Recherche fondamentale

Sorties de leur aquarium, anesthésiées, posées sur un champ glacé, 107 xénopes femelles subissent le prélèvement d'une partie d'un ovaire, opération de quatre à dix minutes répétée jusqu'à trois fois dans leur vie, à six mois d'intervalle au moins. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le projet en prévoit 43 par an. Elles vivent ensuite un à trois ans dans l'animalerie, tant que leurs ovaires reconstituent leur stock d'ovocytes. Sur les 107 animaux, 72 seront tuées parce que leurs ovaires ne régénèrent plus, et 35 seront réutilisées.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les divisions méiotiques de l'ovocyte. Tous les êtres vivants se développent grâce aux divisions de leurs cellules : la cellule duplique son génome puis en redistribue une copie dans chacune des deux cellules filles. La méiose est un mode de division spécialisé spécifique aux cellules reproductrices. Chez les femelles, dans les ovaires, les ovocytes sont bloqués en début de méiose. Cet arrêt permet à l’ovocyte d’accumuler les composants nécessaires au développement du futur embryon. Lors de l’ovulation, un signal hormonal lève le blocage et l’ovocyte réalise les divisions de méiose. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires déclenchés par l’hormone qui conduisent à la division. Ces mécanismes sont encore inconnus et leur étude est très importante pour comprendre la formation de la cellule reproductrice femelle, qui est à la base de la reproduction des individus. Notre étude renseigne aussi sur la division des cellules, qui assure le développement et le maintien de l’intégrité des organismes vivants. Chez l’amphibien Xénope qui est utilisé dans ce projet, la progestérone déclenche dans l’ovocyte l’activation en cascade de différentes protéines, ce qui aboutit à la reprise de la méiose. Sur le plan moléculaire, le blocage de l’ovocyte dépend d’une enzyme qui phosphoryle les protéines. La progestérone induit une diminution de son activité. Ceci provoque la synthèse de nouvelles protéines qui conduisent aux divisions de méiose. Le projet vise à identifier les cibles de l’enzyme et à élucider le mécanisme par lequel elles déclenchent la division. Ce projet a des retombées importantes dans deux domaines : celui du cancer, qui résulte d’une dérégulation de la prolifération cellulaire, et celui de l’infertilité humaine, qui repose en grande partie sur la dérégulation des divisions de l’ovocyte.

Bénéfices attendus

Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l'homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l'origine d'interruptions de grossesses ou d'anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l'espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse. L’atout majeur de l’utilisation du Xénope dans ce domaine a d’ailleurs été à l’origine de l’attribution du Prix Nobel en 2001.

Procédures

Les interventions consistent en un prélèvement d’une partie d’un ovaire, effectué sur un animal anesthésié en conditions stériles et placé sur un champ froid qui supprime la douleur. L’opération dure 4 à 10 min. Seules les extrémités des ovaires sont prélevées pour éviter tout saignement. L’ouverture est suturée sans contraindre les tissus ce qui évite les risques d’hématomes et d’abcès. Le réveil s’effectue en 20 à 30 min, et l’animal est ensuite surveillé pour vérifier la bonne cicatrisation cutanée. Puis il regagne son aquarium. Le projet requiert 43 opérations par an. Chaque femelle est opérée au maximum 3 fois pendant sa vie, chaque opération étant espacée d'au moins 6 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus en post-opératoire portent sur la douleur, le stress et des risques de complication dûs à l’opération. Le stress peut être provoqué par le prélèvement de l’animal dans l’aquarium et l’opération chirurgicale. À noter que le stress thermique potentiellement lié à l’anesthésie, le stress social qui serait engendré par l’isolement post-opératoire et le stress du jeûne pré-opératoire de 5 heures ne sont pas applicables : animal poïkilotherme « à sang froid », à vie solitaire, et nourri tous les 3 jours en conditions normales. La douleur peut être induite par la chirurgie. Les risques de complication sont de légers saignements temporaires de la cicatrice.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie tant qu’ils régénèrent leurs ovocytes suite aux opérations (maximum de 3 opérations par animal, aucun animal n’est opéré plus de 3 fois). Ils demeurent en vie dans l’animalerie entre 1 et 3 années. Ils sont euthanasiés par une méthode réglementaire de façon à lui éviter toute douleur. L’euthanasie est justifiée quand, après une seconde ou une 3ème ovariectomie partielle, les ovaires ne régénèrent plus leur contenu. Le projet reposant intégralement sur l’étude des ovocytes, les animaux ne produisant plus d’ovocytes ne sont donc plus utilisables pour le projet. À l’issue des 5 années du projet, 72 des 107 animaux du projet auront été euthanasiés. 35 seront encore en vie, après avoir subi une ou deux opérations. Ils seront ré-utilisés.

