Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système urogénital
Influence du mercure sur le fonctionnement des mitochondries dans les cellules au cours du développement chez des oiseaux en milieu naturel
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Le cincle plongeur, prédateur d'invertébrés aquatiques qui concentre dans son organisme les polluants de la chaîne alimentaire, est l'espèce retenue pour mesurer l'effet du mercure sur les mitochondries d'oiseaux sauvages. 750 oisillons vont être utilisés sur trois années dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué. Deux jours après l'éclosion, la moitié des jeunes de chaque nid est transportée jusqu'à trente minutes vers un nid d'accueil situé sur un territoire plus ou moins contaminé, puis pesée, baguée et saignée aux jours 7 et 12. Le porteur reconnaît un risque de refroidissement pendant le transport, un effet possible de la prise de sang sur la fin de la croissance, un risque accru de prédation lié aux visites répétées et une dissémination de parasites entre nids. Les oisillons sont ensuite laissés dans le nid où ils se trouvent et rejoignent, s'ils survivent à l'envol, la population suivie depuis dix ans.
Objectifs
Les rivières sont des milieux sensibles à la pollution chimique car le ruissellement y concentre les polluants libérés dans l’environnement. Pourtant l’impact de la pollution sur les organismes vivant dans les rivières reste mal compris. Chez les eucaryotes (c'est-à-dire les organismes dont les cellules possèdent des noyaux), les mitochondries sont responsables de la production d’énergie à l'intérieur des cellules pour les fonctions vitales des organismes. Le fonctionnement des mitochondries devrait donc jouer un rôle majeur dans la capacité des organismes à faire face aux sources de stress dans l'environnement. Les études de toxicologie sur des cellules en culture et des animaux de laboratoire ont clairement montré que de nombreux polluants perturbent le fonctionnement des mitochondries. Pourtant, l’impact des polluants sur les mitochondries dans les populations naturelles reste quasiment inexploré, et les conséquences de cet impact sur la croissance, la reproduction et la survie des organismes sont très mal connues chez les vertébrés sauvages. Le projet a pour objectif de mesurer l'impact du mercure sur le fonctionnement des mitochondries lors de la croissance des jeunes chez une espèce d'oiseau vivant dans les rivières. On se focalisera ici sur le mercure car il s’agit d’un polluant dont les effets sur les mitochondries ont été clairement montrés en laboratoire. Dans les populations naturelles d’oiseaux, le mercure est associé à une survie et/ou une reproduction diminuées, mais on ne sait pas quel est le rôle des mitochondries dans cette diminution. Ici, on cherche à comprendre si c'est le niveau de mercure dans l'environnement auquel les oisillons sont exposés avant ou après l'éclosion (c'est-à-dire durant la formation des oeufs et l'incubation ou durant la croissance au nid) qui influence le plus le fonctionnement des mitochondries. Dans une population suivie depuis 10 ans et où les niveaux de mercure ont été mesurés au préalable à l’échelle de chaque territoire, on réalisera des adoptions croisées partielles d'oisillons juste après l’éclosion entre nids situés dans des territoires à forte et faible concentration de mercure. La croissance de ces jeunes et le fonctionnement de leurs mitochondries seront ensuite mesurés jusqu'à l'envol.
Bénéfices attendus
Le projet vise tout d’abord à apporter des connaissances fondamentales sur l’impact de la pollution sur les organismes en milieu naturel, donc en présence d’autres sources de stress potentielles (parasitisme, prédation, manque de nourriture, etc.), qui peuvent fortement changer les conclusions d’études réalisées in vitro ou en captivité. Pour ce faire, on s’intéresse à des paramètres fondamentaux du fonctionnement des cellules, ici la respiration mitochondriale. Cette étude nous permettra donc de mieux comprendre comment le fonctionnement des mitochondries peut influencer la capacité des animaux à adapter leur métabolisme aux changements environnementaux, et plus spécifiquement quel est l’impact de la pollution au mercure sur le fonctionnement des mitochondries dans la nature ; le projet nous informera aussi sur les conséquences de cet impact sur la croissance, la reproduction et la survie des oiseaux sauvages. Les réponses à ces questions sont essentielles à la fois pour les biologistes évolutifs, pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent les adaptations des oiseaux aux variations de l'environnement, et pour les biologistes de la conservation, pour comprendre ce qui rend certains individus, populations ou espèces plus vulnérables que d'autres à la pollution. De façon plus appliquée, le projet apportera également des informations clé pour comprendre l’impact de la pollution au mercure sur un organisme vivant dans les rivières dans la zone d’étude, et ces informations seront mises à disposition des partenaires institutionnels et associatifs locaux, leur permettant de cibler potentiellement des actions de restauration de la qualité de l’eau face à diverses sources de pollution. De telles actions sont en effet souvent d’une efficacité limitée à cause du manque d’information sur les concentrations de ces polluants à une échelle spatiale fine et sur leurs effets biologiques. L'enjeu de ces restaurations est à la fois environnemental mais aussi sanitaire, car les activités humaines liées à l'eau sont nombreuses dans la zone d’étude (pêche, sports d'eau, baignade...).
Procédures
Les individus inclus dans l’expérience seront soumis à trois interventions, uniques pour chaque animal et d’une durée limitée : 1 - au jour 2 après l'éclosion, la moitié des jeunes expérimentaux de chaque nid sera transportée entre le nid d’origine et le nid d’accueil ; ce transport est réalisé une seule fois, pour une durée de 30 min maximum pour chaque individu déplacé ; 2 - au jour 7 après l'éclosion, les jeunes de chaque nid expérimental seront pesés, bagués et subiront une prise de sang très limitée (sur animaux vigiles) ; cette opération dure environ 10 à 15 minutes pour l’ensemble de la nichée, et elle est incluse dans le suivi à long terme de la population ; 3 -au jour 12 après l'éclosion, les jeunes de chaque nid expérimental seront à nouveau pesés, puis mesurés et une prise de sang sera effectuée pour les analyses du fonctionnement des mitochondries (sur animaux vigiles) ; cette opération dure environ 15 à 20 minutes pour l’ensemble de la nichée. Le dérangement induit par chaque visite au nid reste très limité dans le temps et ne devrait conduire à aucune désertion comme constaté dans le cadre du suivi à long terme de la population au cours duquel les nids sont visités régulièrement aux mêmes stades.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels sur les individus expérimentaux sont : 1 - un risque de refroidissement et/ou manque de nourriture pendant le transport des jeunes entre nids ; 2 - un impact négatif de la prise de sang sur la fin de croissance des jeunes ; 3 - une augmentation du risque de prédation du fait de visites supplémentaires aux nids ; 4 - une dissémination accrue des pathogènes ou parasites entre nids. Le risque d’abandon des nids pendant la phase de manipulation devrait rester nul car les nids ne sont jamais laissés vides au cours des échanges, gardant toujours au moins la moitié des poussins à tout moment. Une diminution du nombre de jeunes au nid peut arriver naturellement (mortalité pendant la croissance) et n’entraîne pas de désertion directe ; ici elle restera très courte. Au cours du suivi à long terme de la population, les nids sont régulièrement visités (pour compter les œufs, vérifier les éclosions, baguer les jeunes, etc.), et les jeunes retirés du nid temporairement pour être pesés. Or ces dérangements n’ont jamais occasionné de désertion directe évidente au cours des 10 années passées du suivi. Le risque d’abandon (ou infanticide) des jeunes suite à l'adoption devrait également rester nul car chez ces espèces de passereaux, les adultes ne reconnaissent pas leurs jeunes et ne sont pas sensibles aux odeurs que les humains peuvent laisser sur eux (nous manipulons régulièrement les jeunes pour le baguage et les mesures sans aucun abandon après le retour au nid ; l’odorat chez ces espèces est extrêmement peu développé). Des expériences d’adoption croisées sont réalisées de façon très fréquente depuis des dizaines d’années chez de multiples espèces d’oiseaux cavicoles, sans augmentation documentée de la mortalité des jeunes. La personne responsable du projet a elle-même conduit par le passé plusieurs expériences d’adoptions croisées chez d'autres espèces, lui conférant une grande expérience dans leur réalisation pratique et les précautions à respecter. Aucun effet à long terme de ces échanges de jeunes n’est attendu non plus sur la composition génétique de la population, puisque les mouvements de dispersion des individus ont déjà lieu naturellement entre rivières dans la zone d’étude et avec les rivières aux alentours.
