (quelques millisecondes à quelques secondes) et indolore pour les animaux, sera réalisé sur animaux vigiles. 70 animaux seront soumis à des gavages deux fois par jour pendant 10 jours (de J0 à J9). Cette technique réalisée en quelques secondes sera réalisée par des personnes expérimentées sur animaux vigiles. L’ensemble des souris subiront également un prélèvement sanguin intracardiaque (quelques secondes) réalisé sous anesthésie avant leur mort.

Impact sur les animaux

Les animaux qui développeront une arthrite peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires à partir de la mise en place de la pathologie (J7) jusqu’à la fin du protocole expérimental (J11).

Devenir

Notre projet nécessite la récupération de prélèvements moléculaires, cellulaires et tissulaires, ce qui ne nous permet pas de garder les animaux en vie après prélèvements. De plus le projet ne nécessite pas de faire une cinétique sur nos animaux. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale.

Remplacement

Notre projet repose sur des études préliminaires réalisées in vitro ayant montré que l’arthrite modulait le métabolisme du fer et que ce dernier avait un impact sur la pathologie. La polyarthrite rhumatoïde étant un système complexe impliquant de nombreux partenaires cellulaires, les études in vitro ne permettent pas de représenter l’ensemble de la pathologie. De ce fait, le modèle in vivo reste le meilleur modèle permettant d’étudier la polyarthrite rhumatoïde dans le cadre de notre projet. Nos résultats in vitro nous permettent de justifier l’intérêt scientifique de notre projet dans un système concret qu’est le système in vivo.

Réduction

Notre projet a été pensé afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Sur un même animal, nous réaliserons des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyse des cellules articulaires et circulantes), et moléculaires (dosages). Les techniques utilisées dans notre projet sont des techniques que nous maitrisons et que nous réalisons régulièrement au laboratoire. Les analyses statistiques seront effectuées à l’aide d'un logiciel adapté. Des tests statistiques pertinents seront utilisés.

Raffinement

Notre projet a été conçu afin de limiter le mal-être des animaux. Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, notre étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale. Afin de limiter le stress des animaux, les souris seront acclimatées pendant une semaine suite à leur arrivée dans la zootechnie et avant de débuter l’expérimentation. De plus, elles seront hébergées avec d’autres souris tout au long du protocole (5 souris par cage) dans des cages d’une superficie de 500 cm2 à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Des objets enrichissants seront disposés dans chaque cage pour limiter le stress des animaux. Notre projet nécessite un suivi quotidien du développement de la maladie chez les animaux. De ce fait, nous observerons attentivement les animaux de manière quotidienne et si ces derniers présentent des altérations physiques, des signes de douleur et/ou des comportements anormaux (flan creusé, dos voûté, poils sales, perte de poids, déshydratation, agressivité, prostration…), un analgésique sera administré si necessaire et si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les animaux concernés seront euthanasiés. A la fin de la procédure, avant l’euthanasie des animaux, un prélèvement intracardiaque sera réalisé. Pour réduire la douleur et le stress des animaux générés par cette procédure, les animaux seront anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine et de xylazine.

Choix des espèces

Les modèles murins de polyarthrite rhumatoïde sont couramment utilisés pour étudier la physiopathologie de cette maladie. De plus, le choix d’utiliser des modèles murins a été conforté par le fait que nous possédons de nombreuses connaissances sur ce modèle, nous permettant un plus grand nombre d’analyses possibles. Les souris utilisées seront âgées de 7 à 8 semaines, ce qui est en conformité avec les études publiées utilisant ce modèle murin d’arthrite.

Testée seize fois et manipulée dix-huit fois sur trente-six semaines, chaque poulette suivie passe par des épreuves de persévérance alimentaire, de réactivité face à un objet nouveau, de motivation sociale, de témérité, de biais d'attention et de contagion émotionnelle. 224 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 200 suivies individuellement. L'objectif déclaré est de fournir aux éleveurs une grille pour repérer tôt les futures piqueuses, l'épointage du bec restant autorisé en France. Le porteur reconnaît que le picage sévère ne pourra pas être évité puisqu'il s'agit précisément de l'observer, 28 poules choisies pour leur tempérament seront tuées par injection pour prélever leur cerveau, les autres partant à l'abattoir.

