Recherche fondamentale
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- Biologie du développement
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Mécanismes génétiques de la formation du système musculosquelettique cervical chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Nées de croisements de lignées transgéniques entretenues au laboratoire, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 160 d'entre elles et léger pour 80. Sur les animaux vivants, le seul geste décrit est une biopsie de l'oreille au sevrage pour lire le génotype, le reste du projet portant sur des embryons et des fœtus mutants récupérés après la mise à mort des mères gestantes, à cinq stades de gestation. Le porteur reconnaît que ces embryons portent des malformations du crâne et du cou, et affirme qu'elles ne provoquent ni détresse ni douleur pendant la gestation. Une partie des souris de génotype recherché est gardée en vie pour renouveler le stock de reproducteurs, l'ensemble étant tué à la fin du projet, et les individus non analysés seront selon ses mots "traités, stockés et exploités pour l'optimisation des protocoles".
Objectifs
Chez l’humain, certaines malformations de naissance touchent spécifiquement le système musculosquelettique cervical, comme dans les syndromes de Klippel-Feil et de Loeys-Dietz, pathologies rares mais sévères. Du point de vue génétique, il a été montré que des acteurs d'une voie de signalisation étaient mutés chez les patients, mais l’origine des malformations est encore inconnue. Une voie de signalisation est une séquence d'étapes impliquant plusieurs gènes qui fonctionnent ensemble pour contrôler les fonctions cellulaires. Afin de comprendre pourquoi la région cervicale est affectée dans ces pathologies, il est primordial d’élucider la fonction de la voie de signalisation TGF-beta au cours du développement embryonnaire sur des modèles animaux proches de l’humain sur l’échelle évolutive. Notre objectif est de générer de nouveaux modèles de souris mutées pour l’un des récepteurs à la TGF-beta permettant ainsi d’inactiver sa fonction et d’étudier les répercussions sur le développement du système musculosquelettique cervical chez les mammifères. Nos recherches ont précédemment mis en évidence que les précurseurs du tissu conjonctif qui orchestrent le développement musculaire ont différentes origines embryonnaires au niveau du cou. Afin de déterminer la contribution relative de la voie TGF-beta dans les différentes populations cellulaires produisant le tissu conjoinctif cervical, nous allons utiliser les outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent d’inactiver les gènes specifiquement dans certains groupes de cellules au cours du développement. Ces expérimentations permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine des malformations musculosquelettiques cervicales caractérisant les pathologies touchant le tissu conjonctif comme chez les patients atteints des syndromes de Klippel-Feil ou de Loeys-Dietz.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet de recherche fondamentale produira des connaissances nouvelles pour la compréhension du rôle de la voie TGF-beta et des précurseurs du tissu conjonctif dans la formation du système musculosquelettique qui est affecté dans de nombreuses pathologies de naissance ou dégénératives humaines, mais aussi dans certaines formes de cancers. Nos données permettront d’établir au mieux le diagnostique, la prise en charge et le suivi clinique personnalisé essentiel à l’amélioration de la qualité de vie des patients après la naissance.
Procédures
Seule une rapide biopsie d'oreille pour caractériser le génotype des individus sera effectuée sur animaux vivants au moment du sevrage avant les mises en accouplement après atteinte de la maturité sexuelle.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de notre projet, les animaux adultes ne présenteront pas de nuissances dûes à l’alteration de leur génome. Cependant, un suivi journalier sera fait de façon à assurer leur bien être. Les embryons et fœtus mutants inactivés pour la voie TGF-beta issus des croisements des lignées d’intérêt porteront des malformations au niveau cranio-cervical qui ne généreront ni détresse ou douleurs pendant la gestation, et seront récupérés avant leur naissance, en majorité avant le dernier tier de gestation après la mise à mort de la mère dans le respect du bien-être animal de manière non douloureuse.
Devenir
Certains animaux de génotype d'intérêt seront gardés en vie pour renouveler le stock des reproducteurs à la fin de la procédure 1. L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin du projet car ne seront pas réutilisés.
Remplacement
La dynamique de développement embryonnaire implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui ne peuvent ni être modélisés, ni reproduits in vitro ce qui rend inévitable de réaliser ces expériences chez l’animal. L’étude in vivo est la plus adaptée pour étudier la formation du système musculosquelettique cervical. Plus particulièrement, effectuer ces observations chez la souris permet une approche génétique nécessaire à l’étude de la formation musculosquelettique sur un modèle de mammifère phylogénétiquement proche de l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour s’assurer de la reproductibilité et pénétrance des phénotypes et pour permettre une interprétation pertinente des résultats tout en contournant le problème de la variabilité inter-individuelle (n=3/conditions si résultats reproductibles). Pour chaque accouplement, nous considérons un nombre moyen de 8 embryons/portée. Selon les règles mendéliennes, 1/4 de la portée sera du génotype délétère d'intérêt et 3/4 de la portée de génotype contrôle. Afin de valider la redondance et la pénétrance des résultats, un minimum de 3 invidividus mutants (et 2 contrôles) sont nécéssaires. Nous évaluons donc 2 portées issues de ces croisements, et ce pour chacun des 5 stades développementaux d’intérêt (à 10.5, 11.5, 12.5, 14.5 et 16.5 jours post-fertilisation). Les individus non utilisés pour l’analyse seront traités, stockés et exploités pour l’optimisation des protocoles.
Raffinement
Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de ce projet expérimental, les individus seront surveillés de manière journalière afin de vérifier la prise alimentaire et d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Tout au long des expériences, les animaux seront maintenus en groupes sociaux d’au moins deux individus et le milieu sera enrichi avec du matériel n'interférant pas avec l'analyse. L’atteinte des points limites entraînera la mise à mort des individus concernés.
Choix des espèces
Pour réaliser ce projet, notre modèle biologique est la souris (Mus Musculus), choix dicté par plusieurs raisons : - La souris est l’espèce animale la plus étudiée en expérimentation animale et dans les recherches biomédicales. La proximité phylogénétique des souris et de l’humain permet d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. - Les connaissances accumulées sur cet organisme modèle ont permis d’identifier de nombreux mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire. - Cet animal de petite taille, est facile à maintenir en animalerie, possède un fort taux de reproduction et offre une panoplie d’outils génétiques. - Nos précédents protocoles ont été optimisés pour ce modèle, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Le projet implique seulement des croisements entre individus adultes sexuellement matures pour obtenir les reproducteurs d’intérêt (entre 6 semaines et 6 mois pour les femelles et 8 semaines et 12 mois pour les mâles). Les reproducteurs sexuellement matures seront croisés entre eux pour générer des embryons et fœtus d'intérêt qui seront analysés aux stades clés du développement du système musculosquelettique.
Etude de l’immuno-hépatotoxicité après transfert de gènes à l’aide de fortes doses de vecteurs adéno-associés recombinants (AAVr) dans un modèle de rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Le rat est présenté comme le seul petit animal développant contre les vecteurs viraux adéno-associés une réponse immunitaire et une toxicité du foie comparables à celles observées chez l'humain. 75 rats vont être utilisés à ce titre, tous tués à l'issue, 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 15 opérés sous anesthésie puis tués avant tout réveil. Ils reçoivent une injection intraveineuse de fortes doses de vecteur, subissent une chirurgie de perfusion du foie d'environ une heure et sept prélèvements de sang étalés sur trois mois. Le porteur signale une douleur modérée possible au niveau de l'incision pendant sept à dix jours de cicatrisation et annonce une grille de scoring de la douleur mise en place "dès que celle-ci s'avère nécessaire", sans préciser qui en juge ni sur quels signes.