Devenir
Le projet vise à obtenir des données sur l’impact de l’exposition au mercure au cours de la croissance, et s’inscrit dans le cadre du suivi à long terme de la population étudiée. Ainsi, une fois le suivi de croissance des jeunes expérimentaux réalisé, les oiseaux sont laissés dans les nids où ils se trouvent et entreront ensuite dans la population d’étude s'ils survivent après l'envol jusqu’à l'âge adulte. Ils seront alors suivis é long terme, de la même façon que les individus non expérimentaux les années suivantes.
Remplacement
L’objectif du projet est de décrire les effets de l’exposition chronique des oiseaux au mercure et ses interactions éventuelles avec d’autres sources de stress en situation naturelle sur des paramètres physiologiques fondamentaux (fonctionnement mitochondrial). Il repose donc par essence sur la possibilité de prendre les mesures sur ces oiseaux en nature. Il n’est donc pas possible de remplacer les animaux utilisés par d’autres types de modèles.
Réduction
Pour réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérience au strict minimum, nous réaliserons des adoptions croisées partielles entre paires de nids, avec dans chaque nid expérimental une partie (la moitié) des jeunes originaires du nid en question et une partie venant de l'autre nid (jeunes adoptés). La comparaison des jeunes issus de nids différents mais élevés dans les mêmes conditions ou du même nid mais élevés dans des conditions différentes permet de tenir compte des autres effets à côté de l’exposition au mercure, comme la date dans la saison, le nombre de jeunes dans le nid, l'âge des parents, etc. Ce protocole permet ainsi de séparer les différents effets en minimisant le nombre de jeunes impliqués dans l'expérience. En 2024, nous avons pu mesurer les caractéristiques mitochondriales sur environ 100 jeunes au cours de leur croissance dans leur nid d’origine, c’est-à-dire hors expérience. Ces données préliminaires nous donnent un ordre de grandeur de l'effet attendu du mercure a priori et ainsi permettent de calibrer le nombre de jeunes nécessaire. Les résultats obtenus sur ces premières mesures donnent une différence entre territoires les plus et les moins exposés au mercure d’environ 7 %. Sur la base d’une telle différence, le nombre de jeunes à considérer dans l'expérience serait compris entre 450 et 750 jeunes au total. Sachant qu’en moyenne chaque nid expérimental contient 4 à 5 poussins, cela correspond à environ 90 à 180 nids expérimentaux. Des échanges entre 30 paires de nids, soit environ 240 à 250 jeunes, sont prévus sur une année. Cependant, parmi ces paires de nids possibles, les différences de niveaux de mercure seront plus ou moins fortes. Donc l’expérience est prévue sur 3 années, pour un total de 180 nids, soit autour de 750 jeunes, ce qui permettra d'avoir suffisamment de jeunes issus de territoires avec des niveaux d'exposition au mercure variables pour détecter leurs effets. La 3e année d’expérience ne sera réalisée que si le nombre de jeunes qui auront effectivement pu être échangés les 2 premières années n’est pas suffisant ; des analyses statistiques sur les données collectées les 2 premières années testeront si des effets peuvent être détectés, et si c'est le cas, l’expérience ne sera pas reconduite la 3e année.
Raffinement
Le projet vise à mesurer et comprendre l’impact de l’exposition au mercure sur des paramètres physiologiques fondamentaux en population naturelle. Pour ce faire, nous utiliserons la variabilité naturelle de l’exposition au mercure entre les différents territoires sur des rivières aux niveaux d’industrialisation passée différents, pour comparer des jeunes soumis à des concentrations de mercure différentes sans avoir à manipuler directement les doses de mercure. Les procédures expérimentales utilisées pendant la manipulation des oiseaux visent à réduire les impacts négatifs potentiels sur les individus : 1 - on utilisera des chaufferettes pour garder les jeunes au chaud pendant le transport ; ces chaufferettes sont déjà utilisées en routine lors du suivi à long terme de la population, en particulier lorsque la température extérieure est basse ; 2 - on nettoiera et désinfectera le matériel utilisé pendant le transport après chaque échange pour limiter la contamination par des parasites ou maladies entre nids ; 3 - on limitera le temps de transport des poussins entre nids à 30 min maximum, ce qui correspond à des temps de pause de nourrissage qui peuvent être observés naturellement. Si le temps de transport dépasse cette durée car il n’y a pas de nids à proximité l’un de l’autre qui peuvent être appariés, nous prévoirons un nourrissage artificiel pendant le transport en utilisant de la nourriture spécifique pour l’élevage d’oiseaux insectivores, enrichie en protéines et vitamines (pâtée d’élevage) ; 4 - on limitera la quantité de sang prélevée lors des mesures à une quantité largement (6 fois) inférieure au maximum préconisé, ce qui a déjà été réalisé sans effet négatif notable sur la survie jusqu’à l’envol ; 5 - on bloquera l’entrée des nids pendant le temps de manipulation des poussins à prélever pour empêcher les parents de trouver le nid vide ce qui pourrait entraîner une désertion ; 6 - on portera une attention particulière pendant l’approche des nids à ne pas toucher les supports (rochers, murs) autour afin d’éviter de laisser des traces odorantes qui pourraient attirer des prédateurs mammifères. Enfin on restera particulièrement vigilant aux procédures mises en oeuvre pour éviter tout impact négatif non prévu qui apparaîtrait, par exemple sur la survie des jeunes, et ajuster les opérations et manipulations afin de les éviter (temps de déplacement plus court, réduction de la durée des manipulations si besoin, etc.).