Objectifs

La filière de production des œufs est en pleine mutation, avec l’abolition progressive à la fois de l’élevage en cages mais aussi de pratiques pouvant compromettre le bien-être des animaux. L’épointage du bec chez la poule pondeuse, une pratique consistant à cautériser l'extrémité du bec à l’aide d’un rayon laser, potentiellement douloureuse, a déjà été interdite dans plusieurs pays. Elle reste cependant couramment utilisée en France pour limiter les effets du picage sévère en élevage, tels que le cannibalisme. L’arrêt de l’épointage s’avère compliqué, car les quelques initiatives actuelles (enrichissement du milieu, contrôle de l’intensité lumineuse, apports nutritionnels spécifiques) ne permettent pas de limiter suffisamment le risque de picage sévère chez les poules non épointées. Pour limiter son apparition, il est nécessaire de mettre en place le plus précocement possible des actions préventives. Or, les méthodes actuelles pour détecter précocement les problèmes de picage, telles que la dégradation de l’état du plumage ou l’observation de comportements agressifs, sont trop tardives pour anticiper les épisodes de picage et intervenir efficacement pour les limiter. L’enjeu est ainsi d’agir le plus tôt possible grâce à des observations comportementales en lien avec le niveau de tempérament “piqueur” des animaux. Ce travail a pour ambition de proposer un outil d’évaluation du risque de picage chez la poule à un stade précoce. Cet outil repose sur une grille d’évaluation du comportement des poulettes à destination des éleveurs. La présente étude visera à compléter et à valider des indicateurs comportementaux/de tempéraments reliés à une propension plus ou moins forte de l’individu à piquer.

Bénéfices attendus

Le but de cette étude est d’élaborer une grille d’indicateurs de traits comportementaux/tempéraments chez la poulette qui servira à évaluer à un stade précoce un risque de picage sévère ultérieur. En effet, les mesures prises pour endiguer et gérer le picage sévère en élevage sont trop tardives. La finalité est d’avoir un outil qui permettra aux éleveurs et éleveuses d’identifier les premiers signes précurseurs du picage dès le stade poulette, sur la base de leur tempérament, afin de prendre les mesures nécessaires pour la bonne gestion de leur lot (ex : apport d’enrichissements supplémentaires dans le milieu de vie, la gestion très douce des transitions alimentaires, le suivi renforcé des animaux (comportement, emplumement) pour déceler le moindre écart, la limitation des changements brusques et les sources de stress, etc….).

Procédures

La procédure n’implique pas d’actes invasifs. Lors des trois sessions de tests (session 1 : 4 tests et sessions 2&3 : 6 tests), chacun des 200 individus sera testé une fois par semaine. Un minimum de deux semaines sera laissé entre les sessions pour laisser la place à des périodes sans perturbation. Au total, une même poule sera donc testée 16 fois, dont trois fois par groupe de 10, et manipulée à deux autres moments pour la pose et le changement des dossards et des bagues. Chacun des 200 individus sera donc manipulé 18 fois, étalé sur 36 semaines d’élevage. Les objectifs des tests de comportement, choisis pour leur lien avec un comportement de picage d'après la littérature scientifique et une étude pilote, sont de pouvoir identifier des comportements contrastés afin de dresser un profil de tempérament d'individus qualifiés de "très piqueur" et un profil d'individus qualifiés de "peu piqueur". Les comportements étudiés sont la persévérance pour accéder à une ressource alimentaire appétante, la réactivité émotionnelle des animaux face à un environnement ou à un objet nouveau, leur motivation sociale, leur témérité, leur activité, leur biais d'attention et leur contagion émotionnelle. L'ensemble de ces 6 tests répétés à trois âges différents (sauf 2 d'entre eux en session 1 car jugés plus exploratoires, permettant de laisser davantage de temps de récupération entre les deux premières sessions de tests) dureront entre 5 minutes et 20 minutes au maximum chacun en fonction du test. Concernant les 24 poules surnuméraires, elles seront manipulées deux fois pour la pose des dossards et dans un maximum de 20 fois sur toute la durée de l’expérimentation au cours de deux tests comportementaux qui nécessitent la présence de congénères dans la zone où seront testés individuellement les 200 individus suivis (elles seront placées par groupe de 2-3 dans une aire dédiée).