Objectifs
Les vecteurs viraux dérivés des virus adéno associés recombinants sont des vecteurs de choix pour la thérapie génique et sont actuellement à l’essai notamment pour les dystrophies rétiniennes, les maladies hépatiques et musculaires ou encore les pathologies du système nerveux. A ce jour, les essais cliniques ont permis l’autorisation sur le marché de sept médicaments. Les rapides progrès du domaine permettent de cibler des pathologies plus complexes qui nécessitent des injections intraveineuses de fortes doses de vecteurs viraux .Malheureusement, ces nouvelles stratégies peuvent entrainer des effets secondaires de toxicité aigüe ou des réponses immunes cytotoxiques contre le vecteur. Parmi les effets indésirables, l'hépatotoxicité a été décrite comme un problème majeur avec des conséquences tragiques chez un certain nombre de patients. Récemment, notre équipe a observé que l'injection chez le rat de vecteurs viraux de type 8 ou 9 pouvait résulter en une inflammation hépatique et une perte d'expression des vecteurs dans le foie. Etonnamment, dans ces mêmes modèles, l’expression du vecteur peut persister à long terme dans d’autres organes comme le muscle périphérique, organe décrit pourtant dans la littérature comme moins tolérogènes que le foie. Les mécanismes précis entrainant la perte d’expression dans le foie ne sont pas encore connus. L’objectif de ce projet est d’étudier si l’inflammation hépatique et la perte d'expression des vecteurs viraux est lié à une réponse immune périphérique. Pour répondre à cette question les vecteurs seront injectés dans le foie isolé temporairement de la circulation générale. Nous vérifierons ensuite si l’immunohépatotoxicité est la même qu’après injection des vecteurs par voie Intra veineuse . A l’euthanasie nous étudierons la réponse immune périphérique vis-à-vis du vecteur et des protéines de capside. Nous analyserons aussi la biodistribution du vecteur et plus particulièrement l’histologie du foie, notamment le phénotype et la fonctionnalité des cellules immunitaires infiltrées dans le parenchyme.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes responsables de l’’immunotoxicité après utilisation de fortes doses de vecteurs viraux dans des modèles pertinents de rongeurs in vivo. Il va permettre notamment de savoir si l’hépatotoxicité observée chez les patients après injection de fortes doses est liée ou non à la réponse immune périphérique. Cette étude pourrait contribuer à mieux comprendre et mieux anticiper l’impact potentiel de l’immunotoxicité du transfert de gènes sur l’efficacité et la sécurité du traitement dans les essais cliniques.
Procédures
Mise au point technique (procédure sans réveil) Evaluation des doses d’anesthésies et d’analgésies pour la chirurgie. Temps de la chirurgie : environ 30 mn . Pour la perfusion de foie, la chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie sur les rats pour la perfusion hépatique dure en totalité environ 1 h. Des prélèvements sanguin sous anesthésie gazeuse seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole (3 mois) soit 7 prélèvements au total. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les injection intraveineuse, les rats recevront sous anesthésie gazeuse une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral . La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn.
Impact sur les animaux
Pour les prélèvements sanguin et les injections de vecteurs viraux en intraveineuses, les animaux seront sous anesthésie gazeuse. Les animaux ressentiront au réveil, une légère douleur au point du prélèvement sanguin et au point d’injection de l’intraveineuse dû à la pénétration de l’aiguille. Les perfusions hépatiques seront réalisées sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée. Malgré tout, les animaux pourraient ressentir une douleur modérée au niveau de la zone d’incision pendant la période de cicatrisation (maximum 7 à 10 jours).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.
Remplacement
L’enjeu majeur des protocoles de thérapies géniques développés à l’aide de virus adéno associés consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat , car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti virus adéno associés et une immunotoxicité vis-à-vis des vecteurs viraux similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des rats injectés avec des virus adéno associés de type 9 développent une réponse immunitaire. Le nombre d’animaux par groupe (10) est donc basé sur nos expériences précédentes lors desquelles nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses qui seront réalisées ici (biodistribution du vecteur, analyses biochimiques et analyses histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en termes d’animaux à inclure. Afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .
Raffinement
Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Le bien-être animal passera également par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur (animaux hébergés à plusieurs par cage, dans la limite réglementaire ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum) avec un enrichissement du milieu (mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. Récemment, nous avons développé un modèle de rat dans lequel nous observons une réponse cellulaire et de l’hépatotoxicité après injection de fortes doses de vecteurs viraux. Ce modèle semble reproduire les effets secondaires observés chez l’homme dans les essais cliniques après injection de vecteurs viraux à forte dose. L'utilisation du rat est donc justifiée par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune et de l’hépatotoxicité. De plus, l’utilisation du modèle rat permet de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. Les rats seront injectés entre 7 et 8 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature. C’est à cet âge également qu'il s'avère le plus facilement opérable tout en conservant un foie avec quelques capacités de réplications cellulaires nécessaires à une bonne intégration du vecteur dans les hépatocytes.
Inactivation des aires olfactives modulant les réseaux de neurones régulant la prise alimentaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique du cerveau pouvant durer une heure trente, puis sept prélèvements de sang à la queue en deux heures pour une partie des animaux : 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement du cerveau. Le porteur, qui cherche à savoir comment les odeurs de nourriture modulent deux populations de neurones de l'hypothalamus, résume les nuisances attendues en une phrase et affirme que toutes les précautions seront prises. Sa grille de points limites décrit pourtant des souris prostrées, au poil hérissé, présentant des signes neurologiques ou perdant jusqu'à 20 % de leur poids, mises à mort par dislocation cervicale si le score persiste plus de quarante-huit heures. Il indique aussi s'entraîner aux gestes chirurgicaux sur des souris nées de croisements sans le génotype recherché, qu'il désigne comme des animaux "produits mais non utilisés".
Objectifs
Dans ce projet nous nous intéressons à la modulation de la régulation de la prise alimentaire par les odeurs. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences menées dans ce projet porteront sur 2 populations de neurones, les neurones sécrétant la pro-opiomélanocortine (POMC) ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et les neurones exprimant la protéine liée à l'agouti (AgRP) ayant une action opposée. Les premiers s’activent au cours des repas et diminuent leur activité lorsque les réserves énergétiques baissent. Les neurones AgRp auraient une réponse opposée. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantité mais également à des signaux sensoriels associés à la présence de nourriture. Ainsi les neurones de ce réseau peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur capacité à moduler la physiologie des neurones POMC et AgRP. Des aires cérébrales impliquées dans le traitement des informations olfactives, l’amygdale médiale et le cortex piriforme postérieur seront inactivées par une approche chémogénétique pour étudier leur rôle dans cette modulation olfactive de l’hypothalamus.
