Recherche fondamentale
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Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie des muqueuses avec l’IgA pour le traitement du cancer de l’estomac
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées par laparoscopie pour 48 d'entre elles, puis suivies en imagerie chaque semaine et prélevées de sang toutes les deux semaines, 525 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés et sévères, toutes tuées à l'issue pour prélever estomac, foie et poumons. De la troisième à la huitième semaine, huit souris sont tuées chaque semaine pour observer la croissance des tumeurs, et 270 autres reçoivent une greffe puis des gavages ou des injections aux posologies comparées. L'objet immédiat est de vérifier qu'un anticorps déjà actif in vitro atteint la tumeur de l'estomac et les métastases. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale observable pendant 48 heures et qualifie les autres gestes de "léger stress", tout en annonçant pour les patients une "révolution" et une "amélioration sans précédent" de leur qualité de vie.
Objectifs
Dans le monde, il y a environ 1 million de nouveau cas de cancer de l’estomac chaque année. Cela place ce cancer au 5ème rang des cancers les plus fréquents au niveau mondial. En France, on estime à environ 7000 nouveaux cas par an avec un taux de survie à 5 ans de 30% environ. Les traitements actuels sont le plus souvent la chirurgie, les chimiothérapies et les immunothérapies ciblant des caractéristiques non spécifiques des cellules cancéreuses. Ces traitements entraînent de forts effets secondaires impactant fortement la vie quotidienne des patients. Nous avons mis au point un nouveau médicament qui cible directement un marqueur de surface des cellules cancéreuses et dont l’efficacité a été prouvée in-vitro. Nous voulons apporter la preuve qu’il est aussi efficace in vivo dans une situation où la cellule cancéreuse a le même environnement tissulaire que chez l’Homme. Une 1ère étude pré-clinique non-réglementaire a été menée avec succès, nous permettant aujourd’hui de continuer notre développement en ciblant le cancer de l’estomac avant de mener les études précliniques réglementaires.
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle thérapeutique qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales. L'efficacité du médicament est l'élément critique pour l'adoption d'un nouveau médicament, mais la voie d'administration l'est tout autant : en prenant le produit par voie orale, le patient redevient acteur de son long parcours de soins et il n'a plus besoin de se déplacer à l'hôpital pour poursuivre son traitement. L'impact sur l'amélioration de la qualité de vie du patient sera considérable, lorsque le médicament sera approuvé et utilisé. Maintenir les patients à domicile en leur permettant de poursuivre leur traitement à distance améliore considérablement l'accès aux soins pour les patients vivant dans des zones rurales dépourvues d'infrastructures médicales importantes (Hôpitaux universitaires, centres de recherche contre le cancer de pointe, centres d'investigation clinique pour les essais cliniques). De plus, les traitements contre le cancer sont généralement extrêmement toxiques, constituant un challenge pour les médecins prescripteurs qui doivent trouver le meilleur équilibre entre bénéfice thérapeutique et tolérance pour le patient. Les effets secondaires nombreux et variés selon les conditions physiologiques du patient rendent le parcours de soins du patient extrêmement difficile à vivre. A cela s'ajoute la lourdeur d'un traitement qui nécessite une administration régulière à l'hôpital (parfois chaque semaine), souvent pendant de longues heures (4 à 6 heures) voire des jours, par perfusion sous contrôle médical. Pour le bien-être du patient, l'administration orale d'un traitement anticancéreux représentera une révolution et une amélioration sans précédent de sa qualité de vie. Enfin, notre démarche s’inscrit dans le contexte du traitement d’indications orphelines telles que les lésions précancéreuses de la muqueuse buccale, qui laissent, par définition, les patients sans aucune chance de traitement.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèvement de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie. 48 animaux vont avoir une laparoscopie pour la greffe orthotopique. Parmi, ces animaux Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 270 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
L’injection en intra-péritonéale du réactif pour la bioluminescence permettant l’analyse par imagerie de l’animal vont entrainer au réveil de l’animal un léger stress. Les gestes de chirurgie entrainent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Les traitements par intra-veineuse ou par injection péritonéale n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille avec un léger stress de courte durée sur les animaux sur la durée de la contention. Les traitements lors des gavages entraineront un léger stress de courte durée lors de la contention.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (estomac, foie, poumon…) pour observer la présence de tumeur au niveau de l'estomac et la présence de métastases dans les autres organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de la tumeur mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments
Remplacement
Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement . La reconnaissance du marqueur tumoral, le recrutement et activation des cellules immunes par notre molécule, l’induction de la mort cellulaire tumorale sont validés de manière in-vitro. Cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés ne permettent pas de valider complètement l’efficacité de notre molécule. La complexité de l’environnement cellulaire de la tumeur et la voie d’administration sont primordials sur la biodistribution de notre molécule. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement tumoral afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la tumeur tissulaire ou aux métastases à distance du site primaire tumoral et du site d’absorption de notre molécule).
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. La première procédure permettra de déterminer la vitesse de croissance et le temps d’essaimage de métastases d’une greffe tumorale orthotopique et de valider la technique de monitoring par imagerie en bioluminescence. Cette imagerie optique permet de réduire le nombre d’animaux utilisés puisque le suivi du développement tumoral se fait de manière longitudinale sur un même groupe d’animaux. La bioluminescence permet également d’anticiper l’apparition des tumeurs profondes non visibles autrement que par l’imagerie et d’inclure ce suivi dans la grille de score. Cet outil qu’est la bioluminescence nous permettra de sélectionner que les animaux ayant une taille de tumeur correspondant à notre besoin ainsi que de déterminer la présence ou non de métastases. Effectivement, lors de l’étude précédente, certains animaux présentaient une taille de tumeur plus importante que la moyenne du lot (dû à la variabilité expérimentale dans l’implantation tumorale) et ne pouvaient donc pas rentrer dans l’analyse. Cette procédure nous permettra de commencer les traitements à partir d’une certaine taille tumorale (correspondant à celle obtenus lors de l’apparition de métastases) et donc de limiter le nombre d’animaux dans la procédure tout en garantissant que ceux greffés et sélectionnés correspondent aux critères de l’étude et donc seront analysables à la fin de la procédure.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations de l’afstal 20235 avec une anesthésie stable et contrôlée en isoflurane (3% induction puis maintien à 1,5%) avec prise en charge multimodale de l’analgésie avec buprénorphine, alpha2 agoniste et anesthésie locale. L’asepsie sera la plus importante possible. La gestion de l’analgésie post-opératoire sera stricte et suivie pour éviter toute douleur aux animaux. Un échange sera fait avec l'équipe de soigneur pour optimiser les soins en post-opératoire (éviter tout mouvement ou changement de cage aux animaux durant cette période, apport d'eau et nourriture gélifiée, augmentation des enrichissements de type nid pour conserver sa température). Tout au long des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique de cyclosporine sera appliqué. L'apport de l'imagerie optique par bioluminescence dans le suivi du développement tumoral permet aussi de s'inscrire dans une démarche de raffinement puisque cet outil permet de réaliser un suivi de paramètres intrinsèques de manière très peu invasive pour les animaux. Durant toute la procédure, les animaux seront étroitement surveillés en applicant le suivis des points limites grâce à la grille de score mise en place pour ce projet.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.
?tude de l?effet d?une hypothyro?die en p?riode postnatale sur la prolif?ration et maturation du microbiote chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1595 souris pour une question sur le microbiote intestinal, dont 280 portées entières retirées à leur mère dès la naissance et confiées à des femelles rendues hypothyroïdiennes par un régime pauvre en iode. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes les souris seront tuées pour un prélèvement de sang et d'organes. Cinq cent vingt d'entre elles sont anesthésiées au gaz chaque semaine pour être mesurées, et pesées trois fois par semaine, quarante subissant en plus un prélèvement de fèces à l'anus. Le porteur écrit qu'une mère de substitution qui ne prend pas la portée en charge expose les souriceaux à la dénutrition et à l'hypothermie, et que ceux dont l'estomac apparaît vide de lait par transparence sont mis à mort.
