Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système musculosquelettique
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- Système respiratoire
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Développement de thérapies anti-cancéreuses CAR-Macrophages
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des souris immunodéficientes d'abord, puis des souris dont le système immunitaire a été remplacé par un système humain, reçoivent des tumeurs mammaires ou des tumeurs du cerveau. 280 souris au total vont être utilisées, 140 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 140 d'un niveau sévère. Une partie subit une chirurgie d'implantation dans un coussinet mammaire, l'autre une injection stéréotaxique dans le cerveau créant un gliome, avant de recevoir des macrophages génétiquement modifiés censés attaquer la tumeur. Le porteur décrit une échelle allant de la faiblesse de la queue à la paralysie complète et prévoit de tuer les animaux dès la paralysie des pattes arrière, les tumeurs étant ensuite prélevées pour analyse.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie pour le traitement des tumeurs solides, en utilisant des cellules immunitaires appelées macrophages. L’objectif est de surmonter les limitations actuelles des immunothérapies anticancéreuses, telles que la faible pénétration des cellules immunitaires dans la tumeur et l’immunosuppression induite par la tumeur elle-même. Les cancers sont souvent difficiles à traiter car les cellules cancéreuses peuvent échapper à l’attaque du système immunitaire. Ce projet propose d’utiliser des macrophages, un type de cellule immunitaire, qui seront modifiés pour mieux combattre les tumeurs. Ces macrophages modifiés seront capables de cibler et de détruire les cellules cancéreuses tout en résistant aux mécanismes de défense de la tumeur. Les macrophages seront modifiés pour exprimer un récepteur spécifique (CAR) qui leur permet de reconnaître et de cibler les cellules tumorales. Les macrophages seront reprogrammés pour adopter un comportement pro-inflammatoire, ce qui les rendra plus efficaces pour combattre les tumeurs et résistants à l’immunosuppression induite par les cellules tumorales. Nous nous appuyons sur nos travaux précédents qui ont démontré que l’inhibition des proprotéines convertases permettait de polariser les macrophages vers un profil pro-inflammatoire. Les souris seront utilisées pour tester cette nouvelle approche. Des souris immunodéficientes seront utilisées dans un premier temps, puis des souris avec un système immunitaire humanisé seront ensuite utilisées pour étudier les interactions entre les macrophages et les autres cellules immunitaires. Les souris recevront, sous anesthésie, des injections de cellules tumorales dans les régions mammaires et cérébrales afin de modéliser la croissance des tumeurs. La croissance des tumeurs sera suivie deux fois par semaine et tout signe de détresse ou de souffrance seront surveillés. Ensuite, nous allons introduire des macrophages modifiés, appelés macrophages CAR, qui sont conçus pour cibler spécifiquement les cellules tumorales et améliorer la réponse immunitaire grâce à leur reprogrammation pro-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait représenter une avancée majeure dans le traitement des tumeurs solides, offrant une nouvelle option thérapeutique aux patients. En améliorant la capacité des macrophages à pénétrer les tumeurs et à rester actifs malgré l'environnement immunosuppresseur, cette recherche pourrait conduire à des traitements plus efficaces et moins invasifs.
Procédures
Les animaux de la procédure expérimentale 1 seront soumis à une seule chirurgie au niveau de la zone d'implantation tumorale (4° coussinet adipeux), cette chirurgie permettant l'implantation des cellules tumorales. Les animaux de la procédure expérimentale 2 seront soumis à une seule neurochirugie par voie stéréaotaxique au niveau de la zone d'implantation tumorale. Les macrophages modifiés seront injectés dans les souris pour cibler les tumeurs.
Impact sur les animaux
Les symptômes attendus sur les animaux sont les symptômes neurologiques qui ont été évalués avant par des scores neurologiques modifiés comme suit : grade 0, absence de symptômes; grade 1 (légers),faiblesse de la queue ou paralysie de la queue; grade 2 (modérés), paraparésie des pattes postérieures ou hémiparésie; grade 3 (sévères), paralysie des pattes postérieures ou hémiparalysie; et grade 4 (très sévères), paralysie complète (tétraplégie), stade moribond ou décès. Mais dans notre projet, tous les animaux seront euthanasiés dès l’apparition de symptômes de grade 3. Les animaux seront observés tous les jours pour l’apparition des symptômes. Les symptômes tels que la douleur et la détresse seront atténués par l’anesthésie et l’administration d’analgésiques. Pour les deux modèles (mammaires et cérébrales), tout signe de souffrance (prostration, isolement, perte de poids supérieure à 20% du poids corporel initial) sera scruté et fera l’objet d’un suivi scoré, tout animal présentant un de ces signes sera mis à mort. Les injections de macrophages peuvent induire des réactions inflammatoires locales au site d'injection et des effets systémiques modérées liés à l'activation immunitaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement pour détecter ces effets, et une euthanasie sera pratiquée dès l'apparition de symptômes sévères.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les souris seront soumises à une euthanasie, et des prélèvements des tumeurs mammaires et des gliomes seront ensuite réalisés pour des analyses par cytométrie en flux et immunofluorescence.
Remplacement
Avant d’envisager toute expérimentation in vivo, nous avons exploré les alternatives non animales disponibles et évalué leur pertinence par rapport aux objectifs du projet. L'efficacité des macrophages CAR a d'abord été testée in vitro sur des lignées cellulaires en 2D, puis ex vivo sur des modèles organoïdes 3D, reproduisant plus fidèlement l’environnement tumoral. Ces expériences ont permis de déterminer que la furine est l'enzyme la plus efficace pour réactiver les macrophages et ont optimisé le multiplicity of infection (MOI) nécessaire pour générer des macrophages CAR fonctionnels, capables de reconnaître et d’éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats valident la pertinence de poursuivre par des études in vivo, indispensables pour évaluer l’efficacité et la sécurité des macrophages CAR dans un microenvironnement tumoral complexe,et pour affiner le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie.
Réduction
Au cours de la rédaction des protocoles in-vivo, une analyse biostatistique a été effectuée afin de définir le nombre idéal des animaux, qui sera utilisé en conjonction avec la crédibilité des résultats obtenus. Le nombre de souris sera réduit le plus possible afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs (lots de 10 animaux par condition). Le projet fait appel à différents modèles expérimentaux, dont des modèles cellulaires en trois dimensions qui ont permis de réduire le nombre de conditions expérimentales à tester in vivo. La validation de ces conditions expérimentales ne peut se faire qu’in vivo pour rendre compte de l’efficacité du traitement dans un système biologique complexe.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront optimisées pour minimiser le stress et la douleur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et des analgésiques seront administrés pour gérer la douleur post-opératoire. Les animaux seront surveillés de près pour détecter tout signe de détresse ou de souffrance, et des critères stricts d'euthanasie seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile. Les techniques et protocoles utilisés seront continuellement évalués et améliorés pour assurer le bien-être maximal des animaux. Les conditions de vie seront améliorées au maximum.
Choix des espèces
C’est une espèce classiquement utilisée en cancérologie dont la génétique et la manipulation sont bien maitrisées en laboratoire. Des tests de macrophages CAR sur les modèles souris ont déjà été publiés précédemment. Nous utiliserons des souris adultes jeunes ayant atteint leur taille maximale, soit âgées de 8 semaines. Pour les souris humanisées, nous utiliserons des souris âgées de 21 semaines (16 semaines après humanisation).
Étude préclinique des anticorps anti-PD1 sur les lymphomes T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 079 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Greffées avec des cellules tumorales prélevées sur des patients atteints d'un lymphome cutané, elles subissent une prise de sang par semaine sous anesthésie jusqu'à leur mort, une injection de cellules immunitaires humaines, puis un anticorps anti-PD1 chaque semaine pendant un mois. La mise à mort intervient quand la tumeur atteint le volume maximal toléré, ou six semaines après le traitement si la tumeur ne se développe pas. Le porteur écrit que la croissance tumorale "ne semble pas induire de souffrance pour l'animal" jusqu'à cette limite.