Bénéfices attendus
Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire par le système olfactif.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h et 7 prélèvements sanguins seront réalisés à la queue en 2h en fin de procédure. Une autre partie des animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée maximale de 1h30.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront principalement dues à la chirurgie stéréotaxique mais toutes les précautions seront prises pour réduire la douleur ou les infections.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux dans le but soit de réaliser les expériences d'électrophysiologie ex vivo soit de vérifier la bonne implantation des fibres optiques.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal l’effet d’odeurs sur le réseau de neurones hypothalamiques impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude du comportement de recherche de nourriture et de prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies, nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin de parfaire les gestes chirurgicaux et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Le nombre d'animaux nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes (Analyses de Variance et test posthocs paramétriques).
Raffinement
En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées sont 2 à 3 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre), présence de différents enrichissements (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Nous rédigeons un protocole pour chaque expérimentation, soumis à l'équipe animalerie qui doit le valider avant de démarrer afin d'assurer de bonnes conditions d'expérimentation. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage: - Perte de poids anormale (15% score 1, 15-20% score 2) -Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...) score 3 - Signes neurologiques score 2. Si un score entre 9 et 12 persiste pendant plus de 48h, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h.
Choix des espèces
Le projet proposé porte sur l’étude de 2 populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation des populations neuronales étudiées dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire (comme l’humain). Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Le présent projet s'intéresse aux effets des odeurs sur le cerveau mature. Néanmoins, les expériences d'électrophysiologie fonctionnent mieux avec des souris jeunes. Les procédures expérimentales débuteront donc à l’âge de 5 semaines (mise sous régime gras sucré). Les mesures neurophysiologiques et comportementales seront réalisées chez l'adulte après la 13ème semaine de vie (pour tenir compte des 8 semaines d'exposition au régime alimentaire hypercalorique).
Dimorphisme sexuel de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées à dix semaines de vie, avant que leur état général ne se dégrade, pour analyse du sang, des urines et des organes, 208 souris porteuses d'une mutation qui provoque une insuffisance rénale spontanée vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre semaines, elles subissent une castration chirurgicale, ovariectomie ou orchidectomie, puis reçoivent un gavage cinq jours par semaine et deux implantations sous-cutanées de capsules d'hormones. S'y ajoutent des prises de sang et une mesure de la filtration rénale par injection rétro-orbitaire, capteur fixé sur le dos pendant quarante-cinq minutes. Le porteur écrit avoir retenu la souris parce que la littérature en fait l'espèce "la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse" dans les conditions de la procédure.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si elle n’est pas correctement traitée, l’IRC peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale. Le traitement de l’IRC doit être adapté en fonction du sexe car son incidence et sa gravité sont différents entre les femmes et les hommes. L’objectif du projet est d’étudier l’influence du sexe sur le développement et le traitement de l’IRC. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. Le projet sera mené chez des souris Alport chez qui l’IRC se développe spontanément et rapidement (quelques semaines) en raison d’une mutation homozygote (KO) dans un gène essentiel pour la fonction rénale. Des expériences menées au laboratoire ont montré que chez ces souris, l’IRC était plus fort chez les femelles que chez les mâles au même âge. De plus, seules les femelles étaient sensibles à l’effet protecteur contre l’IRC d’un agent pharmacologique : l’AP#1. Dans le present projet, nous souhaitons tester l’hypothèse de l’implication des hormones sexuelles dans ces dimorphismes sexuels. A cette fin, nous étudierons l’impact de la castration [ovariectomie (OVX) ou orquiectomie (ORX)] et des hormones sexuelles exogènes sur le développement de l’IRC et de son traitement par l’AP#1. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des mécanismes responsables du dimorphisme sexuel dans l'installation et le traitement de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport.
Procédures
Les souris femelles et males seront soumises à une castration (sous anesthésie gazeuse et analgésie, durée maximale d’environ 10 minutes) à l’âge de 4 semaines, puis traitées à un agent pharmacologique par gavage (5 fois par semaine) combiné ou non à des hormones sexuelle (estradiol ou dihydrotestostérone sous forme de capsules implantés sous la peau 2 fois au cours du protocole). Tous les animaux seront soumis à des prises de sang (sous anesthésie gazeuse) et à une mesures de leur fonction rénale (sous anesthésie gazeuse, un capteur est fixé sur le dos de l’animal pendant 45 minutes et une molécule est injectée). Toutes les procédures non terminales et la mise à mort des animaux seront sont réalisées dans l’EU1. Dans le cas où le matériel nécessaire et/ou des salles de sacrifice seraient indisponibles à l’EU1, la mise à mort des animaux sera réalisée à l’EU2.
Impact sur les animaux
- Castration chirurgicale (OVX, ORX) et implantation de capsules en sous-cutanée: ces interventions peuvent provoquer de la douleur (administration d’anti-douleur) et du stress et des complications sont possibles (saignement, complications au niveau de la cicatrice). Les problèmes de cicatrisation sont des risques faibles- Gavage et collecte d’urine peuvent induire un léger stress - Prise de sang : les prélèvements de sang seront faits sous anesthésie - Evaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’insuffisance rénale chronique. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, limitant les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre connaissance du modèle utilisé, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 208 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique non paramétrique ou paramétrique (en fonction de la taille des groupes et de leurs distributions). La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autres test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés (service de zootechnie agréé par le ministère) par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie et les points limites seront soit l’atteinte du score 3 sur l’un des critères, soit l’atteinte du score 2 sans amélioration après 48h de surveillance. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les chirurgies seront effectuées avant la puberté à l’âge de 4 semaines. A cet âge, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent pas encore d’altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Quel que soit le génotype, les traitements pharmacologiques débuteront à 5 semaines et seront poursuivis jusqu’à 10 semaines (avant détérioration de leur état général), et les animaux seront alors mis à mort.
Etude de la viabilité d’oocystes de coccidies après contact avec des désinfectants
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Infectés par un parasite qui ne se développe que chez Gallus gallus, 1 000 poulets vont être utilisés pour mesurer l'efficacité de désinfectants destinés aux bâtiments d'élevage avicole, 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger. Élevés à l'abri de toute contamination depuis l'éclosion, ils reçoivent à seize jours une inoculation orale de coccidies traitées ou non par désinfectant. L'effet recherché est une diarrhée avec plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours et des lésions intestinales de niveau 3 sur une échelle de 4, faites de points de nécrose sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum. Le porteur range ce travail parmi les moyens d'améliorer la santé et le bien-être des animaux non-humains en élevage, 965 poulets étant tués et 35, écartés à la pesée de quinze jours, réutilisés ailleurs.