Objectifs
Chez l'homme 10% des grossesses s'accompagnent d'hypothyro?die. Si cette derni?re n'est pas corrig?e chez le nouveau n?, elle s'accompagne de d?fauts d?veloppementaux irr?versibles. Comme chez la souris, la p?riode postnatale constitue une fen?tre critique du d?veloppement au cours de laquelle les organes acqui?rent leur maturit? fonctionnelle et s?ajustent aux signaux environnementaux. Dans le m?me temps, le microbiote intestinal se d?veloppe et est n?cessaire ? une croissance optimale. Cette p?riode est donc d?terminante pour l??tablissement des interactions h?te-microbiote. Chez la souris aussi les HT sont cruciales dans cette fen?tre d?veloppementale: en absence d?HT, les souriceaux n?atteignent pas le sevrage. Bien que la signalisation thyro?dienne et la maturation du microbiote soient toutes deux n?cessaires au bon d?roulement de cette p?riode critique, le r?le des HT dans le recrutement du microbiote n'a pas ?t? ?tudi?. Pourtant des donn?es laissent ? penser que cela pourrait ?tre le cas. Chez l'adulte les HT r?gulent la synth?se h?patique des acides biliaires . L?augmentation h?patique d?HT, observ?e d?s trois jours apr?s la naissance, pourrait initier la production d?acides biliaires, acteurs majeurs de la maturation du microbiote intestinal, sugg?rant un r?le des HT sur la maturation du microbiote au cours du d?veloppement. Le but de ce projet est d?explorer si les HT participent ? la maturation du microbiote intestinal pendant la p?riode postnatale chez la souris et si oui comment. La mise en ?vidence d?un dialogue inter-organes (foie-intestin) et inter-r?gnes (microbiote-h?te), pendant la p?riode postnatale permettrait de mieux comprendre les m?canismes impliqu?s dans l?adaptation pr?coce de l?organisme ? son environnement, d?terminante pour permettre le sevrage et la sant? ? l??ge adulte. Vues les similitudes qu'il existe entre les effets d?veloppementaux des HT et le recrutement du microbiote entre homme et souris , les r?sultats obtenus nous ?claireraient sur le r?le des HT dans la maturation du microbiote chez l'homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de d?terminer si et comment les hormones thyro?diennes, un signal hormonal crucial pour le d?veloppement postnatal de l'h?te participent ? la prolif?ration et ? la diversification du microbiote. En effet hormones thyro?diennes et microbiote sont tous deux n?cessaires ? une croissance normale et une maturation de nombreux organes de l?h?te, cependant aucune ?tude n?a pour l?instant interrog? une potentielle interaction entre les deux. S?il existe un effet, nous ?valuerons s?il peut ?tre corrig? en restaurant des concentrations d?hormones thyro?diennes normales. Ces connaissances contribueront ? am?liorer notre compr?hension de la mise en place des communications h?te-microbiote, qui sont n?cessaires non seulement ? la bonne sant? de l?h?te adulte, mais aussi ? son bon d?veloppement postnatal . Si nos hypoth?ses sont confirm?es chez la souris, nos r?sultats permettraient d'envisager l'utilisation de probiotiques en cas d'hypothyro?die chez l'homme ? la naissance, en attendant de stabiliser les niveaux d'hormones thyro?diennes, pour limiter les d?fauts de d?veloppement postnatal pr?coce.
Procédures
1595 animaux seront utilis?s dans le projet, ils seront vigiles sauf indication contraire. 35 femelles gestantes seront nourries pendant les deux derniers tiers de leur gestation avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d?hormone thyro?dienne entra?nant une ? hypothyro?die ?. D?autres recevront un r?gime contr?le. A la naissance, des port?es (280) de m?res contr?les seront donn?es ? adopter ? des m?res hypothyro?diennes. Les m?res hypothyro?diennes et leurs petits adopt?s sont maintenus sous leur r?gime sp?cial au maximum un mois apr?s la naissance. Toutes les souris (520) seront mesur?es chaque semaine sous anesth?sie g?n?rale gazeuse (3 minutes) puis pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Certaine de ces souris (40) seront aussi contentionn?es (< 1 min) pour pr?l?vement de f?ces ? l?anus, 1 fois par semaine. En parall?me des souris portant des modifications g?n?tiques (960) sont n?es et ?lev?es par des m?res nourris avec un r?gime contr?le et seront seulement pes?es (< 1 min) 3 fois par semaine pendant toute la dur?e du protocole. Pour l?ensemble des animaux n?s (1480) au cours de ces exp?riences un pr?l?vement sanguin est effectu? au moment de la mise ? mort. Pour les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour r?aliser ce pr?l?vement sans douleur.
Impact sur les animaux
En cas d??chec d?adoption les petits risquent d??tre d?nutris et en hypothermie . L?g?res douleurs li?es ? diff?rents types d?injection en sous cutan?es et dans l?abdomen (analg?sique) anesth?sique) L?gers inconforts li?s ? la manipulation/contention lors des pes?es et du pr?l?vement de f?ces. L?hypothyro?die chez le nouveau-n? entraine une absence de prise de poids Aucun ph?notype dommageable n?est pr?visible pour les deux nouveaux g?notypes . En tout ?tat de cause, les petits portants ces mutations sont observ?s tous les jours du lundi au vendredi et pes?s trois fois par semaine d?s leur naissance comme il est pr?conis? de le faire pour une nouvelle mutation. Toute souffrance pourra ?tre mise en ?vidence, et les animaux mis ? mort si n?cessaires.
Devenir
L'ensemble des animaux mis en proc?dure seront mis ? mort en vue du pr?l?vement de sang et des organes d'int?r?t.
Remplacement
Cette ?tude implique des interactions r?ciproques entre un organisme et les microbes pr?sents dans son intestin. Elle s?int?resse aussi ? la perturbation de la communication entre plusieurs organes induite par des changements hormonaux. Aucun mod?le in vitro ne permet de reproduire cette complexit?. C'est pourquoi cette ?tude n?cessite l'exp?rimentation animale.
Réduction
Le nombre d?animaux a ?t? r?duit au maximum tout en garantissant la robustesse statistique des r?sultats. Trois types d?exp?riences sont pr?vus et seront r?alis?s de fa?on s?quentielle. Si le premier type r?alis? ne montrent pas un effet des hormones thyro?diennes sur le recrutement et la maturation du microbiote ou sur la production d?acide biliaire, les autres exp?riences n?auront pas lieu d??tre. Si ces exp?riences sont r?alis?es nous r?duirons le nombre de conditions au minimum en n?incluant que les temps pour lesquels un effet a ?t? observ?. Afin de limiter le nombre d?animaux ? utiliser dans de futures exp?riences, tous les organes d?int?r?t potentiels (muscle, tissu adipeux, etc.) seront pr?lev?s ? la fin des protocoles et conserv?s au cong?lateur pour d??ventuelles analyses ult?rieures.
Raffinement
Apr?s l?adoption les animaux sont surveill?s quotidiennement, si les petits ne sont pas pris en charge (absence de lait dans l?estomac, visible par transparence) ils seront mis ? mort. La croissance en taille sera mesur?e individuellement chaque semaine, le poids trois fois par semaine et les animaux seront suivis quotidiennement du lundi au vendredi. Ces fr?quences permettront de d?tecter tout effet dommageable des nouvelles mutations. Des points limites pr?dictifs seront d?finis ? l?avance, et leur atteinte entra?nera la mise ? mort imm?diate des individus concern?s afin de pr?venir toute souffrance prolong?e. Aucune exp?rience autre que la manipulation des souris lors des exp?riences de pes?e, de mesure de la taille, et de la collection de f?ces n?est pr?vue. Pour la mesure de la taille, une anesth?sie gazeuse l?g?re de courte dur?e permettra d??viter la contention et de diminuer le temps n?cessaire ? la mesure. Pour le pr?l?vement terminal de sang des les animaux ?g?s de plus de 21 jours, ces pr?l?vements se font apr?s l'injection sous cutan?e d'un produit analg?siant (30 secondes) suivie 30 minutes apr?s d'une injection d'anesth?siques dans l'abdomen ( 30 secondes), pour qu'il soit sans sans douleur. La profondeur d?anesth?sie sera v?rifi?e. Toutes les mesures visent ? limiter le stress et la douleur tout en assurant la robustesse scientifique des donn?es.
Choix des espèces
La souris sera utilis?e car il s'agit d'un bon mod?le pour ?tudier l?effet des hormones thyro?diennes sur la croissance, les effets sont similaires chez l?homme, seule la temporalit? diff?re. La souris a aussi ?t? largement utilis?e pour ?tudier le microbiote. Enfin il existe des lign?es g?n?tiquement modifi?es permettant d?intervenir de fa?on cibl?e dans un contexte physiologique, en particulier sur la signalisation thyro?dienne, pour avoir acc?s ? des donn?es m?canistiques. Les animaux utilis?s seront des animaux ?g?s de 7 ? 28 jours. L'objectif du projet est d'?tudier les effets de la signalisation thyro?dienne, ? partir du moment o? elle se met en place et temps qu?elle reste tr?s ?lev?e (21 ? 28 jours) sur le recrutement et la diversification du microbiote qui s?effectue dans le m?me temps. Microbiote et signalisation thyro?dienne sont critiques pendant cette p?riode postnatale pour permettre les transformations n?cessaires au sevrage.
D?veloppement et caract?risation de deux mod?les murins humanis?s pour l??tude d?une infection virale humaine dans un contexte de greffe
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à seize anesthésies générales pour une même souris : 300 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un fragment de poumon humain leur est greffé au cours d'une opération de vingt à soixante minutes, puis un cytomégalovirus humain est injecté directement dans le greffon, et l'infection est suivie par imagerie jusqu'à huit fois, avec neuf prélèvements sanguins au maximum par animal. Certaines restent dans le protocole plusieurs mois, jusqu'à l'âge de neuf mois. Le porteur écrit que leur déficit immunitaire, qui les rend fragiles aux infections et impose un hébergement particulier, est aussi ce qui permet la greffe de tissus humains, et interdit ensuite toute réutilisation comme toute adoption.
