Recherche fondamentale

Une injection de cellules cancéreuses dans le flanc droit, sous anesthésie gazeuse, ouvre le protocole pour 1 840 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements, et le porteur décrit une altération possible de l'état général, perte de poids, posture douloureuse, léthargie, arrêt du toilettage. L'objectif est de mesurer l'effet d'une cytokine inflammatoire sur l'efficacité de chimio-immunothérapies déjà utilisées en clinique contre le cancer du poumon. Les effectifs annoncés geste par geste, 920 souris pour la chimiothérapie, 2 080 pour un traitement répété trois fois par semaine et 640 pour un autre, dépassent le total de 1 840 déclaré.

Objectifs

Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies et/ou d’immunothérapies, qui malheureusement ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de la résistance aux traitements. L’IL-1β est une cytokine inflammatoire ayant un rôle ambigu dans le cancer et dans la réponse aux traitements. Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β sur l’efficacité antitumorale des chimio-immunothérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers du poumon chez la souris. Nous étudierons également les cellules immunitaires dans les tumeurs. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d’évaluer les effets de l’IL-1β, sur l’efficacité anti-tumorale des chimio-immunothérapies, utilisées en clinique dans 2 modèles de cancers murins. Ce projet permettra également de déterminer son mécanisme d’action. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par chimio-immunothérapie. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser les effets de la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer. L’identification d’un rôle de l’IL-1 dans la sensibilisation aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents in vitro et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet) puis chez l’Homme.

Procédures

- Injection des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes - Nombre de souris : 1840. - Traitements par chimiothérapie : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 920 - Traitements : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 2080 - Traitements: - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 640

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite (perte de poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. afin de prélever la tumeur et l’analyser.

Remplacement

Le cancer du poumon est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes seront constitués de 10 animaux (suivis de croissance) ou de 5 animaux (immunomonitoring) afin de considérer les variabilités inter-individuelles. Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude tout en en conservant la puissance statistique nécessaire. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Ce projet est divisé en 3 sous-parties. Si aucun effet thérapeutique n’est observé dans la première partie, le projet sera stoppé. Si aucun effet n’est observé en partie II, le projet sera stoppé à ce stade.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (en groupes, dans un environnement enrichi avec mise à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids). Les animaux seront habitués aux techniques de préhension de contention et de pesées. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe et pour les traitements intra-tumoraux. Durant toute l’expérience, suivi du poids au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée. Le volume tumoral sera déterminé trois fois par semaine, afin d’appréhender au plus tôt d’éventuels signes de souffrance.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

Les souris utilisées ont un système immunitaire déficient, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. 8 100 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection intrapéritonéale puis une injection intraveineuse quarante-huit heures plus tard, elles reçoivent des injections quotidiennes sur animal vigile pendant une à trois semaines, certaines subissant en plus des séances d'imagerie ou des ponctions de moelle osseuse sous anesthésie. Toutes seront tuées, le porteur indiquant que la souche immunodéprimée et la greffe humaine interdisent de les garder en vie.

Objectifs

Les Leucémies Aigües Myéloïdes (LAM) sont un cancer du sang et de la moelle osseuse pour lequel la majorité des patients rechutent à cause de la présence de cellules leucémiques qui ont résisté à la thérapie. L’objectif de l’équipe est d’explorer les pistes pouvant être impliquées dans ce processus de résistance et de trouver des stratégies thérapeutiques ciblées. En effet, nous avons découvert que le métabolisme des cellules joue un rôle important dans la résistance, tout comme les mutations génétiques. L’hôte est également un environnement intéressant puisque les cellules leucémiques interagissent directement avec les autres cellules du microenvironnement pour survivre aux différentes thérapies. Notre objectif est d'utiliser nos modèles précliniques pour mimer les différents paramètres cliniques observés à la suite d'une prise en charge thérapeutique : quantification de la charge tumorale post-traitement, mesure de la survie globale des patients selon leur prise en charge, mesure du risque de récidive (apparition des rechutes). A l'issue de nos études, le but est de comparer les différents schémas de traitement et d'étudier les mécanismes de résistance associés pour trouver des combinaisons thérapeutiques efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des thérapies existantes, ou bien de nouvelles molécules en ciblant de manière différente les cellules chimiorésistantes (types inhibiteurs). Nous pourrions également établir différents groupes de patients selon les caractéristiques moléculaires de la maladie, et ainsi prédire la réponse à la chimiothérapie puis orienter les types de patients vers un autre type de thérapie ciblée.