Impact sur les animaux

Les contentions que les tests impliquent sont ponctuellement stressantes pour les animaux. Les tests comportementaux individuels (20 minutes maximum) peuvent engendrer du stress lié à l’isolement social. Le but de l’expérimentation étant d’observer du picage pour le relier à des tempéraments, nous ne pourrons pas l’éviter. En cas de picage sévère, les animaux pourront subir un stress ou de la douleur lié à une blessure (une observation vigilante et quotidienne est prévue ainsi qu'une infirmerie pour traiter les animaux qui seraient blessés).

Devenir

La majorité des animaux seront abattus en circuit classique (abattoir) pour commercialisation. Un total de 28 poules choisies pour leur tempérament « fortement piqueur » et « peu piqueurs » seront mises à mort par injection pour un prélèvement du cerveau pour analyses génomiques futures comme mesure complémentaire aux observations comportementales.

Remplacement

L'impact du tempérament des poulettes sur le comportement de picage sévère ultérieur ne peut être évalué que par des essais sur animaux vivants. De plus, le projet concerne spécifiquement l’espèce de la poule domestique.

Réduction

Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de poules utilisées tout en conservant un effectif suffisant pour être à minima représentatif des conditions d’élevage et pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Le tempérament est propre à chaque individu. Il existe donc une forte variabilité interindividuelle qui nécessite l’implication d’un nombre suffisant d’animaux. Ce projet impliquera donc au total 224 poules, dont parmi elles 200 seront suivies et testées. L’analyse des résultats d’une étude préliminaire nous a permis de conclure que 200 individus étaient un minimum pour nous permettre de différencier statistiquement des poules avec un tempérament « très piqueur » d’un tempérament « peu piqueur » (prévalence de 10% d’individus très piqueurs au sein d’un lot, d’après une étude précédente). Les 24 poules surnuméraires permettent d’augmenter la taille de groupe pour provoquer davantage de comportements d’interactions sociales entre les poules et serviront d’individus familiers lors de deux tests comportementaux impliquant les individus suivis.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer au sein du parc des conditions similaires à celles rencontrées sur le terrain en élevage standard avec des pratiques un peu améliorées (présence de perchoirs dès le stade de poulettes, suivi rapproché quotidien). La densité d'élevage sera très légèrement plus faible que celle rencontrée sur le terrain afin de nous permettre de mieux observer les animaux : 14 poulettes/m² au lieu de 16. Un contrôle des paramètres d'ambiance sera fait quotidiennement de manière automatique dans toutes les salles. L’alimentation et la conduite des animaux seront adaptées à la génétique utilisée en suivant son cahier des charges. Les poules feront l’objet de visites quotidiennes pour la surveillance afin de mettre fin immédiatement aux souffrances des individus malades ou blessés et pour l’entretien (nourrissage, nettoyage, tests). Des visites supplémentaires seront instaurées au besoin selon l’évolution de leur état de santé. L’examen individuel comprendra : une observation des points limites associés au suivi du picage ou à un état léthargique. De plus des observations quotidiennes sont prévues par analyse de vidéo pour suivre l’évolution des comportements de picage. Aussi, lors des tests comportementaux individuels, l’isolement social ne sera que visuel. Les tests seront conduits dans la même salle que l’enclos de vie, ce qui permettra aux animaux de garder un contact auditif et olfactif avec leurs congénères.

Choix des espèces

Ce projet concerne directement la filière d’élevage de poules pondeuses, affectée par la problématique du picage sévère qui est une vraie problématique de santé et bien-être animal et de perte économique en élevage. Le projet vise donc à l’élaboration d’une grille pour évaluer le risque de picage dès le stade de poulettes sur la base de tempéraments. Cette évaluation précoce leur permettra de ne pas attendre les premiers signes visuels de picage sévère pour prendre des mesures de régulations nécessaires du picage. La poule pondeuse est l’espèce cible et est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Une souche très répandue dans la filière d'élevage française, plus sujette au picage, a été choisie pour le projet. Les animaux seront élevés dès leur arrivée en tant que poussins de 1 jour jusqu’à 36 semaines au maximum. Cela nous permettra ainsi de confirmer le lien entre les indicateurs de la grille présumant le tempérament « piqueur/non piqueur » des poulettes et la présence/absence réelle de ce comportement de picage à un stade plus avancé, chez la poule pondeuse, là où il est censé se produire plus fréquemment qu’au stade poulettes.

