Recherche fondamentale

Trois à quatre chirurgies de trois à cinq heures chacune, sur le même animal : 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit d'abord une IRM sous anesthésie, puis les interventions permettant d'implanter des électrodes de stimulation et d'enregistrement dans son cerveau. Il s'agit de cartographier deux populations de neurones du globus pallidus externe, dont la connectivité reste mal connue. Les six animaux sont ensuite tués sous anesthésie profonde, leur cerveau retiré du crâne et congelé, seule façon selon le porteur de localiser les sites d'enregistrement.

Objectifs

Le globus pallidus externe est une structure cérébrale qui joue un rôle central dans le contrôle de nos comportements. Son fonctionnement est également perturbé dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques. Longtemps, on a pensé que cette région du cerveau ne contenait qu’un seul type de neurones. Cependant, des recherches récentes menées chez les rongeurs, les primates non humains et même chez l’humain ont révélé la présence de deux catégories distinctes de neurones. Malgré cela, leur connectivité (c’est-à-dire les zones du cerveau auxquelles chaque type de neurone envoie des signaux), leur rôle dans les fonctions cérébrales, et l’impact potentiel de leur dysfonctionnement restent encore à determiner. Pour y parvenir, nous allons donc stimuler différentes zones du cerveau et observer comment ces stimulations influencent l’activité des deux types de neurones chez des singes anesthésiés. Ce projet se deroulera sur 2EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les connexions dans le cerveau de deux populations de neurones distinctes qui composent une région cérébrale essentielle dans le contrôle de nos comportements et dont le dysfonctionnement est mis en cause dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques humaines. L'étude de cette connectivité anatomique chez les primates non humains revêt donc une importance translationnelle significative. En effet, les primates non humains disposent d'un large éventail de comportements, proches de ceux de l'homme, et leur cerveaux présente une organisation similaire à celle de l'humain. Cela permettra donc d'étendre les conclusions de cette recherche à l'homme et participer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrants d'un dysfonctionnement de cette région du cerveau.

Procédures

Chaque animal subira une imagerie par résonnance magnétique pour obtenir une image morphologique en 3 dimension du cerveau (15min de transport et 60min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à 3 à 4 chirurgies d'une durée de 3 à 5h chacune. Chaque chirurgie permettra l’enregistrement de l’activité neuronale (quelques minutes) durant la procédure de stimulation cérébrale, c'est-à-dire durant l’application impulsions électriques monophasiques uniques de faible intensités, sans danger pour l’animal (durée de 0.1-0.3 ms, intensité de 0.05-0.5 mA) à des fréquences de 0.1-1Hz

Impact sur les animaux

Au cours de la procédure d'imagerie par résonnance magnétique, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. De plus, des douleurs/infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales pour le placement des électrodes d'enregistrement et de stimulation.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet à pour but de caractériser l'anatomie/connectivité d'une structure du cerveau qui contrôle nos comportements et qui dysfonctionne dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et de faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à normaliser son activité chez des patients souffrant de son dysfonctionnement. De ce fait, le recours au PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) est nécessaire.

Réduction

Pour mener notre étude, nous avons réduit au minimum le nombre d'animaux utilisés en planifiant soigneusement et en maximisant les données recueillies pour chaque animal. Comme nous ne disposons pas de données préalables dans la littérature pour déterminer précisément la taille de l'échantillon, nous avons choisi une méthode statistique qui recommande un échantillon de 5 à 10 animaux pour garantir des résultats fiables, et nous avons décidé d'utiliser six animaux. Ce petit nombre est suffisant pour des tests statistiques valides dans notre domaine, où les études sur les primates non humains utilisent souvent 3 à 5 animaux à cause de leur complexité.