Objectifs
Les personnes ayant re?u une greffe d?organe doivent prendre des traitements diminuant l?activit? du syst?me immunitaire afin d??viter le rejet du greffon. Cette diminution des d?fenses immunitaires augmente cependant le risque d?infections. Parmi elles, le cytom?galovirus humain est l?une des plus fr?quentes et peut provoquer des complications importantes ainsi qu?alt?rer la survie du greffon. L??tude de cette infection est difficile car ce virus infecte uniquement les cellules humaines. Les mod?les animaux classiques ne permettent donc pas de reproduire correctement les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire. L?objectif de ce projet est de d?velopper et caract?riser deux mod?les de souris portant des tissus humains afin d??tudier l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. Le premier mod?le permettra d??tudier l?infection du virus dans un greffon pulmonaire humain et de suivre son ?volution au cours du temps gr?ce ? des m?thodes d?imagerie non invasives. Le second mod?le permettra, en plus du greffon pulmonaire, de reconstituer un syst?me immunitaire humain chez la souris. Il servira ? ?tudier les interactions entre le virus, le greffon et les cellules immunitaires humaines, ainsi que la capacit? du syst?me immunitaire ? contr?ler l?infection. Ces mod?les seront ?valu?s en termes de stabilit?, de reproductibilit? et de qualit? de l?infection observ?e. Ce projet a pour objectif d??tablir des mod?les exp?rimentaux robustes pour mieux comprendre les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un contexte de transplantation. Il ne vise pas directement ? tester un traitement, mais ? pr?parer de futures ?tudes th?rapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de d?velopper et caract?riser des mod?les exp?rimentaux reproduisant certaines caract?ristiques de l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. ? court terme, il permettra de mieux comprendre la mani?re dont ce virus infecte et persiste dans des tissus humains greff?s, ainsi que les interactions entre le virus et le syst?me immunitaire humain. Il permettra ?galement de valider des m?thodes de suivi de l?infection au cours du temps chez les m?mes animaux, afin de limiter le nombre d?animaux n?cessaires aux exp?riences. ? moyen terme, ces travaux fourniront des mod?les exp?rimentaux robustes et reproductibles pour l??tude des infections virales humaines chez les patients immunod?prim?s, notamment apr?s une transplantation d?organe. Ils contribueront ? am?liorer les connaissances sur les m?canismes impliqu?s dans le contr?le ou la persistance de l?infection. ? plus long terme, ces mod?les pourront servir de base au d?veloppement et ? l??valuation de nouvelles approches th?rapeutiques contre les infections opportunistes chez les patients greff?s ou immunod?prim?s. Ils pourront ?galement ?tre adapt?s ? l??tude d?autres infections humaines n?cessitant la pr?sence de tissus et de cellules immunitaires humaines. Les b?n?fices attendus concernent principalement l?am?lioration des connaissances en sant? humaine et le d?veloppement futur d?outils de recherche pr?clinique.
Procédures
Les animaux utilis?s dans ce projet subiront diff?rentes interventions r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale. Dix souris recevront une anesth?sie g?n?rale dans le cadre d?une ?tude pilote de validation chirurgicale. Trente souris recevront jusqu?? 10 anesth?sies g?n?rales au cours de la mise en place et du suivi d?un mod?le comportant l?implantation de tissus pulmonaires humains. Soixante-quinze souris recevront jusqu?? 16 anesth?sies g?n?rales dans le cadre du d?veloppement d?un mod?le associant des tissus humains et un syst?me immunitaire humain reconstitu?. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es une seule fois et dureront environ 20 ? 30 minutes pour le mod?le d?implant pulmonaire et 45 ? 60 minutes pour le mod?le de reconstitution immunitaire. Apr?s une p?riode de r?cup?ration, certains animaux recevront une injection locale de virus dans les tissus implant?s. Des suivis r?guliers seront r?alis?s tout au long du projet. Ils comprendront des s?ances d?imagerie sous anesth?sie g?n?rale afin de suivre l??volution de l?infection au cours du temps. Chaque s?ance durera moins de 15 minutes et pourra ?tre r?p?t?e jusqu?? 8 fois selon les groupes exp?rimentaux. Certains animaux feront ?galement l?objet de pr?l?vements sanguins sous anesth?sie afin d??valuer la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Ces pr?l?vements seront r?alis?s ? intervalles espac?s, avec un maximum de 9 pr?l?vements de faible volume par animal sur l?ensemble de la proc?dure. Les animaux issus de l??levage feront ?galement l?objet d?un g?notypage, et les animaux inclus dans les proc?dures exp?rimentales seront identifi?s individuellement avant leur inclusion dans l??tude. La dur?e totale de participation des animaux au projet pourra atteindre plusieurs mois selon les proc?dures exp?rimentales.
Impact sur les animaux
Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui les rend plus sensibles aux infections et n?cessite des conditions d?h?bergement et de surveillance adapt?es. Les principales nuisances attendues sont li?es aux interventions chirurgicales n?cessaires ? l?implantation des tissus humains. Ces interventions peuvent entra?ner une douleur et un inconfort transitoires, principalement dans les jours suivant la chirurgie. Une prise en charge adapt?e de la douleur sera mise en place. Les manipulations r?p?t?es, les s?ances d?imagerie et les pr?l?vements sanguins peuvent ?galement provoquer un stress l?ger et temporaire. L?infection exp?rimentale pourra entra?ner des modifications localis?es des tissus implant?s, telles qu?une inflammation ou des l?sions du greffon pulmonaire humain. Une alt?ration mod?r?e de l??tat g?n?ral des animaux reste ?galement possible en raison de leur fragilit? immunitaire. Les animaux feront l?objet d?une surveillance r?guli?re tout au long du projet afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s si n?cessaire afin de limiter la douleur et les nuisances.
Devenir
? l?issue des proc?dures exp?rimentales, tous les animaux seront mis ? mort afin de permettre le pr?l?vement des tissus et organes n?cessaires aux analyses finales. Ces analyses sont indispensables pour ?valuer la pr?sence du virus, l??tat des tissus humains greff?s et la reconstitution du syst?me immunitaire humain. Les animaux ne pourront pas ?tre r?utilis?s ou propos?s ? l?adoption en raison de leur immunod?ficience, des interventions chirurgicales subies et de la n?cessit? de r?aliser des analyses terminales incompatibles avec leur maintien en vie.
Remplacement
Le cytom?galovirus humain infecte uniquement les cellules humaines et ne peut pas ?tre ?tudi? de mani?re satisfaisante dans des mod?les animaux classiques. Des m?thodes alternatives, comme les cultures cellulaires, les organo?des ou les mod?les de tissus humains en laboratoire, sont utilis?es lorsque cela est possible pour ?tudier certains m?canismes de l?infection. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l?ensemble des interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un organisme vivant. Elles ne permettent pas non plus de suivre l??volution de l?infection au cours du temps dans des tissus humains vascularis?s et int?gr?s ? un organisme. Les mod?les de souris humanis?es utilis?s dans ce projet constituent actuellement la seule approche permettant d??tudier ces interactions dans des conditions proches de celles observ?es chez les patients greff?s et immunod?prim?s.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis? dans ce projet a ?t? d?fini ? partir des donn?es de la litt?rature et des caract?ristiques des mod?les ?tudi?s, notamment les taux attendus de prise des greffons et de reconstitution du syst?me immunitaire humain. Ces param?tres ont ?t? pris en compte afin d??viter de r?p?ter les exp?riences et de limiter l?utilisation d?animaux suppl?mentaires. Le nombre d?animaux par groupe a ?t? limit? au strict n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement exploitables tout en tenant compte de la variabilit? li?e aux tissus humains utilis?s. Le suivi de l?infection sera r?alis? de mani?re r?p?t?e chez les m?mes animaux gr?ce ? des techniques d?imagerie non invasives. Cette approche permet de limiter le nombre total d?animaux n?cessaires en r?duisant les comparaisons entre individus diff?rents. Le protocole exp?rimental a ?galement ?t? con?u afin de limiter le nombre de groupes exp?rimentaux et de r?duire autant que possible le recours ? des groupes t?moins suppl?mentaires.
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en place afin de limiter la douleur, le stress et les nuisances subies par les animaux tout au long du projet. Les souris seront h?berg?es dans des conditions adapt?es ? leur fragilit? immunitaire afin de limiter le risque d?infections. Elles seront maintenues en groupes sociaux autant que possible et b?n?ficieront d?un environnement enrichi pour r?duire le stress. Une p?riode d?acclimatation sera respect?e avant le d?but des proc?dures exp?rimentales. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale avec administration syst?matique de traitements contre la douleur avant et apr?s la chirurgie. Les animaux seront surveill?s jusqu?? leur r?veil complet puis feront l?objet d?un suivi r?gulier portant notamment sur leur ?tat g?n?ral, leur comportement, leur poids et la cicatrisation. Les techniques utilis?es ont ?t? choisies afin de limiter la dur?e des interventions et les complications. Les s?ances d?imagerie seront r?alis?es sous anesth?sie br?ve afin de limiter le stress li? aux manipulations. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s en cas de signes de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral afin de permettre une prise en charge adapt?e ou une euthanasie si n?cessaire.