78 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le derme une injection de Borrelia afzelii, la bactérie de la maladie de Lyme, puis passent cinq anesthésies, une par semaine, pour suivre en imagerie la dissémination des bactéries. La dernière anesthésie ne se termine pas par un réveil : les souris sont tuées pour que soient prélevés peau, articulations, cœur, cerveau, rate et sang. Les retombées annoncées, des molécules ciblant le gène étudié, sont renvoyées au plus long terme, et le porteur indique qu'aucun modèle in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ces interactions.

Objectifs

En 10 ans, l'incidence de la borréliose de Lyme en France a pratiquement doublé, constituant ainsi un problème majeur de santé publique. Cette maladie infectieuse est causée par une bactérie du genre Borrelia, transmises par les tiques, ces dernières agissant comme de véritables vecteurs de ces agents pathogènes en infectant l'homme ou les animaux domestiques lors de leur repas sanguin. En France et en Europe, l'espèce Borrelia afzelii est très fréquente et s'étend. L'objectif principal de ce projet est d'étudier in vivo le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination des bactéries chez la souris et la réponse inflammatoire qui en découle. Ce gène de la bactérie Borrelia permet la production d’une molécule qui leur sert à communiquer entre-elles impactant ainsi leur virulence et leur résistance aux antimicrobiens. Dans notre projet, des souris seront infectées par voie intradermique, pour mimer la voie de pénétration chez l’homme, par Borrelia afzelii qui aura été ou non préalablement modifiées génétiquement pour supprimer l’expression du gène du gène d’intérêt. Les bactéries ayant le gène d'intérêt normal sont appelées sauvage alors que les bactéries où le gène d'intérêt a été supprimé sont dites mutées. A partir de ce point de départ cutané, l’infection sera suivie chez l’animal pendant 28 jours à l’aide d’un système d’imagerie in vivo pour étudier la dissémination des bactéries dans les différents organes et tissus cibles. Au terme de ce suivi, ces tissus cibles de l’infection par Borrelia seront collectés (peau, articulations, tissu cardiaque, système nerveux central, rate, sang) dans le but de quantifier la charge bactérienne ainsi que l’expression des médiateurs de la réponse inflammatoire. La contribution du gène d’intérêt à la dissémination bactérienne et à la réponse inflammatoire développée par les animaux infectés sera mise en évidence par la comparaison des infections entre les souches sauvages et mutées.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination de la bactérie lors de l’infection d’un organisme hôte, sa virulence et la réponse inflammatoire de ce dernier. Ils permettront à plus long terme d’envisager l’utilisation de molécules ciblant le gène d’intérêt pour le traitement de la borréliose de Lyme. Ce champ d’investigation présente un intérêt manifeste, étant donné que l’Homme et les animaux domestiques sont de plus en plus exposés aux tiques et susceptibles d’être infectés par Borrelia afzelli, une espèce qui s’étend en France et en Europe.

Procédures

Tous les animaux (78) seront anesthésiés 5 fois à raison d'une fois par semaine pour faire le suivi de la dissémination bactérienne par imagerie. Lors de la première anesthésie d'une durée de 30 min maximum, les animaux seront rasés au point d'injection et une injection de bactéries dans le derme sera pratiquée avant l'imagerie. Les anesthésies suivantes dureront 10 min environ. Lors de la dernière anesthésie, après l'imagerie, les animaux encore anesthésiés seront mis à mort pour des prélèvements.

Impact sur les animaux

- L’injection pour induire l’anesthésie au début et à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. - L'induction de l'anesthésie gazeuse et le réveil après anesthésie provoque un stress léger et transitoire des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort de manière à collecter les différents tissus cibles au sein desquels la bactérie Borrelia est susceptible de se propager à partir du point d'injection cutané. Pour chaque échantillon biologique collecté, la charge bactérienne sera déterminée et les marqueurs de la réponse inflammatoire seront également analysés.