Objectifs
Les lymphomes T périphériques représentent un large groupe d’hémopathies malignes issus de lymphocytes mature T. Nous nous intéressons particulièrement au syndrome de Sézary, un lymphome T lymphome cutané rare, caractérisé par une prolifération maligne des lymphocytes T dans la peau. Il représente environ 3 % des lymphomes cutanés des cellules T. Cependant, le pronostic est généralement défavorable, avec un taux de survie moyen de 2 à 4 ans après le diagnostic. Des tests préliminaires in vitro ont démontré que des anticorps anti-PD1 sont capables de recruter les cellules immunitaires pour induire la mort des cellules tumorales. Cette preuve de concept in vitro nous a permis de conclure que l’anticorps anti-PD1 permet de détruire les cellules tumorales par un recrutement des cellules immunitaires. Pour passer en phase préclinique, nous devons tester cet anticorps anti-PD1 sur des souris. Nous utilisons un modèle de souris immunodéficientes, sans système immunitaires pour permettre la prise des greffes de tumeurs. Ensuite, nous allons injecter l’anticorps anti-PD1 et des cellules immunitaires humaines. Ce duo nous permettra de tuer les cellules immunitaires. Ce projet permettra de montrer l’efficacité de ce nouveau traitement contre les lymphomes T exprimant la cible PD1 et d’ainsi obtenir un traitement possible contre les lymphomes T.
Bénéfices attendus
Le projet vise à proposer des immunothérapies innovantes pour les lymphomes à cellules T dont le syndrome de Sézary. Les lymphomes à cellules T sont des maladies rares avec peu de traitements efficaces sur le marché. Ce projet nous permettra de démontrer la preuve de concept des anticorps thérapeutiques anti-PD1 sur un modèle de souris patient-derived-xenograft (PDX). Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Procédures
Pour visualiser l’effet des traitements sur les cellules tumorales, nous ferons des prises de sang toutes les semaines sur des souris anesthésiées (conformément aux recommandations) pour réduire leur souffrance. Les souris auront des prélevments de sang jusqu'à la mort de la souris une fois par semaine. De plus, les souris subiront une injection de cellules immunitaires au dès qu'elles auront des cellules tumorales dans le sang. Elles seront alors traitées une fois par semaine par injection intraveineuse d'anti PD1 pendant 1 mois sur souris endormie. Ainsi une fois par semaine, pendant la phase traitement (1mois) , les souris seront anesthésiées et auront un prélevement de sang et un traitement anti-PD1 par semaine.
Impact sur les animaux
Nous allons injecter des cellules tumorales et des cellules immunitaires en intrapéritoénale sur des souris endormies ce qui provoquera une douleur légère aux souris. 2 semaines après l'injection, nous allons leur prélever du sang quand les souris seront endormies. Cela leur provoquera une douleur modérée. Nous mettrons à mort les souris sous anesthésie.
Devenir
Pour l'ensemble de ces procédures, les souris seront mises à mort quand le volume tumoral attendra le maximum tolérable. À noter, ces modèles de lymphome sont largement documentés et la croissance tumorale ne semble pas induire de souffrance pour l'animal jusqu'à cette limite. En cas de non-développement ou de régression de la tumeur, les souris seront conservées pour une durée de 6 semaines après traitement (durée la plus couramment publiée) puis mis à mort pour analyse.
Remplacement
Il a été démontré en culture cellulaire, que l’anticorps anti-PD1 pouvaient induire la mort de cellules tumorales en recrutant les cellules immunitaires. Nous devons donc maintenant tester cet anticorps dans notre modèle PDX in vivo. Cela nous permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de cet anticorps et sa capacité à induire une forte régression tumorale. Si les résultats sont concluants, et en association avec les résultats de toxicologie, ce projet pourra conduire à un essai de phase I chez l’Homme.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris utilisées, des tests préliminaires in vitro ont été fait pour démontrer l’effet de l’anticorps anti-PD1. Pour déterminer le nombre de souris nécessaires, nous avons utilisé des calculs statistiques ce qui nous a permis de déterminer le nombre de souris par groupe par traitement. Ainsi, nous avons besoin d'au moins 11 souris par groupe pour garantir la validité des tests. De plus, nous voudrions tester cet anticorps anti-PD1 sur 7 modèles de PDX pour voir l’efficacité de ce traitement sur différents profils mutationnels de lymphome T.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et la douleur des animaux, des points limites précis ont été définis (volume maximum de la tumeur , perte de poids...). Aussi, lors des phases d'implantation des PDX, les souris seront anesthésiées. Nous mettons en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Les cages sont spacieuses et équipées de litières absorbantes et non toxiques, renouvelées régulièrement pour assurer un environnement propre. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, tels que des tunnels, des matériaux de nidification, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Les souris sont maintenues à une température et une humidité contrôlée, avec un cycle lumière/obscurité approprié pour respecter leur rythme circadien. De plus, nous effectuons des évaluations régulières de la santé et du comportement des animaux, et ajustons les conditions d'hébergement en fonction des besoins spécifiques identifiés. Ces pratiques de raffinement sont essentielles pour garantir le bien-être des souris tout en obtenant des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris pour vérifier l’efficacité des traitements et obtenir des données pharmacocinétiques. Cela permet de voir si les traitements vont diminuer la taille des cellules tumorales. Toutes les études préliminaires ont été mises en place sur des cellules de patients ou des lignées cellulaires. Les souris sont génétiquement modifiées pour être partiellement ou totalement immunodéficientes ce qui permet de greffer de tumeurs humaines, y compris les lymphomes T humains et d'éviter les réactions de rejet de greffes. Nous allons sélectionner des jeunes adultes de 6 à 10 semaines. Ces souris ont fini leur croissance et refléteront au mieux la physiopathologie du lymphome cutané à cellules T dont les tumeurs surviennent principalement chez l'adulte. La standardisation de l'âge permettra une meilleure reproductibilité expérimentale.
Identification des composés sémiochimiques (odeurs) et des voies neuronales impliqués dans les régulations sociales de la fonction de reproduction chez la brebis – Partie 02
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Deux anesthésies générales, deux intubations, une endoscopie de vingt minutes, une heure d'imagerie et huit prélèvements sanguins : 60 brebis sont soumises à cet enchaînement, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les 60 béliers subissent six prélèvements sanguins d'un niveau de souffrance léger et retournent ensuite dans leur troupeau, tandis que les brebis sont tuées pour des analyses de biologie moléculaire. L'objectif est d'identifier les odeurs par lesquelles un bélier rendu sexuellement actif déclenche la reproduction des femelles hors saison, pour remplacer les traitements hormonaux utilisés en élevage depuis les années 1970. Le porteur présente cette voie comme "plus responsable" et "plus éthique", la finalité restant de lisser sur l'année la production de lait et de viande.
Objectifs
Chez les petits ruminants, la saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelle de la disponibilité et du prix des produits (lait et viande) sur le marché. La maîtrise de la saisonnalité de la reproduction chez ces animaux est donc un enjeu majeur pour les éleveurs. Depuis les années 1970, les traitements hormonaux sont utilisés pour désaisonner la reproduction et ils restent le seul moyen efficace pour contrôler la reproduction à ce jour. L’utilisation d’hormones dans les élevages est cependant un sujet de préoccupation majeur et un enjeu de santé publique. Dans ce projet nous proposons d’approfondir la compréhension d’un processus biologique naturel qui pourrait apporter une solution aux traitements actuels : l’effet mâle (EM). En effet, chez les ovins, un mâle rendu sexuellement actif via un traitement photopériodique va, via l’émission de molécules odorantes être capable de désaisonner les femelles qui interagissent avec lui. Dans ce projet nous proposons d’identifier les molécules à l’origine de l’EM mais également de mieux comprendre comment le cerveau des femelles intègrent ces signaux pour développer de nouvellesapproches agroécologiques, bassée surl'olfaction qui pourraient être plus responsables et plus éthiques. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales différentes.
Bénéfices attendus
Le présent projet vise à étudier les mécanismes biologiques de l'effet Male avec pour but ultime de remplacer les traitements pharmacologiques hormonaux dans les exploitations. Une meilleure compréhension des mécanismes de contrôle de la reproduction chez les ovins est néanmoins indispensable pour tenir cet objectif de remplacement.