Raffinement

Les singes seront hébergés dans des conditions standard (cycle lumière/obscurité de 12h avec lumière allumée de 7h00 à 19h00, ~ 60% d'humidité et ~ 22°C). Les animaux seront hébergés en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique, fourrage). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à proximité de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Durant le transport et l'acquisition de l'imagerie par résonnance magnétique (15min de transport + 60min de procédure), les constantes physiologiques de l'animal seront contrôlées à l'aide d'un oxymètre. La chirurgie sera réalisée de façon stérile et sous anesthésie profonde à l'isoflurane/oxygène, après une induction à la kétamine. Une couverture antalgique avec de la Buprénorphine en préopératoire et du Metacam en postopératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Nous administrons un anesthésique local avant incision. Une sonde sera insérée dans le rectum des animaux pour contrôler la température. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. La perte de poids, la déshydratation, la perte de poils et/ou un repli sur soi inhabituel entraineront une surveillance accrue de l'animal et les mesures nécessaires seront prises de concert avec le vétérinaire. Si la situation ne se normalise pas, l'animal sortira immédiatement du protocole.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertebrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation corticale et un réseau des ganglions de la base semblables à celle de l'homme. Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur des animaux de plus de 36 mois, âge où leur système nerveux central est mature. Cela garantit une meilleure comparaison des résultats avec les caractéristiques observées chez l'adulte humain.

1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraire leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent de douze à vingt-six injections ou gavages et développent des symptômes de dépendance aux opiacés et de sevrage. L'objet est d'identifier des traitements facilitant l'abstinence et limitant les troubles de l'humeur qui accompagnent la dépendance. Le porteur annonce quatre tests comportementaux, d'une durée de six à quarante-cinq minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

Les troubles de consommations aux opiacés sont en forte augmentations ces dernières années et ont des conséquences dévastatrices. Ce projet de recherche vise à identifier de nouveaux traitement pouvant limiter le développement des troubles de l’humeur (en particulier dépression) qui se développent lors de la mise en place d’une dépendance aux opiacés. Les opiacés agissent sur le « système opioïde » dans le cerveau. En conditions normales, ce système neuromodulateur régule la douleur, les processus de récompense, les réponses émotionnelles et les réponses au stress. L’exposition aux opiacés altère le fonctionnement de ce système, ce qui conduit aux troubles du comportement et de l'humeur. L’objectif de ce projet consiste à comprendre le développement de ces pathologies, en identifiant des traitements pouvant faciliter l'abstinence aux opiacés, en utilisant des modèles murins. Ce projet sera conduit en respectant la règle des 3R (remplacer –réduire –raffiner) visant à remplacer ou réduirechaque fois que possible le nombre d’animaux, ainsi qu’à optimiser les procédures pour minimiser l’inconfort des animaux tout en permettant d’étudier l’effet de l’exposition aux opiacés sur l’état émotionnel des animaux au long court (4 semaines).

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver des nouveaux traitements pour faciliter l'abstinence aux opiacés et ainsi limiter les symptômes de désespoir et ainsi éviter la rechute ou re-consommation de substance pouvant mener à la mort par overdose des personnes avec des troubles de consommation.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections ou des gavages (de 12 à 26) et à des tests comportementaux (4). La durée d'une injection ou d'un gavage est de 30 secondes et un test comportemental dure de 6 minutes à 45 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction et de sevrage pouvant entrainer une douleur considérée comme modérée. Les injections répétées pourront également un stress modéré.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin d'extraire le cerveau pour des analyses moléculaire.

Remplacement

"Remplacement" : Pour résoudre ce projet, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale mais aussi celle structurelle du système nerveux, notamment avec les réseaux complexes de structures interconnectées dans le système nerveux central chez l’Homme. Les modèles cellulaires ne nous permettraient pas de réaliser des études comportementales ni de reproduire cette complexité structurelle (multiples structures cérébrales impliquées). Il en va de même pour les effets moléculaires des opiacés, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, qui ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.

Réduction

"Réduction" : Les animaux utilisés étant de même parenté sanguine permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 15 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif. De plus, chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors que l’addiction aux opiacés est plus fréquente chez l’homme que chez la femme, on sait très peu de choses sur les mécanismes neurobiologiques qui pourraient différer selon le sexe et contribuer à expliquer cette différence de vulnérabilité. Sur le plan éthique, il apparait essentiel d’aborder systématiquement cet aspect sur le plan de la recherche fondamentale, aussi bien pour maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension de l’addiction aux opiacés chez l’homme, que pour l’utilisation de tous les animaux obtenus lors de la reproduction de la lignée de souris que nous utiliserons.