Choix des espèces
Le cincle plongeur a été choisi comme espèce d'étude pour 4 raisons principales : (1) comme il s'agit d'un prédateur d'invertébrés aquatiques, il concentre les polluants qui transitent le long de la chaîne alimentaire dans son organisme, ce qui permet de les quantifier et de détecter leur impact sur le comportement, la survie, la reproduction dans une population naturelle ; (2) dans la zone d'étude, les rivières sont fortement variables dans les niveaux et type de pollution, en particulier des concentrations de mercure, permettant là encore de détecter des effets de ces polluants et de quantifier leur variation ; (3) la zone d'étude présente une densité de cincles élevée ce qui permet d'assurer suffisamment de nids expérimentaux pour obtenir une puissance statistique satisfaisante ; (4) enfin, bien que le cincle soit une espèce protégée, son statut de conservation en France est « préoccupation mineure » c’est-à-dire le statut le plus favorable (avec des populations stables). L’objectif du projet est de décrire les effets de l’exposition chronique au mercure sur des paramètres physiologiques fondamentaux (fonctionnement mitochondrial) chez des oiseaux en population naturelle au cours de la croissance. Les oiseaux inclus dans l’expérience seront donc des jeunes au nid, entre le jour 2 après l’éclosion (échanges partiels) et le jour 12 (mesures et prise de sang), les jeunes quittant le nid vers le jour 21 ou 22.
Validation de molécules anti diabétique par voie orale chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Gavage quotidien pendant jusqu'à 84 jours, jusqu'à 84 mesures de glycémie par piqûre du bout de la queue, jusqu'à 84 injections d'insuline et jusqu'à 14 prélèvements sanguins : 690 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par une injection pharmacologique, et tous sont tués en fin d'étude après un prélèvement de sang total sous anesthésie. Le porteur liste parmi les effets attendus l'infection et la nécrose de l'extrémité de la queue, liées à la répétition quotidienne des mesures de glycémie et des prises de sang. Les molécules antidiabétiques orales évaluées ne sont désignées que comme des molécules d'intérêt, sans indication de leur nature ni du nombre de composés testés.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique grave qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (hormone hypoglycémiante), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit. De nombreux traitement des patients diabétiques consistent en des injections par voie sous-cutanée, douloureuses et inconfortables (Insuline etc…). Ces traitements sont la plupart du temps combiné à des traitements oraux tel que la metformine afin d’avoir des résultats plus ou moins efficace selon les patients. Enfin ces traitements actuels sont souvent associés à des effets secondaires indésirable. L’objectif du projet est de développer et valider de nouvelles molécules orales pour le traitement du diabète. Le projet se déroulera pour chaque molécule d’intérêt en 2 phases : - Validation de la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt sur un modèle de rat sain - Si nous validons la biodisponibilité de nos molécules d’intérêt, une étude de bio efficacité serra réalisé sur un modèle de rat diabétique.
Bénéfices attendus
Les médicaments oraux sont souvent perçus comme plus pratiques et moins contraignants à prendre que les injections. Cela améliore ainsi la compliance des patients ce qui est un point fondamentale pour une prise en charge efficace et optimale du patient vivant avec un diabète. De plus, les médicaments oraux sont plus faciles à stocker, à transporter et à administrer dans de nombreux contextes, y compris dans des environnements ruraux ou éloignés où l'accès à des soins médicaux spécialisés peut être limité. Enfin, l’un des bénéfices important que le projet apportera sera la découverte de nouvelles molécules efficaces présentant peu ou pas d’effet secondaire chez le patient atteint de diabète.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Des molécules seront administrés aux rats (sains ou diabétiques) par voie orale (gavage 1 fois par jour sur maximum 84 jours, acte de 30 secondes par rat).Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre à l'aide d'une micro goutte de sang obtenue par piqûre de l'extrémité de la queue (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de nos molécules (84 fois/animal maximum). De plus, les animaux diabétiques recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après traitement (durée quelques secondes). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement, au maximum 14 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (1 minute par prélèvement). En fin de procédure, le sang totale des rats sera prélevé sous anesthésie, analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : • Peur de courte durée en lien avec le gavage quotidien et les prises de sang au cours du suivi. • Douleur légère de courte durée de l’incision de la pointe de la queue pour le prélèvement sanguin. • Détérioration (infection ; nécrose) de l’extrémité de la queue en lien avec les mesures glycémiques quotidienne et les prises de sang • Saignement post incision de la queue • Douleur légère de courte durée en lien avec l’injection d'une molécule induisant le diabète • Perte de poids en lien avec l’induction du diabète • Hyperglycémie en lien avec le développement du diabète au cours de l’étude • Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (mesure de glycémie, gavage, prise de sang).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons évaluer l’efficacité de nos traitement oraux dans le cadre du diabète. Or, Il est largement démontré aujourd’hui que la régulation glycémique et la physiopathologie du diabète font intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, pour valider l’efficacité de notre traitement anti diabétique, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à les cellule insuline isolée, mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent (pancréas, foie muscle….). Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux total nécessaire pour obtenir des résultats statistiques a été déterminé en utilisant un logiciel adapté. De plus, que ce soit avant les tests sur l’animal (étude in vitro de toxicité…) et après l’étude de bio disponibilité (PE1), le nombre de groupes (et donc le nombre total d’animaux) sera réévalué afin de ne tester que les concentrations présentant un intérêt thérapeutique. Par conséquent au maximum cette étude nécessitera 690 rats. Enfin, la réalisation de ces procédures par du personnel formé et habitué à ces manipulations, et la standardisation du protocole, garantiront une bonne reproductibilité et une réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de réduire au maximum le stress, les rats seront maintenus en groupe sociaux tout en respectant la règlementation en vigueur concernant le nombre de rat par cage. Le raffinement intervient également au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Afin de limiter au maximum le stress lors du suivi, une habituation à la manipulation et au gavage est réalisée 2x/semaine pendant la période de quarantaine. Le bien-être des animaux sera pris en compte durant l’ensemble de l’étude avec un suivi journalier de ceux-ci avec une surveillance accrue après administration oral de nos molécules. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. Les animaux diabétiques recevront une insulinothérapie en fonction de leur glycémie. Les posologies appliquées seront celles couramment utilisée au laboratoire et validée par notre vétérinaire référent. Le cas échant, la cétonémie sera mesurée afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Enfin, les prélèvements terminaux sont réalisés sous anesthésie et analgésie profonde.