Remplacement

Notre objet d'étude est l’ovocyte, la cellule reproductrice femelle. Cette cellule est extrêmement spécialisée. Son organisation interne très complexe lui permet de réaliser les divisions qui vont lui permettre d’être fécondé par un spermatozoïde. Ces divisions particulières sont également importantes pour les premières étapes de la vie de l’embryon qui sera issu de la fécondation. L’ovocyte n’est donc comparable à aucune autre cellule, et ne peut être reproduit ou « créé » artificiellement par synthèse ou par des cellules souches ou par une modélisation virtuelle. C’est pourquoi nous sommes dans l'obligation d'utiliser des ovocytes intacts issus d’animaux, dans notre cas les Xénopes (des amphibiens), pour les étudier ensuite en laboratoire. Le modèle Xénope lui-même s’inscrit dans une stratégie de remplacement. L’autre modèle utilisé dans les laboratoires pour l’étude du même sujet, la formation de l’ovocyte, est la souris (ou le rat). Les ovaires de Xénope contiennent chacun jusqu’à 6000 ovocytes (contre une vingtaine chez la souris) et ont la capacité de régénérer (ce qui n’existe pas chez la souris). Utiliser le Xénope au lieu de la souris permet donc de limiter énormément le nombre d’animaux utilisés en laboratoire. Enfin, en parallèle à l’utilisation expérimentale des ovocytes, nous utilisons des outils bioinformatiques très récents (moins de cinq ans), basés sur l'intelligence artificielle, en amont des expériences. Ils permettent de guider et cibler les expériences au lieu de travailler de manière exploratoire comme par le passé. Cela permet de limiter le nombre de cellules utilisées, et donc d'animaux.

Réduction

Les expériences de l’ensemble des membres de l’équipe sont planifiées, coordonnées et synchronisées de façon à n’opérer qu’un minimum d’animaux. Les besoins en ovocytes pour les expériences d’une semaine de travail sont précisément estimés, et oscillent entre 1000 et 2000 ovocytes. En conséquence, une seule femelle est opérée chaque semaine. Les 1000 à 2000 ovocytes requis correspondent à un à deux tiers du contenu d’un ovaire. Le contenu de l’ovaire n’est jamais vidé entièrement de façon à préserver les cellules souches qui vont assurer la régénération. En outre, les Xénopes ont la capacité de renouveler leur stock d’ovocytes au bout d’une période minimale de 6 mois : nos statistiques indiquent que 81 pour cent des animaux régénèrent après une opération, et 57 pour cent d’entre eux après une seconde. Ces capacités régénératives nous permettent de ré-utiliser une même femelle jusqu’à trois fois, limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de femelles utilisées par le projet est de 107. Enfin, des outils statistiques et des modèles prédictifs sont utilisés en amont des expériences et permettent d’orienter les expériences nécessaires à réaliser, au lieu de travailler de manière exploratoire en multipliant les expériences comme par le passé. Ainsi, la propriété de régénération du Xénope, la synchronisation des demandes d’ovocytes de tous les membres de l’équipe et les nouveaux outils bioinformatiques disponibles réduisent considérablement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en aquarium de 25 L d’eau déchlorée, filtrée, oxygénée, à 20 degrés. Au-delà de 25 degrés, l’animal entre en léthargie. Des sondes surveillent en temps réel température, acidité et conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes PVC où certains animaux aiment à se cacher, bien que le comportement préféré soit de rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums avec une brosse ou une lingette est effectué tous les 15 jours. 6 à 12 animaux sont regroupés par aquarium. Dépasser 12 peut induire un stress. Aucun stress n’est relevé si le groupe est réduit ou l’individu isolé, car les individus sont solitaires chez cette espèce. À leur arrivée, les animaux sont mis en quarantaine pendant 4 semaines. Ils sont ensuite acclimatés en aquarium pendant au moins 2 semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Ils sont nourris à satiété 2 fois par semaine (vers de vase, cœur de bœuf et granulés de poisson). Ils sont prélevés à la main ou avec une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de ne pas les stresser. Une grille de cotation répertorie toute anomalie et lui attribue un chiffre, de 1 à 3 : 1, surveillance attentive ; 2, surveillance accrue, isolement de l’animal pendant une semaine et soins éventuels, puis réévaluation de l’état de l’animal ; 3, point limite, euthanasie. À un niveau 2, des soins portant sur les affections cutanées peuvent être apportés. L’anesthésie, le prélèvement et l’euthanasie sont pratiqués dans une pièce isolée afin de ne pas stresser les autres animaux. La durée de la chirurgie est minimisée (4 à 10 min). Les opérations sont pratiquées sous anesthésie. L’animal est placé sur le dos sur un champ glacé, ce qui a un effet analgésique. Une surveillance post-opératoire est effectuée pendant 2 semaines.