Choix des espèces
La souris est un mod?le largement utilis? en recherche biom?dicale, notamment pour l??tude du syst?me immunitaire et des maladies infectieuses. Elle permet de r?aliser des ?tudes reproductibles dans un organisme vivant tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires. Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui permet l?implantation de tissus humains et, dans certains cas, la reconstitution d?un syst?me immunitaire humain. Ce mod?le est particuli?rement adapt? ? l??tude du cytom?galovirus humain, un virus qui infecte uniquement les cellules humaines et ne peut donc pas ?tre ?tudi? correctement dans des souris classiques. Cette souche permet ?galement l?implantation de cellules humaines sans recourir ? certaines proc?dures plus invasives habituellement n?cessaires dans d?autres mod?les, ce qui contribue ? limiter les nuisances pour les animaux. Les animaux seront inclus dans les proc?dures exp?rimentales ? l??ge de 8 ? 10 semaines, ?ge auquel leur d?veloppement et leur ?tat physiologique permettent de supporter les interventions chirurgicales dans de bonnes conditions. Selon les proc?dures exp?rimentales, les animaux pourront ?tre suivis pendant plusieurs mois afin de permettre la stabilisation des tissus humains implant?s, la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Au maximum, les souris seront ag?es de 9 mois en fin de proc?dure.
Etude de l?impact d’une kinase sur la dysfonction endoth?liale en condition inflammatoire dans le mod?le murin (UE 1/4)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines maintenues sous anesthésie quatre heures d'affilée pour l'étude d'une thrombose déclenchée au laser, sept heures pour celle d'une inflammation locale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et se répartissent sur cinq établissements : irradiation puis greffe de moelle osseuse dans l'un, infection bactérienne et mise à mort dans les quatre-vingt-seize heures dans un autre, ligature d'un vaisseau abdominal sous anesthésie suivie de quarante-huit heures de survie dans un dernier. Il s'agit de comprendre comment une protéine kinase agit sur l'inflammation, la formation de caillots et la paroi des vaisseaux, les retombées pour les patients restant au stade d'une cible thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucune méthode de substitution pertinente n'est disponible et que le recours à la souris ne peut être évité.
Objectifs
Nous avons identifi? que l?inhibition d'une prot?ine diminuait de fa?on significative la progression des l?sions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d?action de cette prot?ine sur la progression de ces l?sions, nous allons ?valuer son impact sur l?inflammation et la fonction de l?endoth?lium (cellules qui tapissent l?int?rieur d?un vaisseau sanguin) gr?ce ? des mod?les pr?cliniques d?infection (sepsis), d?inflammation et de thrombose (activation de l?endoth?lium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).
Bénéfices attendus
Ces exp?riences permettront d??valuer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la prot?ine ?tudi?e sur la formation de caillots sanguins et l?inflammation, ce qui ne peut pas ?tre reproduit en laboratoire sur des cellules isol?es. Elles aideront ?galement ? d?terminer si cette prot?ine pourrait repr?senter une cible int?ressante pour d?velopper de nouvelles approches th?rapeutiques visant ? prot?ger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements li?s ? des processus inflammatoires ou thrombotiques.
Procédures
Trois types d?interventions seront r?alis?es sur des lots diff?rents d?animaux : 1- Dans le premier ou deuxi?me ?tablissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une irradiation suivie d?une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisi?me ?tablissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une infection bact?rienne. Une seule prise de sang sera r?alis?e sur chaque lot ? differents temps (au plus tard 96h apres le d?but de l?infection). Pour cela les souris seront sous anesth?sie g?n?rale profonde (m?lange de Til?tamine, Zolaz?pam et Xylazine), et seront ensuite euthanasi?es. 3- Dans un quatri?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront h?berg?s pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinqui?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesth?sie profonde, ? un mod?le de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d?inflammation (activation des cellules du vaisseau par une mol?cule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesth?sie tout au long de l?exp?rience et sont euthanasi? ? la fin des exp?rimentations qui durent respectivement 4 heures pour ?tudier la thrombose et 7 Heures pour ?tudier l?inflammation locale. Pour ?tudier la thrombose veineuse, des lots diff?rents d?animaux seront expos?s ? une chirurgie sous anesth?sie avec ligation d?un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures apr?s la chirurgie les animaux sont euthanasi?s.
Impact sur les animaux
- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d?une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets ind?sirables possibles sont une l?g?re baisse de l'alimentation avec l?g?re perte de poids. Les animaux peuvent avoir un l?ger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte dur?ee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Apr?s l?induction d?une infection (l?g?re ? mod?r?e), les effets ind?sirables attendus dans ce mod?le incluent une perte de poids, une diminution de l?activit? et de la vitalit?. Les souris seront ensuite euthanasi?es au plus tard 96h apres le d?but de l?infection. D?autres exp?rimentations (mod?les de thrombose et d?inflammation) sont conduites sans r?veil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesth?sie g?n?rale pendant toute la dur?e des proc?dures exp?rimentales. ? l?issue des exp?rimentations, les animaux sont euthanasi?s sans reprise de conscience.
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analys?s. Les animaux seront ?galement euthanasi?s si l'un des points limites ?tait atteint.
Remplacement
Le recours au mod?le murin est irrempla?able pour le d?roulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexit? des m?canismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique int?gr? non mod?lisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la prot?ine d?interet inactive. Ainsi, l?utilisation d?animaux vivants constitue une ?tape n?cessaire pour r?pondre aux objectifs du projet, aucun mod?le de remplacement pertinent n??tant actuellement disponible.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annonc? a ?t? calcul? au plus juste ? l'aide d'outils statistiques. Cependant si une diff?rence significative est obtenue entre deux groupes exp?rimentaux avant la r?alisation de la totalit? du lot, nous ne r?aliserons pas d'exp?rimentations suppl?mentaires. Dans les exp?rimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou mol?cules seront visualis?s dans les m?mes animaux.
Raffinement
Les souris sont h?berg?es en groupes de cinq individus, dans des cages ventil?es, avec un acc?s ad libitum ? l?eau et ? la nourriture. Si une diminution de l?activit? est observ?e, de l?aliment hydrat? sera mis ? disposition dans la cage afin de faciliter l?acc?s ? la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront ?galement rajout?s comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d?exploration, contribuant ainsi ? r?duire le stress et ? am?liorer le bien-?tre des animaux. Une p?riode d?acclimatation de sept jours est respect?e avant le d?but des exp?rimentations afin de limiter le stress li? ? l?environnement. Les transferts entre deux ?tablissements seront r?alis?s par un transporteur agr??. Les animaux b?n?ficient d?une p?riode d?acclimatation d?une semaine avant toute proc?dure exp?rimentale dans l??tablissement d?accueil.
Choix des espèces
Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliquant une prot?ine kinase dans l?inflammation, la thrombose et la dysfonction endoth?liale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le syst?me immunitaire, s?inscrivant dans une r?ponse physiopathologique int?gr?e qui ne peut ?tre reproduite de mani?re pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours ? l?exp?rimentation animale constitue donc l?unique approche permettant d??tudier ces m?canismes dans leur globalit?. Le mod?le murin est largement reconnu comme le mod?le de r?f?rence pour les ?tudes pr?cliniques de la thrombose et de l?inflammation, en raison de fortes similitudes avec l?Homme, tant au niveau des cellules impliqu?es que des voies mol?culaires mises en jeu. Par ailleurs, l?utilisation de souris g?n?tiquement modifi?es ciblant sp?cifiquement la prot?ine kinase, sans ph?notype dommageable en conditions basales, permet une analyse m?canistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 ? 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 ? 25 semaines pour les exp?rimentations (?ge adulte, syst?me cardiovasculaire mature).
Analyse de la r?gulation de la fission de crypte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour savoir si les cellules de la niche intestinale commandent le dédoublement des cryptes de l'intestin, 162 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur tissu intestinal. Elles reçoivent une injection de tamoxifène sur animal vigile, une seule fois ou une fois par jour pendant trois jours consécutifs, entre le dixième et le quarantième jour après leur naissance, encore hébergées avec leur mère. L'injection supprime leurs cellules de Paneth, dont le porteur reconnaît que l'absence pourrait avoir des conséquences chez les souriceaux. Pour écarter ce risque, il s'appuie sur des observations non publiées de la collaboratrice qui lui a fourni la lignée.
Objectifs
L??pith?lium intestinal se caract?rise par une intense capacit? de renouvellement et de r?g?n?ration assur?e par les cryptes qui abritent les cellules souches et sont donc riches en m?canismes de r?gulation et de contr?le. Lors de cette r?g?n?ration, le nombre de cryptes augmente par un processus appel? fission de crypte qui consiste en un d?doublement d?une crypte m?re en deux cryptes filles. De plus, le processus de fission de crypte est essentiel pour la croissance intestinale pendant la maturation postnatale. Malgr? son importance dans la formation et le maintien de l?intestin, ce processus reste aujourd?hui tr?s mal document?. La litt?rature montre que les cellules de la niche des cellules souches intestinales jouent un r?le pr?pond?rant au cours du processus de crypte fission. Le but de notre projet est de d?finir si et comment les cellules de la niche intestinale contr?le cette fission de crypte. Notre hypoth?se est que la m?canique des cellules souches est cruciale lors de la fission de cryptes.
Bénéfices attendus
De r?centes ?tudes ont montr? qu?une perturbation de ce fonctionnement peut entrainer des fissions anormales et donner des cryptes corrompues impliqu?es dans la formation de micro-ad?nomes et d?ad?nomes dans le petit intestin et le c?lon. Notre ?quipe a notamment identifi? des fissions de cryptes anormales ? l?origine du d?veloppement de maladies intestinales infantiles rares. Ainsi, la fission de crypte est au c?ur de la physiopathologie intestinale humaine. Cependant, les m?canismes r?gissant la fission de crypte sont mal connus. Ainsi, notre ?quipe cherche ? caract?riser ce processus post-d?veloppemental en collaboration avec des cliniciens gastroent?rologues.