Procédures
Six prélèvements sanguins seront réalisés sur les mâles inclus dans cette étude dans EU1. Huit prélèvements sanguins, deux anesthésies générale 2 intubations, une endoscopie et séances d'imagerie seront réalisées sur les femelles inclues dans cette étude dans l'UE2. Les prélèvements sanguins durent quelques secondes et seront suivis d'une récompense. Les anesthésies générales et les intubations durent moins de 1h30. L'endoscopie dure 20 minutes environ et les séances d'imagerie durent environ 1heure.
Impact sur les animaux
Les différentes injections nécessaires pour l'anesthésie générale nécessite une contention légère qui peut induire un stress minime. Les différentes étapes de transport peuvent également engendrer un stress minime pour les animaux. La procédure d'endoscopie peut générée une douleur légère durant quelques heures. La procédure de prélévement sanguin nécessite une contention qui peut induire un stress léger.
Devenir
Les mâles seront réintroduits dans le troupeau d'origine de l'unité expérimentale. Les femelles seront euthanasiées pour les besoins d'étude en biologie moléculaires afin d'affiner notre compréhension du mécanisme.
Remplacement
L'effet mâle est une pratique utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevages. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeu nécessitent, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi est le modèle de référence pour étudier effet. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension de ce processus physiologique.
Réduction
Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés et la moitié seront réintroduit au sein du troupeau de l'EU2. S'agissant d'exposition des femelles exposées aux mâles actifs avec une finalité d'analyse en biologie moléculaire, les animaux seront euthanasiés. Pour les besoins de l'analyse statistique, en se basant sur la variabilité intrinsèque des méthodes de quantifications utilisées dans ce projet, 15 animaux par groupe seront nécessaires à l'étude.
Raffinement
Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude (déplacement pour rejoindre les enclos, déplacement entre les unités expérimentales pour les besoins de l'imagerie). Les habituations seront menées par une mise en contact quotidienne des animaux avec le matériel de transport (petite remorque spécifique pour le transport d'animaux utilisée par le personnel animalier), les animaux seront déplacés à minima par deux, pour éviter la sensation d'isolement pour réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats de qualité. Le comportement (notamment l'isolement du groupe, grincement des dents), l'état clinique des brebis et la prise alimentaire des animaux seront surveillés tout au long de l'expérimentation. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de la prise en charge adéquate avec l'appui d'un avis vétérinaire.
Choix des espèces
L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux vivants et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle choisi ici, est celui pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté.Ainsi les animaux utilisés seront adultes.
Génération de lignées transgéniques de Cryptosporidium spp. sur souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Gavées une fois avec du bicarbonate de sodium, puis une fois avec une solution de parasites, 320 souris immunodéprimées voient leurs selles récoltées jusqu'au terme de la procédure, déclarée d'un niveau de souffrance léger. Certaines développent une diarrhée, un amaigrissement, une déshydratation et de la fatigue, au point d'être tuées avant la fin prévue. Le porteur juge le cas peu fréquent, les parasites transgéniques étant selon lui difficiles à générer et produits en nombre insuffisant pour déclencher des symptômes marqués. Il justifie le recours aux souris par une seule phrase, l'absence d'"alternative crédible", et toutes sont tuées après récolte des oocystes du parasite modifié.
Objectifs
Cryptosporidium spp. est un parasite qui provoque des maladies diarrhéiques chez les humains et les animaux, en particulier chez les jeunes enfants et le bétail. Cette infection, appelée cryptosporidiose, est un gros problème de santé publique et animale parce qu’elle rend beaucoup de jeunes enfants malades et réduit la productivité des élevages, notamment des ruminants comme les vaches. Malheureusement, il n’existe actuellement ni traitement spécifique ni vaccin efficace contre cette maladie. Nous comprenons encore mal comment ce parasite fonctionne. De nombreuses protéines et parties de ce parasite ne sont pas bien étudiées, ce qui rend difficile la découverte de nouveaux traitements. Pour mieux comprendre ces protéines, les chercheurs essaient de modifier génétiquement le parasite en laboratoire. Cela permet de mieux comprendre où ces protéines se trouvent dans le parasite, comment elles interagissent avec d’autres molécules, et quel rôle elles jouent dans l’infection. Cependant, il est difficile de modifier génétiquement ce parasite parce que son cycle de vie est complexe. Une partie de ce cycle inclut une phase de reproduction sexuelle, qui est nécessaire pour intégrer les modifications génétiques. Malheureusement, les modèles de laboratoire actuels ne permettent pas à ce parasite de se reproduire sexuellement de manière efficace, ce qui complique la création de parasites génétiquement modifiés. Le projet en question vise à surmonter ces obstacles en créant des parasites transgéniques, c’est-à-dire des parasites dont les gènes ont été spécifiquement modifiés pour mieux comprendre le rôle des protéines qu’ils produisent. En identifiant les protéines essentielles à la survie et à la virulence du parasite, les chercheurs espèrent découvrir de nouvelles cibles pour des traitements ou des vaccins contre la cryptosporidiose, ce qui pourrait conduire à des stratégies de prévention et de traitement plus efficaces.
Bénéfices attendus
Beaucoup de choses restent a élucider concernant la biologie de Cryptosporidium spp., un parasite responsable de maladies graves. Ces questions concernent des aspects très basiques, comme le rôle de certaines parties du parasite, la façon dont il choisit ses hôtes qu’il s’agisse d’humains ou d’animaux), comment il parvient à entrer dans les cellules, et les effets à long terme de la maladie, notamment chez les enfants. On ne connaît pas non plus la fonction de la plupart des protéines que produit ce parasite. Étant donné que la cryptosporidiose touche à la fois les humains et les animaux, avec des conséquences importantes sur la santé et l’économie, et qu’il n’existe actuellement ni traitement ni vaccin efficace, il est essentiel de faire avancer la recherche sur ces sujets. Le but est de découvrir des cibles potentielles pour développer de nouveaux traitements ou vaccins. Ce projet vise donc à identifier des protéines et des mécanismes clés dans la biologie du parasite et dans le développement de la maladie, afin de trouver de bonnes cibles pour de futurs vaccins et traitements.
Procédures
Les animaux serons gavés avec un petit volume, de bicarbonate de sodium une fois, puis une solution de parasites une fois. Le reste de la procédure consiste a récupérer les selles. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent développer de la diarrhée, avec amaigrissement, déshydratation et fatigue, pouvant mener à la nécessité de sacrifier l’animal avant la fin de la procédure. Néanmoins, il n’est pas attendu que ceci arrive dans une majorité de cas, les parasites transgéniques étant en général difficiles à générer et en un nombre insuffisant pour provoquer des symptômes importants.
Devenir
Animaux infectés avec des pathogènes animaux et humains transgéniques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative crédible a l’utilisation d’animaux pour la génération de Cryptosporidium transgénique en l’état actuel des connaissances.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu sur 5 ans correspond au minimum envisageable pour la génération d’un nombre suffisant de parasites transgéniques si le nombre de souches transgéniques générées est atteint.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies correspondant au standard recommandé pour l’espèce. La procédure en tant que telle n’a qu’un impacte très limité sur le confort des animaux pendant de courtes périodes.
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées sont les modèles les plus petits et les plus pratiques sur lesquels il a été possible de générer expérimentalement des souches de Cryptosporidium transgéniques à ce jour. Il n’existe par ailleurs pas d’alternative aux modèles animaux dans ce but. Pour la génération d’oocystes : les animaux seront utilisés à plus de 3 semaines d’age. Il n’a pas été démontré qu’un age était plus favorable à la génération d’oocystes qu’un autre, et lever toute limite d’âge permet de d’éviter d’avoir a sacrifier des animaux n’ayant pas généré de parasites transgéniques. Pour l’élevage : L’âge minimal pour l’accouplement est de 6 semaines pour les femelles et de 7 semaines pour les mâles. L’âge maximal suggéré avant le premier accouplement est de 10 semaines, dépassé cet âge la capacité reproductrice diminue. Les mâles seront utilisés jusqu’à l’âge de 7 mois, après quoi leur capacité reproductrice diminue. Les femelles seront retirées après 6 portées ou à l’âge de 8 mois (le 1er critère atteint) ou après une baisse significative de production.