Procédures

Au début de chaque protocole, tous les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale puis intraveineuse 48h après. Ils recevront ensuite des injections vigiles d’une minute pour permettre l’administration du traitement pendant une durée de 1 à 3 semaines. Certains animaux recevront en plus une injection de moins d’une minute pour imagerie (acquisitions de 30 secondes après une anesthésie de 15 minutes). D’autres seront anesthésiés pendant 10 à 15 minutes pour supporter un prélèvement de sang ou de moelle osseuse.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, des symptômes liés à l'apparition de la maladie, une gêne physique en cas d'administration thérapeutique prolongée. La fréquence d'administration, la dose et les volumes de traitement seront choisis optimiser le confort des animaux et tous les traitements utilisés auront pour but de réduire la charge tumorale. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasiés pour étudier les échantillons biologiques issus des animaux. Dans chaque cas, la souche étant immunodéprimée et les animaux ayant reçu une greffe de cellules humaines, ils ne peuvent être gardés en vie.

Remplacement

Les modèles in vitro existants de Leucémie Aiguë Myéloïde seront utilisés en première intention pour connaître la sensibilité des cellules leucémiques seules aux différentes traitements. En revanche l'utilisation des modèles in vivo reste nécessaire pour pouvoir étudier le développement tumoral au sein du microenvironnement, et le comportement/mécanisme de résistance des cellules leucémiques dans l’organisme vivant auquel elles s’adaptent.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l’outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d’optimiser le nombre d’animaux et le nombre d’échantillons issu de l’animal.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l’animal, en optimisant la voie et le volume d'injection, et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin est caractérisé dans la compréhension des pathologies cancéreuses et la recherche biomédicale. Il est très utilisé dans le criblage de nouvelles molécules du fait de sa similitude de nombreux gènes avec ceux de l’humain, ce qui permet d’étudier la résistance des cellules aux traitements. Il présente aussi des avantages pratiques tels qu’une reproduction et une croissance rapide, et une facilité de manipulation et d’adaptation aux conditions expérimentales ainsi qu’un coût moindre. Nous utilisons des souris avec un système immunitaire déficient qui permet d'étudier la leucémie aiguë myéloïde humaine in vivo. Nous pourrons aussi utiliser d'autres souches immunodéprimées développées par des laboratoires de production afin d'optimiser nos modèles. La procédure utilise des animaux âgés de 6 minimum à 10 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent ainsi une meilleure prise de greffe leucémique. Nous n'utiliserons pas d'animaux âgés de moins de 6 semaines car leur développement est encore en cours et le microenvironnement de la moelle osseuse pas totalement formé.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