Objectifs
Les parasites du genre Eimeria sont responsables des coccidioses aviaires, maladies intestinales à fort impact sanitaire et économique chez la volaille. Leur gestion représente un enjeu économique majeur pour la filière avicole et un élément important pour l’amélioration de la santé et du bien-être des animaux. Plusieurs moyens de lutte existent : des anticoccidiens distribués dans l’aliment, des vaccins anticoccidiens et des désinfectants ayant un effet sur les formes infectieuses de ces parasites présentes dans l’environnement, les oocystes. Ce projet a pour objectif de développer et proposer un outil spécifique à la filière avicole afin d’évaluer l’efficacité de désinfectants sur les oocystes d’Eimeria spp. et de fournir une réponse adaptée à la problématique des éleveurs. Les oocystes sont mis en contact avec une souillure représentative des élevages avicoles (cocktail contenant de l’aliment, des fientes de volailles et de la poussière produite par les oiseaux) puis déposés sur des supports non poreux (coupons en inox) ou poreux (coupons de terre autoclavée). Les produits à évaluer sont ensuite déposés sur ces supports. La dernière étape du projet vise à tester la viabilité des oocystes traités de différentes manières par rapport à des oocystes non traités, en infectant des poulets avec ces oocystes traités ou non traités.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer un modèle d’étude de l’efficacité de désinfectants sur les oocystes d'Eimeria, spécifiquement adapté aux bâtiments d’élevage de volailles, en utilisant des coccidies parasites des poulets, et en testant les produits sur deux types de surface, poreuse et non poreuse pour représenter les deux types de bâtiments existants en production de poulets : avec sol bétonné ou avec sol en terre battue. De plus, la présence de biofilms et leur nature pouvant influencer l’efficacité des désinfectants, une évaluation préalable de la quantité de matière produite par l’activité des poulets en élevage (quantité de matières fécales produites, quantité d’aliment gaspillé et quantité de poussière produite) et restant après lavage d’un bâtiment (prélèvements de surface après lavage) a permis de définir un biofilm à mélanger avec les oocystes sur les supports afin de se rapprocher des conditions d’utilisation des désinfectants dans les bâtiments d’élevage. Un tel modèle permettra d’évaluer plus objectivement et efficacement l’intérêt potentiel de désinfectants, ceux ayant déjà des indications oocysticides et de nouveaux candidats n’ayant pas cette indication. L’objectif est de contribuer à améliorer la biosécurité en élevage avec une optimisation des choix et des usages des désinfectants, pour réduire l’utilisation de produits médicamenteux et promouvoir la qualité de la production avicole. Ce projet peut permettre de contribuer à une meilleure gestion du risque de coccidiose dans les élevages, en utilisant les produits les plus efficaces.
Procédures
Inoculations par voie orale de suspensions contenant des parasites infectieux sur animaux vigiles à l’âge de 16 jours : une seule inoculation par animal, avec contention de l'animal par un agent et inoculation par un autre agent. La durée de l'inoculation est inférieure à cinq secondes et la durée de la contention, inoculation comprise, est inférieure à la minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont des signes cliniques et lésions intestinales proportionnels à l'intensité de développement des coccidies. Les doses envisagées doivent permettre d'obtenir des signes cliniques modérés avec les oocystes non traités (diarrhée et plumes ébouriffées pendant trois à quatre jours) et des lésions intestinales d'intensité 3 sur une échelle comportant quatre niveaux d'intensité. Les lésions d'intensité 3 sont caractérisées par des points blancs de nécrose nombreux sur la muqueuse du duodénum et du jéjunum, causés par les cellules détruites par les parasites. Une baisse de gain de poids et une augmentation de l'indice de consommation sont attendus pendant cette période.
Devenir
Mise à mort de tous les sujets mis en place dans l'animalerie d'expérimentation : infectés avec des parasites ou témoins hébergés dans la même animalerie que les sujets infectés, risquant d’être contaminés par les oiseaux infectés expérimentalement. Les sujets écartés de l'étude lors de la pesée à 15 jours pourront être réutilisés dans d'autres procédures.
Remplacement
Les tests in vitro de mesure de viabilité des oocystes sont très peu nombreux et ne concernent qu’Eimeria tenella pour le poulet. La capacité des parasites à sortir des oocystes et éventuellement à envahir des cellules dans les seuls tests disponibles, ne garantit pas que ces parasites seront capables de réaliser leur cycle de développement en totalité. Ainsi, des désinfectants ne bloquant pas ces premières étapes en totalité pourraient être considérés comme de mauvais candidats alors que l’effet pourrait se manifester plus tard dans le cycle de développement parasitaire, dans le cas où le produit aurait affaibli initialement les parasites sans pour autant les tuer. De plus, aucun modèle n’est développé pour Eimeria acervulina, qui est la coccidie la plus fréquente, la plus dommageable économiquement et une des moins faciles à diagnostiquer. Il n’y a donc pas actuellement de modèle adapté à Eimeria acervulina permettant de se passer de modèle animal.
Réduction
Les effectifs ont été réduits à vingt sujets par lot, ce qui permet d'obtenir des différences significatives pour une baisse de gain de poids moyen d'environ 15 à 20% par rapport à des animaux non infectés (ou infectés avec une dose n'entraînant pas de baisse de gain de poids). Un lot de référence sera constitué de 20 sujets subdivisé en cinq sous-lots de quatre sujets recevant des doses croissantes d'oocystes non traités, afin d'établir une échelle indicative des indices lésionnels. L'utilisation de quatre sujets par dose au lieu de vingt est envisageable car les lésions sont dose-dépendantes et même si l'échelle sera moins fiable que les résultats des différents lots expérimentaux, il sera possible d'estimer un pourcentage de destruction ou d'inactivation des oocystes traités.
Raffinement
Les oiseaux seront hébergés dans des cages conformes aux conditions exigées pour les animaux utilisés à des fins scientifiques, en groupes homogènes, avec un éclairage naturel, complété par un éclairage artificiel en période de jours courts, et une période d’obscurité la nuit de durée continue minimale de 6 heures, une maîtrise de la température ambiante conforme aux exigences requises en fonction de l’âge des oiseaux, une gestion de la pression et un suivi de l’hygrométrie. Des cordelettes en sisal seront suspendues dans les cages, ainsi que des CD à hauteur des animaux, afin qu'ils puissent jouer avec. Des perchoirs seront installés dans chaque cage. Les points limites définis dans les procédures seront appliqués strictement pendant toute la durée de chaque essai.
Choix des espèces
Le modèle sélectionné pour l'étude sur les oocystes est la coccidie Eimeria acervulina, qui est un parasite strictement inféodé à l'espèce Gallus gallus. Cette coccidie ne se développe que chez le poulet. Les oiseaux seront mis en place à l’âge d’un jour, après éclosion et récupération au couvoir, afin d’éviter toute contamination accidentelle avec des coccidies. Ils seront élevés en animalerie protégée jusqu’à l’âge de 15 jours. Ils seront inoculés le lendemain. L’essai durera ensuite huit jours, afin que la totalité d’un cycle parasitaire soit réalisée et totalement terminée. Ces âges correspondent aux périodes d’apparition les plus fréquentes de cette coccidie dans les élevages, et la durée du cycle parasitaire n’excédant pas sept jours, il n’est pas nécessaire de les garder au-delà huit jours pour pouvoir mesurer les effets des parasites sur les animaux.
Etude par IRM in vivo de la biodistribution d’agents de contraste chez la souris wild type
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
300 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune reçoit un cathéter, une injection d'agent de contraste et jusqu'à une heure d'acquisition IRM, puis un prélèvement de sang juste avant la mise à mort et le prélèvement d'organes. L'objet est d'observer où se distribuent et comment s'éliminent de nouveaux agents de contraste synthétisés au laboratoire, dont la toxicité a déjà été testée sur cellules. Le porteur qualifie le modèle animal de "fondamental", annonce des lots de dix souris réduits au minimum, et n'explique nulle part le passage de ces lots à un total de 300.