Evaluation par imagerie de l’état de la barrière sang-cerveau après traitement par un anticorps chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Issues d'un élevage de souris génétiquement modifiées dont la totalité des naissances est utilisée, y compris celles qui ne portent pas la mutation et deviennent des témoins, 144 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles étant anesthésiées puis tuées sans réveil. Elles subissent une biopsie de la queue pour génotypage, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, jusqu'à trois injections intraveineuses et deux séances d'anesthésie gazeuse d'une heure. L'objet est de suivre par imagerie l'ouverture puis la refermeture de la barrière sang-cerveau provoquée par un anticorps. Le porteur affirme que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro, sans dire ce qui a été tenté.
Objectifs
Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et leur paroi forme une véritable barrière. D'un autre côté cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau, comme les maladies neurodégénératives ou les cancers du cerveau. Certaines stratégies thérapeutiques, bien qu'efficaces pour les organes périphériques, échouent pour les maladies du cerveau car les médicaments ne peuvent atteindre leur cible intracérébrale. L'ouverture de la barrière sang-cerveau de manière ciblée, contrôlée et temporaire, pourrait ouvrir des perspectives énormes pour des maladies jusqu'ici incurables. Un anticorps thérapeutique a été développé récemment le permettant. Son développement nécessite cependant des méthodes précliniques pouvant être utilsées dans le futur chez les patients de manière à suivre précisément l'ouverture et la bonne refermeture de cette barrière. L'imagerie médicale non invasive permet ce suivi. Le but de ce projet est l’étude par imagerie médicale chez la souris de l’ouverture de la barrière sang-cerveau induite par un anticorps thérapeutique.
Bénéfices attendus
De nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces sur cellules ex vivo ou in vivo sur les organes périphériques sont impossibles pour le traitement de maladies cérébrales, telle que alzeihmer ou les cancer du cerveau à cause de la barrière sang-cerveau. Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le fonctionnement de cette barrière, valideront la stratégie permettant de l'ouvrir temporairement et de façon contrôlée et permettrons la mise au point d'une méthode d'imagerie médicale pouvant être, en cas de succès, utilisée en clinique. Ce projet et ces études sur la barrière sang-cerveau pourront permettre à plus long terme de comprendre comment soigner des maladies cérébrales jusqu'ici incurables.
Procédures
Un premier groupe de souris subira : Anesthésie gazeuse (maximum 1h) 1X par animal, Injection intraveineuse anesthésié (
Impact sur les animaux
Au cours des injections, les animaux peuvent ressentir du stress et de l’inconfort à cause de la manipulation, ainsi qu'une douleur légère et de courte durée lors des injections. Un stress léger et de courte durée peut également être généré lors des examens d'imagerie médicale qui nécessitent manipulation et anesthésie. Les biopsies caudales pour génotypage, c'est à dire identification des animaux porteurs d'une mutation nécessaire à cette étude, entraînent une nuisance légère et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.
Remplacement
La complexité de la barrière sang-cerveau et les effets globaux que son ouverture entraine ne peuvent pas être totalement répliqués in vitro. De plus, la procédure d'ouverture de la barrière sang-cerveau et les méthodes d'imagerie non invasive testées dans ce projet sont des méthodes thérapeutiques et d'imagerie médicale qui ont vocation à être appliquées ensuite chez l'homme. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Les effectifs ont été determinés et les resultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum, mais sera suffisant pour conclure de manière robuste au succès ou non de notre étude. En ce qui concerne les animaux transgéniques élevés, nous utiliserons tous les animaux de l'élevage car les souris ne portant pas la mutation d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs.
Raffinement
Pour le génotypage, c’est-à-dire l’identification, des souris génétiquement altérées modèles, nous utilisons une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée qui limite les effets indésirables, le stress et la douleur. Les méthodes d'imagerie que utilisées dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Durant les anesthésies, les souris seront chauffées, leur rythme respiratoire surveillé et du gel oculaire leur sera appliqué pour éviter le déssèchement des yeux. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Cette étude de l'ouverture de la barrière sang-cerveau par imagerie médicale non invasive a pour but d'améliorer l'administration de médicament au cerveau. Cette barrière est contrôlée par les mêmes protéines chez l'homme et la souris. Par ailleurs il existe chez la souris des lignées transgéniques avec des mutations impliquées dans le contrôle de la barrière sang-cerveau permettant de mieux comprendre ce phénomène. Les souris transgéniques seront identifiées à 3 semaines. Pour les procédures expérimentales, des souris adultes seront utilisées.
Rôle des protéines de la membrane basale et des récepteurs transmembranaires dans le développement et la maturation de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent jusqu'à dix administrations par gavage ou par piqûre au cours de leurs quatre premières semaines de vie, avant d'être tués à des âges échelonnés de deux à vingt-huit jours. 3 155 souris vont être utilisées, 2 995 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 160 d'un niveau sévère. Le porteur qualifie chacun des produits administrés de "non toxique et non irritant" et ramène la nuisance à "une gêne d'une courte durée", tout en attendant diarrhées, déshydratation et variations de poids. Une partie des animaux appartient à une lignée qui développe une dystrophie musculaire congénitale et perd l'usage des pattes arrière, et toutes sont tuées pour analyses post-mortem.
Objectifs
L’intestin est composé de plusieurs couches : l’épithélium, la membrane basale et le tissu conjonctif. L'épithélium est une barrière qui protège l'organisme de l'environnement hostile qui se trouve à l’intérieur de l’intestin. Il empêche le passage des toxines, des agents pathogènes et des déchets, tout en permettant l'absorption des nutriments et des ions. Pour maintenir l'intégrité de l’organe, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en une semaine (ce qui en fait l’organe le plus régénératif du corps). L'épithélium recouvre des protubérances en forme de doigts qui s'étendent à l’intérieur de l’intestin (appelées villosités) et des invaginations qui descendent dans le tissu conjonctif (appelées cryptes). Si la formation initiale de l'intestin est un processus embryonnaire (avant la naissance), les principaux changements morphologiques, tels que l'invagination des cryptes ou le début de la migration cellulaire, ne se produisent qu'au cours de la période postnatale (après la naissance), de même que la maturation des cellules épithéliales, qui est cruciale pour la capacité à digérer des aliments solides après le sevrage. Tout au long de leur vie, les cellules épithéliales restent attachées à la membrane basale (BM) par l'intermédiaire de récepteurs spéciaux (intégrines). Celle-ci est composée principalement de protéines qui s'auto-assemblent pour former une structure en forme de feuille. La BM fournit un soutien structurel à l'épithélium, favorise l'attachement des cellules et maintient leur orientation. Cependant, la composition des protéines de la BM n'est pas uniforme et change au cours de la vie et également lors de la survenue de maladies. Le rôle joué par la composition de la BM dans le comportement et la maturation des cellules épithéliales reste inexploré. Dans ce projet, nous visons à évaluer comment certaines des protéines qui composent la membrane basale, et les récepteurs que les cellules utilisent pour se fixer à celle-ci, influencent le comportement et la maturation des cellules au cours du développement.
Bénéfices attendus
Différentes pathologies sont possibles lorsque l'homéostasie intestinale n'est pas maintenue. Il s'agit notamment de problèmes digestifs, de maladies inflammatoires de l'intestin et de cancers. L'implication de la membrane basale dans ces pathologies n'a pas été étudiée. Comprendre le rôle de la membrane basale dans le maintien de l'homéostasie peut apporter un éclairage nouveau sur des pathologies connues. Bien que ce projet relève de la "recherche fondamentale", la compréhension du rôle régulateur de la membrane basale en général peut offrir de nouvelles pistes pour la recherche de pathologies dans l'intestin et, par conséquent, pour la découverte de nouvelles voies de traitement.