Choix des espèces

L’ovocyte de Xénope (une espèce de crapaud) est un modèle très adapté pour l’étude de la division des cellules, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Comprendre la formation de ces cellules est important pour trouver des thérapies soignant l’infertilité humaine et le cancer. Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d'étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d'ovocytes, ce qui limite le nombre d'animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l'ovocyte humain que ne l'est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme. Les animaux utilisés sont des femelles adultes parce qu’elles ont des ovaires pourvus en ovocytes, les cellules que nous étudions. Les embryons et les têtards en sont dépourvus. Les femelles achetées chez un fournisseur agréé ont entre 2 et 3 ans, âge de la maturité sexuelle chez le Xénope.

Deux incisions de six millimètres sont pratiquées dans la peau du dos de 164 souris pour déclencher la formation de neurofibromes, tandis que 196 puis 32 autres sont isolées quinze jours en cage individuelle, au sevrage ou à un an. L'effectif déclaré est pourtant de 188 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur peau soit disséquée. Le porteur annonce une douleur aiguë et une baisse d'activité après les incisions, malgré la lidocaïne appliquée au préalable, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il conclut néanmoins que les tumeurs développées par ces souris n'entraînent "pas de phénotype dommageable", au motif qu'elles restent invisibles à l'œil nu, quand les mêmes tumeurs chez les patients humains provoquent, selon son propre texte, démangeaisons et douleurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 3000. Elle se caractérise par l'apparition de nombreuses tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés, qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses de peau. Ces tumeurs, dont le nombre peut atteindre des milliers peuvent causer des démangeaisons et des douleurs et ont un impact majeur sur la qualité de vie du patient. Les mécanismes responsables de leur développement sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. A l’aide d’un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 nous avons récemment montré que (i) le trauma de peau induit le développement de neurofibromes cutanés, (ii) le développement des neurofibromes cutanés est transitoire et suit 3 phases : initiation, progression et stabilisation, chacune caractérisée par des changements cellulaires et moléculaires. En caractérisant ces différentes phases, nous avons identifié deux protéines comme potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les neurofibromes cutanés en phase de progression (croissance) et en phase de progression (croissance) ou de stabilisation (stade mature), respectivement. Le but de la première partie de ce projet est ainsi d’explorer le rôle et potentiel thérapeutique de ces deux protéines dans le développement des neurofibromes cutanés. Pour cela nous utiliserons le modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 développant des neurofibromes cutanés en combinaison avec des outils génétiques ou pharmacologiques. De plus, nous avons observé que dans la peau saine de souris mutantes de la Neurofibromatose de type 1 sans trauma et sans neurofibromes cutanés, la densité de cellules de Schwann (cellules à l'origine des neurofibromes cutanés) était plus importante que dans la peau saine d’animaux sains (contrôles). La deuxième partie de ce projet vise ainsi à caractériser plus en détail la peau saine des souris mutantes pour la neurofibromatose de type 1 et la comparer à celle de souris saines (contrôles).