Raffinement

"Raffiner" : Nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés aversives des opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, des papiers absorbants et un dôme pour faire un nid. Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs. Les souris seront également habituées aux expérimentations . Les sites d'injections seront alternés (gauche/droite) et des aiguilles à usage unique seront utilisées. Les souris seront laissées un minimum deux semaines d’acclimatation dans leur arrivée dans la zone d’expérimentation. En cas de bagarre importante les animaux seront séparés.

Choix des espèces

La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome. Les souris sont un modèle privilégié pour la recherche biomédicale et sont désormais utilisées comme modèles standard pour l'étude de la fonction neuronale et des réponses comportementales associées en conservant une complexité structurelle et intégrative intacte du système nerveux. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés. Les souris seront adultes, car l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures et adultes.

Injection de cellules tumorales au premier jour, puis deux fois par semaine une injection de marqueur et une imagerie du corps entier sous anesthésie, pendant quatre semaines au plus : 894 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs pulmonaires qui se développent peuvent occasionner une gêne respiratoire. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem, l'objet étant de comprendre comment des macrophages vieillissants favorisent le cancer du poumon chez les personnes âgées. Le calcul annoncé, vingt-quatre souris par condition et cinq génotypes comparés, laisse de côté les trente souris consacrées au seul choix de la lignée de cellules tumorales.

Objectifs

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Il est particulièrement fréquent chez les personnes âgées : 50 % des cas sont diagnostiqués chez des patients de plus de 70 ans. Nous souhaitons donc étudier le développement du cancer du poumon dans le contexte du vieillissement. Les macrophages sont un type de cellules du système immunitaire inné, ce qui signifie qu'ils peuvent réagir rapidement et immédiatement à des menaces telles que l'invasion d'agents pathogènes. Il est également connu que les macrophages se trouvent souvent à proximité de tumeurs en développement. Récemment, des chercheurs ont découvert que dans le cancer du poumon, les macrophages sénescents s'accumulent et favorisent la croissance de la tumeur et la progression de la maladie. La sénescence est un état souvent observé dans les cellules des personnes et animaux âgées. Les cellules sénescentes cessent de se diviser, accumulent des dommages et changent de morphologie et de fonctionnalité. On ne sait toutefois pas comment ces macrophages "âgés" contribuent au développement des tumeurs pulmonaires. Pour répondre à cette question, nous utiliserons différents modèles génétiques de souris qui provoquent un vieillissement accéléré spécifiquement dans les macrophages pulmonaires, mais pas dans les autres cellules du tissu. Nous étudierons le développement de tumeurs chez ces souris et les caractéristiques différentielles des macrophages jeunes et vieux dans ce contexte. Globalement, ce projet vise à découvrir comment les changements liés à l'âge dans le système immunitaire inné contribuent au développement de tumeurs pulmonaires, ce qui ouvrira la voie à de futurs traitements anticancéreux potentiels adaptés aux personnes âgées.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est responsable de la plupart des décès liés aux tumeurs dans le monde. L'âge élevé est l'un des principaux facteurs de risque de son développement et de sa progression, 50 % des cas étant diagnostiqués chez des patients âgés de plus de 70 ans. On sait que les macrophages pulmonaires sénescents, qui s'accumulent au cours du vieillissement de l'organisme, jouent un rôle pro-tumorigène dans le carcinome pulmonaire non à petites cellules, le type de cancer du poumon le plus courant. Mais jusqu'à présent, on ne comprend pas comment ils contribuent au développement de la tumeur. Dans ce projet, nous visons à identifier les caractéristiques des macrophages sénescents qui favorisent la croissance des tumeurs pulmonaires. Cela nous aidera à comprendre pourquoi les organismes âgés sont plus enclins à développer des tumeurs pulmonaires et quel rôle le système immunitaire inné joue dans ce processus. À long terme, ce projet permettra d'accroître nos connaissances sur la manière de prévenir la progression du cancer dans des conditions de vieillissement du système immunitaire et de développer des options de traitement immunothérapeutique spécifiquement adaptées aux personnes âgées. Étant donné que les macrophages sont des cellules résidentes dans tous les tissus et que le vieillissement est un facteur de risque pour de nombreuses maladies, nous nous attendons à ce que ce travail ait un large impact et soit pertinent au-delà du cancer du poumon.

