Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Gestion du ph?notype dommageable d?inflammation chronique de l?intestin lors de l’?levage de lign?es murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Produire des souris qui développent avec l'âge une inflammation chronique de l'intestin, telle est la finalité de cet élevage, qui porte sur 2 560 souris dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La seule intervention décrite est un poinçonnage de l'oreille sur souris vigile, en moins de trente secondes, pour génotyper une partie des reproductrices. La souffrance vient de la lignée elle-même : le porteur annonce de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante en cas de forme sévère, avec une mobilité et un pelage altérés. Le devenir déclaré compte les 2 560 souris comme mises à mort, alors que le résumé indique qu'une partie est expédiée vers un autre établissement utilisateur avant l'expression du "phénotype dommageable", celles gardées pour la reproduction étant tuées avant 24 semaines.
Objectifs
Ce projet d?crit une proc?dure de l'?levage avec la prise en charge des animaux d?une lign?e de souris d?veloppant progressivement une inflammation chronique de l?intestin (colite). Ces souris sont un mod?le des Maladies Inflammatoires Chroniques de l?Intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn et la colite h?morragique qui sont caus?es par un m?lange de facteurs g?n?tiques, environnementaux et li?s aux microbes pr?sents dans l?intestin. Normalement, le corps produit des substances qui aident ? limiter l?inflammation dans l?intestin. Dans notre mod?le de souris, cette mol?cule est absente, ce qui entra?ne une r?action excessive du syst?me immunitaire et une inflammation chronique du c?lon. De plus, des ?l?ments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques peuvent aggraver cette inflammation en modifiant les microbes intestinaux. L?objectif de cet ?levage est de produire des animaux reproduisant la maladie observ?e chez l'homme. Ces animaux seront par la suite utilis?s dans des projets de recherche afin d'?tudier les maladies inflammatoires de l?intestin et, ? terme, aider ? la recherche sur ces maladies chez l?homme.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre ? l'?quipe de recherche et ? leurs partenaires d?avoir les souris n?cessaires pour mener leurs ?tudes sur les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI). A long terme, ces souris aideront les chercheurs ? : mieux comprendre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, identifier des marqueurs pour mieux la diagnostiquer, trouver de nouvelles fa?ons de traiter ces maladies, tester de nouveaux m?dicaments anti-inflammatoires et d??valuer leur efficacit? par rapport aux traitements d?j? disponibles pour les patients atteints de MICI.
Procédures
Afin de r?aliser le g?notypage, un poin?onnage de l?oreille sera effectu? apr?s l??ge de 14 jours. Cette m?thode consiste ? pr?lever sur animaux vigiles un petit ?chantillon de tissu sur la p?riph?rie du pavillon de l?oreille o? le tissu est le plus mince, ? l?aide d?un poin?on. Cette intervention n?est r?alis?e qu?une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Seulement certains animaux utilis?s pour les croisements seront g?notyp?s.
Impact sur les animaux
Une partie des souris dans ce projet peuvent commencer ? d?velopper progressivement avec l??ge une inflammation de l?intestin. En cas de forme s?v?re, cela peut entra?ner de fortes diarrh?es, des saignements rectaux, une d?shydratation et une perte de poids importante. La mobilit? ainsi que l?apparence du pelage peuvent ?tre alt?r?es. Les souris reproductrices pourraient ressentir une l?g?re nuisance due au pr?l?vement effectu? pour le g?notypage (douleur l?g?re de courte dur?e).
Devenir
Une partie des animaux sera exp?di?e en d?but ou avant l?expression du ph?notype dommageable et utilis?e dans des projets de l??quipe de recherche dans un autre ?tablissement utilisateur. Une autre partie des animaux sera utilis?e pour l??levage dans notre ?tablissement. Les animaux utilis?s pour l??levage seront mis ? mort avant 24 semaines, pour limiter l??volution du ph?notype dommageable avec l??ge. Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d??valuation du bien-?tre animal seront mis ? mort.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entiers est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI) sont tr?s complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le syst?me immunitaire, les microbes intestinaux, la g?n?tique et l?environnement. Ces maladies affectent non seulement l?intestin mais aussi d?autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l?environnement et les microbes interagissent avec l?organisme, les souris sont le mod?le le plus adapt?. ? ce jour, il est impossible de recr?er ces interactions complexes en laboratoire par l'utilisation de m?thodes alternatives (par exemple, mod?les cellulaires), d?o? la n?cessit? d??tudier ces maladies sur des animaux vivants.
Réduction
Un nombre total de 2560 animaux au ph?notype dommageable est n?cessaire et comprend les animaux pour l??levage et les animaux n?cessaires pour l?exp?rimentation pour les projets scientifiques associ?s. La production des animaux sera planifi?e et suivie par l?exp?rimentateur et les zootechniciens de l??tablissement utilisateur afin de limiter le nombre d?animaux g?n?r?s au strict n?cessaire pour les besoins exp?rimentaux et l??levage. Le nombre de reproducteurs et la dur?e d?accouplements seront d?finies en amont de la mise en place des croisements. Ces param?tres seront d?finis en fonction des objectifs et des diff?rentes caract?ristiques connues des lign?es (taille de port?es, viabilit?, ph?notype, etc.). L'?levage sera suivi via le fichier de l'?levage. En fin de projet exp?rimental, l??levage sera arr?t? et le mod?le restera disponible cryoarchiv? dans notre ?tablissement.
Raffinement
Les conditions de l?h?bergement, le seuil de l??ge d?utilisation, les crit?res du suivi et les points limites ont ?t? d?finis afin de minimiser les nuisances. Tous les animaux mut?s de mani?re homozygote pour la modification g?n?tique et susceptibles de d?velopper le ph?notype dommageable ? partir de 5-6 semaines seront suivis ? partir de 3-4 semaines (sevrage) et ce jusqu'? leur envoi avant 6 semaines vers l??tablissement o? sera r?alis?e l?exp?rimentation (ou leur mise ? mort) : une ?valuation du bien-?tre animal sera r?alis?e en prenant en compte la pr?sence de diarrh?e, la pr?sence de saignements rectaux, l?apparence et la mobilit? de l?animal. En fonction de l??tat de l?animal, des mesures de raffinement seront mises en place selon les conseils de la v?t?rinaire et/ou la SBEA (disponibilit? de la nourriture directement dans la cage, mise ? disposition d?une solution de r?hydratation g?lifi?e, augmentation de la fr?quence du suivi avec la pes?e d?animaux). Les points limites pr?coces et sp?cifiques pour les signes cliniques de l?inflammation de l?intestin ont ?t? d?finis. Si, malgr? le raffinement mis en place, un point limite est atteint, l?animal sera imm?diatement mis ? mort. Dans le cas o? les animaux homozygotes ne sont pas transf?r?s pour l?exp?rimentation, ces derniers seront utilis?s pour l??levage et mis ? mort avant 24 semaines (pour limiter les nuisances li?es ? la progression de la maladie avec l??ge).
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilis?es pour ?tudier les maladies inflammatoires chroniques de l?intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l?alimentation, l?environnement, les microbes intestinaux et l?intestin lui-m?me. Dans ce projet, nous utilisons une lign?e de souris qui ne produit pas une prot?ine cl? entra?nant ainsi une inflammation intestinale ressemblant ? une colite h?morragique chez l?humain. Ce mod?le g?n?tique de la maladie n?existe que chez la souris. Les souris seront utilis?es pour les croisements d?s l??ge de 7-8 semaines (maturit? sexuelle) et ce jusqu?? 24 semaines, pour limiter l?expression du ph?notype dommageable qui progresse avec l??ge. Le ph?notype dommageable de colite est susceptible d'appara?tre ? partir de l'?ge de 5-6 semaines, mais dans l??levage de l?EU du chercheur seulement 5% d?animaux sont concern?s ? cet ?ge. Les animaux envoy?s pour exp?rimentation auront ainsi un ?ge de 4-6 semaines pour limiter et potentiellement ?viter l?expression du ph?notype dommageable avant l?envoi.
Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins antipaludéens.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 275
Infectés par le paludisme puis contrôlés chaque jour par une goutte de sang, 8 585 rongeurs, 8 310 souris et 275 rats, subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger et sont tous tués, le prélèvement final se faisant sous anesthésie profonde sans réveil. Ces infections servent à produire les parasites P. berghei et P. yoelii, que trois axes de recherche décrits dans un projet complémentaire utiliseront ensuite. Le porteur écrit que les infections "ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux" au motif que les procédures s'arrêteront avant l'apparition des symptômes cliniques. Les inoculations se font sur de jeunes adultes de quatre semaines parce qu'ils "ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite".
Objectifs
Notre but majeur est la compréhension fonctionnelle des interactions parasite-hôte qui surviennent lors de la phase initiale du paludisme dans le but ultime de développer un vaccin anti-paludique. A cet effet, nous utilisons une combinaison d’outils de génétique moléculaire, de biologie cellulaire et d’imagerie intra-vitale afin de comprendre comment l’animal est infecté et comment il monte une réponse immunitaire protectrice contre le parasite. Tous ces sujets doivent être abordés in vivo car la complexité de l'infection et de l'immunité ne peut être reproduite in vitro. Par conséquent, en utilisant 2 parasites (P.berghei et P.yoelii) dans un modèle murin de paludisme, notre travail se décline selon trois axes majeurs : 1. Imagerie fonctionnelle des phases cutanée et hépatique de l’infection. 2. Compréhension de la mise en place de la protection contre les formes cutanée et hépatique du parasite 3. Développement préclinique d'un vaccin ciblant les formes cutanée et hépatique du parasite Le projet « Production du parasite responsable du paludisme murin pour des études biologiques, immunologiques et pour le développement de vaccins anti-paludéens » concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire pour générer les parasites qui seront utilisés dans ces trois axes de recherche. Les procédures adressant les questions scientifiques spécifiques utilisant des animaux de laboratoire liées à ces trois axes seront décrites dans un projet complémentaire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons (i) mieux comprendre les premières étapes de l’infection en utilisant des approches de biologie cellulaire et moléculaire ainsi que la microscopie intra-vitale pour identifier les composants essentiels du parasite susceptibles de constituer des cibles pour de nouveaux médicaments et vaccins, (ii) mieux comprendre comment une immunité protectrice contre le parasite peut se développer et identifier de nouvelles cibles vaccinales, et (iii) développer pré-cliniquement un vaccin plus efficace contre le paludisme.