Bénéfices attendus

Les mécanismes responsables du développement des neurofibromes cutanés sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. Les rôles de deux protéines: la Ténascine-C et la Périostine dans leur développement n’ont jamais été explorés et constituent de nouvelles pistes mécanistiques et thérapeutiques. La peau saine d’individus atteints de la Neurofibromatose de type 1 n’a jamais été caractérisée en détails bien que ce soit une question importante puisque à ce jour, l’hétérogénéité en nombre, taille et localisation des neurofibromes cutanés observée chez les patients reste inexpliquée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale courte (de l’ordre de 10 min) correspondant à l'induction de deux petites lésions incisionnelles manuelles de 6 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur (l'incision est réalisée sur l'épaisseur totale de la peau de la souris qui est très fine, de l'ordre de moins d'1 mm). Cela concerne 164 animaux. Certains animaux seront isolés dans des cages individuelles dès le sevrage à 1 mois, pendant 15 jours avant d’être mis à mort, cela concerne 196 animaux. Finalement 32 animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de l'âge d'un an, pendant 15 jours avant d'être mis à mort.

Impact sur les animaux

Les neurofibromes cutanés développés par les souris mutantes NF1 sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris. Aucun effet nuisible ou indésirable lié à l’absence de Ténascine-C ou à l’inhibition de Périostine n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. Des nuisances sont cependant à prévoir suite à l'induction de lésions manuelles (douleur aigüe, diminution des mouvements et de l’activité normale due à l’inconfort), bien que de la lidocaïne soit appliquée préalablement pour en atténuer les effets. Des nuisances liées au stress des manipulations, à la contention des souris, à l’anesthésie générale et aux gestes techniques d’injections sont également à prévoir. Enfin, lorsque les souris seront gardées seules dans des cages isolées, du stress est à prévoir.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour que leur peau puisse être disséquée et analysée.

Remplacement

Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des neurofibromes cutanés et permettant d’évaluer le rôle de ces deux protéines dans ce processus. De plus, il n’existe pas d’inhibiteur pharmacologique pour inhiber l’activité de la Tenascine-C, il est donc nécessaire d’utiliser les animaux mutants pour inactiver la Ténascine-C de façon génétique et évaluer son rôle dans le développement des neurofibrmes cutanés. Enfin, l’hébergement des souris en isolation est le seul moyen de prévenir les morsures et donc les lésions de peau induisant le développement des neurofibromes cutanés.

Réduction

Pour la réduction du nombre d'animaux dans ces procédures expérimentales, nous nous sommes basés sur des expériences similaires déjà documentées dans la littérature. En effet, la connaissance approfondie du modèle de souris NF1, le traitement à la cilengitide, l'inactivation génétique de la Tenascin-C, ainsi que la réalisation de lésions cutanées nous permet d’utiliser des modèles maîtrisés. Cela évite les mises au point préalables, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en se basant sur une analyse statistique, le nombre d'animaux est optimisé pour garantir des résultats statistiquement significatifs avec le minimum d'animaux nécessaires. Cela inclut l'utilisation de techniques comme l'analyse de puissance pour déterminer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Pour le Raffinement ; de la lidocaïne sera appliquée sur la peau du dos des souris avant la réalisation des lésions afin de limiter la douleur liée à cette procédure. À la suite des lésions, l’état des souris sera évalué une fois par jour pendant une semaine puis deux fois par semaine pour le reste de la durée du suivi (1 mois). Lors de ces visites le poids, l’activité, d’éventuels signes d’inflammation au niveau des points d’injection, une éventuelle paralysie, l’état de stress et de douleur des souris (poils hérissés) seront évalués. En présence de tels signes persistants (plus de 24h), les souris seront mises à mort via une anesthésie générale par dislocation cervicale. Le personnel de l’animalerie nous informe également régulièrement (lors des changements de cages notamment) de l’état de santé des souris. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients atteints de la Neurofibromatose de type 1, les souris mutantes pour la Neurofibromatose de type 1 développent des neurofibromes cutanés dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Les souris gardées seules dans des cages isolées seront hébergées dans un environnement enrichi contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Ces animaux sont également gardés dans des cages transparentes permettant le contact visuel avec les animaux des cages voisines. De plus, les expériences seront réalisées rapidement après isolation, ce qui limitera le temps passé en isolation.