Procédures

Chaque animal recevra une injection de cellules tumorales au début de l'expérience (durée du geste : environ 10 secondes). À partir du troisième jour après l'injection, la taille de la tumeur sera contrôlée deux fois par semaine, ce qui nécessite l'injection d'un produit de marquage (durée du geste : inf à 10 sec) et la réalisation d'une imagerie non invasive du corps entier sous anesthésie (durée de l’anesthésie :10 minutes). La durée maximale de l'expérience est de 4 semaines.

Impact sur les animaux

L'injection intraveineuse de cellules tumorales et l'injection de produits de marquage pour l’imagerie peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d'injection. Les animaux auxquels on a injecté des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires qui pourront occasionner une gêne respiratoire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Nous nous intéressons à la réponse systémique du système immunitaire au développement de tumeurs pulmonaires. Cette réaction ne peut être étudiée que dans un organisme entier, avec une circulation lymphatique et sanguine intacte, une hématopoïèse active (formation de nouvelles cellules immunitaires par la moelle osseuse) et des poumons fonctionnels. l De nombreuses méthodes requises pour le projet proposé ainsi que des modèles génétiquement modifiés pour nos protéines d'intérêts ne sont disponibles et établis que chez la souris.. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis dans la littérature, ce qui fait de la souris un organisme modèle approprié. Dans la mesure du possible, nous utiliserons des alternatives in vitro à l'expérimentation animale, telles que la co-culture de macrophages et de cellules tumorales. Nous disposons déjà de premiers résultats utilisant ce système in vitro (sphéroïdes, formés à partir de la co-culture de cellules tumorales et de macrophages), qui renforcent nos hypothèses. Cependant, ce système est trop simplifié pour comprendre pleinement les adaptations que les macrophages du poumon et d'autres composants du système immunitaire subissent in vivo en réponse au développement de tumeurs. En outre, nous prévoyons de remplacer la microscopie in vivo par des approches d'imagerie ex vivo, qui réduisent le nombre de procédures sur les animaux vivants, mais qui nécessitent toujours l'induction et la surveillance de tumeurs in vivo.L'expérimentation animale ne peut donc pas être entièrement remplacée par des alternatives in vitro.

Réduction

Nous avons déterminé, sur la base d'expériences déjà réalisées avec des tests statistiques, que nous avons besoin de 24 souris par condition expérimentale. Nous les répartirons en 3 groupes d'expériences indépendantes de 8 animaux chacune afin d'obtenir des résultats aussi robustes que possible. Nous étudierons 5 génotypes différents ainsi que des souris non modifiées génétiquement, y compris des contrôles correspondants pour chacune de ces conditions. Nous aurons besoin de 3 séries d'expériences pour l'analyse des tissus post-mortem. De plus, nous devons tester trois lignées différentes de cellules tumorales pour trouver celle qui donne le meilleur résultat expérimental. Cela nécessite 30 souris. Pour réduire le nombre d'animaux à utiliser, nous employons un plan d'étude longitudinal basé sur l'imagerie par bioluminescence pour mesurer la croissance tumorale, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Pour l'analyse post-mortem, le tissu pulmonaire sera réparti entre plusieurs méthodes d'analyse afin de permettre une utilisation optimale de chaque animal impliqué dans l'expérimentation animale.

Raffinement

Afin d’assurer le bien-être des animaux, ils auront une période d’acclimatation d’une semaine afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Nous surveillerons régulièrement leur état général. La lignée cellulaire tumorale qu’on utilisera permet de suivre la croissance tumorale par bioluminescence (mesure non invasive, faite deux fois par semaine, pendant maximum 4 semaines). Nous pèserons également les souris deux fois par semaine pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction d’une grille de score adaptée à notre projet. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des compléments alimentaires.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle de choix pour les expériences dans le domaine de l'immunologie des tumeurs. Cette recherche nécessite un contexte génétique bien défini et des modèles génétiquement modifiés, qui ne sont disponibles que chez cette espèce. En outre, les parallèles entre le vieillissement murin et humain, la composition immunitaire du microenvironnement tumoral et les types de cellules immunitaires dans les poumons sont bien établis. Tous ces éléments font de la souris le seul organisme modèle approprié pour notre projet. Des souris adultes seront utilisées pour toutes les expériences, ce qui est nécessaire pour étudier un système immunitaire mature. Comme nous étudions les effets du vieillissement sur le développement des tumeurs, nous utiliserons des souris dont l'âge se situe entre 8 semaines (jeunes adultes) et 24 mois (adultes âgés).