Procédures
Après infection, la parasitémie des animaux est contrôlée à partir d’une goutte de sang. Le prélèvement dure quelques secondes et est effectué quotidiennement, le plus souvent à partir du troisième jour pour 3 jours. Un prélèvement de sang final est réalisé après analgésie et anesthésie. Cette anesthésie est profonde et d’une durée suffisante pour réaliser le prélèvement sans réveil de l’animal. Après le prélèvement, les animaux sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Le rongeur vigile ne souffrira que de l’inconfort transitoire causé par la réalisation, selon les experiences, d’injections, la réalisation de gavage oral ou le prélèvement de volumes de sang. Les infections mises en œuvre ne nuiront pas aux libertés individuelles des animaux dans la mesure où les procédures prendront fin avant l’apparition des symptômes cliniques, soit par des prélèvements de sang terminaux sans réveil effectués sur des animaux profondément anesthésiés, soit par mise à mort.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort.
Remplacement
Les processus conduisant à l'infection de l'hôte par les différents stades parasitaires ou à la protection de l'hôte contre ces stades par le biais de la vaccination sont extrêmement complexes. Dans la phase initiale de l’infection, ils impliquent des interactions multiples et dynamiques entre le parasite et plusieurs types cellulaires dans la peau, les ganglions, les vaisseaux, le sang, la rate et le foie, qu'il est impossible de répliquer dans leur ensemble dans un système in vitro. En l’absence de méthodes alternatives adéquates, l’étude approfondie de cette phase nécessite donc l’utilisation de modèles animaux pour appréhender cette incroyable complexité. Depuis les années 1950, les espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, P. berghei et P. yoelii, sont devenues les espèces de choix pour étudier cette phase, et ont notamment permis la découverte des candidats vaccins les plus importants contre le paludisme. Une deuxième difficulté réside dans la production du stade parasitaire inoculé dans la peau de l'hôte par le moustique vecteur. Il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium in vitro. Par conséquent, pour réaliser l’ensemble des études proposées, des infections hebdomadaires de rongeurs et de moustiques sont nécessaires pour l’obtention de ce stade parasitaire. Dans le but de réduire à l’avenir le recours aux animaux, un de nos axes de recherche aborde ce problème en proposant la mise au point d’un système de culture des sporozoïtes in vitro.
Réduction
Nous sommes conscients de la nécessité de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la recherche scientifique. En l’absence de méthodes alternatives permettant de s’affranchir du recours aux rongeurs pour produire les stocks cryo-préservés de sang infecté et les staes parasitaires de Plasmodium berghei et yoelii, nous avons donc mis à profit notre expérience de plus de 15 années dans le domaine pour optimiser nos protocoles d’infection et réduire au minimum nécessaire le nombre d’animaux permettant une production stable et robuste de parasites. Ceci passe notamment par l’utilisation d’inoculums standardisés de parasites, d’une quantification précise de l’infection et d’une étape de contrôle qualité et de standardisation de chaque stock de sang avant utilisation en routine. Par ailleurs, un de nos axes de recherche a pour objectif la mise au point d’une méthode de culture in vitro des parasites, ce qui à l’avenir pourrait permettre de réduire encore le recours aux animaux.
Raffinement
Toutes nos procédures expérimentales ont été établies de manière à causer le moins de souffrance possible aux animaux et calibrées de manière à prendre fin avant l’apparition de symptômes du paludisme chez les animaux infectés. A partir d’une parasitémie seuil correspondant à un délai de deux à trois jours avant la possible survenue de manifestations cliniques liées à l’infection palustre, les animaux seront suivis quotidiennement et leur comportement sera évalué en utilisant une échelle de détresse pour détecter des problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. En particulier, si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc. Si les points limites - définis de sorte à précéder l’apparition des symptômes liés au paludisme - sont atteints, les souris seront immédiatement mises à mort. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses seront menées sur des animaux anesthésiés. Pour les procédures invasives, les rongeurs bénéficieront de plus d’une couverture analgésique supplémentaire pour prévenir tout inconfort durant la manipulation. Tous les animaux anesthésiés seront par ailleurs mis à mort avant leur réveil.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei et P. yoelii sont des espèces de rongeurs sauvages d’Afrique Centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est reconnu dans la communauté scientifique que l’infection des rongeurs avec ces parasites est un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l’Homme. La plupart des concepts issus des modèles rongeurs, en particulier dans le domaine de la vaccinologie anti-paludisme, se sont révélés exacts chez l’Homme. La preuve de l’intérêt d’une recherche rigoureuse chez le rongeur pour éclairer ou informer la recherche chez l’Homme n’est plus à faire. Les animaux sont acclimatés pendant 7 jours minimum. Les inoculations de parasites aux souris et rats seront réalisées sur de jeunes adultes de 4 semaines car ils ne sont pas immunocompétents, ce qui favorise l’infection par le parasite.
Un traitement innovant pour prot?ger le c?ur f?minin de la cardiotoxicit? de la chimioth?rapie traitant les cancers gyn?cologiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
614 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue et le cœur prélevé pour analyse. Selon les lots, chacune reçoit 2, 7 ou 13 injections, un à deux prélèvements de sang et une à trois échographies de trente minutes, tous les gestes étant réalisés sous anesthésie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe et que l'étude "doit être réalisée dans un organisme vivant complet". Le médicament visé, capable de prévenir les dégâts cardiaques de la chimiothérapie, n'existe à ce jour sous aucune forme, et le porteur écrit que le trouver "représenterait un progrès majeur pour la santé publique".
Objectifs
Certains traitements de chimioth?rapie, utilis?s pour traiter les cancers gyn?cologiques, notamment dans les formes agressives du cancer du sein, sont tr?s efficaces pour d?truire les cellules tumorales. Cependant, ces traitements peuvent endommager le c?ur, un effet secondaire appel? cardiotoxicit?. C?est pourquoi il est important de surveiller ?troitement la sant? cardiaque des patientes afin d??viter qu?elles d?veloppent une insuffisance cardiaque. Les causes pr?cises de ces dommages au c?ur ne sont pas encore totalement comprises, mais on sait qu?ils impliquent la formation de substances tr?s r?actives, appel?es radicaux libres, dans le muscle cardiaque. Le c?ur a peu de moyens pour se prot?ger contre ces radicaux libres, ce qui provoque un stress important. Ce stress entraine la mort des cellules cardiaques d?s la premi?re dose de traitement et s?aggrave avec le temps, leur causant des d?g?ts irr?versibles. Des ?tudes r?centes ont identifi? une prot?ine qui joue un r?le central dans la mort cellulaire induite par la chimioth?rapie. Notre ?quipe a par le pass? travaill? sur la protection du c?ur lors d?accidents cardiaques comme l?infarctus, et dans ce cadre nous avons pu rep?rer l?int?r?t de cette prot?ine que l?on appelle ? FAS ?. Nous avons notamment identifi? une mani?re de bloquer ses interactions et d?emp?cher la mort des cellules cardiaques. Nous pensons que cette m?me strat?gie de blocage pourrait aider ? pr?venir les dommages au c?ur caus?s par certains traitements anticanc?reux, c?est pourquoi notre projet vise ? tester nos mol?cules bloquantes pour prot?ger efficacement le c?ur contre les effets n?fastes de ces traitements.
Bénéfices attendus
? ce jour, il n?existe aucun m?dicament efficace pour prot?ger le c?ur des effets secondaires des traitements chimioth?rapeutiques, qui peuvent endommager durablement le muscle cardiaque. Ces dommages peuvent entra?ner une maladie du c?ur, qui se manifeste souvent plusieurs ann?es apr?s la fin du traitement. Chez les femmes, ces m?dicaments sont fr?quemment utilis?s pour soigner certains cancers gyn?cologiques, notamment ceux de l?ovaire, de l?endom?tre et du sein. De plus en plus, les cardiologues sont amen?s ? suivre des patientes en r?mission de leur cancer, mais qui d?veloppent ensuite des probl?mes cardiaques li?s ? ces traitements. Il est important de savoir que les femmes trait?es jeunes avec ces m?dicaments ont un risque de cardiotoxicit? quatre fois plus ?lev? que les hommes. Par ailleurs, des facteurs comme la m?nopause ou l?hypertension art?rielle augmentent encore ce risque. Prendre soin du c?ur des patientes ayant re?u ces traitements est donc essentiel, car cela influence fortement leur sant? ? long terme et leur qualit? de vie. Trouver un m?dicament capable de pr?venir ou limiter les d?g?ts cardiaques caus?s par la chimioth?rapie repr?senterait un progr?s majeur pour la sant? publique et permettrait aussi de r?duire les co?ts li?s aux complications cardiaques dans la soci?t?.
Procédures
Les animaux seront r?partis en plusieurs lots. En fonction du lot, les animaux pourront recevoir 2, 7 ou 13 injections espac?es dans le temps (geste durant 1 minute, maximum un geste par semaine), un ? deux pr?l?vements de sang (geste durant 5 minutes) et une ? trois ?chographies (examen durant 30 minutes). Tous les gestes seront r?alis?s sous anesth?sie.
Impact sur les animaux
Avant les traitements, les animaux seront manipul?s avec pr?caution pour ?tre pes?s, ce qui peut entra?ner un l?ger stress. Les injections et pr?l?vements sanguins pourront ?galement g?n?rer un stress li? ? la manipulation et ? la mise sous anesth?sie. La g?ne ressentie lors de ces gestes est comparable ? celle d?une piq?re d?aiguille. Le traitement de chimioth?rapie pourra entra?ner un inconfort g?n?ral, notamment digestif. Les injections pourront ?galement entra?ner une irritation locale au site d?administration.