Choix des espèces

Nous avons récemment concu un modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des neurofibromes cutanés et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et le rôle de la Ténascine-C et de la Périostine dans leur développement, ou d'étudier la peau saine mutante NF1. Des animaux adultes âgés de 6 semaines seront utilisés pour qu'ils n'aient pas encore développé de neurofibromes cutanés. Des animaux adultes âgés de 1 an seront également utilisés afin qu'ils aient développé des neurofibromes cutanés matures.

180 souris femelles vont être utilisées pendant vingt-huit semaines, chacune soumise à un régime gras, 72 d'entre elles subissant en plus l'ablation des ovaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole enchaîne échographies cardiaques et IRM sous anesthésie, cathétérisme invasif pour 150 souris, tests d'effort sur tapis de course, mesures de pression à la queue et 72 heures en cage métabolique individuelle, posées sur une grille destinée à recueillir les urines. Toutes sont tuées à l'âge de 37 semaines pour prélever leurs organes. Le bénéfice annoncé se limite à des données précliniques en faveur d'un médicament bloquant l'action de l'aldostérone.

Objectifs

Nos souhaitons déterminer, chez des souris femelles obèses et atteintes d’insuffisance cardiaque suite à l’administration pendant 12 semaines d’un régime riche en graisse, si la suppression définitive des ovaires (ovariectomie), mimant la ménopause, provoque une accélération de l’aggravation progressive de leur insuffisance cardiaque. En effet, la ménopause est responsable d’un effondrement des taux d’œstrogènes, susceptible d’aggraver les conséquences de l’obésité et de l’insuffisance cardiaque. De plus, nous déterminerons si un médicament permettant de bloquer les récepteurs (et donc l’action) d’une hormone nommée aldostérone, permet d’empêcher ou de freiner cette aggravation de l’insuffisance cardiaque. Nous étudierons donc la fonction cardiaque des souris (par échographie et cathétérisme), la fonction des artères coronaires qui perfusent le cœur (par IRM), et leur pression artérielle. Nous étudierons également le métabolisme des souris obèses (mesure du glucose dans le sang après ingestion d’un excès de glucose ou après administration d’insuline) et le risque d’insuffisance rénale (via des mesures dans les urines). Nous étudierons également la possible aggravation par l’ovariectomie et l’action espérée du médicament sur le confort de vie des animaux, en mesurant leur activité spontanée (mesure des déplacements libres), leur capacité d’exercice (sur tapis de course) et leur anxiété (comportement lors de l’exploration d’un espace inconnu). Enfin, des analyses post-mortem du remodelage du cœur et des vaisseaux, et des mesures de l’expression cardiaque de nombreux gènes et protéines impliquées dans la maladie et/ou cibles de l’action du médicament, seront réalisées pour compléter et apporter des explications aux études réalisées chez les souris.

Bénéfices attendus

Acquisition de données précliniques en faveur d'un traitement pharmacologique par ARM pour améliorer l'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservé chez femelles en conditions ou non de post-ménopause et atteintes d'un Syndrome métabolique et, en particulier l'amélioration de paramètres fonctionnels cardiaques, vasuclaires et possiblement métaboliques. Une insuffisance cardiaque correspond à l’incapacité du cœur à répondre aux besoins de perfusion sanguine pour les différentes fonctions d’organes. La fraction d’éjection est la quantité de sang éjectée à chaque battement cardiaque par rapport au volume de remplissage du cœur (en particulier pour le ventricule gauche qui éjecte le sang oxygéné pour tout l’organisme sauf les poumons). Quand la fraction d’éjection est préservée à l’état de base, les malades en activité basale ne se rendent pas compte de leur maladie, qui ne se révèle, par une douleur et un essoufflement, que lors d’un exercice intense, d’une période de grosse fatigue ou d’un stress aigüe (la fraction d’éjection se réduisant dans ces conditions).