Procédures
Une injection sur animal vigile (geste de 1 minute maximum) par jour. Seront test?s 2 types d'administration : soit une seule injection, soit une injection par jour pendant 3 jours cons?cutifs.
Impact sur les animaux
Du stress peut subvenir lors de la contention pour l?injection, ainsi qu?une douleur de faible intensit? lors de l?introduction de l?aiguille. Les lign?es de souris avec lesquelles nous travaillerons n'ont pas de ph?notype dommageable. Toutefois, l?ablation des cellules de Paneth pourrait avoir des cons?quences durant la p?riode postnatale, bien que les observations non publi?es de notre collaboratrice ayant fourni la lign?e murine, sugg?rent qu'un ph?nom?ne de compensation limite les r?percussions majeures sur l'hom?ostasie intestinale globale m?me chez les souriceaux. N?anmoins, afin de prendre en compte un ?ventuel impact transitoire sur la fonction de barri?re intestinale ou sur la physiologie digestive dans les jours suivant l'induction, nous int?grerons un suivi renforc? des animaux entre 5 et 20 jours post-injection tamoxif?ne. Ce suivi comprendra notamment l'?valuation quotidienne de l'?tat g?n?ral, de la croissance pond?rale, de l'aspect de l'abdomen, de l'activit? spontan?e, de la prise alimentaire (appr?ci?e indirectement chez les jeunes animaux par l'?tat g?n?ral et la croissance) ainsi que de la pr?sence ?ventuelle d'anomalies digestives. Lorsque cela sera possible en fonction de l'?ge des animaux et de la production de f?ces individualisables, l'aspect des selles (consistance, diarrh?e, souillure p?rianale) sera ?galement surveill?. Toute alt?ration persistante de ces param?tres entra?nera une ?valuation rapproch?e de l'animal et l'application des points limites d?finis dans le protocole. Ces mesures permettront de d?tecter pr?cocement toute cons?quence inattendue li?e ? la perte des cellules de Paneth durant cette fen?tre postnatale sensible.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasi?s ? la fin des proc?dures afin de pr?lever le tissu intestinal.
Remplacement
Une grande partie du projet est d?j? r?alis?e in vitro ? l?aide de cultures d?organo?des dans notre ?quipe ; des cultures d?organo?des intestinaux nous permettent d??tudier le m?canisme de fission des cryptes de fa?on globale. Cependant, pour ?valuer sp?cifiquement le r?le des cellules de la niche intestinale dans l?environnement complexe du tissu, nous devons utiliser des animaux. En effet, les m?thodes utilisant les cellules en culture ne peuvent pas remplacer la complexit? des interactions tissulaires dans un organe tel que l?intestin. Nos mod?les d?organo?des permettent de reconstituer les populations cellulaires du tissu intestinal afin de r?aliser des tests in vitro pour comprendre l?importance, le r?le des cellules de Paneth. Cependant leur utilisation pr?sente des limites, ils ne miment pas l?architecture et le fonctionnement du tissu ?pith?lial intestinal dans son entier, ainsi que ses interactions avec le m?senchyme sous-jacent. Afin d??tudier le ph?nom?ne de fission de crypte pendant le d?veloppement post-natal, nous avons besoin de suivre in vivo le tissu intestinal fonctionnel dans son entier dans son environnement.
Réduction
Nous nous effor?ons de limiter le nombre d?animaux par groupe en utilisant un maximum de donn?es pour chaque animal. Ainsi, pour chaque animal, sont pr?lev?s des ?chantillons pour l?histologie, l?immunohistologie et analyse en microscopie ? fluorescence confocale, et isolation de cryptes pour pr?paration de cultures d?organo?des. De plus, le nombre d'animaux a ?t? d?termin? ? partir d'une analyse de puissance statistique.
Raffinement
Les souris sont h?berg?es avec leur m?re, dans des zones satisfaisant leurs besoins physiologiques et leur apportant un maximum de bien-?tre. Les conditions de temp?rature, lumi?re, et humidit? sont contr?l?es. Les souris nouveaux-n?s et leur m?re sont ensemble isol?s dans une cage, et disposent de diff?rents enrichissements (coton, d?me et tubes en carton). Une d?sinfection syst?matique du site d?injection ? l??thanol sera r?alis?e sur chaque souris pour l?injection du tamoxif?ne. Les souris qui auront subi cette injection seront plac?es dans une zone de stabulation d?di?e, avec moins de bruit et de passages et seront observ?es quotidiennement par un animalier ou l?exp?rimentateur. Les personnes pratiquant les injections sont form?es et ont une expertise afin de maitriser le geste et r?duire le temps de contention et de ce fait r?duire le stress chez les souris. Enfin, des points limites ont ?t? mis en place et seront appliqu?s.
Choix des espèces
Chez la souris, l?organisation du tissu intestinal est similaire ? celle d?crite chez l?Homme et c?est un mod?le exp?rimental tr?s utilis? dans la litt?rature pour l??tude du d?veloppement et de la physiologie intestinale. Les animaux seront utilis?s au stade juv?nile entre les jours postnataux/ jeune adulte 10 (jour postnatal P10) et 40 (jour postnatal P40) car c?est dans cette fen?tre d?veloppementale que se r?alisent la grande majorit? des fissions de crypte. Nous utiliserons des animaux g?n?tiquement modifi?s pour pouvoir supprimer la pr?sence de cellules de la niche intestinale et permettre de d?terminer leur r?le sp?cifique ? l'aide de la microscopie lors du d?veloppement intestinal.
Evaluation du r?le d?un facteur de croissance dans un mod?le murin de maladie r?nale chronique
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en adénine leur provoque une maladie rénale chronique sur quatre semaines, ce qui réduit leur prise alimentaire et ralentit leur croissance. Une partie d'entre elles passe deux séjours en cage individuelle, quarante-huit heures puis vingt-quatre heures, isolées de leurs congénères et posées sur une grille métallique, le temps de recueillir urines et fèces. Le porteur indique que les souris dont aucun organe n'est prélevé sont tuées elles aussi, parce que le traitement les a rendues insuffisantes rénales, une atteinte qu'il qualifie d'irréversible et d'incurable.
Objectifs
La maladie r?nale chronique constitue un probl?me majeur de sant? publique, touchant environ 10 pourcents de la population mondiale et pr?s de 6 millions de fran?ais. Elle se caract?rise par une perte progressive et irr?versible de la fonction r?nale, associ?e ? des complications m?taboliques et nutritionnelles. Les principaux sympt?mes, en plus de l?alt?ration des fonctions r?nales, incluent la d?nutrition et la perte de masse adipeuse et musculaire. R?cemment, des analyses ont mis en ?vidence une association entre la s?v?rit? de cette maladie et les concentrations circulantes d?une prot?ine. Cette prot?ine est ?galement impliqu?e dans le maintien du taux de potassium dans le sang et de son acidit?. Ces deux param?tres pouvant ?tre fortement perturb?s lors de la maladie r?nale chronique, la question du r?le de cette prot?ine se pose. une alimentation enrichie en ad?nine permettra l?induction d?une maladie r?nale chronique r?nale chez des souris qui poss?dent ou non cette prot?ine et l??volution de la fonction r?nale, le d?veloppement de la fibrose, l?acidit? et le taux de potassium sanguin seront ?tudi?s, ces crit?res correspondant directement aux alt?rations observ?es chez les patients.
Bénéfices attendus
? court terme, ce projet permettra d??valuer si l?absence de la prot?ine ?tudi?e exerce un effet b?n?fique ou d?l?t?re sur les complications de la maladie r?nale chronique. Il s?agit d?un travail exploratoire dont les r?sultats pourront servir ? d?velopper un projet de plus grande ampleur. ? plus long terme, ces travaux pourraient contribuer ? l??mergence d?une nouvelle strat?gie th?rapeutique visant ? am?liorer la fonction r?nale, l??tat nutritionnel et la qualit? de vie des patients atteints de maladie r?nale chronique.
Procédures
Tous les animaux recevront un r?gime sp?cifique pour induire la pathologie ?tudi?e ou le r?gime contr?le pour une dur?e de 4 semaines (prise spontan?e). Une partie des animaux sera plac?s 2 fois en h?bergement individuel durant 48h (habituation) puis 24h (recueil) afin de r?cup?rer les urines et fec?s sur animal vigil. Une partie de ces animaux subiront un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (1 fois, 5 minutes par animal). Une autre partie de ces animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie sans r?veil (10 minutes par animal).Tous les animaux seront euthanasi?s par une m?thode r?glementaire sous anesth?sie et analg?sie.