Cinq semaines avant le premier test, 57 % des animaux subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes destinée à permettre l'enregistrement de leur activité neuronale. 1 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de provoquer une mémoire de peur pathologique, analogue à celle des états de stress post-traumatique, puis de mesurer le rôle des récepteurs cannabinoïdes de type 1 dans son acquisition. Le porteur retient la souris parce que le modèle d'altération de la mémoire traumatique a été établi chez elle et que le matériel comportemental est dimensionné pour cette espèce.

Objectifs

Les états de stress post-traumatiques (EPST) ont une prévalence importante dans le monde et sont extrêmement invalidant pour les patients en souffrant. Une des caractéristiques majeures de ces troubles correspond à une altération qualitative de la mémoire associant (i) une hypermnésie émotionnelle, i.e. intrusion des souvenirs traumatiques dans un contexte ordinaire et sûr de la vie quotidienne, et (ii) une amnésie contextuelle, i.e. impossibilité du patient à précisément décrire le contexte péri-traumatique. De plus, les stratégies thérapeutiques pour ces troubles ne sont que très limitées avec un fort taux de rechute, cela étant en grande partie dû à une grande méconnaissance des mécanismes neurobiologiques sous-jacent. Le système endocannabinoïde, et plus particulièrement les récepteurs cannabinoïdes de type 1 , sont un des systèmes majeurs régulant les comportements de stress. L’objectif de ce projet est de caractériser l’implication des récepteurs CB1 dans l’acquisition et l’expression de cette mémoire, ce qui pourrait permettre de proposer un potentiel mécanisme neurobiologique sous-tendant ces pathologies, ainsi qu’une éventuelle stratégie thérapeutique.

Bénéfices attendus

Par la caractérisation d’un mécanisme neurobiologique sous tendant la mémoire traumatique, ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment en ciblant les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1.

Procédures

Les animaux de ce projet seront tous soumis à un test de mémoire d'une durée comprise entre 2.5 et 6min par jour sur 4 jours, ainsi qu’à des injections (1 ou 2 selon le groupe expérimental, réalisées au jour 2 du test de mémoire). Parmi l’ensemble des animaux du projet, 57% subiront en plus au préalable (minimum 5 semaines avant le test comportemental) une intervention chirurgicale d’environ 30 à 45 minutes sous anesthésie avec pré, péri- et post médication permettant de minimiser le stress et la douleur qui permettra l’étude de l’activité neuronale.

Impact sur les animaux

Notre étude repose sur l’utilisation d’un test de mémoire associé à des injections permettant d’étudier le développement d’une forme de mémoire émotionnelle ce qui peut générer un stress temporaire chez l’animal. Aussi, l’étude de l’activité neuronales requiert une intervention chirurgicale préalable pouvant engendrer de la douleur et du stress, qui seront pris en charge par l’utilisation de médication avant, pendant et après l’acte chirurgical associées à un suivi méticuleux de la récupération post-opératoire. Ces nuisances entrainent une classe de sévérité « modérée ».

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue du protocole comportemental afin d’éviter tout stress/souffrance supplémentaire. Les animaux ayant subit une intervention chirurgicale seront mis à mort à l’issue de la procédure comportementales afin de s’assurer de la réussite de la chirurgie et d’étudier l’activité du cerveau.

Remplacement

L’utilisation d’animaux dans ce projet se justifie par (i) l’absence de modèle in vitro permettant l’étude des processus de mémorisation et (ii) la nécessité de manipuler l’expression et/ou l’activité des récepteurs CB1 lors de ces processus. L’organisation du système nerveux des souris est suffisamment proche de l’espèce humaine pour pouvoir raisonnablement extrapoler les observations faites sur ces animaux.

Réduction

Le nombre de souris se justifie de par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux pour permettre des analyses statistiques concluantes. Un nombre inférieur pourrait impliquer une réplication de l’expérience ce qui induit l’utilisation d’un nombre encore plus important d’animaux.