Choix des espèces
Le rat est la principale espèce utilisée dans les études sur le diabète car les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, notre laboratoire possède une grande expertise sur la sensibilité à la molécule induisant le diabète chez le rat, du pourcentage de réussite d’induction du diabète et son suivi. Enfin, le volume de sang pouvant être récolté nous permet de réaliser l’ensemble de nos dosages biologiques/biochimiques. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. C’est à ce poids que le protocole d’induction du diabète présente le meilleur taux de succès avec un risque de mortalité faible.
Etude pharmacologique de vecteurs médicaments après implantation et administration intrathécale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par injection létale pour le prélèvement du sang, des tissus et des organes. Chacune est tondue, opérée sous anesthésie gazeuse pour l'implantation d'un dispositif, puis subit une douleur que le porteur qualifie lui-même de significative pendant les vingt-quatre premières heures, des réouvertures de cicatrice pour l'administration des molécules et jusqu'à quatre micro-incisions du bout de la queue par semaine pour les prises de sang. L'objet est de comparer, pour une société développant des vecteurs qui acheminent des médicaments vers le système nerveux central, une perfusion intrathécale de vingt-quatre heures à une injection unique. Le porteur écrit que le recours à l'animal est "indispensable" faute de modèle prédictif, et que ce même recours constitue "le principal désavantage" de sa demande.
Objectifs
Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration intraveineuse ou sous-cutanée. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a également permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou encore chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations galéniques, Il s’agira de contourner les problématiques de demi-vie sanguine (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de systèmes implantatoires à délivrances prolongées et maîtrisées. Nous pourrons ainsi proposer de meilleurs pharmacologies, optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces. Dans ce projet nous chercherons donc à démontrer au niveau intrathécale (c'est à dire dans le liquide méningé de la Moelle épinière et du cerveau) les effets bénéfiques d'une infusion sur 24 heures de nos molécules par rapport à une simple injection standard. A terme, une fois le schéma validé, nous chercherons à réduire les doses, tout en gardant la même efficacité pharmacologique.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher de meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces. De plus, en proposant une administration en intrathécale, nous chercherons à mettre en place une voie d’administration directement transposable à l’homme, voie qui est de plus en plus utilisée pour le développement de traitements contre les neuropathies, notamment par l’administration de molécules complexes ou qui ne passent pas bien la Barrière Hématoencéphalique du cerveau.
Procédures
-Tonte des animaux : Sur animal anesthésié, une seule fois (durée 30 secondes). -Injection anti-douleur pré-opératoire : Sur animal vigile, une fois, durée quelques secondes sur animal éveillé (10 secondes). -Chirurgie implantatoire : Sous Anesthésie gazeuse, une seule fois (Induction anesthésie 3 minutes, stabilisation et maintien 15 minutes). - Réveil : Avant réveil, injection d’un antidouleur (Une fois, quelques secondes). -Suivi post-opératoire : Sur animal vigile, injection d’un antidouleur longue durée (minimum 3 fois), une toutes les 24h pendant 72h (ou plus si besoin), (Durée injection quelques secondes). - Administration des molécules : Sur animal anesthésié, en une seule fois (durée bolus ou pose pompe ALZET 30 secondes). - Prélèvements sanguins intermédiaires : Sur animaux vigiles (≤2min), une seule fois/24h et maximum 4 fois/semaine. - Mise à mort (Point final étude) : Sur animal vigile, administration rapide d’une dose létale anesthésique (quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées. -TRANSPORT ET ADAPTATION : Sources stress et angoisse non négligeable due au transport -TONTE : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et lors du réveil, mais pas de douleur. - ANTALGIE PRE-OPERATOIRE : Stress et angoisse notables (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - CHIRURGIE IMPLANTATOIRE : Rapide stress et présence d’angoisse (quelques secondes) le temps d’induction à l’anesthésie, douleur significative lors de la chirurgie, se poursuivant après le réveil. - SUIVI POST-OPERATOIRE : Douleur significative les 24 premières heures. Stress et angoisse non négligeables à l’administration de l’anti-douleur (30 secondes) lors de la contention manuelle, et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - ADMINISTRATIONS DES MOLECULES : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et douleur non significative à la réouverture de la cicatrice au niveau cutanée. Douleur notable au réveil et lors de l’injection de l’anti-douleur (pénétration aiguille à travers la peau). - PRELEVEMENTS SANGUINS INTERMEDIAIRES : Stress et angoisse transitoire lors de la mise en contention (≤10 secondes), puis douleur notable lors de la micro-incision de l’extrémité de la queue pour réaliser le prélèvement sanguin (quelques secondes). - MISE A MORT (en fin d’incubation) : Léger stress (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur notable (légère et rapide) lors de l’injection par la pénétration cutanée de l’aiguille.
Devenir
Dans les deux procédures de cette demande, les animaux seront tous mis à mort en point final de l'étude afin de collecter en post-mortem le sang total, les tissus et organes d’intérêts.
Remplacement
Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués et validés sur des études in vitro (sur cellules) et in vivo sur de récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cibles, mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pour de l’infusion médicamenteuse au niveau intrathécale, nous devrons absolument envisager de réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel, tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.
Réduction
La totalité des animaux (n=512) sera implantée en début de chaque procédure, soit pour une administration par bolus ou par une infusion longue durée (autonome). Réalisation de groupes de n=4 individus par test (1 cage de 2 mâles/1 cage de 2 femelles), à raison de 4 tests par étude et 4 études par an, ce qui représente 64 individus/an et par procédure. Ce qui représente pour la voie bolus, 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans et pour l’infusion, également 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans. Par soucis de comparaisons à l’historique des différentes pharmacocinétiques, nous poursuivrons nos expérimentations sur la même lignée de souris. Ce modèle sera également utilisé par la suite, pour humaniser la cible, en vue d’une transposition de nos tests à l’Homme. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le « n=4 » sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée des tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. 2 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une autre pièce également cyclée (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en carton et bandelettes de carton). Les opérations chirurgicales, implantations et administrations bolus se feront sur animaux anesthésiés, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se poursuivra une fois l’animal éveillé, au cours de sa stabulation post-implantation. Les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (ici souris), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) avec une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge correspond à un poids moyen de 27-30g environ. Cet âge s’avère particulièrement intéressant en termes pratique, économique et risques de toxicité par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risque immunogène).
Détection par imagerie médicale de la fibrose cardiaque dans un modèle d’infarctus du myocarde chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectés sous la peau, intubés jusqu'à trente minutes, puis opérés du thorax pour reproduire un infarctus du myocarde, 180 rats de huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent trois à cinq anesthésies générales d'une heure pour les séances d'imagerie, deux à quatre injections intraveineuses et une injection intrapéritonéale par animal. Le porteur indique que l'opération peut induire une insuffisance cardiaque, une perte de poids et un affaiblissement, et que les examens d'imagerie génèrent eux aussi du stress. Tous sont tués à l'issue pour que leurs tissus soient analysés ex vivo.