Objectifs
Notre équipe synthétise régulièrement de nouveaux agents de contraste afin d’améliorer le contraste sur les images IRM pour une détection précoce de pathologies (cancers, inflammation, maladies neurodégénératives). Ces agents sont issus des agents de contraste déjà utilisés en routine clinique. Le but de ce projet est d’étudier la biodistribution de ces nouveaux agents de contraste synthétisés une fois injectés dans la souris afin, d’apporter des informations sur leur cinétique d’élimination ou sur une éventuelle rétention dans les organes. La toxicité de ces agents de contraste aura été préalablement testée sur des cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’améliorer la connaissance sur la biodistribution des agents de contraste dans l’organisme (voie d’élimination, éventuel stockage dans les organes) vivant. Notre projet permettra de faire avancer la connaissance en chimie pharmaceutique. L’objectif est de concevoir des molécules moins toxiques pour l’organisme et qui s’élimine plus rapidement.
Procédures
Les injections durent quelques secondes. La pose du cathéter se fait en moins d’une minute. Les acquisitions d’images IRM durent 1 heure au maximum. Uns seul prélèvement de sang sera réalisé à la fin des expériences IRM sous souris encore anesthésiées. Ce prélèvement dure moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. L'anesthésie peut entraîner une baisse de la température corporelle de la souris. La pose du cathéter peut entrainer une petite "douleur" liée à la piqure de l'aiguille.
Devenir
Toutes les souris encore sous anesthésie seront par la suite mises à mort à la fin des procédures pour prélèvement de sang et d’organes.
Remplacement
Le modèle animal est fondamental puisque l’étude de la biodistribution des agents de contraste ne peut se faire que sur organisme vivants avec des organes en fonctionnement puisque l’on s’intéresse au passage d l’agent de contraste dans le sang puis dans les divers organes. Une attention particulière est menée sur les organes d’élimination de stockage et d’excrétion (rein, foie, rate).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire (à savoir 10 souris par lot) pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Ce projet nécessitera 300 souris.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées par groupes sociaux de 5 dans les cages en portoir ventilé, avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h. Divers objets d'enrichissement du milieu sont utilisés (maison transparente rouge, celluron, granulés ainsi que bâtonnets de bois à ronger). Les souris auront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des études IRM. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Durant les acquisitions IRM les souris sont sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane : ceci permet de réduire le stress de l’animal et surtout les mouvements qui sont rédhibitoires pour la réalisation des images IRM. Leur rythme respiratoire est contrôlé au cours de l’anesthésie à l’aide d’un appareil de suivi (patch placé sous la cage thoracique et relié à un ordinateur). Leur température corporelle est maintenue constante grâce à un tapis d’eau chauffée).
Choix des espèces
Notre établissement, utilise des souris, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animalerie, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris a un génome possédant 99% de similitude avec le génome humain. - Ce projet est réalisée sur des souris wild type. Elle sera le point de départ (témoin) d’autres études que nous réalisons sur des modèles souris de tumeurs Des souris de 8 semaines seront utilisées; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation. Ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).
Exposition chronique aux additifs et contaminants alimentaires inorganiques de la vie in utero à l’âge adulte chez la souris: impact d’une infection à Salmonella sur la réponse du système immunitaire systémique et l’homéostasie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Fournir aux instances réglementaires des données sur l'E551, un additif alimentaire à base de nanoparticules de silice : 88 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Exposées à l'additif de la vie in utero jusqu'à 130 jours après la naissance, elles reçoivent ensuite une injection unique de Salmonella. Le porteur indique que cette infection peut provoquer une morbidité et une mort rapide au bout de cinq jours, et écarte tout recours aux analgésiques et aux anesthésiques au motif qu'ils fausseraient les paramètres immunitaires mesurés. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet de recréer les dialogues inter-organes et conclut que le principe de remplacement est "inapplicable".
Objectifs
Ce projet fait suite aux résultats obtenus dans un précédent projet montrant une altération de la réponse immunitaire intestinal et systémique après exposition des animaux à l’additif E551 constitué de nanoparticules de dioxyde de silice. Ces données suggèrent une susceptibilité accrue aux infections chez les animaux exposés à cet additif. Ainsi, ce projet a pour but d’évaluer la susceptibilité des animaux exposés au E551 à une infection systémique induite par inoculation de la bactérie Salmonella.
Bénéfices attendus
Le projet permettra la mise en évidence de l'impact de l'additif dioxyde de silice sur la réponse des défenses immunitaires des suites d'une infection systémique à une bactérie pathogénique possiblement retrouvée dans l'alimentation (Salmonella). Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de ces additifs et contaminants. Cet impact pourra être pris en compte par les instances règlementaires afin de réguler l'exposition humaine aux nanoparticules inorganiques de type Silice.
Procédures
Les animaux auront été exposés au préalable à l'additif alimentaire contenant des nanoparticules de dioxyde de silice à une dose encadrant l'exposition humaine et ce de manière périnatale et pendant 130 jours post-natal. Puis ils seront infectés à Salmonella délivrée par une injection unique nécessitant une contention d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
L'injection de Salmonella s'effectue après contention de l'individu et peut engendrer un stress lié à la manipulation de l'animal et à l'injection en elle-même. L'infection par Salmonella de degré sévère peut conduire à une morbidité et une mortalité rapide au bout de 5 jours.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements permettant d'étudier la réponse immunitaire contre Salmonella.
Remplacement
Le projet étudie la réponse à une infection à Salmonella Typhimurium, après une période d'exposition à un nanomatériel alimentaire allant de la périnatalité au stade adulte sur un organisme. L'utilisation du modèle animal est nécessaire afin d'avoir cette exposition chronique dès la vie in utero. De plus l'étude portera sur des impacts de l'axe intestin-réponse immunitaire systémique. Aucun modèle alternatif ne permet de recréer tous les dialogues inter-organes. Du fait de ces 2 raisons majeures, le recours à l'animal est donc nécessaire et le principe de remplacement inapplicable.
Réduction
Pour optimiser le nombre d'animaux utilisés, une étude pilote sera effectuée pour déterminer l'inoculum optimale et le temps d'observation post-injection et ainsi réduire le nombre de groupes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les individus présentant une détérioration de l'état général (poil piqué, dos vouté, difficulté de mobilité, agressivité extrême) et/ou une perte de poids significative ou une diminution de la prise alimentaire seront écartés de l'étude et des soins adaptés leur seront donnés. L'infection par Salmonella peut perturber l'état général des animaux qui seront observés en continu jusqu'à leur mise à mort. L'emploi d’analgésiques et d’anesthésiques perturberait la réponse à l'infection par Salmonella et influerait sur les paramètres immunitaires mesurés, rendant leur utilisation incompatible avec notre étude.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils et savoirs sont développés afin d'étudier le système immunitaire et la réponse à une infection, notamment par Salmonella. Des résultats préliminaires concernant l'exposition in utero et chronique aux additifs alimentaires ont déjà été obtenu sur une lignée murine. Cette même lignée a aussi été utilisé par d’autres équipes de recherche et montre une sensibilité à l’infection par Salmonella. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l'âge adulte pour mimer une exposition périnatale et chronique à long terme.