Devenir
Tous les animaux ? l?issue de l?exp?rimentation seront mis ? mort et le coeur pr?lev? pour analyse.
Remplacement
Pour ce projet, il n?existe pas encore de m?thode alternative sans animaux. En effet, notre ?tude doit ?tre r?alis?e dans un organisme vivant complet. Cela est particuli?rement important car les mol?cules qui bloquent de la mort cellulaire prot?gent non seulement les cellules du c?ur, mais aussi les cellules des vaisseaux sanguins, qui sont elles aussi expos?es au traitement de chimioth?rapie. En r?alisant ces exp?riences sur des animaux vivants, nous pouvons aussi v?rifier que les mol?cules inject?es dans le sang atteignent bien tous les organes concern?s, notamment le c?ur. Ce protocole imite ainsi une situation r?elle que l?on rencontre en clinique.
Réduction
Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? ? l?aide d?un outil statistique afin d?obtenir des r?sultats fiables tout en ?vitant l?utilisation excessive d?animaux. Plusieurs mesures sont mises en place pour r?duire au maximum leur nombre, notamment l?analyse de plusieurs param?tres chez un m?me animal, ce qui permet de limiter le recours ? des animaux suppl?mentaires. L?organisation des exp?riences a ?galement ?t? optimis?e afin d?obtenir un maximum d?informations ? partir de chaque animal.
Raffinement
Pour les 2 proc?dures de traitement et pour les enregistrements ?chocardiographiques, les conditions d?anesth?sie g?n?rale sont utilis?es pour r?aliser les injections sans stress ni douleur. Ce protocole a ?t? optimis? de mani?re ? ce qu?il soit le moins invasif possible Les pr?l?vements sanguins seront ?galement r?alis?s sous anesth?sie. Dans ce contexte, les animaux vigiles ne recevront qu?une injection d?anesth?sique.
Choix des espèces
La souris a ?t? choisie pour d?velopper les mod?les d??tude de l??quipe. Les raisons sont : -L?Homme et la souris poss?dent 99% de g?nes identiques donc le choix de la souris est tr?s avantageux pour une ?tude qui permet d??tudier les effets d?un futur m?dicament - Des ?tudes montrent que presque tous les g?nes associ?s ? des maladies humaines sont retrouv?s chez les rongeurs. - Les r?sultats ant?rieurs obtenus par l??quipe montrent que ce mod?le est proche de l?Homme (contrairement au rat). Des souris femelles ?g?es de 8 ? 12 semaines seront utilis?es pour repr?senter la population des femmes trait?es par chimioth?rapie en clinique humaine suite ? un cancer gyn?cologique.
Impact du stress gestationnel ou de l’exposition aux glucocorticoïdes sur le développement testiculaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
10 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un quart des femelles gestantes subissent trois séances de contention de trente minutes par jour pendant sept jours consécutifs, puis une injection et un prélèvement sanguin submandibulaire, avant une perfusion intracardiaque de fixateur sous anesthésie qui provoque leur mort. Les femelles gestantes sont tuées pour permettre le prélèvement des fœtus, eux-mêmes tués pour les analyses. Les femelles nées de ces gestations sont tuées à leur tour, le porteur indiquant qu'elles ne sont pas "nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet", qui portent sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.
Objectifs
Le testicule est un organe vulnérable aux perturbations hormonales pendant la grossesse. Toute altération d’un des type de cellule du testicule peut induire des problèmes durables de fertilité masculine. Ce projet vise à comprendre comment l’exposition aux hormones du stress pendant la gestation perturbent le développement testiculaire et programment des défauts de fertilité à l’âge adulte. Cette étude est indispensable pour plusieurs raisons. La dexaméthasone est un médicament qui imite une hormone naturelle du stress et qui est utilisé chez la femme enceinte en cas de risque d’accouchement prématuré. Malgré son efficacité clinique, ses effets secondaires à long terme sur la reproduction masculine restent mal connus. Aussi, le stress est devenu très fréquent dans la vie moderne, en raison des contraintes environnementales, professionnelles et sociales. Il augmente durablement les hormones du stress dans l’organisme mais les répercussions pendant la grossesse sont largement sous-estimées. Enfin, de nombreuses causes connues d’infertilité masculine comme les perturbateurs endocriniens, l’obésité, les infections, les maladies chroniques s’accompagnent d’une augmentation des hormones de stress, suggérant un rôle mécanistique encore insuffisamment exploré. L’objectif du projet est d’identifier comment ces expositions modifient l’état des cellules du testicule en étudiant en particulier la protéine qui permet aux cellules de répondre aux hormones du stress. Le projet analysera également les conséquences à long terme sur la spermatogenèse et la fertilité adulte, ainsi que la possible transmission de ces effets aux générations suivantes. En améliorant la compréhension des mécanismes biologiques impliqués, ce projet contribuera à réévaluer l’utilisation de ces traitements pendant la grossesse et à prévenir les effets à long terme sur la fertilité masculine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels le stress gestationnel et les glucocorticoïdes synthétiques, tels que la dexaméthasone, influencent le développement du testicule, la fertilité masculine et la production hormonale. À court terme, ce travail permettra d’identifier de manière précise les effets cellulaires et moléculaires induits par ces expositions au cours de la gestation. Les données obtenues fourniront des informations inédites sur les étapes critiques du développement testiculaire sensibles aux variations hormonales maternelles, ainsi que sur le rôle du récepteur des glucocorticoïdes dans ces processus. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à une meilleure évaluation du risque associé au stress maternel chronique ou à l’utilisation de glucocorticoïdes pendant la grossesse. Les résultats permettront d’identifier des mécanismes responsables d’éventuelles altérations persistantes ou transmissibles de la fertilité masculine. Ces connaissances sont importantes pour améliorer le conseil clinique concernant l’usage de la dexaméthasone en contexte obstétrical et pour renforcer la prévention des expositions délétères durant la gestation. Enfin, en mettant en lumière les mécanismes cellulaires impliqués dans la programmation fœtale de la fertilité, ce projet pourrait à terme favoriser le développement de stratégies thérapeutiques visant à limiter ou corriger les effets néfastes d’expositions précoces. Ces avancées bénéficieraient potentiellement à la santé reproductive humaine et animale, dans un contexte de baisse globale de la fertilité et d’augmentation documentée des situations de stress environnemental.
Procédures
25% des femelles gestantes subiront une contention à raison de trois séances par jour, d’une durée de trente minutes chacune, pendant 7 jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 50% des femelles gestantes reçoivent une injection unique d’un médicament ou un placébo (durée de l’injection : moins de 1 minute) une fois par jour, sur une durée de sept jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 25% des femelles gestantes reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Les mâles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Un anesthésique sera administré par injection pour permettre la perfusion intracardiaque d’un fixateur histologique. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels incluent un stress transitoire lié à la manipulation et à la contention, une douleur légère et brève au point d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité ou de la prise alimentaire après les procédures répétées. La contention répétée et les injections de médicament qui imite une hormone naturelle du stress induisent une élévation attendue des hormones de stress et une légère perte de poids. Elles induisent une augmentation temporaire de l’activité de l’axe du stress, se traduisant par une élévation des hormones glucocorticoïdes et un stress comportemental modéré chez les femelles gestantes. Ces effets sont attendus pendant la durée des séances de contention et sont réversibles après la fin du protocole qui n’excèdera pas 7 jours consécutifs. Aucun effet physique durable n’est attendu. Les injections répétées induisent un risque limité de rougeur, d’hématome ou d’inflammation locale. Le prélèvement sanguin submandibulaire peut entraîner un saignement transitoire et une ecchymose locale. La perfusion intracardiaque terminale est réalisée sous anesthésie profonde, éliminant toute perception douloureuse.
Devenir
Toutes les femelles gestantes sont euthanasiées afin de permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées ou replacées. Les embryons et fœtus prélevés sont euthanasiés pour la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés ou replacés. Les mâles issus des femelles gestantes expérimentales sont mis à mort afin de permettre le prélèvement des testicules nécessaires aux analyses moléculaires, histologiques et immunohistochimiques visant à étudier le développement testiculaire, la spermatogenèse et les mécanismes associés. Les femelles issues des femelles gestantes expérimentales sont mises à mort car elles ne sont pas nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet, qui portent spécifiquement sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.
Remplacement
Le développement du testicule fœtal, la mise en place des interactions entre cellules de Sertoli, cellules germinales, cellules de Leydig et macrophages testiculaires, ainsi que la mise en route de la spermatogenèse, sont des processus hautement intégrés qui dépendent de signaux hormonaux, paracrines et systémiques impossibles à reproduire dans des modèles in vitro. Les organoïdes testiculaires et les cultures cellulaires existantes permettent d’étudier certaines fonctions isolées, mais ne reproduisent ni l’organisation tridimensionnelle, ni la vascularisation, ni l’environnement endocrinien maternel, ni les variations physiologiques des glucocorticoïdes. Ils ne permettent pas non plus de modéliser un stress gestationnel, lequel implique une réponse neuroendocrinienne complexe propre à l’organisme entier. De plus, l’étude des effets du stress ou de la dexaméthasone sur la transmission transgénérationnelle nécessite la prise en compte de la reprogrammation épigénétique germinale, processus qui ne peut être étudié qu’in vivo. Le remplacement par des méthodes n’impliquant pas l’animal vivant n’est pas possible pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs au risque de se tromper de 5%, aux stades intéressants, nous aurons besoin d’un nombre d’animaux assez important à savoir 10 individus par condition, par stade et par génotype. Plusieurs mesures ont été mises en place pour réduire le nombre total d’animaux. Les accouplements sont planifiés de manière à produire simultanément des animaux contrôles et mutants au sein des mêmes portées, limitant le nombre de reproducteurs nécessaires. Les analyses embryonnaires sont réalisées sur des stades choisis de façon ciblée, sur la base des phénotypes observés, afin d’éviter des prélèvements multiples et inutiles. Pour les adultes, seules les étapes développementales pertinentes seront examinées : aucun animal ne sera utilisé si les résultats des phases précédentes ne justifient pas la poursuite des analyses. Les tissus prélevés sont systématiquement partagés entre analyses histologiques, immunologiques ou moléculaires, de manière à éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires pour des examens complémentaires. Les analyses intégratives, incluant par exemple des approches combinant transcriptomique et épigénomique, permettent également de réduire le nombre d’animaux en regroupant plusieurs types de données à partir des mêmes échantillons. Enfin, l’absence d’études pilotes supplémentaires limite l’utilisation d’animaux, car les protocoles reposent sur des méthodes déjà établies dans la littérature ou validées au sein de l’équipe.