Génétiquement modifiées pour développer une athérosclérose, 132 souris sont irradiées pendant trente minutes, ce qui détruit les cellules de leur moelle osseuse avant une greffe qui les repeuple. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et associent l'immunodépression, quatre semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une perte de poids, des troubles digestifs, un grisonnement des poils et seize semaines de régime riche en cholestérol. Le porteur qualifie l'irradiation d'indolore et les plaques formées dans les vaisseaux d'"indolores et asymptomatiques". Toutes sont tuées par ponction du cœur sous anesthésie, pour prélever ces plaques et les valves aortiques.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires, comme l’athérosclérose, sont la principale cause de mortalité dans le monde. L’athérosclérose se produit lorsque des plaques graisseuses (issues des lipides) se forment dans les artères, bloquant le flux sanguin et augmentant le risque de crise cardiaque ou d’AVC. En réponse à cette accumulation de graisses, la paroi artérielle devient inflammée, activant des cellules immunitaires appelées macrophages, qui sont responsables de l’élimination des particules nocives dans l’organisme. Cependant, dans les plaques, les macrophages eux-mêmes absorbent trop de graisses, contribuant ainsi à l’emballement de la croissance de la plaque. Les traitements actuels ne réduisent que partiellement le risque cardiovasculaire, il est donc urgent de trouver de nouvelles approches. Récemment, des chercheurs ont identifié des lipides complexes, appelées plasmalogènes, qui sont associées au risque cardiovasculaire. Les niveaux de plasmalogènes dans le sang pourraient être un bon indicateur du risque de maladie cardiovasculaire. Cependant, on ne sait pas encore avec certitude si les plasmalogènes jouent un rôle direct dans l’athérosclérose et l’inflammation qui l’accompagne, ni leur rôle dans les cellules immunitaires que sont les macrophages. Ce projet nous aidera à comprendre comment les plasmalogènes, qui sont très présents dans les macrophages, pourraient contribuer au développement de l’athérosclérose en modulant des étapes clés de la maladie. Le développement de l’athérosclérose sera examiné dans un modèle de souris génétiquement modifiées prédisposées à la maladie, et dont le système immunitaire uniquement verra sa quantité de plasmalogène soit inchangée, soit partiellement réduite, soit totalement. Ces souris seront nourries avec un régime riche en cholestérol, nécessaire au déclenchement de la maladie. Ce modèle d’athérosclérose est similaire au développement de la maladie chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Chez l’homme, l’athérosclérose est un facteur de risque majeur dans les maladies cardiovasculaires, qui est la première cause de mortalité. Les moyens thérapeutiques actuels ne permettent de réduire le risque cardiovasculaire que partiellement. Il est donc crucial de trouver de nouvelles de pistes thérapeutiques. Ce projet permettra de connaître davantage la composition en lipides des plaques, de comprendre les interactions complexes des plasmalogènes au niveau du système immunitaire sur le développement de la maladie, et de confirmer leur importance dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments permettraient une meilleure compréhension du développement de l’athérosclérose, et pourrait mettre en lumière de nouvelles pistes ou cibles thérapeutiques pour le développement d’éventuels traitements, qui restent à ce jour encore relativement limités.

Procédures

- Prise de sang (2 prélèvements ponctuels, de moins de 5 min chacun, espacés de 5 semaines) - Transport (1h, 1 aller-retour) - Irradiation (30 min) - Injection intraveineuse caudale unique et ponctuelle (greffe, 1 injection bolus,

Impact sur les animaux

De faibles douleurs, de courte durée, peuvent être occasionnées lors des prises de sang par voie caudale et de l’injection intra-veineuse. Un tube de contention sera utilisé pour l’injection intra-veineuse afin d’éviter tout mouvement indésirés de l’animal, minimiser le temps de contention et favoriser le bon déroulement de l’injection. Cette contention entraine une gêne provisoire de quelques minutes et peut être stressante pour l’animal. Les animaux seront manipulés de manière hebdomadaire pour effectuer les pesées. L’irradiation entraine les effets suivants : - Immunodépression : destruction des cellules de la moelle osseuse entrainant un risque infectieux augmenté. Cet effet disparaitra lorsque la prise de greffe de moëlle osseuse sera effective. Afin d’éviter les infections lors cette phase d’immunodépression transitoire, les souris recevront une antibiothérapie durant 4 semaines. Ce traitement peut entrainer certains effets secondaires propres à l’antibiotique (principalement des réactions allergiques, cependant rares). - Affaiblissement général se traduisant par une perte de poids et de la fatigue. - Atteintes intestinales : L'irradiation peut endommager les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, pouvant entrainer des troubles digestifs et une absorption réduite des nutriments (contrôlé par une pesée régulière). De nouveau cet effet est transitoire grâce au renouvellement naturel et constant des cellules épithéliales. - Altération de la peau et des poils : Grisonnement localisé des poils possible et ralentissement de la repousse. Le transport aller-retour vers la plateforme d’irradiation (moins de 20 minutes) est stressant pour les souris.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour la détermination des lésions. Les plaques dans les vaisseaux sanguins seront prélevées post-mortem pour en déterminer la composition. Les valves aortiques situées au niveau du cœur seront prélevées afin de déterminer l’étendues des plaques.