Etude de l’activité cérébrale par photométrie chez la souris atteinte de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Opérées pendant environ quarante minutes pour se voir implanter une fibre optique dans le cerveau, puis soumises à quatre injections quotidiennes de tamoxifène sans anesthésie, 100 souris subissent une lésion du nerf sciatique ou une injection d'adjuvant de Freund destinée à provoquer une douleur chronique. Elles passent quatre à onze semaines en enregistrement par photométrie, à raison de séances d'environ trois heures, et subissent deux jours de tests comportementaux par semaine, dont le porteur ne précise pas la nature. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, la lésion nerveuse entraînant selon lui une douleur et des comorbidités anxiodépressives pendant environ six semaines. Toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau, une mise à mort qu'il présente comme un moyen de leur éviter toute souffrance inutile.
Objectifs
Avenant : nos résultats préliminaires montrent que la douleur est encodée différement au niveau du cortex cingulaire antérieur (ACC) en fonction du stimulus douloureux appliqué (mécanique ou thermique) mais également en fonction de l'évolution de la pathologie dans le temps. Afin de rafiner notre analyse, nous souhaitons enregistrer sélectivement les neurones pyramidaux de ce cortex, notamment ceux exprimant l'isoforme gamma de la protéine kinase C.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre comment les neurones pyramidaux du cortex cingulaire antérieur (ACC) sont impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoires selon les modalités sensorielles mobilisées.
Procédures
Tous les animaux (n=100) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Ils recevront également tous 4 injections consécutives de tamoxifen, 1 fois par jour. Cet acte maîtrisé par le laboratoire est réalisé sans anesthésie et dure moins d'une minute. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion nerveuse du nerf sciatique et entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection d'Adjuvant Complet de Freund (CFA) entraine une inflammation cutanée et une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. L'injection intrapéritonéale de tamoxifen entraine une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.
Choix des espèces
Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature
Etude de l’implication de l’AhR astrocytaire sur les effets et le metabolisme de la morphine dans un modèle neuroinflammatoire de souris sauvages et KO
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir si une inflammation cérébrale accélère la dégradation de la morphine, 360 souris, dont 120 mutantes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent du lipopolysaccharide, qui provoque fièvre, perte de poids, diarrhées et une sensibilité accrue à la douleur, puis passent des mesures du seuil de douleur sur plaque chaude ou froide et un test locomoteur de dix minutes. Un seuil maximal de stimulation borne les tests de douleur, même sans réaction de la souris. Une chirurgie terminale sous anesthésie précède leur mise à mort, pratiquée pour prélever leurs tissus cérébraux et les analyser en spectrométrie de masse.
Objectifs
Le sepsis, résultant d’une inflammation systémique induite par un pathogène, est à l'origine de 20% des décès mondiaux (11 millions en 2017). Dans 70% des cas cette pathologie entraine des problèmes neurologiques qui pourraient être liés à une dégradation accrue de certains neurotransmetteurs. Lors d’un sepsis, l’AhR (Aryl hydrocarbone Receptor) initie une voie de signalisation intracellulaire qui induit une augmentation des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs qui sont dégradés de la même manière que la morphine. Notre but est d’étudier la dégradation des neurotransmetteurs (et de la morphine qui représente un traceur de l’activité de dégradation) dans un modèle de sepsis chez la souris. Nous voulons également déterminer si l’inhibition de l’AhR peut restaurer des niveaux normaux de neurotransmetteurs et ainsi faciliter la guérison.
Bénéfices attendus
Notre but est de définir si une neuroinflammation globale induite par le lipopolysaccharide (qui induit le facteur de transcription Aryl hydrocarbone Receptor, AhR), provoque une dégradation accrue de la morphine et une diminution de ses effets analgésiques. Par ailleurs, notre but est d’identifier les molécules endogènes (neurotransmetteurs) dégradées par ces enzymes et de déterminer si l’inhibition de l’AhR par la Stemregenine 1 (SR1) ou la délétion génétique astrocytaire peut être bénéfique. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre les neuroinflammations induites par le sepsis. Ces travaux permettront de déterminer l’implication de l’AhR dans la dégradation de la morphine en condition septique. Ils permettront également de déterminer quelles molécules endogènes sont sur-dégradées et de déterminer si le SR1 peux normaliser les taux de neurotransmetteurs, permettant ainsi une meilleure récupération.
Procédures
12 groupes de souris subiront des injections de substances sur animal vigile (30sec) et 8 groupes auront des tests de mesure du seuil de douleur (25sec) et 4 groupes d’animaux auront un test de comportement locomoteur (10min). Les 12 groupes auront une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min).
Impact sur les animaux
L’injection de lipopolysaccharide chez la souris induit une inflammation aiguë. Elle est aussi associée à une fièvre et une perte de poids transitoires chez les animaux. Par ailleurs, le lipopolysaccharide ne provoque pas de douleur mais induit une sensibilité accrue à la douleur (allodynie et hyperalgésie). Elle induit également une diminution de l'activité locomotrice et des diarrhées. Un stress thermique bref sera appliqué afin de déterminer l’effets de nos traitements. Le traitement à la Stemregenine 1 (SR1) pourrait potentiellement diminuer les effets de l’inflammation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour obtenir des tissues cérébraux à analyser en spectrométrie de masse .
Remplacement
Nos études utilisant des cultures cellulaires primaires de cellules gliales ont montré que le LPS augmentait le métabolisme de la morphine et que le SR1 abolissait cette augmentation. Cependant, les cultures primaires de cellules gliales ne reflètent pas le contexte intégré du cerveau qui comporte d’autres types cellulaires qui interagissent. In vivo, l’injection de LPS induit une neuroinflammation aiguë qui provoque une diminution de l’activité motrice, ainsi qu’une hyperalgie et une allodynie qui ne peux pas se mesurer in vitro. Le but du projet est de montrer, chez la souris, que l’AhR qui induit une enzyme de dégradation diminue les quantités de morphine et de certains neurotransmetteurs. De fait, nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur et/ou la locomotion. (2) les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau entier.
Réduction
360 animaux (120 souris mâles et 120 souris femelles C57BL/6J + 60 souris mâles et 60 souris femelles mutantes) sont nécessaires aux études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement analgésique en conditions neuropathiques. Les effectifs de 10 animaux prennent également en compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres) ou de la possibilité d’un problème technique. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être rajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions.
Raffinement
Les interactions sociales seront stimulées par des cages enrichies avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation, ainsi que de la frisure et des bâtons de bois. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Les blessures superficielles consécutive à des bagarres sont désinfectées. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e., boites du test, enceinte de la plaque chaude/froide) est réalisée durant 14 jours. Dans les tests comportementaux où on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) et ce, même en absence de réaction de l'animal. Par ailleurs des points-limites ont été établies pour chacune des procédures réalisées. La chirurgie terminale sera effectuée sous anesthésie générale et sous analgésie locale. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer tout nouvel élément contribuant au bien- être animal aux procédures.
Choix des espèces
Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés et les modèles inflammatoires induit par le LPS sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de la souris est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur neuropathique. Nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voies métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études précliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du SNC et du système opioïde est uniquement mature chez l’adulte.
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’obésité et/ou diabète
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 300
Organisme de recherche contractuelle, ce laboratoire teste ce qu'il appelle des "molécules-clients" sur des rongeurs engraissés par un régime hypercalorique, dès l'âge de 3 semaines si le client le demande. 900 rongeurs, 600 souris et 300 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des jeûnes de trois à six heures, jusqu'à trois tests de tolérance au glucose ou à l'insuline, des gavages ou des injections répétés et jusqu'à une prise de sang par semaine. Leurs organes, prélevés après la mise à mort, servent à caractériser l'inflammation. Le bénéfice annoncé, réduire l'impact de l'obésité "à tous les niveaux", reste renvoyé "à terme".