Objectifs
Après la phase aiguë d'un infarctus du myocarde, un processus de réparation et de formation de tissu cicatriciel, appelé fibrose, est déclenché pour combler la région endommagée et éviter la rupture du coeur. Cependant la fibrose peut se développer au delà de la zone atteinte par l'infarctus, entraînant une diminution de la force contractile du coeur et conduire à de l'insuffisance cardiaque, source de morbidité et de mortalité. La détection le plus précocement possible de la fibrose, sa localisation et sa quantification précise sont donc essentielles dans la prise en charge des patients post infarctus. Le but de ce projet est la détection précoce par imagerie médicale non invasive de la fibrose cardiaque dans l'infarctus chez le rat.
Bénéfices attendus
Les méthodes testées dans ce projet pourraient émerger comme outils de diagnostique précoce pour le suivi de la fibrose cardiaque et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans l'infarctus du myocarde, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques.
Procédures
Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée (
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent être attendus suite aux actes chirurgicaux, telle qu’une douleur modérée et de courte durée liée à l’opération et aux points de suture, bien que ces actes soient menés sous anesthésie générale gazeuse. Suite à l'opération, une insuffisance cardiaque peut être induite et entrainer des effets indésirables comme par exemple une perte de poids et un affaiblissement de l’animal. Au cours des injections intraveineuses, intrapéritonéales et sous cutanées les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort lors de la manipulation et une douleur légère et de courte durée au niveau du lieu d’injection. Un stress peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale, qui nécessitent manipulation et anesthésie.
Devenir
A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasives de détection et de quantification du développement de la fibrose cardiaque suite à un infarctus. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, dont certains issues de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre maximal d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par des méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec les expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels des résultats statistiquement significatifs et reproductibles ont pu être obtenus. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié (zootechniciens et expérimentateurs) avec une surveillance post-opératoire accrue et la mise en place de points limites adaptés permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection d’antalgiques et par une mise à mort anticipée dans le cas d’atteinte de plusieurs points limites. L'ensemble des chirurgies de ce projet seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie pré- et post-opératoire. Les méthodes d'imagerie utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le rongeur qui est le modèle le plus courant pour les études de l’ischémie du myocarde. Le rat a été choisi pour la comparaison des études en scintigraphie de la littérature. De plus, la taille du rat et son rythme cardiaque plus lent par rapport à la souris facilitent le succès des études en imagerie cardiaque non invasive. Les infarctus du myorcade affectent principalement les êtres humains à l'âge adulte. Des rats de 8 semaines seront utilisés car c’est l’âge ou les animaux sont de jeunes adultes ayant atteint la maturité.
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 1/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Transportées entre deux établissements utilisateurs selon une charte de transport, 4 200 souris vont être utilisées dans ce projet sur la production de chaleur par le tissu adipeux brun. 3 520 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 440 un niveau léger et 240 un niveau sévère, aucune n'étant réutilisée et toutes étant tuées pour le prélèvement des dépôts adipeux, du foie, des muscles, du pancréas, du cœur et des reins. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, des chirurgies, un isolement pouvant durer cinq jours et des hébergements à 4 °C ou 30 °C, l'exposition aiguë au froid pouvant provoquer une hypothermie sévère. Le porteur indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer les animaux pour une partie des questions posées, et conclut que les échanges entre le cœur et le tissu adipeux brun rendent le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Décryptage des changements de transmission astrocytaire sur les neurones induits par l’ocytocine dans l’amygdale centrale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cinq chocs électriques de 0,6 milliampère en dix minutes : c'est le protocole de stress aigu appliqué à une partie des souris de ce projet sur les mécanismes cérébraux du trouble de stress post-traumatique. 1 100 souris au total vont être utilisées, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, chacune subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau et, pour certaines, une biopsie de queue vers le sixième jour après la naissance. Le porteur annonce vouloir modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale sur simulateur informatique pour diminuer à l'avenir le nombre d'animaux utilisés, sans que cette perspective n'entame les 1 100 souris engagées ici. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé ex vivo.
Objectifs
Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle." (INSERM). Ces troubles surviennent suivant des épisodes de peur intense, où le souvenir de cet évènement est ensuite revécu par la personne. Ainsi, les TSPT ont pour cause le souvenir anormalement fort de l'événement traumatisant. Leur encodage nait de l'interaction de plusieurs régions cérébrales, parmi lesquelles l'amygdale centrale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Nous nous intéressons tout particulièrement à un type de cellulaire : les astrocytes. Ces cellules ont pour rôle principale d’assurer le bon fonctionnement des neurones à proximité, fonction dont dépend leur morphologie. Aujourd’hui, il est établi que l’ocytocine (OT) via son récepteur (OTR) présent sur les astrocytes de l’amygdale centrale permet la modulation de la réponse émotionnelle lors d’une anxiété, d’une peur ou d’un stress aigu. Ce projet vise à comprendre comment l’OTR, via les astrocytes, module l’activité neuronale. Pour cela, nous couplerons pharmacologie et pharmacogénétique à des enregistrements d’activité des neurones et d’imagerie de fluorescence des astrocytes. Cette étude apportera de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, via une meilleure compréhension des interactions neurone-astrocyte.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place notamment l’impact de la gliotransmission sur le réseau neuronale au cours d’un stress aigu ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.
Procédures
La totalité des souris subiront une procédure chirurgicale d'injection cerebrale et une chirurgie terminale pour perfusion avec prélèvement sur animal anesthésié. Certains animaux subiront une biopsie de queue sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Enfin, des souris subiront en plus un protocole de stress pendant 10min.
Impact sur les animaux
Pour les expériences sans protocole de stress, la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter les anesthésiques. Les injections virales peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision ainsi qu’une perte de poids sont attendues après l'opération. Le protocole de stress aigu est un protocole qui provoque un stress, une angoisse ainsi qu'une douleur courte et transitoire ne pouvant être evités etant l'essence même de notre étude.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo.
Remplacement
Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Lors de notre étude, nous allons modéliser les réseaux neuronaux avec les astrocytes au niveau de notre structure nous permettant à l'avenir de diminuer le nombre d'animaux utilisés
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages enrichies. Les souris seront observées quotidiennement (aspect du pelage, mobilité, absence de prostration). Une attention particulière sera portée aux signes de stress, qui sera limité au maximum par une manipulation des animaux au moyen d’un tunnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux tout au long de la chirurgie. Un gel hydratatnt sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, de la nourriture hydratée et des croquettes seront déposés dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites précoces et spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le protocole de stress, des tests préalables ont déjà été réalisés dans nos études précédentes sur : 1) le nombre de choc (5) et 2) la l'intensité de ces derniers (0,6mA) qui correspondent à la bibliographie du domaine.
Choix des espèces
Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. De plus, nos différentes procédures ont besoin de modèles génétiquement modifiés qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.