Raffinement
Les femelles gestantes font l’objet d’un suivi quotidien après l’induction du stress et lors des périodes de traitement ; incluant l’évaluation quotidienne du poids et du comportement spontané. Toute absence de prise de poids, diminution de mobilité, ou altération de l’état général entraîne une action immédiate avec mise à disposition d’une alimentation en gel et surveillance trois fois par jour. Le stress gestationnel est induit par une contention dans un tunnel ventilée, sur une durée et fréquence standardisée, ne provoquant ni douleur physique ni lésion. Les périodes de contention sont réalisées dans un environnement calme afin de limiter les stimulations additionnelles. Les femelles sont remises immédiatement dans leur cage d’origine après la procédure et leur comportement est contrôlé après chaque session. Les administrations de médicaments ou de substances sont réalisées avec des volumes minimaux et des aiguilles adaptées afin de réduire l’impact de la procédure. Le volume des prélèvements sanguins sont limités au strict nécessaire pour les dosages hormonaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de limiter le stress et de respecter leurs besoins comportementaux. Des mesures de raffinement supplémentaires pourront être intégrées tout au long du projet comme des maisonnettes, des batônnets à ronger, une limitation du changement de cage et une mise à disposition de matériel de nidification supplémentaire. Des points limites ont été définis, en cas de souffrances constatés des mesures correctives adaptés seront mises en œuvre.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue l’espèce la plus pertinente pour étudier le développement testiculaire, la fonction des glucocorticoïdes et les effets du stress gestationnel. Son organisation testiculaire, la dynamique de la spermatogenèse et la régulation endocrinienne du développement reproducteur présentent de fortes similarités avec celles de l’Homme. De plus, le développement embryonnaire du testicule y est décrit de manière très détaillée, ce qui en fait un modèle de référence. Le projet repose sur une approche de génomique fonctionnelle ciblant spécifiquement certaines cellules testiculaires, pour laquelle la souris est particulièrement adaptée en raison de son temps de génération court et de la disponibilité de nombreux outils génétiques. Son faible temps de gestation et sa descendance abondante facilitent les études intergénérationnelles. L’utilisation des femelles se limite aux fonctions reproductrices nécessaires à la production des animaux utilisés et à l’application des traitements gestationnels. Les femelles seront mises en accouplement entre 8 et 16 semaines d’âge, période correspondant à une maturité reproductive optimale. Les embryons et fœtus permettent d’analyser la différenciation sexuelle du testicule, la prolifération des cellules de Sertoli, la quiescence des cellules germinales, la mise en place de la vascularisation et la production de testostérone fœtale, tous processus sensibles aux variations hormonales maternelles et aux expositions gestationnelles expérimentales. Les nouveau-nés sont examinés pour le maintien de la quiescence des cellules germinales, la localisation et la prolifération des macrophages testiculaires anti-inflammatoires, ainsi que le développement initial des organes sexuels. Les stades néonatals correspondent à la reprise de la prolifération germinale, au début de la méiose et à l’apparition des progéniteurs de cellules de Leydig adultes. Les stades prépubères permettent d’étudier la maturation des cellules de Sertoli et la différenciation des cellules de Leydig immatures, la progression de la méiose et l’émergence des macrophages pro-inflammatoires. Les souris adultes permettent d'étudier la maturité sexuelle et le vieillissement testiculaire. Ces stades sont essentiels pour évaluer la spermatogenèse, la production hormonale, la fertilité et les conséquences à long terme des expositions gestationnelles.
Création et élevage de nouvelles lignées de souris permettant l’étude du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Inspectées et pesées deux à trois minutes par semaine pendant huit semaines à partir de quatre mois, soumises à contention lors de prélèvements de matières fécales, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inactivation de certains gènes doit leur donner des polypes intestinaux, avec anémie, saignements intestinaux et risque de perte de poids, pour obtenir des lignées qui développent d'elles-mêmes des micro-tumeurs de l'intestin. Le devenir compte 680 souris tuées, quand le porteur écrit que les animaux ayant servi à la reproduction ou dépourvus des combinaisons de gènes recherchées seront "en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques", ou tués. Les procédures décrites s'arrêtent à l'inspection, à la pesée et aux prélèvements fécaux, sans que le porteur précise ce que subissent les souris dont les polypes progressent, ni ce que couvre l'usage pédagogique annoncé.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à comprendre le rôle de différents gènes dans les toutes premières étapes de la formation de tumeurs intestinales. A ce titre, nous développerons des lignées de souris génétiquement modifiées développant de manière spontanée des micro tumeurs intestinales, mimant la maladie humaine. Ce projet de création de lignées sera accompagné d’un protocole d’élevage et de suivi adapté.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer de nouveaux modèles d’études valorisables dans le cadre de la lutte contre le cancer colorectal, touchant de nombreuses personnes dans les pays occidentaux. L’exploitation de ces modèles permettront de découvrir de nouveaux éléments clefs dans la prise en charge de l’inflammation et son impact dans la formation des tumeurs.
Procédures
Les animaux, à partir de 4 mois d’âge, seront régulièrement inspectés et pesés (2-3 minutes par semaine, durant 8 semaines). Les animaux seront soumis à contention lors de prélèvements fécaux, et manipulés lors des phases de mises en accouplement et de leur suivi.
Impact sur les animaux
L'inactivation de certains gènes conférera une susceptibilité accrue des animaux à la formation de polypes intestinaux, avec apparition de signe d’anémie, et risque de perte de poid et de saignements intestinaux.
Devenir
Les animaux, après utilisation pour reproduction, ou ne possédant pas les combinaisons de gènes souhaités seront en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques ou euthanasiées.
Remplacement
La question centrale de notre projet implique de comprendre les interactions entre les microbes, les cellules intestinales et le système immunitaire dans le cadre de la formation du tumeurs digestives. A ce jour, les alternatives utilisant des cultures de cellules ne permettent pas de reproduire un tel niveau de complexité. Dans ce contexte, le modèle animal représente notre seule alternative
Réduction
Nous avons, sur la base de données précédemment acquises, et grâce à une approche statistique robuste, pu déterminer le nombre minimum d’animaux requis pour permettre d’obtenir des données interprétables.
Raffinement
Nous avons mis en place un mode de suivi adapté à nos procédures, consistant en une surveillance accrue des individus lors des phases de vieillissement, accompagné d’une grille de suivi reprenant les paramètres physiologiques les plus pertinents à mesurer. L’utilisation de points limites adaptés nous permettra de rapidement stopper l’expérience en cas d’atteintes de critères d’arrêts, et réduire toutes nuisances aux animaux.
Choix des espèces
La souris possède de nombreuses similitudes avec l’homme en termes de biologie digestive, et cette espèce permet d’inactiver certains gènes d’intérêts. Les animaux seront utilisés à partir de 5 à 6 semaine, lorsque le système digestif arrive à maturité.
Collectes sanguines de cellules immunitaires chez le chien
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Mettre au point des aliments pour chiens : 30 chiens en bonne santé vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour tester des solutions nutritionnelles visant leur système immunitaire et leurs muscles. Chacun subit jusqu'à deux prélèvements de dix-huit millilitres de sang, sous anesthésique local, la contention et la piqûre étant les nuisances retenues par le porteur. Les cellules immunitaires prélevées servent ensuite à des travaux en culture, le porteur annonçant d'évaluer "de manière préclinique l'efficacité de solutions nutritionnelles ciblant la santé immunitaire". Trente chiens sont comptés comme réutilisés, quand il écrit qu'ils seront "soit réutilisés dans une autre procédure le cas échéant, soit placés dans le cadre d'un programme d'adoption", sans dire combien iront vers chacune des deux voies.
Objectifs
L’objectif de l’étude est d’explorer l’influence de la nutrition sur les interactions entre le système immunitaire et les tissues musculo squelettiques au cours du vieillissement chez le chien. L’étude repose sur la collecte de prélèvements sanguins chez des chiens en bonne santé afin d’isoler des cellules immunitaires et d’étudier leurs interactions in vitro avec différents types cellulaires, en lien avec les objectifs suivants : 1) Soutenir le développement et la validation de modèles cellulaires pertinents pour étudier la santé immunitaire du chien ; 2) Évaluer de manière préclinique l’efficacité de solutions nutritionnelles ciblant la santé immunitaire, et des tissus musculo squelettiques. Les cellules isolées seront utilisées dans des approches in vitro visant à établir, valider des modèles expérimentaux adaptés et évaluer l’efficacité de solutions nutritionnelles.
Bénéfices attendus
Cette étude aura pour bénéfices potentiels, le développement d'aliments pour chien ayant avec un impact positif sur la santé immunitaire et le système musculosquelettique du chien.
Procédures
Il sera réalisé sur chaque chien de l'étude, 2 prélévements sanguins maximum d'un volume de 18mL chacun.
Impact sur les animaux
Les nuisances identifiées à la prise de sang sont:1) un stress potentiel associé à la contention du chien, et 2) une légère douleur à l'introduction de l'aiguille, malgré l'anesthésique local qui sera appliqué avant.