Objectifs
Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses. La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués, tels que la synthèse de médiateurs cytokiniques et lipidiques clés. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques.
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1) Deux sessions de jeûne de 3 à 6h, espacées de 48h minimum, dans le cas de la réalisation de tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (d'une durée de 4h maxiumum chacun). Les animaux ont accès à l’eau mais pas à la nourriture. Au maximum, 3 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline pourront être réalisés au cours d’une étude. 2) Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage (sonde en acier inoxydable réutilisable), les injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intravasculaire, intradermique. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). 3) Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 3 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal. Le nombre maximum de prélèvements sanguins sera de 1 par semaine.
Impact sur les animaux
Les trois principales nuisances attendues concernent (1) la surcharge pondérale des animaux, (2) la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, (3) l’administration répétée des molécules-clients à tester. La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage. La réalisation de prélèvements et d’administrations répétés pourra générer un stress chez l’animal, ainsi qu’une douleur au point de piqure.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.
Remplacement
Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portat sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.
Réduction
La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimental). Le nombre de rats et de souris nécessaire a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétences mis à jour régulièrement. Les souris et les rats seront hébergés selon les conditions de la directive 2010/63/UE. Chaque fois que cela sera nécessaire, une analgésie et/ou une anesthésie seront administrées aux animaux. Leur environnement sera enrichi de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole, afin de leur permettre de se distraire et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être, un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.
Etude de l’immunité innée: élevage de souris à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunodéficientes par construction, les souris de cet élevage portent des mutations qui suppriment certaines cellules de l'immunité innée ou, à l'inverse, activent ses voies. 5 082 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la seule décrite étant une biopsie d'oreille, pour approvisionner d'autres projets sur le cancer et les maladies inflammatoires. Le porteur affirme que leur phénotype dommageable ne se déclare pas en conditions stériles. Les reproductrices et reproducteurs sont tués après six mois de reproduction, les autres souris partent vers d'autres protocoles ou des prélèvements post-mortem, et jusqu'à 1 270 souris "de mauvaise caractérisation génétique" sont utilisées pour entraîner le personnel aux gestes techniques.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est d'étudier le rôle de l'immunité innée au cours d'une réponse anti-cancéreuse ou dans le cadre de maladie autoinflammatoires (dans lesquelles le système immunitaire innée attaque l'organisme). Cette étude nécessite de générer diverses souris qui sont immunodéficientes (et donc plus sensibles aux infections). L'objectif de ce projet est de produire ces animaux qui seront ensuite utilisés dans des projets de recherche portant sur l'immunité innée dans le cancer et les maladies inflammatoire et ceci en réduisant les nuisances du phénotype dommageable en élevage, et en optimisant l’élevage. Ce projet ne concerne que la gestion (élevage et reproduction) des différentes lignées de souris, l'ensemble des projets expérimentaux menés sur ces animaux est validé en parallèle. Différentes lignées de souris immunodéficientes sont nécessaires pour comprendre ces mécanismes de l'inflammation: des souris ayant des mutations conduisant à la perte de certaines cellules de l'immunité innée, ou au contraire des mutations menant à une activation des voies de l'immunité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de générer les animaux qui rentreront ensuite dans différents projets de recherche ayant pour objectifs de mieux comprendre le role de l'immunité innée dans les maladies à composante inflammatoire et la lutte contre les tumeurs et ceci en réduisant les nuisances du phénotype dommageable en élevage (conditions d'léevage stériles comme décrit précédemment), et en optimisant l’élevage. A moyen terme, cela pourrait déboucher sur de nouveaux traitements.
Procédures
Les souris seront soumises à une biopsie sur l'oreille. Une seule intervention d'une durée de moins de 5 secondes sera réalisée par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience) mais qui ne se déclarera pas dans les conditions d'hébergement et de reproduction décrites.
Devenir
Les reproducteurs seront mis à mort à la fin de la période de reproduction (6 mois de reproduction), tout animal ayant atteint un point limite sera automatiquement mis à mort. Les autres animaux produits seront utilisés pour le renouvellement des trios reproducteurs, dans les protocoles validés par le ministère sur ces lignées ou hors-projet (prélèvement d'organes post-mortem pour études in vitro ou mise au point de protocoles). Certains des animaux (maximum 1270 de mauvaise caractérisation génétique) sont utilisés pour l'entraînement des utilisateurs aux gestes techniques sur animaux (dans le cadre d'une DAP portée par notre animalerie et validée par le ministère).
Remplacement
L'élevage de ces souris est indispensable pour générer les souris qui seront utilisées dans les projets de recherche portant sur l'implication de l'immunité innée dans le cancer ou les maladies à composante inflammatoire. Ces maladies ne sont qu'imparfaitement modellisées par les techniques actuelles telles que la production d'organoïdes. En effet, dans ce cas, la composante temps et développement reste imparfaite. D'autre part, l'interaction entre plusieurs organes étant nécessaire à l'apparition des phénotypes que nous étudions, des modèles in vitro ou in silico ne permettent pas d'accumuler des données suffisamment prédictives ou représentatives de la situation pathologique.
Réduction
Des calculs d'effectifs ont permis d'établir le nombre minimal d'animaux par lignée nécessaire en reproduction pour permettre de réaliser les différents projets de cette thématique. Nous nous sommes basés sur un nombre moyen théorique d'animaux par portées et le nombre moyen théorique de portées par femelle et par semestre. Nous avons ainsi calculé au plus juste le nombre de cages de reproduction nécessaires avec ces chiffres et compte-tenu du nombre d'animaux nécessaires pour les expérimentations en aval. Si certains animaux ne peuvent être utilisés pour nos protocoles expérimentaux, ils seront utilisés hors protocole pour des prélèvements post-mortem permettant la mise au point et l'optimisation des expériences (par exemple, mise au point des immuno-marquages multiparamétriques sur des suspensions cellulaires de rate). Enfin, les trios reproducteurs sont changés tous les 6 mois pour ne pas garder de trios peu productifs, ce qui impliquerait d'augmenter leur nombre pour garder une production constante. La dimension de l'élevage sera dynamiquement évaluée pour prendre en compte l'objectif de réduction et s'adapter aux besoins des projets (notamment une réduction de l'élevage dans les phases de diminution des besoins des projets).
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cagées à portoirs ventilés et manipulés par un personel expérimenté en conditions stériles. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. La plupart de ces souris est hébergée dans notre animalerie depuis plus de 5 ans avec une observation quotidienne, nous avons donc le recul nécessaire pour affirmer que le phénotype d'immunodéficience sur les gènes de l'immunité innée considérés n'est pas dommageable en condition d'élevage classiques (c'est à dire sans pathogènes) mais requiert des conditions d'infections controlées pour s'exprimer expérimentalement. Une biopsie d'oreille est parfois requise, cette biopsie n'engendre qu'une douleur légère ne nécessitant pas de prise en charge particulière, absence de saignement. Cependant, le lendemain de la biopsie, une attention particulière sera portée aux oreilles des animaux. En cas de lésions infectées, un lavage au sérum physiologique sera réalisée suivi d'une application de pommade antiseptique et cicatrisante sur conseil vétérinaire. Si l'infection auriculaire s'aggrave dans les 48h , l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l'homme en terme de génétique, d'anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l'étude des réponses immunitaires et des réponses inflammatoires observées lors des maladies à composantes inflammatoires et des infections bactériennes. Des souris âgées de plus de 6 semaines et de moins de 12 mois seront utilisées pour la reproduction du fait de leur maturité sexuelle et avant la décroissance de la fertilité.