Impact des acides biliaires sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, le métabolisme, l’immunité anti-tumorale et la réponse aux immunothérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux séances d'irradiation locale du thymus, des injections pratiquées directement dans le thymus ou les ganglions mésentériques après incision de la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries : 9 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour le prélèvement de la tumeur, du foie, des intestins, des ganglions, de la rate et du thymus, le porteur indiquant vouloir obtenir le maximum de prélèvements au cours d'une seule expérimentation. L'équipe veut savoir si des acides biliaires administrés par voie orale rétablissent l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez des patients dont le microbiote a été déséquilibré par des antibiotiques. Elle justifie la souris par des lignées tumorales murines dont l'implantation serait "indispensable" pour étudier l'immunité antitumorale sur un animal vivant et entier.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur. De plus, nous avons montré que les antibiotiques diminuaient le nombre de cellules du thymus (organe d'activation des cellules immunitaires) et que les récepteurs aux acides biliaires étaient exprimés dans cet organe. Nous nous demandons donc si les acides biliaires pourraient restaurer la formation de thymocytes et ainsi améliorer la réponse aux immunothérapies chez les patients.
Bénéfices attendus
Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs sous anesthésie locale (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute). Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois :utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire ou intrathymique. Certains animaux auront un prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min). Le thymus des souris sera irradié 2 fois localement (durée 7 minutes et 40 secondes), à 5 jours d'intervalle. Certains animaux recevront des injections dans les ganglions mésentériques ou dans le thymus : durée maximale 5 minutes sous analgésie et anesthésie générale, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne mécanique modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau. L'irradiation locale n'entraîne aucune conséquence pour les animaux dans les conditions où elles sont hébergées. Les injections dans les ganglions ou le thymus entraîneront une douleur légère et transitoire au réveil due à la plaie occasionnée par la section de la peau pour donner accès à ces tissus.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, thymus ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Un médicament analgésique sera administré en cas de douleur. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.
Evaluation du devenir de la voie cortico-réticulo-spinale dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une ou deux chirurgies d'une heure chacune, espacées de deux semaines, pour injecter des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées, lors d'une chirurgie terminale ou plus tôt lorsque leur génotype ne convient pas. 440 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, une biopsie d'oreille sur animal éveillé servant au génotypage des lignées transgéniques. Le projet cherche à savoir si des neurones de la formation réticulée compensent la perte des neurones moteurs dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur justifie la souris par la disponibilité de plusieurs lignées mutantes et par le fait que la multiplication des modèles est, écrit-il, désormais requise pour convaincre la communauté scientifique.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. La SLA découle de la mort de neurones impliqués dans le contrôle des muscles et présents dans deux régions : 1) la partie supérieure du cerveau (cortex cérébral) et 2) la moelle épinière. Ces neurones qui dégénèrent au cours de la SLA sont en interaction avec une troisième population neuronale impliquée dans le contrôle des muscles et situées entre ces deux populations, dans une région appelée formation réticulée. Malgré ces interactions, on ne connaît ni le devenir au cours de la maladie, ni la contribution à la maladie des neurones de la formation réticulée. Partant de résultats scientifiques obtenus dans d’autres contextes pathologiques, nous émettons l’hypothèse que les neurones de la formation réticulée pourraient compenser les pertes des neurones directement ciblés par la SLA, et représenter une population neuronale d’intérêt thérapeutique. Pour tester cette hypothèse, nous proposons 1) de marquer et quantifier les neurones de la formation réticulée, et 2) de marquer et quantifier les neurones du cortex cérébral (en amont), qui se connectent directement aux neurones de la formation réticulé
Bénéfices attendus
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Histologiquement et cliniquement elle se définit comme la dégénérescence des neurones moteurs du cortex cérébral et de la moelle épinière. Cependant, ceux-ci sont en interaction avec d’autres neurones moteurs, notamment dans la formation réticulée, dont la contribution à la maladie n’a pas encore été évaluée, et qui pourraient compenser, sur le plan fonctionnel, les pertes des autres neurones, et représenter de fait une nouvelle population neuronale d’intérêt thérapeutique. Dans ce contexte, nous nous proposons d’évaluer le devenir des neurones moteurs de la formation réticulée dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique, afin de développer de potentielles nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d’intervention : - Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques. - Une chirurgie unique, ou deux chirurgies successives, sur animaux anesthésiés, espacées de deux semaines, d’une durée de 1 heure maximum chacune pour injecter au sein du cerveau ou de la moelle épinière les traceurs permettant d’identifier les neurones d’intérêts et leurs connexions. - Une chirurgie terminale, sur animaux anesthésiés, pour prélever les organes d’intérêt : cerveau et moelle épinière.
Impact sur les animaux
1. Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, une contention douce, et une douleur légère à l’oreille lors de la biopsie requise pour le génotypage des animaux. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. 2. Une partie des animaux pourraient présenter de légères atteintes motrices et une perte de poids inférieure à 10%. 3. Des chirurgies qui peuvent entraîner des douleurs modérées dues à une inflammation transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt (cerveau et moelle épinière), ou en raison d’un génotype non conforme.
Remplacement
Ce projet consiste à déterminer, dans un contexte neurodégénératif, le devenir et le rôle de neurones impliqués dans le contrôle moteurs, et en interaction avec deux populations neuronales situées en amont et en aval et ciblées par la SLA, au sein du système nerveux central de mammifère. Une telle complexité des réseaux neuronaux ne peut pas, à l’heure actuelle, être reproduite in vitro. En effet, les organoïdes ne permettent actuellement que de modéliser deux des trois régions du cerveau qui sont investiguées ici. En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal ne saurait être remplacé par un modèle cellulaire ou in sillico.
Réduction
D’après les travaux préliminaires de notre consortium de recherche (composé d’experts de la moelle épinière, de la formation réticulée et du cortex cérébral), un nombre minimum de 8 animaux (4 femelles et 4 mâles) pourrait suffire pour mettre en évidence une modification statistiquement significative des populations neuronales d’intérêt ou de leur connectivité. Ici, nous proposons des groupes de 10 animaux afin de pouvoir exclure éventuellement un (ou plusieurs) animal(aux) si la qualité de certaines chirurgies s’avérait insuffisante. Nous proposons donc de commencer les expériences avec 8 animaux par groupe, et de n’inclure davantage d’animaux que si nécessaire. Le nombre d'animaux a été évalué pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les femelles et les mâles issus de mêmes portées.