Remplacement

L’athérosclérose est une maladie complexe qui ne peut pas être mimée in vitro. Elle implique des interactions entre l’inflammation, les lipides, le cholestérol, le flux sanguin, mais également entre différents tissus comme le foie ou le tissu adipeux. Il est possible in vitro d’étudier ces différents acteurs impliqués dans cette maladie séparément, mais seule l’utilisation de modèles animaux présentant une athérosclérose proche de celle de l’Homme peut permettre de tenir compte de tous ces éléments ensembles, et ainsi permettre une meilleure compréhension globale de cette maladie. Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces.

Réduction

Un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires afin de pouvoir conclure à de réelles différences entre nos groupes, nous a permis de réduire le nombre d’animaux à 11 par groupe, ce chiffre correspondant au nombre minimum nécessaire pour avoir des données exploitables par la suite. Les différences attendues sont des différences dans la formation des plaques dans les vaisseaux sanguins ainsi que des paramètres qui lui sont associées. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel. Enfin les expériences seront répétées une deuxième fois afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus.

Raffinement

Le transport est stressant pour les souris. Tout sera fait pour limiter l’inconfort et le stress des animaux pendant cette étape (Enrichissement, gel diet, voiture climatisée). L’irradiation est quand-a-elle indolore. Les souris seront transférées dans de nouvelles cages propres à leur retour et un temps de repos de 2h minimum sera respecté pour limiter un stress trop important. Ce délai est nécessairement court puisque la greffe doit être rapidement effectuée. L’irradiation supprime le système immunitaire. 2 à 4 semaines sont nécessaire à la greffe pour fournir de nouveau un système immunitaire entièrement fonctionnel. Ceci sera pallié par 4 semaines d’antibiotiques, dilués dans l’eau de boisson et renouvelés quotidiennement, pour limiter le risque infectieux. Durant cette période, et pendant l’injection de la greffe, tout sera fait pour garder les souris dans un environnement propre et exempt de pathogènes. L’injection et les différentes prises de sang se feront après application d’un anesthésique local. Un tube de contention conçu pour restreindre le temps de confinement et le risque de mouvement indésirable de la souris pendant l’injection sera utilisé afin de réduire le temps de manipulation des souris. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque se fera sous anesthésie gazeuse, la souris sera maintenue à 37°C via un plateau chauffant le temps de la ponction, de la lidocaïne sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite euthanasié pour effectuer les différents prélèvements. Le milieu d’hébergement sera enrichi (objet pour se cacher, nid). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10. La mise sous régime riche en cholestérol entrainera la formation de plaque dans les vaisseaux sanguins des souris, celles-ci sont indolores et asymptomatiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, l’athérosclérose étant une maladie s’installant sur le temps et touchant la population adulte.

Un rat dont la température corporelle chute durablement sous 33,5 °C sort du protocole, et peut y être réintroduit après avoir été réchauffé. 580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolés en cage individuelle pendant 19 à 26 jours, ils subissent une prise de température rectale chaque jour, et 204 d'entre eux vivent à 4-6 °C jour et nuit durant deux à trois semaines, avec des frissons possibles les premiers jours. L'objectif est de comprendre comment le tissu adipeux brun produit de la chaleur. Le bénéfice reste au conditionnel, un système qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" contre l'obésité, alors que l'isolement touche tous les rats dès le premier jour.