Impact sur les animaux
L?induction de la maladie r?nale chronique r?duit la prise alimentaire et ralentit la croissance pond?rale, entra?nant un inconfort pendant les 4 semaines. Les effets ind?sirables des interventions pr?vues sont connus car d?j? test?s chez la souris dans d?autres contextes que celui du pr?sent projet. En fonction des groupes exp?rimentaux, certains animaux seront h?berg?s individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur f?ces. Ce type d?h?bergement g?n?re des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont h?berg?s individuellement (stress social) et se d?placent sur une grille m?tallique de surface r?duite. En fonction des groupes exp?rimentaux, une partie des animaux subira un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (risque d?arr?t cardio-respiratoire) pouvant entrainer une h?morragie (stress h?modynamique).
Devenir
En fin de proc?dure, tous les animaux sont euthanasi?s. Les analyses permettant de r?pondre ? la question scientifique, n?cessitent des pr?l?vements d?organes qui rendent incompatible leur maintien en vie. Pour ceux qui n?ont pas subi de pr?l?vements d?organes, le traitement les ayant rendus insuffisants r?naux, maladie irr?versible et incurable, les animaux seront ?galement euthanasi?s.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des m?thodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est pr?f?rable. Toutefois, seules des ?tudes sur des animaux nous permettront d??tudier les cons?quences de la maladie r?nale chronique. En effet ces processus font intervenir des syst?mes complexes qui travaillent de concert et qui agissent ?galement les uns sur les autres. L?identification de l?implication possible de ces diff?rents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilit?s pour d?velopper des strat?gies th?rapeutiques novatrices.
Réduction
Ce projet a une dur?e de 4 ans, et n?cessitera l?utilisation de 480 souris. Nous avons calcul? la taille des effectifs, en nous appuyant sur notre exp?rience des m?thodes envisag?es, la connaissance de leur reproductibilit? et un calcul de puissance le nombre d?animaux au plus faible nous permettant d'obtenir des r?sultats statistiquement robustes. Nous r?duirons le nombre d?animaux en r?alisant des exp?riences sur les m?mes animaux en limitant toutefois les exp?riences qui aboutiraient ? des souffrances trop importantes et et/ou qui pourraient impacter n?gativement certains r?sultats, les rendant inexploitables. Le nombre d?animaux calcul? dans ce projet tient compte du taux de succ?s de l?induction de la maladie r?nale chronique.
Raffinement
Les animaux auront un acc?s libre ? la nourriture et ? de l?eau filtr?e, et seront plac?s dans des cages ventil?es. Leur environnement sera enrichi avec au moins deux objets : du nid v?g?tal et/ou des cylindres en carton et/ou des bouts de bois et/ou des maisons en plastique. Afin de limiter les d?sagr?ments li?s aux cages ? m?tabolisme et ? la grille, nous pla?ons une coupelle en verre de 6 cm de diam?tre ce qui permet ? la souris de dormir ou de se r?fugier sans ?tre en contact avec la grille. Nous avons v?rifi? que la majorit? des souris s?installent dans les coupelles pour dormir mais que cela ne change en rien les recueils d?urine et de f?ces. Ces cages sont situ?es sur des racks qui permettent aux souris de maintenir un lien olfactif, visuel et sonore entre elles. Afin de limiter la perte de poids li?e ? une baisse de consommation de nourriture, du chocolat en poudre est ajout? ? la celle-ci pour en augmenter l?app?tence. Par ailleurs, l?aspect g?n?ral des animaux et leur comportement (vivacit?, capacit? ? se mouvoir, propret? du pelage etc?) seront observ?s en m?me temps que la mesure du poids corporel, ces crit?res servant ? ?tablir des points limites En cas d?atteinte de ceux-ci, les animaux seront euthanasi?s pour ?viter toutes douleurs/souffrances suppl?mentaires. Les actes invasifs sont effectu?s par un personnel qualifi? et form? ? l?exp?rimentation animal et ? la chirurgie sous anesth?sie et analg?sie.
Choix des espèces
Le mod?le animal permet de r?aliser des exp?riences de physiopathologie r?nale de mammif?re en prenant en compte tous les param?tres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'?tude des fonctions r?nales qui ont des effets syst?miques. Nous avons choisi de mener nos exp?riences chez la souris, car les mod?les d?invalidation des g?nes susceptibles de nous int?resser ont ?t? g?n?r?s chez la souris et pourrais nous ?tre utiles pour la suite de ce projet. Il s?agit d?animaux adultes car la maladie r?nale chronique touche particuli?rement les personnes adultes chez l?humain. De plus, ces exp?riences ont pour objectif d'?tre associ?es ou compar?es ? des exp?riences d?j? r?alis?es dans le laboratoire sur ces m?mes lign?es de souris.
Evaluation in vivo du stress oxydant c?r?bral dans un mod?le murin par une m?thode de spectroscopie et d?imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris reçoit dans le cerveau des molécules destinées à y produire un stress oxydant, après une opération de vingt minutes sous anesthésie, puis passe jusqu'à deux heures sous les appareils d'imagerie. 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, du sang étant prélevé sous anesthésie juste avant. Il s'agit de mettre au point des molécules qui deviennent visibles en imagerie quand un stress oxydant est présent, et d'évaluer leur toxicité en prélevant les tissus après la mort. Le résumé ne nomme ni les molécules injectées, ni la région du cerveau visée, ni la nature de l'opération de vingt minutes, et ne dit pas combien de souris passent dans chacun des deux groupes.
Objectifs
Le stress oxydant correspond ? un d?s?quilibre dans l?organisme qui peut endommager les cellules et les tissus. Il joue un r?le important dans de nombreuses maladies fr?quentes comme les maladies cardiaques, certaines maladies c?r?brales ou encore les cancers. Aujourd?hui, il est difficile de d?tecter ce ph?nom?ne ? un stade pr?coce de ces maladies chez un ?tre vivant sans faire de pr?l?vements. Ce projet a pour objectif de d?velopper une nouvelle m?thode permettant de d?tecter ce stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. Pour cela, nous utilisons des mol?cules sp?cialement con?ues pour devenir visibles en imagerie uniquement lorsqu?un stress oxydant est pr?sent. L??tude men?e chez la souris vise ? v?rifier si ces nouvelles mol?cules permettent de localiser et de mesurer ce ph?nom?ne dans le cerveau. Elle permettra ?galement d??valuer leur s?curit? d?utilisation. ? terme, ces travaux pourraient contribuer ? am?liorer le diagnostic pr?coce de certaines maladies et ? faciliter le d?veloppement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de d?velopper de nouvelles mol?cules permettant de d?tecter le stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. A court terme cette m?thode pourrait permettre de suivre un m?me individu dans le temps sans avoir recours ? des analyses n?cessitant de multiples pr?l?vements, ainsi qu?une m?thode plus fiable d??valuation du stress oxydant. Cela pourrait contribuer ? r?duire le nombre d?animaux utilis?s en recherche. ? plus long terme, cette approche pourrait am?liorer la compr?hension de nombreuses maladies fr?quentes, notamment celles qui touchent le cerveau, les maladies cardiovasculaires ou encore certains cancers. Elle pourrait aussi contribuer au d?veloppement de nouveaux traitements en permettant de mieux ?valuer leur efficacit?.
Procédures
Un groupe d'animaux subira seulement une injection de moins de 2 minutes. L'autre groupe sera soumis ? une proc?dure chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie d'une dur?e de 20 minutes puis ? une injection et ? diff?rents examens d'imagerie non invasifs sous anesth?sie qui dureront au maximum deux heures. Pour l'ensemble des animaux, du sang sera pr?lev? sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie (moins d'une minute) avant la mise ? mort.
Impact sur les animaux
L?injection dans le cerveau de mol?cules g?n?rant un stress oxydant cause un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e. L?injection des mol?cules d?imagerie et l?administration d?analg?siques peuvent provoquer un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e.
Devenir
L?ensemble des souris seront mises ? mort afin de pr?lever certains tissus pour des analyses permettant d??valuer l??ventuelle toxicit? des mol?cules utilis?es pour l?imagerie, ainsi que la r?partition de ces mol?cules dans diff?rents organes et tissus (en plus du cerveau).
Remplacement
Des ?tudes ont d?abord ?t? r?alis?es en laboratoire sur des cellules afin de v?rifier que les mol?cules utilis?es ne sont pas toxiques et pour s?lectionner les plus prometteuses. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d?un organisme vivant. Ils ne permettent pas non plus de savoir comment ces mol?cules se distribuent dans le corps ni d??valuer leur comportement dans le cerveau. M?me si leur capacit? ? d?tecter le stress oxydant a d?j? ?t? d?montr?e sur des cellules, il est n?cessaire de confirmer ces r?sultats dans un organisme vivant, o? ce ph?nom?ne peut ?tre reproduit de mani?re contr?l?e. ? l?heure actuelle, il n?existe pas de m?thode alternative permettant de r?pondre ? ces questions sans avoir recours ? l?animal.
Réduction
Les effectifs ont ?t? ramen?s au minimum permettant toutefois d?avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilis? un outil informatique pour calculer le nombre minimum d'animaux n?cessaire en utilisant les donn?es pr?liminaires.