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, frisure, tunnels), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Les animaux seront utilisés avant l’apparition de symptômes moteurs sévères. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoires. Enfin, des points limites spécifiques au phénotype des animaux, ou aux chirurgies ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) il existe plusieurs lignées de souris qui, dans leur ensemble, couvrent plusieurs mutations retrouvées chez les patients contrairement aux modèles de primates (très rares) ou de rats (peu fréquents), et la multiplication des modèles est désormais requise pour convaincre la communauté scientifique, et 3) elles permettent davantage de manipulations génétiques, par croisement, qui permettent en outre de répondre également à des questions mécanistiques. Les animaux seront utilisés à partir de 45 jours et jusqu'à 90 jours ou 120 jours maximum selon les lignées, et dans tous les cas avant l’apparition de symptômes moteurs sévères.
Étude des mécanismes de modification de la réponse immunitaire par l’influence de cellules mémoires
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées appartient à une lignée transgénique retenue pour son nombre plus élevé de cellules mémoires dites MAIT, censé rendre l'effet recherché plus facile à observer. 1 946 souris vont être utilisées, 1 574 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 372 un niveau modéré. Elles reçoivent une injection de cellules sous anesthésie, puis une administration de produits sous une anesthésie pouvant atteindre quarante minutes, puis six injections espacées de vingt minutes le jour de leur mise à mort. Le porteur affirme que les activations du système immunitaire ainsi provoquées ne sont pas douloureuses et que le passage par un organisme vivant intégré est "indispensable" pour tester les mécanismes de régulation. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire a pour rôle de détecter un potentiel danger et d’y répondre par le biais des globules blancs afin d’éliminer cette source de danger. On compte parmi ces globules blancs des cellules appelées « lymphocytes T », dont le sous-type dit « CD4 » est absolument essentiel pour l’organisation et l’action du système immunitaire. Par exemple, les patients qui ont un déficit en lymphocyte T CD4 développent de graves maladies infectieuses. Chaque lymphocyte T généré dans l’organisme est capable de reconnaître une cible qui lui est unique. Quand un lymphocyte T n’a pas encore rencontré sa cible au long de la vie de l’individu, on dit qu’il est « naïf » et lorsqu’il a rencontré sa cible, on dit que cette cellule est « mémoire ». Les cellules mémoires sont capables de répondre plus rapidement en cas de reconnaissance d’un danger et c’est sur ce principe qu’est basée la vaccination.
Bénéfices attendus
Ce projet tente de répondre à une question fondamentale en immunologie : comprendre les différents signaux qui sont intégrés par les cellules T CD4 naïves et qui peuvent influencer leur activité. Ce projet pourrait permettre à court terme d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent l’activation des cellules T CD4 naïves qui, pour rappel, sont des cellules clés de la fonction du système immunitaire. A plus long terme, nos résultats pourraient avoir des applications très intéressantes notamment dans le domaine de la vaccination car nous pourrions développer de nouveaux adjuvants capables d’activer des cellules mémoires et ainsi orienter la réponse T CD4 naïve de la façon la plus optimale par rapport à l’effet recherché.
Procédures
Dans la procédure expérimentale, les souris anesthésiées recevront d’abord une injection de cellules mémoires et/ou naïves (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 5 min). Puis les animaux recevront 6h plus tard une administration de produits non douloureux. Ce geste sera réalisé sur animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie < 40 min). Le jour de la mise à mort, les animaux recevront six injections, chacune séparée de 20 min, d’un produit non inflammatoire sous anesthésie (durée de chaque anesthésie < 5 min).
Impact sur les animaux
Suite à l'injection d’anesthésique dans l'abdomen une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées
Remplacement
Le type d’activité que peut adopter une cellule CD4 naïve a déjà été étudiée in vitro et nous sommes capables aujourd’hui de modifier le comportement d’un lymphocyte T CD4 in vitro. Cependant, le comportement que va adopter un lymphocyte T CD4 in vivo peut être très différent de celui obtenu in vitro. Malheureusement, nous n’avons pas aujourd’hui les technologies nous permettant de reproduire in vitro les différents signaux complexes que peuvent recevoir les cellules naïves au sein de leur environnement proche. En effet, les mécanismes qui peuvent moduler l’activité des cellules naïves CD4 sont très nombreux et font notamment intervenir les cellules présentatrices de l’antigène (c’est-à-dire la source de danger), les cellules naïves et les cellules mémoires. Ainsi, une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris est nécessaire. Cette étape est notamment indispensable pour tester les mécanismes de régulation. Stratégie de remplacement : Des expériences in vitro ont déjà été réalisées au laboratoire et ont démontré que l’environnement immédiat des lymphocytes est déterminant pour leurs fonctions. Il est maintenant nécessaire de valider ces résultats dans un environnement intégré qu’est la souris.
Réduction
Nous utiliserons de façon générale 12 souris par groupe expérimental. Il s’agit d’un nombre suffisant nous permettant de surmonter les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à notre modèle. Ce nombre se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire en utilisant ce modèle.
Raffinement
Tous les gestes douloureux ou nécessitant une immobilisation parfaite de l’animal seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Lors des anesthésies, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Par ailleurs, pour éviter l’assèchement des yeux pendant les anesthésies, les yeux des animaux seront recouverts de vaseline officinale. Une solution de Ringer lactate préchauffée à 37°C sera administrée en fin d’anesthésie pour améliorer le réveil de l’animal. Les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’état des animaux sera évalué de manière objective grâce à une grille de score permettant de définir des points-limite. L’atteinte de ces points-limite conduira à la mise en place de soins de support/analgésiques voire à la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie pour plusieurs raisons : a) nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet notamment d'utiliser des souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt. b) la souris est aussi un modèle de choix du fait de la disponibilité de souches congéniques (« génétiquement proches ») et transgéniques (« génétiquement modifiées »). c) enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris Nous utiliserons des souris de « phénotype sauvage » (non génétiquement modifiées) mais également une lignée transgénique car cette lignée possède un plus grand nombre de cellules mémoires particulières dites « MAIT » ce qui permettrait d’observer plus facilement l’effet biologique attendu (influence des cellules mémoires sur le devenir des cellules naïves). Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 12 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Rôle d’une protéine des vaisseaux sanguins dans une pathologie rénale, la glomérulonéphrite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Deux injections intraveineuses de sérum déclenchent une maladie rénale chez 480 souris, dont l'évolution est ensuite suivie pendant cinq à quatorze jours. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin pour analyser leurs reins. Une partie subit en plus une chirurgie de trente minutes pour une injection directe dans le rein, une autre reçoit un anticoagulant mélangé à sa nourriture, et le prélèvement final d'urine se fait par incision abdominale. Le porteur ramène l'œdème et la présence de protéines dans les urines à "une certaine gêne", et affirme que les conditions de la circulation sanguine ne peuvent pas être reproduites "en dehors d'un organisme complet".
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de déterminer comment notre protéine d'interêt, qui bloque des enzymes dans les vaisseaux sanguins, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Des résultats précédents indiquent que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. Nous voulons déterminer son mécanisme d'action et quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.