Objectifs

La progression de l'obésité dans le monde est une préoccupation cruciale de la recherche médicale. L’une des stratégies envisagées pour lutter contre ce fléau consisterait à stimuler la thermogenèse, en particulier par le tissu adipeux brun et beige, qui ont la capacité de produire une grande quantité de chaleur à partir de la graisse qu’ils brûlent. La caractérisation des mécanismes de thermogenèse constitue donc une piste de recherche prometteuse pour la prévention et le traitement des maladies métaboliques. Le projet présenté ici permettra d'identifier précisément le rôle du système Créatine-Kinase / Phosphocréatine, dans le processus de production de chaleur par les tissus adipeux brun / beige et de déterminer si ce système pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans la lutte contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Le système Créatine-Kinase / Phosphocréatine (système CK / PCr) est connu depuis des années pour jouer un rôle majeur dans le transfert d’énergie (réserve et navette énergétique) au sein des cellules musculaires et nerveuses. Des travaux récents montrent une nouvelle fonction de ce système dans la thermorégulation par le tissu adipeux, et également dans la prévention des maladies métaboliques, Cependant, les mécanismes impliqués restent à être élucidés. Notre projet vise à caractériser pour la première fois le rôle du système CK / PCr dans la bioénergétique des tissus adipeux et de déterminer par quel(s) mécanisme(s) et à quelle ampleur, le système CK / PCr participe à la production de chaleur par les tissus adipeux brun/beige. Cette étude pourrait apporter une connaissance primordiale concernant la bioénergétique des tissus adipeux et conduire à de nouvelles approches thérapeutiques dans la prévention et le traitement des maladies métaboliques associées à l’obésité.

Procédures

Les 3 groupes d’animaux seront exposés aux différentes températures (respectivement à 4-6°C, 22-23°C ou 28°), 24h/24, 7J/7 durant 14 ou 21 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire), en armoire ventilée et en cage individuelle. La prise de température corporelle (sonde rectale) sera prise quotidiennement durant toute la période de stabulation (phase d’habituation de 5 jours avant le début de l’exposition aux différentes températures et pendant toute la durée de l’exposition jusqu’au jour de l’euthanasie de l’animal, soit durant 19 ou 26 jours (selon le protocole choisi lors de la série préliminaire). La prise de la température corporelle aura lieu 1 fois par jour pour tous les groupes, à l’exception des 5 premiers jours concernant les animaux du groupe exposé au froid (4-6°C), pour lesquels la température corporelle sera prise 2 fois par jour (début de matinée vers 9h et milieu d’après-midi vers 15h). Cette prise de température, qui nécessite une légère contention, ne dure pas plus d’une minute.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les rats seront hébergés en cage individuelle afin de pouvoir suivre précisément leur prise alimentaire. L'isolement constituera donc un inconfort pour l'ensemble des animaux. La seconde source d'inconfort sera liée à l'exposition au froid (4-6°C), 24h/24, durant 2-3 semaines. Elle concerne 204 animaux. Les études utilisant de tels protocoles d'exposition au froid, ne décrivent ni de chute drastique de la température corporelle, ni d'inconfort majeur. Après quelques jours d'acclimatation, durant lesquels les animaux peuvent frissonner et présenter une légère baisse de leur température corporelle, les animaux retrouvent une activité normale. L'inconfort lié à l'exposition au froid est d'autant moindre que, la température de thermoneutralité des rats étant autour de 28°C, lorsque ces derniers sont hébergés à 22°C, ils présentent déjà une certaine adaptation (présence marquée de tissu adipeux brun interscapulaire).

Devenir

A l'issue de l'unique procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui auraient éventuellement été exclus de la procédure seront également euthanasiés dès la sortie du protocole. Des tissus pourront éventuellement être prélevés après euthanasie et congelés en vue d’une utilisation ultérieure en TP pour des dosages biochimiques.

Remplacement

Au vu de sa complexité, le phénomène de brunissement induit naturellement en réponse à l'exposition au froid, ne peut pas être entièrement reproduit in vitro. En effet, les tissus adipeux sont constitués de cellules de différents types qui interagissent entre elles et il est difficile de reproduire cette hétérogénéité et ce dialogue in vitro. De plus, l’étude des modifications adaptatives des tissus adipeux en réponse au froid nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme, qui préserve la communication nerveuse et hormonale, entre les différents types de tissus adipeux d’une part, et entre ces tissus et les organes impliqués dans le métabolisme, comme le foie et le pancréas, d’autre part. L'exposition au froid de l'animal, constitue donc une approche indispensable à l'étude du phénomène de brunissement et aucun modèle alternatif ne peut remplacer le modèle animal. Cependant, en parallèle de ces travaux à l'échelle de l'animal, l'utilisation de modèles cellulaires issus de tissus adipeux humains permettra de voir si certains mécanismes observés sur les adipocytes de rat acclimatés au froid sont retrouvés/ transposables chez l'Homme.