Devenir
A l'issue de la procédure, les chiens seront soit réutilisés dans une autre procédure le cas échéant, soit placés dans le cadre d'un programme d'adoption.
Remplacement
Les cellules immunitaires ne peuvent qu'être isolées à partir de sang de l'espèce étudiée. Par conséquent, il n'est pas possible de remplacer le recours à l'espèce animale étudiée dans ce projet, soit le chien.
Réduction
Plusieurs collectes indépendantes de sang sont nécessaires car les cellules sanguines obtenues ne sont pas immortelles et ont donc une durée de vie limitée en culture. Par conséquent, les stocks cellulaires ne peuvent pas être maintenus indéfiniment et doivent être reconstitués périodiquement afin d’assurer la pérennité du programme de recherche. L’utilisation de multiples donneurs est indispensable pour prendre en compte la variabilité biologique attendue entre les chiens (par exemple : âge, sexe, race/taille corporelle) et pour réduire le risque que les résultats soient influencés par un ou quelques donneurs atypiques. En outre, la sélection de 30 chiens est fondée sur des données internes et sur des cohortes utilisées dans la littérature.
Raffinement
La surface des logements des chiens est supérieure au minimum réglementaire requis pour les conditions d’hébergement des espèces cibles. L’aménagement des logements est également développé pour favoriser le confort des individus ainsi que le contact physique, visuel, olfactif et auditif avec les congénères directement proches. Les chiens bénéficient de socialisation individuelle et collective répétées via différentes activités (toilettage, jeu, sortie en parc en groupe, promenades en laisse). Les chiens sont également habitués à venir en clinique vétérinaire où les prélèvements seront faits ce qui permettra de diminuer le stress. Les chiens seront sélectionnés selon le critère connu de réaction normale à la prise de sang. Tout animal ayant précédemment mal réagit lors d'un prélévement sanguin ne se sera pas sélectionné. Un analgésique local sera utilisé 10 minutes au préalable à la prise de sang pour limiter la douleur liée à l'introduction de l'aiguille au moment du prélèvement sanguin.
Choix des espèces
L'étude portant sur le développement d'un modèle canin, il est nécessaire d'utiliser des individus des espèces cibles pour les prélèvement sanguins. Les chiens sont au stade adulte, avec un âge supérieur à 2 ans.
Exploration de nouvelles voies de régulation de la fibrose et de la résistance aux thérapies ciblées dans le carcinome hépatocellulaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une injection unique de composé cancérigène à l'âge de douze jours doit faire pousser un cancer du foie chez 96 souris mâles, suivies jusqu'à un an, avec dix prélèvements de sang et sept échographies sous anesthésie gazeuse chacune, et deux injections par semaine pendant cinq mois pour vingt-quatre d'entre elles. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré. Le porteur détaille le stress de contention, la douleur légère à l'insertion de l'aiguille et le risque d'hypothermie sous anesthésie, et mentionne en une ligne la perte de poids, l'hépatomégalie et la masse hépatique qu'entraîne le cancer qu'il provoque. Les 96 souris sont tuées pour analyser leur foie, et seuls des mâles sont utilisés, le porteur indiquant que les femelles sont moins sensibles aux maladies du foie.
Objectifs
L’inflammation chronique et la fibrose (cicatrisation progressive du foie) jouent un rôle central dans l’évolution des maladies du foie vers la cirrhose, puis vers un cancer du foie appelé carcinome hépatocellulaire (CHC). À ce jour, ce cancer est surtout traité par des médicaments appelés inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK), mais les patients finissent souvent par devenir résistants à ces traitements. Ce projet a pour objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans la progression de la fibrose, du CHC et dans l’apparition de cette résistance aux ITK. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris dans lequel un cancer du foie est provoqué par une injection unique de d'un composé cancerigène. Deux moments d’analyse sont prévus : à 8 mois, correspondant au stade de cirrhose, et à 12 mois, correspondant au stade de CHC. Les expériences consisteront à modifier certaines voies biologiques dans le foie à l’aide de vecteurs viraux, puis à analyser les tissus à ces deux stades clés (8 et 12 mois) par des examens microscopiques et moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs biologiques et des pistes thérapeutiques plus ciblées pour ralentir la progression vers la cirrhose et améliorer la prise en charge du CHC résistant.
Procédures
Durant ce projet les animaux subiront une injection à 12 jours (30s/ injection) ainsi que 1 prélèvement sanguin par mois de 3 à 8 ou 12 mois sur animaux vigiles par contention (1min / prélèvement), soit au total 10 prélèvements maximum par animal. Les animaux seront également soumis à une échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée de 15 minutes une fois par mois de 6 à 8 ou 12 mois, soit au maximum 7 échographies maximum par animal. 2 groupes d'animaux (24 souris) seront soumis à 2 injections par semaine pendant 5 mois.
Impact sur les animaux
Le modèle d'hépatocarcinome que nous utilisons induit le développement d'un cancer à 1 an, pouvant induire une perte de poids ainsi que des troubles hépatiques (hépatomégalie ou masse sur le foie). Lors des injections, l’animal va ressentir un stress lors de la contention et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille. Les animaux subiront des prélèvements sanguins répétés, pouvant entraîner une légère douleur. Des contentions seront pratiquées ce qui entraîne un stress léger. Une anesthésie gazeuse induit un stress et pourrait induire une hypothermie (prévenue par le maintien de l'animal sur une plaque chauffante).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin d'analyser différents organes dont le foie.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de l’inhibition ou la surexpression de protéines sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie hépatique. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations (homéostasie lipidique, fonction hépatique). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, dérèglements biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d’analyse et réduction du nombre d’animaux utilisés. Seules des souris mâles seront utilisées, car il est bien documenté dans la littérature que les femelles sont moins sensibles aux maladies hépatiques. Au cours de cette étude, des données seront recueillies et analysées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont hebergés dans les conditions réglementaires. Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés toutes les deux semaines, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Le modèle d’hépatocarcinome que nous utilisons a déjà été largement décrit dans la littérature et étudié au laboratoire, et nous savons qu'il induit un hépatocarcinome après 1 an. Afin de suivre l'apparition de l'hépatocarcinome, en plus du suivi clinique quotidien, une analyse mensuelle de différents marqueurs sanguins sera réalisée ainsi qu'une échographie du foie.
Choix des espèces
La souris permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. La molécule provoquant l’hépatocarcinome est administrée à des animaux de 12 jours, car à ce stade les hépatocytes (cellules du foie) sont encore très prolifératifs et par conséquent plus sensibles aux mutagènes. Les animaux sont ensuite suivis jusqu’à un an maximum, âge auquel ils présentent un hépatocarcinome.
Rôle des gènes d’études dans le développement des myosites inflammatoires : analyse de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une posture inhabituelle, un poil hérissé, un dos voûté, le retrait et l'absence d'interaction avec les congénères déclenchent le retrait de l'étude et une mise à mort immédiate. 2400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées en fin de procédure pour des analyses de tissus. Toutes reçoivent cinq jours d'injections dans le péritoine pour inactiver les gènes étudiés dans le muscle, ainsi que jusqu'à trois prélèvements de sang, et 1600 d'entre elles des injections en quatre zones sous la peau qui provoquent des lésions musculaires, suivies d'un gavage quotidien de glucocorticoïde pendant une semaine. Le porteur présente les 2400 souris comme "une estimation haute", ce nombre devant être "ajusté à la baisse" en fonction des résultats intermédiaires.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle des gènes d’études dans l’homéostasie du muscle squelettique et dans le développement des myosites inflammatoires, à l’aide de modèles murins présentant une invalidation conditionnelle et spécifique du muscle squelettique. Plus précisément, il s’agit de comparer l’impact d’une délétion musculaire de ces gènes induite après une lésion musculaire aiguë par toxine et avant l’induction d’une myosite expérimentale, sur les paramètres cliniques, histologiques, moléculaires et immunologiques du muscle.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle précis des gènes d’études dans la physiopathologie des myosites inflammatoires et des myopathies inflammatoires idiopathiques, qui se caractérisent par une faiblesse musculaire proximale, une élévation des enzymes musculaires et une inflammation musculaire persistante. L’utilisation de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle, combinée à des modèles de myosite expérimentale, devrait permettre d’identifier des voies de signalisation et des populations cellulaires clés dans la transition entre lésion musculaire aiguë, régénération et inflammation chronique. À terme, ces données pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques orientées vers le muscle dans les myopathies inflammatoires, ou à l’optimisation des stratégies de prise en charge existantes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (2400) seront sujets à des traitements par injection intra-péritonéale pendant 5 jours pour induire l’inactivation des gènes d’étude au niveau des muscles (30 secondes maximum de contention par injection soit 2minutes et 30 secondes au maximum par animal). Tout animal de l’expérience pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum (30 secondes de contention par prélèvement) au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Les 1600 souris des procédures 2 et 3 seront injectés en 4 zones en sous-cutanée et sous anesthésie gazeuse afin d’induire les lésions musculaires (30 minutes de l’anesthésie au réveil par animal), suivi d’une administration quotidienne par gavage (30 secondes de contention par administration et par animal) d’un glucocorticoïde pendant 1 semaine.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Des effets indésirables liés aux injections sous anesthésie sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie prévu dans la grille de scoring. Les gavages peuvent entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux. Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).