Procédures
La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 5 à 14 jours. Un groupe de souris aura auparavant une procédure chirurgicale de 30 minutes environ pour une injection dans le rein qui permet d'augmenter la production de notre protéine d'intêret. Pour savoir si le mécanisme d'action de notre protéine est lié à la coagulation, un autre groupe de souris aura un traitement anticoagulant ajouté à la nourriture. A la fin des procédures, un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie, ainsi qu'un prelevement d'urine directement dans la vessie après une petite incision abdominale, puis les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses pour déclencher la maladie rénale peuvent provoquer une petite gène de courte durée. La maladie rénale elle même est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal) qui peut également provoquer une certaine gène. Certains animaux auront également une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée transitoire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.
Remplacement
L'étude de la fonction de la protéine étudiée et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites en dehors d'un organisme complet.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique et celle d'une étude précédente. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés et la production de ces animaux est basée sur ce nombre. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt, de l'injection dans le rein, ou du traitement anticoagulant, nous ne ferons pas de deuxième groupe.
Raffinement
Les souris ont à disposition des cotons et du papier kraft leur permettant d’exprimer un comportement naturel de mise en place d’un nid, ainsi que de batonnets de bois. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les injections est traitée préventivement par l'administration d'un antidouleur. La prise en charge d’une éventuelle douleur au cour de la procédure s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 2 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.
Optimisation des stratégies de vaccination thérapeutique anti-tumorales par association à des traitements visant les vaisseaux sanguins chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
960 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Chacune peut recevoir dix-huit gavages en neuf jours, quatre injections intrapéritonéales, trois injections sous-cutanées, et pour certaines une incision cutanée permettant d'injecter des cellules tumorales dans le foie ou dans le rein, suivie d'une imagerie hebdomadaire sous anesthésie pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids, s'immobiliser ou s'isoler. Il affirme que le microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduit en dehors d'un organisme vivant, et fait de ces modèles un "prérequis nécessaire" avant tout essai clinique.
Objectifs
La vaccination thérapeutique demeure la seule immunothérapie capable d'induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique. Cependant la vaccination thérapeutique lorsqu’elle est utilisée en monothérapie s’avère peu efficace. Lors de la progression du cancer, la tumeur développe de nombreux mécanismes d’échappement au système immunitaire tels que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins anormaux (appelée angiogenèse tumorale). Cette angiogenèse empêche l’arrivée des lymphocytes T au sein de la tumeur et favorise un environnement hostile au système immunitaire. Il peut donc être intéressant d’associer la vaccination thérapeutique à des traitements ciblant ces vaisseaux sanguins (appelés traitements antiangiogéniques) afin d’améliorer son efficacité. Des travaux ont montré une forte synergie d’action entre ces deux traitements, et cela, uniquement lorsque la vaccination est initiée à l’arrêt du traitement antiangiogénique. L’objectif de ce projet est à présent de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeux qui pourraient expliquer le bénéfice d’une combinaison administrée de façon séquentielle entre un traitement antiangiogénique et la vaccination thérapeutique. Les bénéfices possible d’une trithérapie en associant cette combinaison thérapeutique à d’autres immunothérapies seront également évalués. Ce projet apportera de meilleures connaissances sur la séquence d’administration de plusieurs traitements thérapeutiques et pourra aider aux développement de nouvelles combinaisons thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’impact des traitements antiangiogéniques lors d’une réponse vaccinale. Notre approche longitudinale nous permettra de déterminer la cinétique d’apparition des modifications angiogéniques et immunitaires associées à cette combinaison thérapeutique. Ces résultats pourraient orienter sur le choix des anti-angiogéniques à utiliser en combinaison dans les essais cliniques. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques telle que des combinaisons entre traitement antiangiogénique et vaccin en association à des immunothérapies.
Procédures
Injection par voie sous-cutanée de cellules ou produit : 3 fois, sur animaux vigiles ; durée du geste: 1-2 min. Gavage 2 fois par jour tous les jours pendant 9 jours, sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours); durée totale du geste 1-2 min. Chirurgie (incision cutanée latérale) : Injection de cellules tumorales dans le foie (1 fois) ou dans le rein (1fois) sur animaux sous anesthésie gazeuse ; durée du geste : 5 min. Imagerie : Injection en intra-péritonéale (i.p) du produit et Imagerie sous anesthésie gazeuse : 1fois/semaine, durée 30 min. Injection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Prélèvement de sang: 1 fois/souris sur souris anesthésiées ; durée du geste : 1-2 min. Chirurgie terminale sans réveil sur animaux sous anesthésie, durée 20 min.
Impact sur les animaux
L’injection par voie sous-cutanée cause un stress de courte durée et n’est pas connue pour engendrer des nuisances ou douleurs. Le gavage cause un stress et une gêne transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoires, risques d’infection et problème de cicatrisation. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 4 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des troubles du comportement (immobilité, isolement...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes en vue de l’analyse de la réponse immunitaire et de l’angiogenèse
Remplacement
L’implication du système immunitaire dans la lutte anti-tumorale et le microenvironnement tumoral sont extrêmement complexes, et ne peuvent être reproduits en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à des modèles animaux qui développent des pathologies qui se rapprochent le plus physiologiquement possible de ceux retrouvés chez l’homme. Ces modèles sont fondamentaux pour étudier l’efficacité de nouveaux traitements thérapeutiques. Ils sont un prérequis nécessaire avant le lancement d’essais cliniques chez l’homme.
Réduction
Certains paramètres expérimentaux ont déjà été déterminés par des études précédentes, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Un nombre d’animaux minimum pour constituer des groupes statistiquement significatifs a été déterminé. Ainsi pour les procédures n’impliquant pas de chirurgie, des groupes de 10 souris par point d’étude sont nécessaires. Pour les procédures impliquant de la chirurgie, des groupes de 12 souris par point d’étude sont nécessaires pour palier une éventuelle hétérogénéité de la réponse immunitaire après chirurgie et/ou d'éventuelles complications post-chirurgie. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les expérimentateurs effectuent un suivi bihebdomadaire des souris. Le vaccin et les différents traitements sont préparés dans des diluants compatibles pour des applications chez l’animal et ne sont pas connus pour être toxiques aux doses utilisées. Les prélèvements de sang et la chirurgie sont réalisés sur animaux sous anesthésie générale. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pré et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. L’alimentation des souris sera adaptée si besoin afin d’assurer leur hydratation et une prise alimentation: croquettes humidifiées, gel hydratant renouvelée 2 fois/semaine. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal idéal pour l’étude du système immunitaire au sein d’un organisme vivant. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car à cet âge là, le système immunitaire est entièrement développé et mature.
Un modèle poisson pour tester des agents à visée thérapeutique dans le syndrome Kabuki
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.
Objectifs
Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.
Procédures
L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (
Impact sur les animaux
La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.
Devenir
Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.
Remplacement
Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.
Réduction
Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.
Raffinement
Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.