Procédures
Une première cohorte d’animaux sera divisée en 5 groupes à des stades précoces du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 4 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 2 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un cinquième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis Une seconde cohorte d’animaux sera divisée en 4 groupes à des stades avancés du développement : - Un premier groupe auquel on administrera jusqu’à 7 fois au cours de l’expérience avec 3 produits non toxiques et non irritants puis les animaux seront mis à mort à 8 temps différents - Un deuxième groupe auquel on administrera jusqu’à 10 fois au cours de l’expérience avec 4 produits non toxiques et non irritants différents puis les animaux seront mis à mort à 2 temps différents - Un troisième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis - Un quatrième groupe auquel on administrera jusqu’à 5 fois au cours de l’expérience avec 1 produit non toxique et non irritant puis les animaux seront mis à mort à 1 temps précis
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous utiliserons plusieurs modèles de souris dont la lignée Lama2-dyw (perte de la protéine Lama2 dans la membrane basale). Un modèle inductible qui limiterait la mutation au système gastro-intestinal n’existe pas actuellement. Les animaux Lama2-dyw développent une dystrophie musculaire congénitale lors des premières semaines après la naissance. L’espérance de vie pour ce modèle est de 8 à 14 semaines, ici nous l’utiliserons seulement jusqu’à 4 semaines maximum. Jusqu’à cet âge, les animaux sont attendus plus petits que les animaux témoins (qui ne développent pas la maladie) mais ne subissent aucune perte de poids. Ils peuvent montrer des difficultés à se mouvoir dû à une faiblesse musculaire au niveau des membres postérieurs. Lorsque c’est possible, nous utiliserons un modèle de souris inductible où la mutation peut être limitée au système gastro-intestinal. Dans ce cas là, les animaux vont recevoir différents traitements (produits non toxiques et non irritants) par gavage orale ou par une piqûre. Les nuisances attendues sont donc une gêne d’une courte durée au point d’injection ou dans la gorge. Suite à l'administration de ces produits, nous nous attendons à observer des changements dans l’intestin et l’épithélium intestinal des souris. Ces changements pourraient entraîner une perte ou un gain de poids, une diarrhée et une déshydratation ou une constipation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L’intestin est un système physiologique complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, sang, lymphe, neurones, muscles, tissu conjonctif, membrane basale et différents types de cellules. L’objectif principal de ce projet étant d’identifier la régulation de la membrane basale (BM) sur l’homéostasie et le développement de l’intestin, la réduction au système in vitro seulement pourrait nous empêcher d’identifier les effets régulateurs sur les différentes parties qui composent l’intestin. L’objectif du projet est d’identifier le rôle des protéines dans la régulation de la BM et de déterminer comment la BM est impliquée dans les problèmes digestifs (maladie ou cancer). Cependant, le rôle de la BM dans l’intestin pourrait être secondaire à son effet sur le système musculaire ou sur le système neuronal. Nous aurions besoin d’un modèle murin pour identifier les différents composants affectés par l’absence de protéines, et comment ces autres systèmes affectent le petit intestin. Nous utiliserons des organoïdes et des explants de tissus en supplément, mais ils ne peuvent pas répondre à toutes nos questions de recherche car il n’existe aucun moyen de reproduire la membrane basale (sa composition et sa structure) in vitro, mais seulement certains de ses composants de base (en fonction de notre protéine d’intérêt elle est ou non présentes dans la culture in vitro). Pour l’utilisation des organoïdes, nous produirons un stock d’organoïdes provenant des mêmes souris d’intérêts et contrôles pour les études de fonctionnalisation in vitro. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, pour diminuer le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l’échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée aux caractéristiques similaires. Les croisements de souris seront optimisés pour produire le plus grand nombre d’animaux de tous les génotypes d’intérêts. Plusieurs types d’analyses seront effectués sur la même souris. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Des outils statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaires pour chaque expérience, afin de produire des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les femelles gestantes seront séparées 2 à 3 jours avant la mise à bas pour le bon déroulement de la procédure Pour réduire et limiter le stress, aucun changement de cage ne sera effectué pendant la première semaine suivant la naissance. De plus, la mère sera manipulée avant les jeunes, afin d’incorporer son odeur sur les gants, pour éviter tout risque d’abandon de la part de la mère. La bonne manipulation des jeunes par la mère sera vérifiée. Pour les animaux développant la dystrophie, ils seront monitorés tous les jours (week-end compris) et auront à disposition de la nourriture et de l’eau accessible directement au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire. L’espérance de vie des animaux atteints de cette maladie est de 8 à 14 semaines, ici nous les utiliseront maximum à 4 semaines (P28) donc nous n’effectuerons pas de sevrage (normalement à P21) afin de faciliter le développement jusqu’à la mise à mort. Pour tous les animaux, une grille de score est établie pour évaluer l’état des animaux de façon objective.
Choix des espèces
Il n’est pas possible d’étudier le développement des tissus intestinaux à partir d’études in vitro, le seul moyen approprié reste l’utilisation d’un modèle évolutif et ressemblant au modèle humain, comme c’est le cas pour la souris. La souris de laboratoire est largement utilisée dans la recherche gastro-intestinale. Ses similitudes avec l’Homme, tant au niveau génétique qu’au niveau de la physiologie, de la morphologie et de la structure de l’organe, font qu’il est facile de relier les résultats obtenus chez la souris à ceux obtenus chez l’Homme. Enfin, la disponibilité d’une variété d’outils génétiques, ainsi qu’un assemblage complet et annoté du génome, de même qu’une reproduction rapide en font un bon modèle pour ce projet et même le seul modèle animal disponible puisqu’il n’existe pas encore d’autres modèles utilisables pour cette étude. Nous utiliserons des souris âgées de P2, P7, P14, P21 et P28 (P = jour après naissance) pour évaluer le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement de l'intestin. À ces âges, la morphologie de l'intestin change radicalement, et nous testerons l'implication de la membrane basale dans la régulation de ces changements. De plus, nous utiliserons des stades précoces du développement pour déterminer le rôle de la protéine durant l’embryogénèse à E13,5, E15,5 et E18,5 (E = jour après fécondation) en utilisant des souris adultes gestantes. Enfin nous utiliserons des souris adultes pour étudier le rôle de nos protéines d’intérêts, soit entre 8 et 16 semaines pour avoir un système gastrointestinal mature.
Atténuation du déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer par l’exercice physique : corrélats biologiques chez la souris modèle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.
Objectifs
Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.
Procédures
Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.
Devenir
A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.
Remplacement
Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.
Elevage de souris modèles de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) de phénotype dommageable pour l’étude de l’implication des cellules microgliales/macrophages dans cette maladie.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Maintenir une lignée de souris qui perdent leur force musculaire puis se paralysent vers 165 jours de vie, pour approvisionner d'autres protocoles : 2 164 souris vont être utilisées, 2 044 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 120 d'un niveau sévère. L'acte déclaré se limite à une biopsie de la queue de deux minutes sur animal vigile, pour le génotypage. La sévérité tient au phénotype lui-même, qui touche la moitié des 2 160 souriceaux issus des accouplements prévus sur cinq ans. Les souris porteuses du génotype recherché passent en "utilisation continue" dans d'autres projets, les autres sont tuées, anciens reproducteurs compris.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave, caractérisée par la mort des motoneurones entrainant une paralysie et le décès des patients en 2 à 5 ans. Les cellules microgliales, macrophages du système nerveux central (SNC) sont activées au cours de différentes maladies neurodégénératives incluant la SLA. Ces cellules sont capables de sécréter des facteurs trophiques ou toxiques pour les motoneurones. La modulation de l’activité des cellules microgliales et des macrophages dans la SLA a montré des bénéfices et l’étude de ces mécanismes doit être poursuivie. Le modèle SLA de souris transgéniques à phénotype dommageable, permet d’étudier les phénomènes complexes liés aux cellules microgliales et macrophages et leurs interactions avec les motoneurones. L’utilisation de ce modèle animal est donc indispensable. Ce projet a pour but de maintenir cette lignée de souris transgéniques afin de fournir une quantité suffisante d’animaux pour étudier les rôles des cellules microgliales et macrophages dans la SLA.