Procédures

Des souris femelles de 9 semaines seront placées sous régime gras induisant une obésité (durée du protocole : 28 semaines). Un groupe de souris contrôles sera maintenu sous régime standard. Après 16 semaines de régime gras, les souris seront ou non ovariectomisées, puis mises ou non sous traitement pharmacologique pendant 12 semaines pour limiter la progression de l’Insuffisance cardiaque liée à l’obésité. Les souris seront suivies par échocardiographie sous anesthésie au gaz. Les mesures seront réalisées après 16 semaines de régime gras puis 6 semaines après ovariectomie et après 12 semaines de traitement. Les animaux subiront différentes techniques : chirurgie ovariectomie chez l'animal anesthésié durée 20 minutes/animal (Nombre : 72 souris) , Échographie cardiaque chez l'animal anesthésié durée 30 minutes/ animal ( Nombre : 180 souris), Test de glucose tolérance par prélèvement sanguin sur les animaux vigiles durée 5 minutes/animal (Nombre: 90 souris), IRM chez l'animal anesthésié durée 30 minutes/animal (Nombre : 30 souris), Hémodynamique invasive (évaluation de la fonction systolique et diastolique) chez animal anesthésié durée de 30 minutes/animal (Nombre: 150 souris ), Pléthysmographie (pression a la queue) sur animaux vigile durée 20 minutes / animal (Nombre : 90 souris), test a l'effort sur animaux vigile durée 30 minutes/animal (Nombre: 90 souris), activité spontané chez animaux vigile durée 72 heure (Nombre: 90 souris) (Une fois) , Openfield (test expérimental utilisé pour évaluer les niveaux généraux d'activité locomotrice , l'anxiété et la volonté d'explorer) animaux vigile durée 15 minutes / animal (Nombre : 90 souris) et cage metabolique (Récuperation dans feces et urines) animaux vigile sur une durée de 12 heures (Nombre : 60 souris). Toutes les interventions serons réalisé une seule fois chez chaque animal.

Impact sur les animaux

Douleur post-opératoire après l’ovariectomie. Tapis de course le teste a l'effort peut entraine un stress. Mais aussi Stress lié à la contention lors de la mesure de la pression artérielle. Stress et inconfort liés à la mise en cage à métabolisme individuelle pendant une nuit (12h00), les souris étant posées sur une grille permettant de collecter les urines au travers. Inconfort ou douleur lors des phases de réveil après anesthésie générale. Ces anesthésies générales suivies d’une phase de réveil concernent les opérations d’ovariectomie, échographie cardiaque et les examens par IRM.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches

Remplacement

Les expériences réalisées in vivo ne peuvent être remplacées par des études in vitro en raison de la complexité de la pathologie d'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection nécessitant des analyses fonctionnelles et physiopathologiques complexes, en particulier dans le contexte intégratif de comorbidités telles qu’un diabète de type 2, une dysfonction endothéliale, une dysfonction du tissu adipeux, le risque d’une insuffisance rénale ou hépatique, et en présence de remodelages tissulaires et d’une inflammation chronique. Dès lors, l'utilisation d'animaux ne saurait à ce jour être remplacée par des méthodes alternatives aboutissant à laprécision requise quant à la qualité et à la précision attendues des mesures expérimentales, et quant à l'hypothèse d'une amélioration de la santé des animaux placés sous traitement pharmacologique .

Réduction

L'ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d'animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire à mettre en évidence une différence entre les groupes. Le nombre d'animaux demandé pour tout le protocole (deux séries de souris avec n=90 souris incluant 5 groupes avec n=18/groupe) correspond également à une volonté de ne pas soumettre les animaux à une fréquence trop élevée d'actes expérimentaux qui génèrerait un excès de stress expérimental et un risque accru de souffrance.