Raffinement

Toutes les souris du projet seront hébergées dans une animalerie agréée disposant d’une régulation de température, d’hygrométrie et du cycle jour/nuit (12h/12h). Les animaux seront tous hébergés collectivement avec du matériel de nidification adapté au nombre d’animaux, ainsi que de l’eau de boisson et de la nourriture ad libitum. Les cages seront changées une fois par semaine tout en maintenant le plus possible le matériel de nidification lors du changement afin de conserver l’empreinte olfactive et ainsi diminuer le stress. Toutes les souris seront quotidiennement observées permettant ainsi de détecter précocement tout changement. Si besoin, l’animal sera soigné et/ou surveillé, avec consultation du vétérinaire. Pour les animaux subissant une intervention chirurgicale, le stress et la douleur potentielle seront pris en charge par la mise en place de pré-, péri- et post-médication adaptée associées à un suivi méticuleux de l’animal.

Choix des espèces

L’espèce animale est la souris adulte. Cela se justifie par sa proximité phylogénétique avec l’Homme et la présence de comportement similaires notamment concernant les processus de mémoire, d’intérêt pour le présent projet. En effet, la plupart des études sur les mécanismes de la mémoire émotionnelle ont été obtenu chez cette espèce. De plus l’utilisation de souris permet l’étude au niveau (sub)cellulaire via des techniques histologiques. Enfin le modèle central à ce projet, i.e. l’altération qualitative de la mémoire de type EPST, a été établi chez la souris. Aussi, l’ensemble du matériel comportemental utilisé est dimensionné pour cette espèce. Les souris utilisées seront toutes à l’âge adultes (8-16 semaines) le modèle ayant été validé à ces âges. De plus, l’expression et la distribution des récepteurs CB1 varie au cours du développement ce qui pourrait altérer les conclusions du présent projet.

Toutes tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes, 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage unique de Clostridioides difficile et une à deux injections intrapéritonéales, puis leurs selles sont recueillies chaque jour. Le porteur décrit des diarrhées de deux à trois jours et une perte de poids de 5 à 15 %, avec un retour au poids initial généralement observé trois jours après l'infection. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider in vivo ce que des tests in vitro ont déjà montré sur l'effet de l'oxygène sur la croissance de cette bactérie.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas des infections associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente» dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Il est donc urgent de mieux comprendre les différentes étapes de développement de la bactérie dans le tube digestif. Ces dommages intestinaux causés par C. difficile peuvent varier en fonction du niveau d'oxygène disponible dans le tube digestif. Dans ce projet, notre but est d’étudier l’influence de l’oxygène sur C. difficile et les troubles intestinaux induits par cette bactérie pathogène.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes de pathogénicité de cette bactérie permettrait de développer et de proposer des stratégies thérapeutiques plus adaptées aux patients et limiter le risque de récidives et de dissémination de bactéries dans l'environnement.

Procédures

Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile (un gavage unique durant la procédure qui dure moins de 10 secondespar animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum) ce recueil dure moins d'une minute, sur la durée de l'essai.

Impact sur les animaux

Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches de C. difficile et 1 ou 2 injections intrapéritonéales (une automatique d’antibiotique et éventuellement une autre 2h avant l'euthanasie des souris prévue à J-7, J0 et J2). Cette 2ème injection intra-péritonéale est dépendante du kit commercial qui sera utilisé pour l'analyse des coupes histologiques. Dans la mesure du possible, nous privilégierons le protocole ne nécessitant pas cette injection. Les nuisances induites par ces injections sont qualifiées de légères. Suite à l’infection, le modèle peut induit des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui vairent entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection.

Devenir

Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro ont permis d'évaluer l'impact de l'oxygène sur la croissance de C. difficile. L'étape de vérification de ces résultats obtenus in vitro par un modèle in vivo est indispensable afin de tenir compte de l'environnement complexe du tube digestif et notamment le microbiote impliqué dans le taux d'oxygène présent. Le recours à l'animal est indispensable pour valider les résultats obtenus in vitro. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre maximun d'animaux utilisés au nombre de 384 , tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites définis éthiquement non acceptables.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.