Remplacement

Des expériences in vitro ont été réalisées au préalable pour étudier l’impact de la mutation du gène d’intérêt de Borrelia afzelii sur la croissance bactérienne. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier l’impact de cette délétion du gène d’intérêt sur la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte, ainsi que sur la réponse inflammatoire de l’organisme en réponse à l’infection, qu’il est impossible d’étudier in vitro, compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu. De plus, il n'existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.

Réduction

A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Ainsi, nous proposons d’utiliser 18 animaux par lot en effectuant 3 expériences indépendantes avec 6 souris par lot. Ce découpage en 3 expériences indépendantes permettra d’envisager une démarche de réduction par analyse de tendance en cours de projet, dans le cas où des différences statistiques significatives seraient observées.

Raffinement

Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues (rasage, injection de bactéries, imagerie) avec contrôle de la température par tapis chauffant. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d’une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en œuvre précocement en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infection bactérienne par la bactérie Borrelia sont fréquemment utilisés pour étudier in vivo la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte et la réponse inflammatoire induite. La réponse inflammatoire de la souris est par ailleurs décrite et étudiée depuis des décennies et autorise des comparaisons avec la réponse inflammatoire humaine. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse inflammatoire de l’hôte en réponse à l’infection et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l’Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système inflammatoire est bien développé.

1 080 souris vont être utilisées dans le premier volet du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Anesthésiées pour la greffe d'un fragment tumoral pancréatique, elles reçoivent une chimiothérapie deux fois par semaine pendant quatre semaines, une radiothérapie quotidienne pendant cinq jours, et cinq séances d'IRM d'une heure trente. Le bénéfice avancé tient à des marqueurs d'imagerie que le porteur juge "facilement transposables" en clinique, quand la perte de poids et la croissance tumorale sont, elles, décrites comme attendues. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité du milieu tumoral, et compte l'IRM comme une réduction puisqu'elle évite de tuer des souris à chaque temps d'imagerie.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. La réponse tumorale aux traitements existants reste très difficile à évaluer en clinique par manque de biomarqueurs. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie et à la radiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) est un outil permettant l’acquisition d’images anatomiques in vivo de haute résolution, mais également d’images fonctionnelles. La combinaison de nouvelles modalités IRM a permis l’élaboration de nouveaux biomarqueurs en imagerie pour la caractérisation tumorale. Ce projet vise à étudier l’efficacité de l’association de chimiothérapies suivie par de la radiothérapie externe in vivo grâce à l’utilisation de ces nouveaux biomarqueurs en imagerie. Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’étudier in vivo les modifications biophysiques des tumeurs mesurées par IRM dues aux différents traitements étudiés dans ce projet. Il s’agira, in fine, de pouvoir évaluer quel traitement sera le plus efficace selon les paramètres biophysiques initiaux de la tumeur, ainsi que d’évaluer rapidement l’efficacité du traitement. Dans les études cliniques, ces techniques IRM seront facilement transposables,

Procédures

Les animaux seront anesthésiés en vue d'une greffe tumorale puis traités par chimiothérapie et radiothérapie (EU1). Durée de la greffe : 2 minutes Durée de la chimiothérapie : injection IP d'environ 1 min, 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Durée de la radiothérapie : 5 minutes/jour pendant 5 jours. Durée des injections d'anesthésiant et d'agent de contraste : inférieure à 1 min. Les souris seront suivies 5 fois par IRM sous anesthésie d'1h30 (avant, pendant et après le traitement) (EU2).