Raffinement

Pour s'assurer de bonnes conditions de vie des souris, une observation rigoureuse est indispensable. Les souris sont hébergées dans une animalerie conventionnelle à 5 souris/cage, en portoirs ventilés avec accès ad-libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, plus un enrichissement du milieu (plaque de cellulose, tunnel cartonné). Pour le maintien des conditions d'hygiène, le change est réalisé une fois par semaine. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement par les soigneurs et au moins de manière hebdomadaire par le responsable du protocole et/ou ses collaborateurs, pour déceler le moindre signe de souffrance. Le protocole est initié une semaine après l’arrivée des animaux à l’animalerie pour respecter un temps d’adaptation suite au transport. La procédure de réveil, dans un espace dédié, répond aux mêmes exigences, sous observation de l'expérimentateur pour pouvoir procéder à une analgésie en cas d'observation de signes de souffrance. Les conditions de soin sont destinées réduire autant que possible la douleur ou l’angoisse que pourraient ressentir les animaux. Pour les procédures réalisées avec des souris vigiles, des phases d'habituation progressive au dispositif expérimental sans mesure sont réalisées afin de minimiser le stress des animaux. Les point limite sont mise en place our évalué la douleur de l'animal et cette grille de score sera appliqué a chaque animal.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale (souris ) se justifie par une longue expérience du laboratoire concernant les modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, notamment l’l'Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection après administration d’un régime riche en graisse. De plus, nous disposons d’une animalerie moderne avec des portoirs ventilés facilitant l’hébergement et favorisant le confort et la sécurité sanitaire des souris. Enfin, nous disposons d’une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et vasculaires, in vivo et ex vivo, chez la souris. Les souris utilisées seront des souris matures âgées de 9 semaines au moment de l'inclusion dans le protocole et âgées de 37 semaines au moment de la mise à mort. La durée du protocole implique 16 semaines sous régime alimentaire pour obtenir une Insuffisance cardiaque à fraction d'éjection , préalablement à l'ovariectomie et à l'observation de ses potentiels effets agravants, qui seront suivis au cours des 12 semaines suivant la chirurgie, de même que seront observés au cours de cette période les effets préventifs espérés d'un traitement.

880 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau une greffe de cellules de lymphome humain, puis neuf injections de traitement en trois semaines, et des prises de sang au sinus rétro-orbitaire deux fois par mois puis une fois par semaine. À un stade avancé, la tumeur peut se nécroser, le porteur rangeant cette nécrose parmi les nuisances possibles. Le projet est mené avec une entreprise pharmaceutique et des hôpitaux, et vise à amener au moins un des traitements testés jusqu'à un essai clinique de phase 1.

Objectifs

Les lymphomes T cutanés (LTC) sont des cancers relativement rares avec une incidence d’environ 650 nouveaux cas/an en France, qui surviennent chez les personnes plutôt âgées. Aussi, au regard du vieillissement de la population, on peut s’attendre à une augmentation du nombre de cas diagnostiqués par an dans les prochaines années. Dans les formes les plus agressives de la maladie, la survie des patients est faible (entre 20%-30% à 5 ans) car il n’existe pas de thérapie curative excepté la greffe de moelle osseuse mais qui s’adresse à des patients de moins de 60 ans. Afin de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques nous avons pour objectif de tester de nouvelles molécules qui pourront ensuite faire l’objet d’un essai clinique de phase I.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet translationnel en collaboration avec une entreprise pharmaceutique et des hôpitaux dans le cadre d’un projet collaboratif qui permettra d’aboutir à un essai clinique de phase 1 pour au moins un des traitements testés. Notre lien avec nos collaborateurs cliniciens et industriels, nous permettrait d’envisager de proposer au moins 2 nouvelles thérapies seules ou en combinaison.

Procédures

Récapitulatif synthétique des interventions : - 1 injection de cellules tumorales sur souris anesthésiées en début d’expérimentation (2min). - Des prélèvements de sang 2 fois par mois puis une fois par semaine(2min). -9 injections avec les traitements sont réalisées sous la peau ou dans la cavité péritonéale tous les 2 jours sur 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : - La prise de sang 2x/mois puis 1x/semaine au niveau du sinus rétro-orbital - L’inoculation sous-cutanée des cellules tumorales - Les injections des traitements+/-cellules effectrices tous les 2 jours pendant 3 semaines - Le stress dû à la contention/préhension des animaux- A un stade avancé du développement tumoral, une nuisance possible est l’apparition de nécrose de la tumeur.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Dans notre démarche d’établissement de nouveaux modèles d’études des LTC, nous développons en parallèle dans l’équipe de nouvelles approches de culture tridimensionnelles que nous comparons à ceux in vivo afin de les valider. Ce projet financé est en cours de finalisation et permettrait à terme de remplacer en partie l’utilisation d’animaux et de tester des molécules thérapeutiques in vitro. Néanmoins, l’oncogenèse est un processus intégré qui fait intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour compléter nos études.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d’animaux. La croissance tumorale sera suivie tout au long de l’expérience notamment grâce la détection des cellules dans le sang des animaux ce qui nous permet d’utiliser moins d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort. Les animaux seront hébergés en groupe, recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris non immunocompétentes qui vont permettre la greffe de cellules humaines. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines car à ce stade elles présentent un système hématopoïétique mature (fin puberté) pour permettre un suivi sur au moins 4 semaines post-injection dans de bonnes conditions d’âge de l’animal.