Raffinement
Toutes les mesures sont mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les animaux re?oivent syst?matiquement des m?dicaments contre la douleur avant, pendant et apr?s les interventions. Les proc?dures chirurgicales et d?imagerie sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale afin qu?ils ne ressentent pas de douleur ou de stress, et une anesth?sie locale est ?galement mise en place avant la chirurgie. Apr?s les interventions, les animaux sont surveill?s r?guli?rement jusqu?? leur r?veil, puis tout au long de l??tude afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance. Une grille de score est mise en place et des points limites adapt?s aux interventions ont ?t? d?finis afin de prendre en charge de mani?re pr?coce et adapt?e la douleur qui pourrait ?tre ressentie par les animaux inclus dans l??tude. En cas d?atteinte de points limites, une administration d?analg?sique sera mise en ?uvre. Enfin, des crit?res d?arr?t de souffrance ont ?galement ?t? d?termin?s et aboutiront ? la mise ? mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement d?crit dans litt?rature pour ce type d?exp?rimentation. Dans ce projet, son utilisation est notamment li?e au fait que les ?quipements disponibles sont sp?cialement con?us pour des animaux de petite taille comme la souris ou le rat, et ne permettent pas d??tudier des esp?ces plus grandes. Une lign?e de souris ? pelage clair est utilis?e afin de faciliter les injections, qui sont ainsi plus facilement r?alis?es et moins stressantes pour les animaux. Enfin, des souris adultes pesant de 17 ? 22 g sont utilis?es car leur taille est adapt?e aux appareils d?imagerie employ?s, permettant de r?aliser les examens dans des conditions ad hoc.
Évaluation de la capacité du microbiote intestinal de donneurs humains, de différents niveaux d’entraînement physique, à moduler la susceptibilité et la sévérité d’une colite induite par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Vidées de leur flore intestinale par un cocktail d'antibiotiques à large spectre, gavées du microbiote fécal de donneurs humains, puis exposées au dextran sulfate de sodium pour déclencher une colite, 67 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si le microbiote de donneurs plus ou moins entraînés physiquement change la gravité de la colite, la souris servant d'intermédiaire entre une étude clinique menée sur des humains et ses conclusions. Le porteur écrit que "Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement", puis qu'aucun soin pharmacologique n'est possible et que les souris atteignant un point limite seront tuées.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comprenant la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent environ 7 millions de personnes dans le monde. Elles se caractérisent par des lésions digestives discontinues pour la première et une inflammation colique continue pour la seconde. Leur origine reste partiellement inconnue, mais elles résultent d’une réponse inflammatoire inappropriée chez des individus génétiquement prédisposés, influencée par des facteurs environnementaux, une dysbiose du microbiote intestinal et une altération de la barrière intestinale. L’activité physique (AP) est aujourd’hui reconnue comme un levier thérapeutique, notamment dans la prévention des maladies chroniques, et influence également le microbiote intestinal. Plusieurs études, dont une de notre laboratoire, ont montré un lien entre niveau d’entraînement et signatures microbiennes. Une AP modérée à élevée est associée à une plus grande diversité microbienne et à une production accrue de métabolites bénéfiques, tandis que la sédentarité ou un entraînement très intensif peuvent altérer ces fonctions. Cependant, le rôle exact de l’AP dans le développement et l’évolution des MICI reste encore mal compris. Dans ce cadre, nous menons une étude clinique visant à caractériser le microbiote intestinal en lien avec la capacité cardiovasculaire et le profil métabolique à l’exercice chez des individus de niveaux d’activité variés. En parallèle, une étude préclinique repose sur la transplantation de microbiote fécal de ces participants chez des souris, suivie de l’induction d’une colite chimique. Afin de de permettre l’étude du rôle causal du microbiote intestinal dans la susceptibilité aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, les souris recevront dans un premier temps un cocktail d’antibiotiques à large spectre. Cette étape permet une déplétion importante du microbiote résident, réduisant la variabilité interindividuelle et créant une niche écologique disponible pour une recolonisation contrôlée. Puis, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d’établir des microbiotes expérimentaux différenciés. Enfin, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d'établir des microbiotes expérimentaux différenciés.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation existe entre une signature bactérienne et fonctionnelle retrouvée chez les populations de différents niveaux d’entraînement et la susceptibilité de la réponse à une colite induite. Sur le plan de la santé, cette étude permettra d’identifier des profils ayant des signatures bactériennes et fonctionnelles pour 1) mieux comprendre les mécanismes d’apparition ou non des MICI et 2) développer des stratégies de prévention et de prise en charge personnalisées de ces maladies, fondées sur la modulation du microbiote intestinal.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute), un prelèvement sanguin de 100 μL et un prelèvement terminal intra-cardiaque avant la mise à mort. Les animaux subiront également le gavage oral pour la transplantation du microbiote fécale (FMT) des sujets humains et l’induction de la colite par le Dextran Sodium Sulfate.
Impact sur les animaux
Le traitement par antibiotiques à large spectre est administré à des doses extrapolées de celles utilisées en clinique humaine et ajustées au modèle animal. Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement. Ils comprennent, pour le traitement antibiotique, une déplétion du microbiote intestinal pouvant entraîner une modification temporaire du transit et une diminution de la fermentation bactérienne. Le gavage de suspension de microbiote peut induire un stress aigu transitoire lié à la manipulation ainsi qu’une possible fausse route. Enfin, l’induction de la colite par DSS entraîne des effets dose-dépendants incluant une perte de poids, une modification du transit intestinal (diarrhée), et une inflammation colique transitoire associée à une altération de la barrière épithéliale Les procédures de gavage peuvent engendrer un stress transitoire chez les animaux. Le traitement au Dextran Sodium Sulfate (DSS) peut induire des troubles gastro-intestinaux tels qu’une diarrhée et une inflammation intestinale transitoire, pouvant entraîner une perte de poids et une diminution de la prise alimentaire. Ces effets sont attendus, surveillés et limités dans le temps.
Devenir
A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses histologiques et moléculaires sur ces tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions dynamiques entre le microbiote intestinal de différentes signatures fonctionnelles et bactériennes et la réponse à la colite induite sur la physiogie de la barrière intestinale de l’hôte. Ces phénomènes impliquent des réponses systémiques, des interactions multi-organes et des adaptations physiologiques complexes. Il n’existe, à ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire fidèlement ces interactions intégrées et mimer la colite. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de permettre la mise en évidence d’une différence de sévérité de la colite entre les groupes expérimentaux, évaluée à partir de critères cliniques incluant la perte de poids, la consistance des selles et la présence de saignements. L’étude comprend cinq groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, le donneur de microbiote est considéré comme l’unité de réplication biologique. Plusieurs souris recevront le microbiote d’un même donneur, ce qui permet de prendre en compte la variabilité technique liée à la transplantation tout en réduisant le nombre total d’animaux. Par ailleurs, une procédure pilote sera réalisée sur 9 animaux (3 par groupe) afin d’évaluer la faisabilité du modèle et d’ajuster les conditions expérimentales. Cette étape permettra notamment de suivre la tolérance, la cinétique de perte de poids et la sévérité clinique, sans objectif de démonstration statistique. Elle vise à réduire le risque d’échec de la procédure principale et à éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 2 animaux par cage. Des jouets seront introduits afin de minimiser le stress induit par les différents traitements. Le raffinement est complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Un questionnaire pour mesurer le niveau d’inconfort des rongeurs est mis à disposition dans les locaux. En cas de souffrance ou inconfort constaté, toutes les mesures nécessaires pour réduire la souffrance seront mises en place. Compte tenu de la pathologie développée dans ce projet et de l’impossibilité de recourir à des soins pharmacologiques, les animaux présentant un inconfort lié à au moins l’un des points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle approprié pour l’étude du microbiote et de la barrière intestinale en raison : •De sa facilité de manipulation •De son homogénéité génétique Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre ainsi qu’une transplantation du microbiote fécal du l’Homme vers l’animal chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation. Pour étudier l'effet de la flore intestinale sur la susceptibilité de la réponse à la colite induite, il faut disposer d'animaux adultes dont le développement de la barrière intestinale et du système immunitaire est stabilisé.
Analyse du comportement de migration des civelles d’anguille europ?enne en milieu exp?rimental
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pêchées au tamis à main, acclimatées trois à quatre jours, anesthésiées, pesées, mesurées, puis marquées de deux ou trois points de couleur injectés sous la peau à l'aiguille : 720 civelles d'anguille européenne sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles passent ensuite six jours dans des bassins qui reproduisent l'alternance des courants de marée et le cycle jour-nuit, filmées trente secondes toutes les quarante minutes. Elles ne sont pas nourries pendant toute cette période, ce que le porteur ne compte pas comme une nuisance puisque les civelles jeûnent aussi lors de la migration en estuaire. L'espèce est classée en danger critique d'extinction, et les 720 poissons sont tous tués à l'issue, le porteur indiquant que leur poids, de 150 à 350 milligrammes, ne permet pas de recueillir assez de matériel biologique autrement.