Remplacement
Les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls. L’utilisation de modèles murins de myosite expérimentale est actuellement la seule approche permettant de reproduire l’ensemble des aspects cliniques, histologiques et immunologiques de ces pathologies et d’évaluer l’impact d’une invalidation musculaire conditionnelle des gènes étudiés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de manière à obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre de souris par groupe, en se basant sur les pratiques publiées en modèles murins de myosite et de lésion musculaire (10 animaux par groupe et par condition). Pour chaque lignée et par temps étudiés (1 ; 3 ;5 ;7 ;9 mois post-traitement), 10 souris sont prévues pour les analyses de rétro transcrits, 10 pour l’expression protéique, 10 pour les analyses FACS et 10 pour l’histologie, réparties entre transgéniques et contrôles. Ainsi, 40 souris transgéniques pour chacune des 3 lignées sont nécessaires, soit 120 souris transgéniques et 40 contrôles par temps d’études de chaque procédure expérimentale (soit (120+40)x5 temps x 3 procédures), au total 2400 animaux au maximum seront nécessaires pour cette étude. Lorsque cela est possible sans compromettre la qualité des analyses, plusieurs types de mesures seront combinés sur un même animal (par exemple tests fonctionnels, prélèvements sanguins et analyses moléculaires sur muscles distincts). Ce nombre constitue une estimation haute et sera ajusté à la baisse en fonction des résultats intermédiaires, notamment si certains temps expérimentaux précoces ou tardifs s’avèrent non pertinents.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid, bâtons de bois et des maisonnettes...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé, avec une sonde rigide de 20G, par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de noyade accidentelle au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est nécessaire pour l’étude des maladies musculaires et des myosites expérimentales, car les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls Les stades d’études vont de jeunes adultes à adultes, nous utiliserons donc des souris de 1, 3, 5,7 et 9 mois après le 1er traitement, les souris les plus âgées auront donc 11 mois.
Identification et neurostimulation de réseaux cérébraux impliqués dans le développement de la dépression majeure suite à une douleur chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Une chirurgie sous anesthésie leur installe une douleur chronique censée produire un état anxio-dépressif, suivie de cinq examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer deux heures quarante, d'un test de douleur, de quatre tests d'anxio-dépression que le porteur ne nomme pas, d'un jeûne de vingt-quatre heures et d'un isolement de même durée en cage individuelle. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype anxio-dépressif "sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Il juge "indispensable" de travailler sur un "modèle animal, social, entier" et qualifie la souris adulte d'"incontournable dans la recherche en neurosciences".
Objectifs
La dépression majeure est une maladie fréquente qui touche environ 5 à 10 % de la population mondiale. Elle représente aujourd’hui l’une des principales causes d’invalidité et constitue un enjeu majeur de santé publique, avec un impact social et économique très important en Europe. Malgré les nombreux travaux de recherche menés dans ce domaine, le diagnostic repose encore principalement sur l’évaluation clinique des symptômes, car aucun biomarqueur fiable de la maladie n’a encore été identifié. Une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression est donc nécessaire afin d’identifier de nouveaux outils diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques. La douleur chronique est un facteur important dans le développement de la dépression : environ la moitié des patients dépressifs présentent également des douleurs chroniques. Des études d’imagerie cérébrale ont montré que ces troubles sont associés à des modifications de l’organisation et du fonctionnement de certains réseaux cérébraux. Cependant, les altérations spécifiques liées à l’association entre douleur chronique et dépression restent encore mal comprises. Ce projet vise à étudier ces mécanismes à l’aide d’un modèle murin de douleur chronique associé à un état anxio-dépressif. L’objectif est d’analyser l’évolution des connexions entre différentes régions du cerveau au cours du temps, ainsi que l’effet potentiel de stimulations cérébrales ciblées sur ces réseaux. Les protocoles de stimulation utilisés s’inspirent directement d’approches de neuromodulation actuellement étudiées chez l’humain et l’étude des modifications cérébrales sera réalisée grâce à l’imagerie par résonance magnétique, une technique non invasive largement utilisée en recherche clinique, ce qui favorisera la comparaison entre les résultats obtenus chez l’animal et ceux observés chez les patients. À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux comprendre les bases biologiques de ces troubles et à développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels associés.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier des biomarqueurs cérébraux caractéristiques du développement de la comorbidité douleur - dépression, ainsi que d’approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques. L’identification de ces biomarqueurs et la caractérisation des effets de ces protocoles de neurostimulation permettra, in fine, d’optimiser l’efficacité thérapeutique et d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h -Les animaux sont soumis à un maximum de 5 examens IRM sous anesthésie d’une durée maximale de 2h40. - Les animaux subissent un test évaluant la douleur de 15 minutes en moyenne. – Les animaux subissent une stimulation courte de maximum 20 secondes, et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). Les tests répétables seront effectués un maximum de deux fois. - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental. -Les animaux seront mis en cage individuelle pour une période de 24h maximum au cours de l’un des tests comportementaux. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aiguë, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation fonctionnelle et comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité des réponses individuelles des animaux.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines après leur arrivée pour s’habituer aux nouvelles conditions environnementales. Ils seront hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences
Imagerie photoacoustique et de fluorescence de l’activité neuronale dans le systeme nerveux central chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 65
Ouverture du crâne pendant trente minutes à deux heures quinze, pose d'une fenêtre crânienne, injections de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau au moyen d'un cadre stéréotaxique : 194 souris et 65 rats, 259 individus au total, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Certains enchaînent des séances d'imagerie répétées pendant quelques semaines à plusieurs mois, jusqu'à ce que la qualité des données ne permette plus de poursuivre. L'objectif est de mettre au point l'imagerie photoacoustique, une technique dont les applications médicales sont renvoyées au long terme. Le porteur indique que l'effectif n'a pas été calculé statistiquement, les informations requises manquant encore pour cette technologie, et l'avoir fixé d'après son expérience et celle d'autres équipes.
Objectifs
Les techniques actuelles de microscopie permettent d’observer l’activité des neurones dans le cerveau avec une très grande précision. Cependant, la lumière utilisée pour ces observations ne pénètre que sur une faible profondeur, de l’ordre d’un millimètre. L’étude de régions cérébrales plus profondes nécessite alors des interventions chirurgicales invasives pouvant altérer les tissus observés. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à des profondeurs plus importantes tout en limitant ces contraintes. Cette technique utilise la lumière pour stimuler les tissus et les ultrasons pour recueillir l’information. Elle pourrait ainsi permettre d’accéder à des régions du cerveau aujourd’hui difficiles à étudier. L’objectif de ce projet est de développer et d’optimiser cette technologie afin de la rendre utilisable pour l’étude de l’activité neuronale. Les travaux porteront sur trois aspects complémentaires : l’amélioration des performances de l’instrument d’imagerie, le développement de fenêtres crâniennes adaptées permettant le passage de la lumière et des ultrasons, et l’identification des marqueurs biologiques les plus adaptés à cette nouvelle méthode. Une première phase d’optimisation sera réalisée sur des échantillons de tissu nerveux, avant une phase d’évaluation chez l’animal vivant. À terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles approches d’imagerie cérébrale permettant d’étudier le fonctionnement du cerveau de façon moins invasive et à plus grande profondeur que les techniques actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La compréhension du fonctionnement du cerveau repose sur la capacité à observer l’activité des neurones dans des conditions aussi proches que possible de leur état naturel. Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre de nombreuses maladies neurologiques, psychiatriques ou neurodégénératives et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles méthodes de diagnostic ou de traitement. Les techniques actuelles d’imagerie permettent déjà d’observer l’activité cérébrale avec une très grande précision, mais elles sont principalement limitées aux régions superficielles du cerveau. L’étude de structures plus profondes nécessite souvent des interventions invasives susceptibles de perturber les tissus observés. L’imagerie photoacoustique constitue une approche prometteuse pour dépasser cette limitation. Elle pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à plusieurs millimètres de profondeur, voire davantage, tout en limitant les perturbations induites par la mesure elle-même. À terme, cette technologie pourrait permettre l’étude de structures cérébrales profondes impliquées dans la mémoire, le mouvement, les émotions ou certaines pathologies neurologiques. Le projet vise ainsi à développer et optimiser une nouvelle méthode d’imagerie fonctionnelle du cerveau, capable de fournir des informations plus détaillées et moins invasives que celles actuellement accessibles pour les régions profondes du système nerveux central. Les connaissances acquises bénéficieront principalement à la recherche fondamentale en neurosciences, mais elles pourraient également contribuer, à plus long terme, à l’amélioration de la compréhension et de la prise en charge de nombreuses maladies du cerveau.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions réalisées sous anesthésie générale : * Injection de faibles volumes de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau à l’aide d’un dispositif stéréotaxique. Cette intervention dure généralement entre 1 heure 15 minutes et 1 heure 45 minutes et est suivie d’une période de récupération post-opératoire. * Réalisation d’une ouverture limitée de l’os du crâne (craniotomie) afin de permettre l’accès aux structures cérébrales d’intérêt et, selon les procédures, la mise en place d’une fenêtre crânienne destinée à l’imagerie. Selon la procédure, la durée de l’intervention est comprise entre 30 minutes et 2 heures 15 minutes. Les animaux récupèrent ensuite de l’anesthésie et bénéficient d’un suivi post-opératoire adapté. * Séances d’imagerie réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie générale selon la procédure considérée. Ces séances permettent d’enregistrer l’activité cérébrale sans provoquer de douleur supplémentaire. * Dans les procédures où la dernière intervention est terminale, les animaux sont placés sous anesthésie profonde et ne sont pas réveillés. Selon les objectifs scientifiques, cette intervention se termine soit par une perfusion intracardiaque, soit par l'administration d'un agent euthanasiant. Ces procédures terminales durent généralement une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont liées aux interventions chirurgicales nécessaires à la réalisation du projet, notamment les injections ciblées dans le cerveau et la mise en place de fenêtres crâniennes permettant l’imagerie. Comme pour toute intervention chirurgicale, ces procédures peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire après l’opération ainsi qu’une perte de poids temporaire pendant la phase de récupération. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale et bénéficient d’une prise en charge antalgique avant, pendant et après la chirurgie afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux font également l’objet d’un suivi post-opératoire rapproché permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Dans un faible nombre de cas, des irritations locales, une inflammation ou une infection peuvent apparaître au niveau de la zone opérée ou autour de la fenêtre crânienne. Si nécessaire, des traitements adaptés (anti-inflammatoires, analgésiques ou traitements locaux) sont mis en œuvre et des points limites prédéfinis permettent d'interrompre la procédure et de procéder à une euthanasie anticipée si le bien-être de l’animal est compromis. Les séances d’imagerie elles-mêmes sont non invasives. Elles sont réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie selon les procédures et ne devraient pas entraîner de douleur supplémentaire pour les animaux.