Impact sur les animaux

Effets indésirables direct: - douleur associée à une injection ou implantation d'un fragment tumoral - douleur associée à une injection intraveineuse et Intra péritonéale. - stress occasionné par le transport des souris entre les 2 sites. Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés: - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales les animaux seront euthanasiés et les tumeurs seront analysées

Remplacement

Il n’existe pas de modèles in vitro reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique par imagerie IRM.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’utilisation de l’IRM pour le suivi de la réponse au traitement de manière non invasive, nous permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d'euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur les sites. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Les conditions d'entretien de manipulation des animaux permettent de les protéger via les équipements et procédures de travail d'une contamination par des pathogènes ou opportunistes. Ensuite les procédures expérimentales seront uniquement réalisées par des ingénieurs expérimentés. De plus, celui-ci avec l'aide de l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. De nombreux critères ont été mis en place afin d'évaluer toute forme de détresse chez les animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécéssaire.

Choix des espèces

Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés, et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymiques nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe.

La lignée de souris retenue est dépourvue de certaines cellules immunitaires, ce qui écarte le rejet des cellules cancéreuses greffées. 50 de ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe tumorale sur les deux flancs, dix d'entre elles se voyant en plus implanter une pastille d'hormones quatre jours plus tôt, et les tumeurs sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur écrit que les animaux sont tués à l'issue parce qu'ils "servent d'individu receveur de greffe" et ne serviront pas à d'autres projets, cette étude pilote visant seulement à choisir le modèle qui sera utilisé ensuite.

Objectifs

La sénescence cellulaire est un programme cellulaire déclenché en réponse à divers stimuli tels que des dommages à l’ADN. Les cellules sénescentes sécrètent un cocktail de molécules appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) qui peut modifier l’architecture de la tumeur et ainsi promouvoir la croissance tumorale, l’évasion immunitaire et les métastases. La compréhension des interactions entre cellules sénescentes, leur SASP et les cellules cancéreuses offre l’opportunité de découvrir de nouvelles thérapies efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets des cellules sénescentes et les molécules qu’elles sécrètent sur plusieurs types de cancer (cancer du poumon, du sein ou du foie). Cette étude pilote nous permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour la suite de notre étude in vivo.

Procédures

Toutes les souris recevront une greffe de cellules cancéreuses sur chaque flanc (deux au total par animal) qui formeront des tumeurs solides. Chaque greffe sera réalisée sous anesthésie générale qui durera moins de 5 minutes, le temps d'une piqure d'aiguille. Pour les souris receveuses de greffe de cellules de cancer du sein : chaque animal (10 au total) recevra la greffe d'une pastille d'hormones 4 jours avant la greffe de cellules pour que la tumeur se forme. Cette intervention durera moins de 5 minutes sous anesthésie générale. Après une semaine d'acclimatation et trois fois par semaine jusqu'à euthanasie : l'état global de chaque animal sera observé et pesé (10 secondes par pesée), le volume de chaque tumeur sera mesuré avec un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Nous allons greffer des cellules cancéreuses à des souris et le suivre le développement de tumeurs. Le greffes seront réalisées sous anesthésie légère qui durera moins 5 minutes pour chaque animal. Les procédures que vont subir les animaux peuvent causer du stress et de légères douleurs. Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après la greffe ou lorsque la tumeur atteindra une taille limite. Certaines souris (10 au total) recevront la greffe d'une pastille d'hormones qui durera moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure peut causer du stress et de légères douleurs au niveau de la zone de greffe. Le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive, le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par mesure avec un pied à coulisse et seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude 3 fois par semaine. Les possibles nuisances liées aux gestes et intervention que vont subir les animaux : stress dû à l'anesthésie, douleur au niveau de la zone de greffe de cellules, douleur au niveau de la zone d'incision pour la pastille d'hormone, stress dû à la manipulation régulière.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils servent d'individu receveur de greffe et ne serviront pas pour d'autres projets.

Remplacement

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas les cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées.

Réduction

Les effectifs de 5 animaux par groupe ont été choisi. Chaque animal recevra deux greffes identiques (une sur chaque flanc), cela nous permet d’obtenir un grand nombre de tumeurs en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Nous obtiendrons une réponse statistiquement significative et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. En raison du déficit immunitaire partiel des souris choisies, des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. La nourriture ansi que l’eau sera desinfecté ou stérilisé. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 3 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas certaines cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées. Nous utiliserons des souris âgées de 5 à 6 semaines. C'est un âge où l'animal est considéré adulte et peut supporter au mieux la greffe de cellules.