Réduction

Le choix du modèle animal, le rat plutôt que la souris, permet de limiter le nombre d'animaux à utiliser. En effet, les tissus adipeux brun et beige sont des tissus peu abondants et certains des protocoles de l’étude nécessiteraient, chez la souris, de grouper les TAB provenant de 3 à 4 animaux pour une seule expérimentation. Chez le rat, 2 animaux seulement devraient suffire pour obtenir la même quantité d’informations. Par ailleurs, le choix d'une exposition prolongée au froid (2-3 semaines) afin d'obtenir une adaptation maximale de l’animal, permettra d’atteindre les objectifs de l’étude tout en limitant le nombre d’animaux nécessaire. Grâce à l'utilisation d'appareillage de précision, une précision maximale des mesures pourra être obtenue avec très peu de matériel biologique. Pour finir, le niveau de dispersion des données attendues a été pris en compte, afin de calculer le nombre d'animaux au plus juste sans risquer pour autant de compromettre l'interprétation statistique des résultats. De plus, si les données issues de la série préliminaire pour la condition choisie sont exploitables, elles pourront être intégrées à l'étude principale, ce qui réduira le nombre total d'animaux de 8 individus.

Raffinement

Un suivi attentif des animaux, par un personnel formé, sera opéré chaque jour durant la période de stabulation avant et pendant l'exposition aux températures étudiées, afin d'évaluer l'inconfort subi (isolement, effet de la température ambiante) et leurs éventuelles conséquences sur le bien-être animal. Des critères comportementaux visant à évaluer l'état général de l'animal et la mesure de variables physiologiques concrètes (masse corporelle, température rectale) de façon journalière et la prise de nourriture (2 fois par semaine) seront mis en place. Afin de limiter leur stress, les rats seront placés en armoire ventilée 5 jours avant le début de l'exposition au froid ou à la neutralité thermique). Ils seront en cage individuelle, mais ils pourront se voir et se sentir. Puis après 5 jours d'habituation aux conditions de stabulation en armoire ventilée, les rats seront exposés à la température étudiée (4-6°C ou 28°C). Durant la phase d'adaptation au froid, décrite pour durer quelques jours, une surveillance rapprochée (2 fois par jour) des animaux est prévue. Des points limites seront définis et permettront de mener des actions visant à réduire l'inconfort, pouvant aller jusqu'à la sortie du protocole si les signes de souffrance dépassent certaines limites fixées ou si la température corporelle chute durablement en dessous de 33,5°C. L'animal pourra être réchauffé et réintroduit ou pas dans le protocole selon sa récupération. Si l'acclimatation au froid s'avérait trop difficile, la mise en place d'un protocole d'exposition progressif au froid serait envisagée. Cela ne sera très probablement pas nécessaire car des études similaires ne décrivent pas d'inconfort majeur lié à l'exposition au froid. En effet, les rats, dont la neutralité thermique est autour de 28°C, présentent déjà une certaine adaptation de leur tissu adipeux brun au froid, lorsqu'ils sont hébergés à 22°C. Afin de limiter l'impact de l'isolement et du froid et d'améliorer le bien-être des animaux, leur milieu de vie sera enrichi durant toute la période de stabulation, et, notamment les 4 premiers jours d'exposition, par du matériel de nidation limitant l'impact du froid. En plus des expériences prévues dans le projet ANR (sur les tissus adipeux), il est prévu de prélever d'autres organes (foie, coeur, cerveau, muscle, vaisseaux sanguins) afin de recueillir un maximum de données sur les effets du froid et sur l'impact de la température de stabulation (22-23°C versus 28°C neutralité thermique).

Choix des espèces

La plupart des études sur les mécanismes de thermorégulation ont été menées sur les modèles rat ou souris. Plus récemment, le cycle futile de la créatine a été décrit chez la souris. Le choix de focaliser l'étude sur le modèle rat a été motivé principalement par le fait que la taille de l'animal étant supérieure, la quantité de tissu adipeux brun est considérablement plus importante et que par conséquent le nombre d'animaux nécessaire pour une même expérience pourra être réduit par rapport au modèle souris. Par ailleurs, le rat est considéré comme étant un modèle plus proche de l'humain, ce modèle est couramment utilisé et de nombreuses données existent. Les animaux mâles et femelles seront utilisés à l'âge jeune adulte, environ 8-10 semaines. Chez l'adulte tous les mécanismes de thermorégulation sont établis et l'influence hormonale est stabilisée.