Devenir
À l'issue de toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sont mis à mort. Les procédures 1 et 2 se terminent par une perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale profonde. Cette intervention terminale est nécessaire à la préparation, à la conservation et à l'analyse des tissus nerveux dans le cadre du projet. Dans les procédures 3, 4 et 5, les animaux participent à des séances répétées d'imagerie cérébrale pendant une période pouvant aller de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la qualité et de l'intérêt scientifique des données recueillies. Lorsque les objectifs scientifiques du projet sont atteints ou que la qualité des données ne permet plus de poursuivre les acquisitions dans des conditions satisfaisantes, les animaux sont euthanasiés. En outre, tout animal atteignant l'un des points limites prédéfinis garantissant son bien-être est immédiatement retiré de l'étude et mis à mort. La dernière phase de la procédure 6 est réalisée sous anesthésie terminale. Les animaux ne sont pas réveillés après la séance d'imagerie et sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde à l'issue de celle-ci. Aucun animal ne peut être replacé ou réutilisé à l'issue des procédures, en raison des interventions chirurgicales réalisées, de la présence d'implants crâniens, des injections intracérébrales effectuées et, selon les procédures, de la nécessité de prélever ou de préserver les tissus dans des conditions compatibles avec les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les cultures cellulaires et les autres méthodes réalisées en dehors de l’organisme vivant constituent des outils précieux pour réduire le recours aux animaux et sont utilisées dans ce projet chaque fois qu’elles permettent de répondre à une question scientifique. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du cerveau ou de la moelle épinière, qui reposent sur les interactions entre de très nombreuses cellules organisées en réseaux et en communication permanente avec le reste de l’organisme. Les préparations de tissu nerveux (tranches) préservent une partie de ces connexions et seront utilisées lors de la phase initiale d’optimisation du projet. Elles permettent d’obtenir des informations importantes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, elles ne reproduisent qu’imparfaitement le fonctionnement du système nerveux dans un organisme vivant. L’objectif principal du projet étant de développer une méthode permettant d’observer l’activité cérébrale dans des conditions physiologiques, certaines questions scientifiques nécessitent l’étude du cerveau chez l’animal vivant. À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir l’ensemble des informations recherchées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux sont hébergés dans des conditions contrôlées, conformes aux bonnes pratiques, afin de limiter le stress et les problèmes sanitaires susceptibles d'influencer les résultats. Cette standardisation permet d'obtenir des données plus fiables et de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Habituellement, le nombre d'animaux utilisé dans une étude est déterminé à l'aide de méthodes statistiques. Toutefois, le présent projet vise à développer et optimiser une nouvelle technologie d'imagerie, pour laquelle les informations nécessaires à ce type de calcul ne sont pas encore disponibles. Les effectifs ont donc été définis à partir de notre expérience et de celle d'autres équipes utilisant des approches similaires. Plusieurs mesures sont mises en œuvre pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs expériences sont réalisées sur un même animal. Pour les procédures où cela est pertinent, une première phase d'optimisation technique, conduite sur un nombre limité d'animaux, permet d'identifier les meilleures conditions expérimentales avant le lancement des expériences principales. Cette stratégie réduit les échecs d'origine technique et contribue ainsi à limiter l'utilisation d'animaux. Enfin, les expériences sont réalisées chez des animaux des deux sexes afin d'éviter la production d'animaux non utilisés et de garantir que les résultats obtenus soient représentatifs des femelles comme des mâles.
Raffinement
Le projet a été conçu de manière à réduire autant que possible la douleur, la souffrance, l’angoisse et les contraintes imposées aux animaux. Les animaux sont hébergés en groupes afin de préserver leurs interactions sociales (2 à 5 souris ou 2 à 3 rats par cage). Leur environnement est enrichi à l’aide de matériaux de nidification, d’abris et d’objets à explorer ou à ronger. Ces enrichissements sont régulièrement renouvelés afin de favoriser l’expression de comportements naturels et d’améliorer leur bien-être. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale. L’anesthésie par inhalation est privilégiée car elle permet un endormissement et un réveil rapides ainsi qu’un meilleur contrôle de la profondeur anesthésique. Des traitements antalgiques sont administrés avant et après les interventions afin de prévenir et limiter la douleur. Une analgésie locale est également réalisée au niveau de la zone opérée. Pendant les interventions, la température corporelle des animaux est maintenue à l’aide d’une couverture chauffante et un gel ophtalmique est appliqué afin de protéger les yeux. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opératoire est désinfectée afin de limiter les risques d’infection. Après les interventions, les animaux bénéficient d’un suivi renforcé permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de complication. Leur état général, leur poids et leur comportement sont évalués à l’aide d’une grille de suivi standardisée. Si des signes de douleur ou d’altération du bien-être sont observés, des traitements adaptés sont administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, des points limites prédéfinis conduisent à une euthanasie anticipée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Notre expérience montre que les interventions prévues dans ce projet sont généralement bien tolérées lorsque ces mesures de prise en charge et de suivi sont appliquées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche en neurosciences. Leur système nerveux présente de nombreuses similitudes d’organisation et de fonctionnement avec celui des autres mammifères, ce qui en fait des modèles particulièrement adaptés pour développer et évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie du cerveau. Le projet utilise à la fois des souris et des rats, car ces deux espèces présentent des avantages complémentaires. Les souris permettent notamment de tirer parti des nombreuses ressources génétiques disponibles, en particulier des lignées transgéniques exprimant des marqueurs biologiques d’intérêt pour l’étude de l’activité neuronale. Des souris sauvages et transgéniques adaptées aux objectifs du projet seront utilisées. Les rats seront principalement utilisés lors des expériences d’imagerie chez l’animal vivant. Leur taille plus importante est mieux adaptée aux caractéristiques techniques du système d’imagerie photoacoustique utilisé dans ce projet et facilite l’étude de structures cérébrales plus profondes. Certaines souches de rats, notamment les rats Long-Evans, pourront être privilégiées lorsque leurs caractéristiques sont particulièrement adaptées aux procédures prévues. Le projet nécessite l’utilisation d’animaux à différents stades de développement. Les expériences réalisées sur des échantillons de tissu nerveux utilisent préférentiellement de jeunes animaux, car leurs tissus sont mieux adaptés à la préparation de tranches destinées aux études préliminaires. Les expériences d’imagerie chez l’animal vivant sont réalisées chez des animaux plus âgés, dont le système nerveux est suffisamment développé pour répondre aux objectifs du projet.
Signalisation astrocytaire en physiopathologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 80 d'entre elles subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau pouvant durer quatre heures, et 80 huit séances d'imagerie de soixante minutes maintenues sous contention. Jusqu'à 332 souris reçoivent en plus des substances par gavage cinq jours de suite ou par voie orale huit fois. Le projet cherche à localiser un facteur de transcription dans les prolongements des astrocytes qui touchent les vaisseaux du cerveau, après induction d'une inflammation périphérique, les retombées annoncées pour la maladie d'Alzheimer ou l'accident vasculaire cérébral restant à l'état de perspectives. Toutes sont mises à mort pour prélever leur cerveau, analysé en biochimie et en histologie.
Objectifs
Les astrocytes sont des cellules importantes dans le cerveau. Elles remplissent des fonctions clés notamment au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux, qu’elles contactent par des structures spécialisées appelées prolongements périvasculaires. En conditions pathologiques, les astrocytes subissent d’important changements, sous l’influence notamment de voies de signalisation qui activent l’expression de gènes cibles dans le noyau des astrocytes, via des facteurs de transcription. Des données préliminaires montrent que certains facteurs de transcription sont aussi présents dans les prolongements périvasculaires des astrocytes, près des vaisseaux. Nous émettons l’hypothèse qu’un facteur de transcription cible a un rôle spécifique au niveau des prolongements périvasculaires, où il pourrait détecter les signaux physiopathologiques venant de la périphérie et réguler efficacement la fonction des astrocytes. Nous utiliserons une nouvelle souris transgénique dans laquelle ce facteur de transcription est marqué par une protéine fluorescente seulement dans les astrocytes, qui ne s’exprimera qu’après traitement au tamoxifène. Nous pourrons alors visualiser directement sa localisation et ses mouvements dans les prolongements périvasculaires par imagerie biphotonique. Nous pourrons aussi identifier les partenaires de ce facteur de transcription dans les prolongements périvasculaires, grâce à des analyses protéomiques en conditions physiologiques et après induction d’une inflammation périphérique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le fonctionnement des astrocytes à l’interface avec le système vasculaire en conditions normales et inflammatoires. Ceci ouvre des perspectives thérapeutiques pour mieux cibler des potentielles altérations pathologiques au niveau vasculaire qui se produisent dans de nombreuses pathologies du cerveau (maladie d’Alzheimer, inflammation, accident vasculaire cérébral…).
Procédures
Injection sur souris vigile ou anesthésiée : 10 sec, 1 fois. (196 souris) Administration de substance par gavage sur souris vigile : 10 secondes, 5 fois sur 5 jours (maximum 332 souris) ou par voie orale sur souris vigile : 1 min, 8 fois au total (1 fois/jour) (maximum 332 souris) Chirurgie avec injection dans le cerveau sur souris anesthésiée : 4h maximum, 1 fois (80 souris) Injection d’une substance sur souris anesthésiée, 30 secondes, 5 fois sur 5 jours (40 souris) Imagerie sur souris vigile après habituation à la contention : 8 sessions de 60 min maximum sur 5 jours. (80 souris)
Impact sur les animaux
Des douleurs post-opératoires modérées et de courte durée sont possibles. Certaines injections peuvent induire un inconfort de type « état grippal » : provoquant des douleurs légères à modérées pendant maximum 72h. Stress et inconfort liés à la contention nécessaire pour l’acquisition d’images. Stress léger lors de l’administartion par gavage et douleur légère et de courte durée liées à certaines injections.