Soumises à des contentions répétées destinées à produire un état de stress, puis à l'injection d'une substance inflammatoire, 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent une perte d'appétit, une chute de température et un retrait social, que le porteur nomme "comportement de maladie" et présente comme contribuant à leur rétablissement. Il écrit par ailleurs que la contention laisse l'état général des souris stable, sans perte de poids ni changement d'activité, tout en s'en servant comme modèle de stress. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, et la rubrique consacrée au remplacement décrit un travail sur les oméga-3 et les régimes alimentaires, quand l'objectif annoncé porte sur un récepteur de la neuroinflammation.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de dépression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents composés biologiques d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces molécules bioactives a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces composés influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes neuroinflammatoires impliqués dans les troubles psychiatriques, notamment via le rôle du récepteur HCAR2 dans les cellules immunitaires du cerveau et de la périphérie.

Procédures

Pour désactiver le gène spécifique HCAR2 dans certaines cellules immunitaires du cerveau (positives pour le gène CX3CR1), les souris recevront une injection par jour pendant cinq jours. Trois semaines plus tard, un groupe de souris modifiées et un groupe témoin recevront une substance inflammatoire pour observer leur réaction. Leur état sera suivi pendant les 48 heures suivantes. À la fin de l’expérience, les souris seront endormies sans douleur grâce à un anesthésiant, suivi d’une injection pour mettre fin à leur vie. Chaque injection ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont limitées et soigneusement contrôlées grâce à des protocoles rigoureux et des mesures adaptées. La contention répétée est une méthode utilisée pour modéliser un état de stress. Bien qu’elle puisse entraîner un inconfort temporaire, l’état général des souris reste stable, sans perte de poids ni altération de leur activité habituelle, selon notre expérience et les données disponibles. L’injection d’une substance inflammatoire entraîne une activation temporaire du système immunitaire, provoquant un malaise passager caractérisé par des modifications de la température corporelle, du métabolisme énergétique, une perte d’appétit et un comportement de retrait social. Ce phénomène, appelé « comportement de maladie », contribue au rétablissement des animaux et disparaît en 48 heures. Les évaluations comportementales sont conçues pour minimiser l’impact sur le bien-être des souris, avec des durées d’exposition réduites et des manipulations adaptées. De plus, les lignées utilisées sont bien caractérisées, et un suivi rigoureux permet de détecter rapidement tout effet inattendu. Pour garantir le bien-être des animaux, des mesures spécifiques sont mises en place : une surveillance quotidienne par l’expérimentateur et bihebdomadaire par les animaliers, ainsi qu’une évaluation systématique de la douleur après chaque manipulation, avec administration d’analgésiques si nécessaire. L’enrichissement de l’environnement, des manipulations douces et une attention constante visent à réduire au maximum les effets indésirables tout en assurant des conditions optimales pour les expériences.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale ou si les points limites sont atteints au cours de l'une d'entre elle, les souris seront euthanasiés afin de préléver les tissus nécéssaires aux analyses.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris sont nécessaire par groupe afin de permettre une robustesse des données.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement ainsi que des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientique.En fin d'expérimentation, les animaux seront mis a mort par une anesthésie sans reveil avec au préalable une analgésie pour limiter la douleur pendant la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris en raison de leur petite taille, qui permet de les héberger facilement dans des conditions d’élevage optimales en animalerie. Nous privilégions la souris plutôt que le rat, car de nombreuses lignées transgéniques sont déjà disponibles dans notre laboratoire, contrairement aux rats. Ce choix s’inscrit également dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, les cellules immunitaires de la souris et de l’homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui facilite la transposition des résultats obtenus chez l’animal à l’humain. Les différentes lignées transgéniques générées arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines avant de commencer les protocoles de stress. Les tests comportementaux débuteront sur des animaux âgés de 12 semaines au maximum.