Bénéfices attendus
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative actuellement incurable entrainant une paralysie progressive et la mort des patients en moyenne en 2 à 5 ans. La SLA touche 8000 personnes en France avec une prévalence de 4/100000 personnes. L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie dans un modèle de souris de SLA, en ciblant les macrophages, cellules immunitaires des tissus par différentes stratégies. Un bénéfice du remplacement des macrophages des souris SLA par des macrophages moins toxiques a été montré dans ce modèle. L’utilisation de molécules pharmacologiques pour moduler la réponse toxique des macrophages ou cibler des gènes spécifiques dans les macrophages pourrait donc être bénéfique et transférable en clinique. Notre hypothèse de cibler les macrophages permettrait de ralentir la progression de la maladie chez les souris SLA. Le modèle de souris utilisé est un modèle qui reproduit de façon relativement fidèle, les différents stades de la sclérose latérale amyotrophique chez l’homme. C'est donc un modèle très utile pour tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques et étudier les mécanismes cellulaires complexes qui conduisent à la dégénérescence des neurones moteurs.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (animal vigil, 2 minutes). Dans de rare cas, un reprélèvement à la queue pourra être réalisé (animal vigil, 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris auront : 1) Un prélèvements pour génotypage : biopsie caudale. De la douleur légère de courte durée peut être ressentie lors de ces biospies. Lors de la contention, les animaux peuvent ressentir un stress de courte durée lors de leur manipulation. 2) Un phénotype dommageable entrainant la perte de force musculaire et la paralysie progressive de l'animal vers 165 jours de vie.
Devenir
Les animaux avec un génotype d'intérêt seront utilisés dans un projet de recherche autorisé par le ministère. Les animaux passant dans les projets de recherche autorisés seront alors en utilisation continue. Les autres animaux sans génotype d'intérêt qui n'auront pas pu être utilisés dans d'autres projets seront euthanasiés par une méthode réglementaire adaptée à l'âge des animaux ainsi que les anciens reproducteurs. Les accouplements sont réalisés pour produire au maximum des animaux d'intérêt.
Remplacement
Nous avons déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester avant de passer à l’expérimentation sur le modèle de souris. Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles nos projets nécessitent l’utilisation de souris à phénotype dommageable modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA).
Réduction
Nous utiliserons, dans ce projet, un nombre minimal d’accouplements pour pouvoir (i) obtenir ce nombre minimal d’animaux pour les projets associés et (ii) conserver les lignées qui ne se reproduisent que pendant un temps limité soit 120 mâles pour les 5 ans. Ces accouplements donnerons naissances à 2160 souriceaux pour le génotype invasif dont 50 pourcents qui seront à phénotype dommageable. Ainsi 2164 animaux seront utilisés pour ce projet (4 mâles fondateurs et 2160 descendants). Le nombre d'accouplements lancés est systématiquement revu en fonction du nombre d'animaux déclarés dans les projets de recherche. Les animaux sans génotype d'intérêt seront réutilisés en priorité (contrôles négatifs de nos études ou projets d'autres équipes de recherche ou projet de tutorat). Une lignée peut être maintenue en entretien minimum uniquement avec la validation de la structure bien-être animal (SBEA). Ce projet étant un projet d'élevage, il n'y aura pas de tests statistiques réalisés. Les tests seront réalisés dans le cadre des projets expérimentaux autorisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés conformément à la réglementation avec température et hygrométrie contrôlée, cycle jour nuit 12h 12h, avec au maximum 5 animaux par cages. Chaque cage contient au moins deux éléments d'enrichissement : nid en carton et bâton à ronger. La surveillance quotidienne du bien-être animal est prise en charge par un personnel dédié au soin et à l’expérimentation. Une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Dès les premiers signes de paralysie, les mâles seront placés en cage avec litière de cellulose et des croquettes seront disposées au fond de la cage. Des points limites clairs sont mis en place pour limiter la souffrance des animaux. Les animaux sont vérifiés quotidiennement.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons, mouches, vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat. C’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Tous les souriceaux, mâles et femelles, seront principalement identifiés et génotypés entre l’âge de 15 jours et 3 semaines. Les souris mâles positives pour le gène d'intérêt sont utilisées au stade adulte (entre 50 et 130 jours pour la reproduction durant leur période de fertilité maximale). Les femelles positives entreront dans une procédure expérimentale entre leur 28eme et leur 50eme jour de vie car les souris sont sevrées à 28jours de vie au plus tard et doivent entrer en procédure avant 50 jours de vie (moment du début du suivi du développement de la maladie (stade présymptomatique).
Evaluation pharmacologique de molécules anti-virales et de vaccins pour le traitement de la Covid-19 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées par le SARS-CoV-2, 3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont soit maintenues immobiles quarante minutes dans une chambre de contention, le nez dans le flux d'air, soit anesthésiées pour une instillation nasale, puis reçoivent chaque jour pendant dix jours un composé ou un vaccin avant le prélèvement des organes. Le projet est vendu comme prestation de service : doses, voie d'administration et fréquence sont fixées avec le client, académique ou privé, ce qui empêche le porteur d'annoncer le nombre et la durée des interventions. Le virus se multiplie dans les poumons et provoque inflammation, lésions et difficultés respiratoires, et le porteur revendique un "besoin urgent d'études in vivo" pour "pérenniser la plateforme technologique".
Objectifs
Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouveaux vaccins et de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 est décrit dans la littérature. Ces souris sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de péréniser la plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus sont utilisées pour tester de nouveuax vaccins et de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de continuer à contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19.
Procédures
Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois (durée d’environ 1 minute). Les nouveaux vaccins et les nouvelles molécules potentiellement antivirales seront testés selon la voie d’injection définie en accord avec le client fournisseur. Les doses et la fréquence d’administration dépendent des composés et de l'étude. Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée. Pour des procédures dites « classiques », les animaux reçoivent une infection, une administration de molécules ou vaccins tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
L’infection des souris peut se faire soit : - Par instillation intranasale, des nuisances modérées, (durée 1 minute), sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre). - Par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres pendant 40 min et induit un stress modéré. La préhension et la contention afin de procéder aux diverses injections ou gavage engendre un stress modéré (durée 1 minute). La pesée des animaux (durée 1 minute) entraine un stress léger. Suite à l’infection des souris, le virus se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Les effets attendus sont : altération de l’état général et difficultés respiratoires. L’effet cumulatif de ces actes sur un même animal (infection, injections et développement de l’infection, pesée) entraine des nuisances sévères
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouveaux vaccins ou de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sou d'un vaccin sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances et de vaccins, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 3000 sur 5 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales/vaccins à tester, doses différentes de la molécule antivirale/vaccins). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée à la procédure expérimentale par l'utilisation d'anesthésique pendant l’infection, lors des différentes injections des traitements potentiels. Pour l’infection des souris par nébulisation les souris sont mises en place dans les tubes de contention par du personnel habitué à l’utilisation de l’appareil ce qui réduit le stress des animaux. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites précoces seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie. Des souris adultes si possible, âgées entre 5 à 10 semaines seront utilisées pour ce projet.
Etudes d’Imagerie et de Spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire des muscles squelettiques et cardiaque dans les modèles canins de maladies neuromusculaires
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
129 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, puis renvoyés à leur établissement d'origine : 49 mâles atteints de dystrophie musculaire, 40 femelles porteuses de la mutation et 40 chiens sains. Chaque examen d'IRM dure jusqu'à trois heures sous anesthésie générale, avec induction par injection, intubation et parfois injection d'un produit de contraste. Le porteur décrit une méthode non invasive et atraumatique, tout en listant le stress de la pose de voie veineuse, l'irritation liée à l'intubation et le risque d'hypothermie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la structure du muscle squelettique ou du cœur, et conclut que les modèles canins restent "irremplaçables".