Devenir
Les souris de chaque procédure seront mises à mort par une méthode validée, pour récupérer leur cerveau qui sera analysé par différentes méthodes complémentaires (biochimie, histologie)
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes, mais aussi avec les vaisseaux sanguins, objets de cette étude. Ces interactions cellulaires complexes ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles de lignées cellulaires ou cultures dérivées de cellules induites à la pluripotence ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. Les modèles animaux permettent d’étudier les neurones, les astrocytes et les cellules vasculaires dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 568 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris grâce à des approches de protéomique et d’analyses histologiques. De même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir mettre à mort des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant l’imagerie permet de réduire le stress des souris. Enfin, nous évaluerons l’administration de substance par prise volontaire pour éviter le stress de la contention lors du gavage.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones, astrocytes et cellules vasculaires. Les organismes modèles simples (C Elegans, D Melanogaster) possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère et pas de véritable système vasculaire. Seul le modèle souris que nous allons utiliser dans ce projet permet d’identifier notre protéine d’intérêt seulement dans les astrocytes grâce à sa fusion à une protéine fluorescente i) détectable par microcopie biphotonique et en histologie et ii) purifiable par des techniques de biochimie. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et vasculaire mature. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et avasculaire mature.
Validation de la sécurité pour la peau d’un mode d’application rapide et dynamique des ultrasons focalisés dans le modèle lapin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Jusqu'à sept zones de tir sur la peau au-dessus du foie pour un même lapin, en une séance d'une heure trente : 60 lapins vont être utilisés, maintenus en hyperextension sur un support, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Les ultrasons focalisés à haute intensité doivent y provoquer des brûlures du premier au second degré, auxquelles s'ajoutent un endommagement du foie et un risque de blessure lié à la position. L'étude sert à vérifier, pour l'entreprise qui la soumet, qu'un protocole plus rapide de destruction des varices ne brûlera pas la peau des patients. Le porteur affirme que le lapin est "le meilleur modèle pour l'étude de l'échauffement cutané", les brûlures observées sur cochon ou sur brebis correspondant selon lui à des couches plus profondes.
Objectifs
La technologie des ultrasons focalisés permet de détruire des veines pathologiques (varices par exemple) sans incision. Une sonde émet des ultrasons qui traversent la peau et se concentrent sur le tissu à traiter où ils induisent un échauffement local important. Le geste est guidé en temps réel par échographie. Dans ce contexte, le but de cette étude est de valider la sécurité des paramètres de traitement avant passage sur l’homme pour le traitement des varices. Un protocole de traitement est déjà appliqué en clinique actuellement et l’objectif de cette étude est de proposer un protocole permettant un traitement plus rapide tout en traitant un plus grand nombre de veines : - Les veines plus superficielles (jusqu’à 6 mm sous la peau alors qu’il est aujourd’hui possible de ne traiter des veines qui sont au maximum à 9 mm sous la peau). Lors des traitements de ces veines superficielles, il existe un risque important de créer des dommages entre la peau et la veine traitée. - Les veines plus profondes (jusqu’à 30 mm sous la peau). Par ailleurs en vue d’accélérer le protocole de traitement, de nouvelles impulsions ultrasonores avec de nouveaux paramètres doivent être développés. Il est nécessaire pour proposer un nouveau protocole de traitement de vérifier que celui-ci ne présente pas de risques pour le patient notamment de risques de brulure de peau. L'objectif de l'étude est donc de : • Vérifier que le traitement ne crée pas de brulures de peau. Des traitements aigus seront réalisés pour constater les effets du traitement sur la peau de l’animal.
Bénéfices attendus
A court terme, l’étude permet à l’entreprise qui la soumet de mieux comprendre les problématiques liées à l’utilisation d’ultrasons focalisés à haute intensité notamment lors de traitement de veines superficielles. Plusieurs paramètres comme la fréquence des ultrasons, l’enveloppe du signal utilisé seront étudiés et les impacts des changements sur ces paramètres pourront être directement étudiés, le tout permettant de mieux comprendre les ondes avec lesquelles les opérateurs travaillent. Il sera ainsi possible de modifier ces paramètres jusqu’à obtenir le traitement le plus sûr pour garantir la non présence d’événements indésirables avec la nouvelle impulsion d’ultrasons focalisés et la nouvelle tête de traitement. Le bénéfice pour les êtres humains serait à long terme de proposer un traitement non invasif permettant de traiter les varices ayant une durée de traitement comparable à celle proposée par les techniques concurrentes. De plus il sera possible d’élargir les critères d’éligibilité au traitement avec les ultrasons focalisés à haute intensité donc de traiter plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à l'application d’ondes ultrasonores focalisées à haute intensité. Il sera placé sous anesthésie générale, pendant 1h30. Cette intervention n’est réalisée qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Pour les animaux inclus dans l’étude, le traitement est délivré sous anesthésie générale. Les nuisances attendues ici sont un stress de courte durée lié à la manipulation et la contention. Les brûlures attendues sont des brûlures allant du premier au second degré, par ailleurs l’effet de ces brûlures sera de courte durée et non ressenti car la procédure est effectuée sans réveil sous anesthésie générale. Il y a également un risque de blessure lorsque l’on place l’animal sur le support dans la position d'hyperextension. Il existe de plus un endommagement du foie par les ultrasons.
Devenir
La procédure est sans réveil de l’animal. Les brûlures, l’endommagement du foie de l’animal et la position d’hyperextension induisent des dommages qui pourraient engendrer des douleurs et une dégradation de l’état de l’animal s’il était réveillé.
Remplacement
Plusieurs alternatives sont mises en place dans l’entreprise pour remplacer les animaux dans les procédures de tests. L’alternative non animale disponible est la simulation numérique, elle constitue la première approche dans une étude et permet d’analyser les premiers effets des modifications (l’agrandissement de la tête de traitement pour traiter plus profondément est analysée en premier temps par une simulation numérique). Or il existe des incertitudes importantes (propriété des tissus connues avec une précision insuffisante, dynamique du flux sanguin, lien peu documenté entre température, temps d’exposition et dommages biologiques…) qui ne permettent pas de réaliser l’ensemble de l’étude sur ces simulations. En effet, la simulation numérique ne permet pas d’effectuer des simulations thermiques suffisamment précises. D’autre part, avec les paramètres envisagés, il est possible que les tirs engendrent de la cavitation au niveau de la peau qui est impossible à simuler dans l’état actuel des connaissances. Une partie des expérimentations sur animaux vivants a été remplacée par la réalisation d’expériences ex-vivo. Ceci nous permet d’avoir des premières connaissances sur les tailles et la localisation des lésions qui vont être obtenues. Par ailleurs, le tissu utilisé est homogène. On ne peut pas évaluer les risques sur la peau et le tissu utilisé (viande de dinde sous vide) ne présente pas de vascularisation nécessaire pour évaluer les impacts de l’impulsion d’ultrasons focalisés à haute intensité étudiée. Il n’est également pas possible de faire des essais sur de la peau isolée car le transfert thermique du corps vers la peau a un impact non négligeable sur l’apparition de brulures. Sont également mises en place des recherches sur une nouvelle technique pour remplacer l’expérience de la sécurité à la peau avec un système de papiers thermosensibles. Les papiers changent de couleur lorsque leur température est supérieure à une valeur seuil. Cette méthode permet de trouver des premières valeurs de puissances pouvant entrainer des brulures et donc de réduire l’échelle de puissances à tester. Dans cette étude, nous chercherons à valider cette nouvelle approche pour remplacer au maximum le nombre d’animaux nécessaires sur la sécurité à la peau.
Réduction
Cette étude est réalisée sur la peau au-dessus du foie du lapin. Dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux inclus dans l’étude, le maximum d’emplacements sur le foie du lapin pour évaluer la sécurité à la peau sera utilisé (jusqu’à 7 zones par lapin). Le lapin sera positionné sur un support permettant de mettre les lapins en hyperextension, afin que le foie soit bien dégagé. Cela permet d’augmenter le nombre d’emplacement à cet endroit (de 5 à 7 zones). Le nombre d’animaux nécessaires pour cette étude est de 60.
Raffinement
Les lapins sont hébergés dans les conditions répondant aux standards de l'espèce. Les enrichissements distribués consistent en des blocs de foin compactés, des bûches de bois à ronger et des jouets (balles, haltères en plastiques). Les lapins bénéficient d’une période d’acclimatation de 7 à 10 jours permettant de les habituer à la manipulation et la contention. Ils peuvent être également laissés en liberté sur de courtes périodes dans la salle d’hébergement dans un parc par petits groupes sous surveillance. Les cages disposent de plateforme permettant de se poser en hauteur ou de se cacher. Les lapins sont anesthésiés (valences analgésique, myorelaxation, perte de connaissance) durant l'ensemble de la procédure et entourés de bouillottes d'eau chaude (la position en hyperextension ne permet pas d'utiliser un tapis chauffant). Les paramètres physiologiques des lapins sous anesthésie sont monitorés pour suivi et contrôle (fréquence respiratoire, oxymétrie, capnie, ECG, température).
Choix des espèces
D’après notre expérience préclinique, le lapin est le meilleur modèle pour l’étude de l’échauffement cutané. De plus les données collectées par le passé pour définir la procédure de traitement actuellement utilisée en clinique se sont révélées fiables pour le passage à l’homme. Par comparaison, le type de brûlures qui peuvent être observées sur cochon ou sur brebis correspondent à des dommages de couches plus profondes et modélisent mal ce qui se passe sur l’homme.