STIMULATION CARDIAQUE FŒTALE: EVALUATION DE FAISABILITE VIA UN STIMULATEUR CARDIAQUE SANS SONDE CHEZ LA BREBIS
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Ouvertes par césarienne sous anesthésie générale, leur fœtus sorti pour recevoir un stimulateur cardiaque posé autour du cœur puis replacé dans l'utérus, 10 brebis gestantes et leurs 10 fœtus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'intervention dure trente minutes, avec ventilation par intubation, et le porteur prévoit des douleurs opératoires et postopératoires pour la brebis comme pour le fœtus. Une échographie cardiaque hebdomadaire suit ensuite la gestation jusqu'au terme, puis une radiographie du thorax. Les brebis et les fœtus sont tués après la mise bas, ou pendant l'intervention en cas d'échec d'implantation.
Objectifs
Cette étude sera la 2ème étape d’une étude de faisabilité. En 2023, succès d’implantation d’un pacemaker miniature de nouvelle génération sans sonde chez des lapins par notre équipe. L’objectif de cette 2ème étape sera d’évaluer la faisabilité d’implantation d’un dispositif équivalent chez le fœtus de brebis gestantes pour traiter des troubles du rythme (ralentissement du coeur) chez les fœtus. Après implantation du dispositif sous anesthésie générale par césarienne, puis réintégration chirurgicale du fœtus dans la brebis gestante, le développement du foetus sera surveillé (échographie du fœtus et vérification du fonctionnement du pacemaker) jusqu’au terme de la grossesse. Des traitements analgésiques seront administrés pendant l’intervention et pendant le suivi au cours de la grossesse pour éviter les douleurs chez la brebis gestante et chez le fœtus. Sur une durée de 5 ans, l’étude sera mise en place chez 10 brebis, mais l’étude sera arrêtée dès 2 succès d’implantation consécutifs. Les animaux seront mis à mort près la mise-bas.
Bénéfices attendus
Il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement efficace chez les fœtus en bradycardie sévère (ralentissement très important du coeur) avec mauvaise tolérance. La seule option est l’extraction par césarienne si le terme de la grossesse le permet, avec les complications connues de la grande prématurité. Si différentes stratégies de stimulation lors de la vie foetale ont été essayées, sans succès chez l’homme, il apparait que le système de stimulation doit être implanté entièrement dans le fœtus, en raison du déplacement des sondes reliant le pacemaker au coeur lié aux mouvements du fœtus quand le boitier du pacemaker est externe ou dans le ventre maternel. Le développement d’une technique de stimulation adaptée est essentiel pour permettre d’accélérer la fréquence cardiaque des fœtus afin de poursuivre le développement normal jusqu’au terme de la grossesse. Cela est d’autant plus importants que le taux de mortalité reste très important mais aussi car le risque de récidive pour un futur enfant chez la même mère est aussi considérable (supérieur à 20%). Cette étude sera la première à évaluer la faisabilité d’implantation d’un pacemaker sans sonde en position épicardique (autour du coeur) chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains. Si les résultats sont positifs, cette étude sera complétée par une étude chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie avec implantation d'un stimulateur sans sonde par voie épicardique (autour du coeur avec stimulateur en position abdominale). La durée de l'intervention est évaluée à 30 minutes. La procédure est prévue chez 10 brebis gestantes avec arrêt de l'étude dès 2 implantations successives avec succès. Injections avant, pendant, et après la chirurgie de traitement antalgique et sédatif par voie intraveineuse (injection en bolus avant et après l'intervention et administration continue pendant la chirurgie). Ventilation invasive avec intubation pendant la chirurgie (30 minutes). Après la chirurgie, échographie cardiaque du fœtus hebdomadaire (durée de l'examen de 10 minutes) jusqu’à la fin de la gestation, et radiographie du thorax en fin d’étude (durée de l'examen
Impact sur les animaux
Pour la brebis gestante : chirurgie pour implantation de pacemaker épicardique (autour du coeur). Douleurs opératoires et post-opératoires pendant le suivi jusq’au terme de la gestation. Stress lié aux échographies cardiaques et à la radiographie thoracique. Pour le fœtus : chirurgie pour implantation du pacemaker. Douleurs opératoires et post-opératoires.
Devenir
Mise à mort soit lors de l'intervention en cas d'échec d'implantation (brebis et foetus) ou si un point limite est observé. En cas de succès d'implantation, mise à mort après la mise-bas. Mise à mort du foetus après mise bas par voie basse également.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’évaluer la faisabilité d’implantation de stimulateurs cardiaques sans sonde en épicardique (autour du coeur) chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains et le fonctionnement optimal de ces stimulateurs cardiaques, ce projet doit donc être réalisé sur des animaux vivants. Le travail préliminaire réalisé chez le lapin a permis de mettre en évidence les avantages et la biocompatibilité de ce type de pacemaker sans sonde.
Réduction
Le nombre d’animaux (n=10 brebis gestantes + 10 foetus maximum pouvant être réduit dès 2 implantations avec succès consécutives) a été discuté de façon collégiale avec les cardiologues pédiatriques, les rythmologues, et les chirurgiens cardiaques, pour être réduit au maximum mais permettre cependant de démontrer la fiabilité de l’approche et d’optimiser la technique d’implantation avant les premières implantations chez des fœtus humains. De plus, les implantations seront prévues 2 brebis par 2 brebis (2 brebis prévues par session), permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux en fonction des résultats à chaque étape.
Raffinement
La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi). Les procédures auront lieu sous anesthésie générale après pré médication. Pendant la période post-opératoire, la brebis est hébergée dans un box commun avec la 2ème brebis de la même session. Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voir les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, difficultés à respirer, douleur, vocalises, aspect de la cicatrice). Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, prostration, fièvre) ou de difficulté à respirer persistante pendant plus de 48h, les animaux seront mis à mort. Des points limites seront également surveillés pour le bien être du fœtus (épanchement autour du coeur, activité cardiaque).
Choix des espèces
La brebis a été choisie car le gabarit du foetus est comparable au gabarit du foetus humain, l'objectif étant d'implanter un pacemaker en épicardique (autour du coeur) pendant la gestation. Les quelques cas d'implantation avec succès d'un pacemaker chez l'animal en gestation ont été rapportés chez la brebis par d'autres équipes (avec utilisation de pacemakers classiques d'ancienne génération). Brebis gestantes à un terme où les fœtus feront entre 600 gr et 800 gr (correspondant au gabarit des fœtus humains entre 22 et 26 SA).L a durée de la gestation chez la brebis est d’environ 147 jours (intervalle entre 142-152 jj). Pour avoir un foetus d’environ 800 gr, cela correspondra à un terme de 13-14 semaines. Brebis gestante l'objectif étant d'implanter les pacemakers sur des foetus pendant la grossesse.