Objectifs
Les objectifs principaux de ce projet sont l'évaluation des méthodes non invasives pour caractériser structure et fonction des muscles dans des modèles pertinents de pathologies musculaires et établir des mesures fiables, voire des biomarqueurs qui décrivent le stade d'avancement de la maladie et son évolutivité. D'autre part, ces modalités seront utilisées pour evaluer un traitement innovant visant à rduire la fibrose musculaire
Bénéfices attendus
L’imagerie et la spectroscopie par résonnance magnétique représentent des techniques d’évaluation intrinsèquement non invasives et atraumatiques. L’utilisation d’un scanner à tunnel large et haute résolution permettent une évaluation corps entier ce qui permet donc d’avoir une bonne appréhension de la répartition des lésions musculaires. Le recours à diverses séquences permet d’obtenir divers contrastes ce qui traduit diverses propriétés des muscles. L'IRM devrait à terme aboutir à la définition de nouveaux biomarqueurs et d'établir des données de références permettant un diagnostic précoce par une méthode non invasive. Le développement de séquences entrelacées permet un raffinement supplémentaire de ces approches en raccourcsissant les durée d'examen. Le développement de nouveaux biomarqueurs devrait aider à l'évaluation de traitements innovants qui font encore défaut dans le contexte des maladies neuromusculaires.
Procédures
Une cohorte de chiens sera utilisée pour evaluer et valider de nouvelles méthodes d'imagerie médicale. Elle se décompose en chiens sains (M et F), de chiennes porteuses de la mutation et de chiens mâles atteints de la maladie. L’examen IRM (imagerie par résonnance magnétique), du fait de sa nature non invasive n’induit pas de douleur, mais une sédation est requise pour éviter les mouvements durant les acquisitions de données et améliorer le confort de l’animal. Les chiens seront donc endormis par médicament injectable, intubés et l'anesthésie entretenue par inhalation d’un anesthésique sous forme gazeuse. La durée de prépartion d'un chien est d'environ un quart d'heure. Un monitorage cardio-respiratoire continue ainsi que la surveillance de la température corporelle sont mis en place durant tout l'examen. Certaines séquences d'imagerie font appel à l'injection d'un produit de contraste. La durée d'un examen complet est limitée à 3 heures.
Impact sur les animaux
L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est certes non invasive et non douloureux, mais nécessite l’immobilité, d’où le besoin d’une anesthésie. L’induction de l’anesthésie par injection pourrait être source de stress et d’une douleur de courte durée au point de ponction de la voie intraveineuse. De même, la nécessité d’intuber pourrait causer une légère irritation. L’anesthésie nécessaire pour l’imagerie pourrait entrainer une hypothermie liée à l’immobilité et dans de rares cas de complications. Certaines séquences d’imagerie pourront nécessiter l’injection de produit de contraste pour l’IRM, ce qui ne devrait pas impacter l’animal (produit utilisé en pratique vétérinaire clinique).
Devenir
Tous les animaux retourneront à leur établissement d'origine qui gère la surveillance des chiens. La gestion des animaux en dehors de l'imagerie reste sous la responsabilité de l'équipe vétérinaire et n'implique pas le laboratoire de RMN. L'imagerie in vivo par une méthode non invasive comme l'IRM s'incrit dans ce contexte.
Remplacement
L’imagerie/spectroscopie par RMN répond au critère ‘remplacement’ de la règle des 3R en permettant de s’affranchir des prélèvements pour un grand nombre d’évaluations du tissu musculaire ; l’histologie tout comme la biochimie restent des méthodes invasives pouvant nécessiter l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles canins gardent ainsi une place irremplaçable aussi bien pour la recherche fondamentale que pour les études précliniques en thérapeutique. car ils présentent des similitudes phénotypiques avec les pathologies humaines (fibrose, cycles de dégénérescence / régénérescence des fibres musculaires, atteinte cardiaque et respiratoire, …).
Réduction
La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiparamétriques chez l’animal vivant, et représente une des caractéristiques singulières de la méthode RMN. Il est ainsi possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie, d’extraire plusieurs caractéristiques du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de répéter un examen sur un même animal sans effets nocifs pour celui-ci rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces trois spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de ‘réduire’ le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R. Les nouvelles modalités d’imagerie/spectroscopie par RMN nécessiteront une validation chez des animaux sains (mâles et femelles (20 + 20), des femelles porteuses de la mutation (40) et des animaux malades mâles (49), soit un total de 129 chiens. De ce sous-groupe de chiens ayant la maladie génétique, une cohorte (9) sera incluse dans un essai thérapeutique basée sur une approche de thérapie cellulaire. Le nombre total d’individu est estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques.
Raffinement
L’inclusion des animaux se fera selon des critères d’inclusion qui sont clairement établis en amont des examen RMN par l’équipe promotrice. En résumé, le statut génétique est établi et un examen clinique doit permettre d’établir un phénotype clairement décrit. Les animaux prévus ici devraient ainsi présentés un phénotype modéré. Toutefois en cas de dégradation de l’état clinique lié à la pathologie ou de survenue d’une pathologie intercurrente, les animaux seront exclus de notre protocole. En soi l’imagerie/spectroscopie par RMN est un examen non invasif et atraumatique. La RMN répond donc au critère de ‘Raffinement’, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques. Toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie par inhalation afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress lié à l’examen. L’anesthésie bénéficie d’un monitorage cardio-respiratoire continue jusqu’au réveil de l’animal. Certains examens peuvent nécessiter l’injection d’un produit de contraste. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant. Fréquence respiratoire et saturation périphérique en oxygène sont contrôlés en permanence pendant toute la durée de l’examen. La surveillance clinique est assurée jusqu’au réveil complet de l’animal et les animaux pourront retourner à leur lieu d’hébergement habituel. Les chiens restent donc sous la surveillance constante du vétérinaire qui aura toute liberté d’interrompre un examen s’il le juge nécessaire.
Choix des espèces
Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et de tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. La règlementation sur le développement médicamenteux prescrit le recours à une expérimentation in vivo pertinente pour la pathologie humaine ciblée. Les modèles canins des maladies neuromusculaires, tels que le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), sont très utilisés dans la recherche sur les pathologies neuromusculaires. En effet, le phénotype sévère lié à l’absence de dystrophine, observé chez ces animaux, présente des similitudes importantes avec l’expression de la maladie chez l’homme. Afin de diagnostiquer le plus tôt possible la pathologie neuromusculaire, les examens qui vont être évaluer ont recours à des chiens peu symptomatiques, d'un âge adultes jeunes.
Etude par imagerie de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à six séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse et quinze tests comportementaux. 75 d'entre elles reçoivent un composé qui déclenche une épilepsie, les 63 autres formant le groupe témoin. Les crises attendues sont focales et non convulsives, les souris cessant leur activité en cours, et les tests mesurent l'activité motrice, la dépression et l'anxiété. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et corréler l'imagerie aux analyses immunohistochimiques.
Objectifs
L'épilepsie, une maladie neurologique fréquente touchant environ 1% de la population et générant 100 nouveaux cas annuels pour 100 000 habitants, demeure une condition potentiellement sérieuse dont les mécanismes moléculaires et cellulaires restent encore mal compris. De fait, les traitements médicamenteux actuels se limitent principalement à des approches symptomatiques. Notre démarche vise à approfondir notre compréhension de l'épilepsie tout en identifiant de nouvelles voies thérapeutiques potentielles, en mettant particulièrement l'accent sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires cérébraux. L’imagerie fonctionnelle se présente comme un outil puissant pour explorer in vivo divers mécanismes cérébraux. Ainsi, la tomographie par émission de positons (TEP), largement utilisée en médecine nucléaire, permet de suivre au cours du temps différents paramètres dans les différentes régions du cerveau. Dans le cas de l’épilepsie, la TEP est particulièrement intéressante pour observer : • Le métabolisme des cellules du cerveau, un indicateur de leur activité ; • La concentration en synapses, ces zones de transmission d’information entre neurones ; • L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, la barrière naturelle qui protège le cerveau. Le choix du radiotraceur varie en fonction du paramètre que l’on souhaite suivre. L'objectif de ce travail consiste à appliquer cette méthode d'imagerie, déjà développée et appliquée dans notre laboratoire, y compris chez l'Homme, à un modèle rongeur d'épilepsie bien caractérisé. Cette approche permettra d'identifier les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie neurologique, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques. De plus, nous réaliserons des tests de comportement afin de corréler les données de l’imagerie à des symptômes cliniques. Les tests de comportement, tels que l'évaluation de l'anxiété, de la dépression et de l’activité motrice, sont essentiels pour comprendre les comorbidités neurocomportementales de l’épilepsie. Ils permettent de mesurer l'impact des crises sur le comportement et de développer des interventions thérapeutiques adaptées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à élucider les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans l'épilepsie, en établissant une corrélation entre ces dysfonctionnements et les comportements manifestés par les animaux. De plus, cette approche permettra d'identifier la méthode d'imagerie la plus pertinente pour une poursuite du développement chez l'homme. À terme, cette étude ouvrira la voie à l'exploration in vivo de ces mécanismes chez des patients atteints d'épilepsie, avec l'objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait ainsi contribuer à l'avancement des traitements et à l'amélioration de la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : - Administration (75 animaux, durée 25 minutes) d’un composé induisant une épilepsie pour le groupe épilepsie tandis que le groupe témoin (63 animaux, durée 25 minutes) ne recevra pas de composé induit une épilepsie. - Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 imageries maximales par animal) - Injection d’un radiotraceur (1 minute) - Les rongeurs seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de mesurer 1) l'activité motrice (durée du test = 10 minutes, 15 tests comportementaux maximales par animal), 2) la dépression (test de 6 minutes) et 3) l’anxiété (test de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - des crises épileptiques principalement focales et non convulsives (les souris cessent leur activité en cours) ; - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des analyses immunohistochimique permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans l’épilepsie et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes d’un dysfonctionnement cérébral. Les modèles animaux permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Il n’existe pour l’instant pas de méthode alternative capable de faire ces observations.