Du chocolat administré au début de la phase de sommeil pour empêcher 90 souris de dormir, des électrodes qui détruisent au courant électrique les neurones du noyau suprachiasmatique : 674 souris et 284 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les interventions chirurgicales durent de trente minutes à une heure et se répètent, avec pose d'un cathéter dans la veine du cou, injections de virus dans le cerveau, tests de comportement et de sommeil à 3, 6 et 12 mois. Certains animaux passent deux semaines isolés pour mesurer la perturbation de leurs rythmes, dans des cages transparentes voisines qui leur permettent de voir leurs congénères. Le porteur retient souris et rats pour comparer deux physiologies, garde les animaux jusqu'à 18 mois après le début des expériences et n'en laisse survivre aucun, y compris dans les groupes témoins.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Un premier groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une deuxième chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après, soit au total 24 jours après le début des expériences afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un deuxième groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un premier sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un deuxième sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant (chocolat) au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un troisième groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un quatrième groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires, par l’injection d'une euthanasiant chimique.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont manipulés individuellement, et dans le calme, afin de limiter tout stress des animaux non manipulés. Ils seront également habitués à la manipulation. * Les manipulations (administrations et sacrifices) s'effectuent à distance des autres animaux. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible par anesthésie gazeuse. *Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle souffrance (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par un euthanasiant chimique. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations) Un stress momentané est possible suite aux manipulations mais celui-ci sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).

Tués à la fin des procédures pour vérifier l'emplacement des marqueurs dans leur cerveau, 576 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure trente, puis une tâche comportementale d'une heure par jour pendant trois mois, sous rationnement alimentaire maintenu pendant la même durée pour le garder à 90 ou 95 % de son poids. Le porteur qualifie l'impact de ce rationnement de très faible, une "légère sensation de faim" qui garantit la motivation à obtenir une récompense. L'objectif déclaré est de comprendre les circuits neuronaux de la décision entre choix familiers et choix nouveaux, et le porteur conclut que ces fonctions cognitives ne s'étudient que sur des "organismes entiers".

Objectifs

Tous les jours nous prenons des décisions qui peuvent être familières ou non. Les décisions familières sont celles qui ont déjà été prises auparavant et dont l’issue est prévisible. Au contraire, les décisions non familières sont celles auxquelles on n’a jamais fait face auparavant et pour lesquelles on a peu ou pas d’expérience. Lorsque l’on fait face à une décision non familière, il faut alors utiliser nos expériences de choix passées pour guider nos actions, par exemple on peut admettre une proposition en raison de son lien avec une proposition préalablement tenue pour vraie. Ainsi, lorsque l’on a déjà pris une décision dans laquelle A>B et C>D, on peut se référer à cette situation passée lorsque l’on fait face à une nouvelle décision non familière entre B et C. Le but de ce projet est de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent la prise de décision en particulier entre les situations de choix familières versus les choix nouveaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les processus de prise de décision. De nombreuses maladies neuropsychiatriques sont caractérisées par des déficits cognitifs et notamment des troubles de la prise de décision. Ainsi ce projet va permettre une meilleure connaissance fondamentale de ces processus cognitifs complexes mais également aider à mieux comprendre certains troubles neuropsychiatriques impliquant un déficit de prise de décision.

Procédures

Tous les animaux subiront une tâche comportementale de 1h max/jour pendant 3 mois maximum ainsi qu’un rationnement alimentaire léger pendant 3 mois maximum. Les animaux subiront une chirurgie cérébrale d’environ une heure trente.

Impact sur les animaux

Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire) mais peut entrainer du stress. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peuvent, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 3 jours pour s’assurer de la récupération complète des animaux. Des points limites généraux et spécifiques, des mesures conservatoires ainsi que des critères d’arrêt ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.