Réduction
Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum), ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en ne compromettant pas une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Deux semaines d’acclimatation sont prévues après la livraison et avant de débuter le protocole. Un suivi régulier permettra de repérer une éventuelle souffrance animale et de prendre en charge l’animal concerné dans les plus brefs délais. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Des analgésiques seront également administrés avant et après la chirurgie. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections neurologique. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP ainsi qu’à l’étude comportementale. Plus particulièrement : - les rongeurs sont particulièrement appropriés pour ce type d'étude en raison de leur taille, de leur facilité d'hébergement et de manipulation ; - il existe de nombreux tests comportementaux standardisés chez les rongeurs pour mesurer les comportements dépressifs et anxieux. Ces tests permettent de corréler efficacement les données d'imagerie avec les symptômes cliniques observés dans l'épilepsie, offrant ainsi une compréhension plus complète des mécanismes physiopathologiques et des comorbidités comportementales associées à cette maladie. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).
Etude des mécanismes conduisant à l’élimination rapide des plaquettes transfusés lors d’un état réfractaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris sont saignées à l'aorte sous anesthésie générale puis tuées sans reprendre conscience, leurs plaquettes étant transfusées à 198 autres souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces dernières subissent cinq prélèvements à la queue étalés sur les deux heures qui suivent la transfusion, une partie recevant d'abord une injection par semaine pendant trois semaines pour provoquer une réaction immunitaire. Pour les donneuses, le porteur retient des mâles, à âge égal plus lourds que les femelles et donc porteurs d'un volume sanguin plus grand. Aucune n'est gardée en vie, le prélèvement étant terminal et les receveuses ne pouvant plus être réutilisées une fois leur système immunitaire stimulé.
Objectifs
.Les patients pris en charge dans le cadre d'une chimiothérapie myelosuppressive ont besoin d'un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Cependant, dans certains cas, les plaquettes transfusées sont très rapidement éliminées de la circulation sanguine du receveur et la transfusion se révèle inefficace sur un plan thérapeutique, c'est ce qu'on appelle un état réfractaire. Les mécanismes liés à cette élimination ne sont pas totalement compris et cette absence de connaissances représente donc un réel frein au développement de stratégies thérapeutiques. Les objectifs de ce projet sont donc de pouvoir étudier finement les mécanismes qui conduisent à l'élimination des plaquettes transfusées. Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de modéliser l'état réfractaire chez le rongeur afin de pouvoir disposer d'un modèle pré-clinique qui nous permettra de tester différentes stratégies thérapeutiques dans le cadre de la prise en charge des patients en état réfractaire.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients en état réfractaire repose actuellement sur la transfusion d'un produit plaquettaire dit "compatible" avec le receveru. C'est une solution qui n'est pas satisfaisante car elle ne peut pas être mise en place en cas d'urgence et requiert des ressources qui sont par définition limitées (le nombre de produit compatible par receveur est extrêmement restreint). Le bénéfice de ce projet à long terme pourra être une meilleure prise en charge des patients présentant un état réfractaire en utilisant des stratégies thérapeutiques efficaces pour amilorer l'efficacité transfusionnelle.
Procédures
Il n'y aura aucune procédure faite sur animaux vigiles, les animaux recevront une anesthésie . Il n'y a pas de procédures chirurgicales avec réveil, les animaux subiront sous anesthésie générale un prélèvement à l'aorte (souris donneuses de plaquettes) qui dure moins de 5 minutes. Les souris receveuses subiront (sous anesthésie) une transfusion de plaquettes sanguines avec ou non un traitement pharmacologique puis des prélèvements à la queue itératifs sur les 2h suivant la transfusion (prélèvements à 1', 5', 15', 30', 2h).
Impact sur les animaux
Pour toutes les procédures, un stress lié aux manipulations est possible ainsi qu'un effet de l'anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Dans le cadre de la procédure liée à l'alloimmunisation, les injections répétées (une injection par semaine pendant 3 semaines consécutives) peut être associée à un risque de lésion au niveau du site d'injection. Il n'y a pas de nuisance attendue aux différents traitements reçus pour prévenir l'état réfractaire.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures. Les animaux subissent en effet soit un prélèvement sanguin terminal ou des transfusions plaquettaires. Pour ces derniers, il n'est pas possible de les réutiliser dans d'autres expériences car il y a eu une stimulation du système immuniataire (production d'anticorps).
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est de comprendre les mécanismes d'action des anticorpsconduisant à l'élimination des plaquettes transfusées. Cette question ne peut être abordée qu'in vivo Cette question ne peut être abordée qu'in vivo puisque l’élimination des plaquettes se fait dans un système intégré (circulation sanguine, composés plasmatiques, macrophages tissulaires). Cependant, nous avons mis au point des tests d'activation plaquettaire en réponse aux anticorps in vitro. ces tests seront mis à profit pour déterminer les doses des différentes molécules candidates à administrer pour prévenir l'état réfractaire.
Réduction
Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Si l’état réfractaire est totalement inhibé avec une des approches, les conditions où plusieurs approches sont combinées ne seront pas testées. Le critère recherché est le temps de circulation de plaquettes in vivo. Nous effectuons donc une comparaison des courbes d’élimination des plaquettes en fonction du temps dans les souris traitées versus les souris non traitées Les effectifs ont été calculés au plus juste en tenant compte de la variabilité déjà observée dans ce genre d'expériences. Afin de réduire au maximum le nombre de souris donneuses, nous privilégierons les souris donneuses mâles. A âge équivalent, elles ont un poids plus important que les souris femelles et donc un volume sanguin plus important, ainsi nous pouvons isoler une quantité suffisante de plaquettes sanguines en utilisant moins d’animaux.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Pour réduire le stress provoqué par la manipulation des animaux, ceux-ci auront une phase d’habituation à la contention et à la manipulation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par la mise en place de nourriture de type « pâté » 3 jours avant le début des expérimentations faisant intervenir une chirurgie • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation. • Par l’injection d’analgésique et d’antalgique avant chaque procédure chirurgicale • Par application d’ocrygel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signes de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure . Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés, notamment les modèles de transfusion. Puisque nous souhaitons mimer la différence d’haplotype entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire. De plus,le modèle d’allo-immunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les souris donneuses de plaquettes seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Les souris receveuses seront utilisées au stade adulte entre 7 et 20 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte et à une période où les souris n'ont pas un poids trop important qui nécessiterait d'injecter beaucoup plus de plaquettes et/ou des différentes molécules testées dans ce projet (nous utiliserons des souris dont le poids est compris entre 18 et 25g)