Objectifs
L'anguille europ?enne est une esp?ce de poisson migrateur qui a connu un d?clin spectaculaire depuis les ann?es 1980 et suscite de vives inqui?tudes tant pour la conservation de l?esp?ce que pour la durabilit? de la p?che. Ce projet concerne le stade juv?nile de l?esp?ce, appel? civelle, qui vient de la mer et remonte les estuaires pour atteindre les rivi?res dans lesquelles elles vont se d?velopper pendant plusieurs ann?es. Il est n?anmoins aujourd'hui ?tabli que toutes les civelles ne remontent pas jusqu'? la rivi?re mais se s?dentarisent en estuaire. Les raisons de ces diff?rents comportements de migration ne sont pas connues mais l?enjeu est important car le sexe des individus d?pend de l'environnement. Les civelles se s?dentarisant en estuaire se transforment plut?t en m?les tandis que les individus migrant en rivi?re se d?veloppent majoritairement en femelles. L?objectif de ce projet sera de tester l?hypoth?se d?une diff?rence g?n?tique entre les civelles migrantes et non migrantes, permettant d'expliquer, au moins en partie, cette migration facultative. Afin de r?aliser ces analyses, nous devons tout d?abord identifier les diff?rents comportements de migration en milieu exp?rimental. En milieu naturel, les civelles utilisent les courant de mar?e pour remonter les estuaires : elles montent dans la colonne d'eau et avancent avec le courant lors de la mar?e montante, puis redescendent et s'enfouissent dans le substrat lors de la mar?e descendante. Afin de d?terminer ces comportements de migration en milieu exp?rimental, les civelles seront marqu?es pour les reconnaitre individuellement. Elles seront ensuite plac?es dans deux installations identiques mimant l'alternance des courants de mar?e. Un enregistrement vid?o permettra d'observer le comportement de chaque individu afin de d?terminer s'il est migrant ou non migrant. Nous travaillerons sur des civelles pr?lev?es sur deux sites: ? l?entr?e d?un estuaire et ? plusieurs kilom?tres de son embouchure en zone d'eau douce . Nous travaillerons ?galement sur deux phases d?arriv?es de civelles sur nos c?tes: l?automne et le printemps. Les analyses g?n?tiques effectu?es sur chaque individu seront mis en relation avec leur comportement, le site de pr?l?vement et la saison.
Bénéfices attendus
Ce projet vise ? contribuer ? une meilleure compr?hension du comportement de migration des civelles d?anguille europ?enne dans l'estuaire. L'analyse de la variabilit? g?n?tique entre individus migrants et non migrants devra nous permettre d?anticiper le fonctionnement et l??volution de la population.
Procédures
Les civelles seront p?ch?es en milieu naturel et rapport?es au laboratoire dans leur eau d'origine. Elles seront acclimat?es ? l'eau douce durant 3 ? 4 jours puis anesth?si?es pour les peser, les mesurer et les marquer individuellement avec 2 ? 3 points de couleur non toxique. Le marquage est r?alis? en injectant un point de couleur d'environ 1 mm sous la peau de la civelle ? l'aide d'une aiguille tr?s fine. Pour chaque site/saison, 180 civelles seront plac?es dans deux installations identiques mimant l'aternance des courants et l'alternance jour/nuit (90 civelles dans chaque installation). Des enregistrements vid?o seront r?alis?s ? raison de 30 secondes toutes les 40 minutes pour suivre le comportement des civelles. Le suivi s'effectuera sur 6 jours afin de stabiliser les comportements. Toutes les civelles sont ensuite mises ? mort pour analyses g?n?tiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sur les animaux concernent les manipulations qui peuvent g?n?rer un stress: p?che, mise en place dans les installations, r?veil apr?s anesth?sie, environnement inconnu. Le marquage pourrait constituer une g?ne momentan?e au r?veil bien qu?aucune modification du comportement de nage n?ait ?t? observ?e jusqu?? maintenant. Les civelles jeunant durant toute la migration estuarienne en milieu naturel, l?absence d?alimentation n?est pas consid?r?e comme une nuisance.
Devenir
L'objectif final du projet ?tant d'effectuer des analyses g?n?tiques sur chaque civelle, elles doivent toutes ?tre mises ? mort. En effet, de par la petite taille des animaux (150 ? 350 milligrammes) le pr?l?vement d'un morceau de nageoire, de mucus, ou une biopsie ne permet pas de collecter suffisamment de mat?riel biologique pour les analyses.
Remplacement
Le comportement de migration ?tant sp?cifique ? l?esp?ce et au stade, le remplacement par une autre esp?ce ou un autre stade n?est pas envisageable. Il n?existe par ailleurs aucune pisciculture d?anguille.
Réduction
Les analyses g?n?tiques pr?vues n?cessitent habituellement chez les mammif?res plus de 1000 individus. Dans le cas de l?anguille europ?enne, nous comptons sur la particularit? de l'esp?ce (une seule population), pour limiter notre ?chantillon ? 720 individus (environ 200 grammes au total) tout en gardant une puissance suffisante pour les analyses.
Raffinement
Les civelles seront p?ch?es au tamis ? main par nos soins, une technique beaucoup moins traumatisante que le tamis pouss? par un bateau, utilis? par les p?cheurs professionnels. Les bacs de stabulation sont ?quip?s d?abris sp?cialement con?us pour les civelles (carr?s de 5cm/5cm de paillasson retourn?s et lest?s). Le marquage par points de couleur non toxique et la biom?trie seront effectu?s par une ?quipe exp?riment?e, selon une proc?dure ne durant pas plus de 4 minutes entre le d?but de l'anesth?sie et le r?veil. Les civelles d?anguille remontent les estuaires en nageant principalement de nuit avec le courant ? mar?e montante et en s?abritant dans le substrat ? mar?e descendante. Pour nos tris comportementaux, les animaux seront donc plac?s dans des structures leur permettant de synchroniser leur comportement sur l'alternance du jour et de la nuit ainsi que sur l?alternance du courant toutes les 6,2h, mimant les courants de mar?e. Nos installations sont ?quip?es de substrat (cailloux de 2 ? 3 cm) permettant aux civelles de s?enfouir. L?esp?ce ?tant nocturne et fuyant la lumi?re, l?intensit? lumineuse dans toutes les installations sera tr?s faible durant la journ?e et nulle durant la nuit. Une aube et un cr?puscule seront appliqu?s afin d'?viter les changements de luminosit? brutaux et de permettre la synchronisation du comportement de nage sur l?alternance jour-nuit. Une lumi?re ultraviolette, non d?tect?e par les civelles, permettra de suivre les marques color?es fluorescentes la nuit. La temp?rature sera maintenue ? 12 ?C afin de se rapprocher des conditions en milieu naturel.
Choix des espèces
L'anguille europ?enne pr?sente un int?r?t patrimonial et ?conomique. L'esp?ce est en danger critique d'extinction et il est urgent de mieux comprendre son cycle de vie afin de contribuer ? optimiser la gestion de la population. Notre projet porte sur le stade juv?nile, appel? civelle, car c'est ? ce stade de d?veloppement que l'animal remonte les estuaires.
Amélioration de la réponse à la stimulation ovarienne chez la ratte Wistar par immunothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".
Objectifs
L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.
Procédures
Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...
Remplacement
Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.
Réduction
Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.
Choix des espèces
La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.
?tude du r?le des fibroblastes tumoraux dans la r?sistance aux chimioth?rapies et aux immunoth?rapies dans le cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dix-huit semaines d'applications de substances destinées à faire pousser des tumeurs sur la peau du dos pour une première procédure, dix pour une seconde : 714 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les tumeurs cutanées provoquent des rougeurs, un épaississement de la peau, des croûtes, parfois une ulcération ou une infection locale, et peuvent devenir assez volumineuses pour gêner les déplacements. Il s'agit de savoir si le blocage de certains fibroblastes du voisinage de la tumeur ralentit la maladie et rend les immunothérapies plus efficaces. Le porteur justifie le choix de la souris par son statut de référence dans l'étude des cancers de la peau et par son système immunitaire intact, qu'il présente comme la condition pour étudier les réponses aux immunothérapies.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre pourquoi certains cancers de la peau r?sistent aux traitements, notamment aux immunoth?rapies, qui stimulent les d?fenses naturelles de l'organisme contre les cellules canc?reuses. Nous ?tudierons, chez la souris, le r?le de cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Ces cellules participent ? l'organisation et au fonctionnement du tissu tumoral. Nos travaux sugg?rent que certaines favorisent la croissance de la tumeur en cr?ant un environnement protecteur autour des cellules canc?reuses, tandis que d'autres limitent l'action des cellules immunitaires charg?es de d?truire la tumeur. L'objectif est de d?terminer comment ces diff?rentes populations de fibroblastes contribuent ? la r?sistance des cancers de la peau aux traitements, qu'il s'agisse des immunoth?rapies ou des chimioth?rapies. Une meilleure compr?hension de ces m?canismes pourrait permettre, ? terme, de d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques afin d'am?liorer l'efficacit? des traitements chez les patients atteints de cancer de la peau.
Bénéfices attendus
Les cancers de la peau peuvent ?tre trait?s par des immunoth?rapies, qui stimulent le syst?me immunitaire pour ?liminer les cellules canc?reuses. Cependant, ces traitements ne sont efficaces que chez une partie des patients. Il est donc essentiel de comprendre pourquoi certaines tumeurs r?sistent aux traitements afin de d?velopper des approches plus efficaces. Ce projet a pour objectif d'?tudier le r?le de certaines cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Nos travaux sugg?rent que ces cellules contribuent ? la croissance du cancer et prot?gent les cellules canc?reuses contre les traitements. En utilisant un mod?le de cancer de la peau chez la souris, nous ?valuerons si le blocage de l'activit? de ces fibroblastes permet de ralentir la progression de la maladie et d'am?liorer l'efficacit? des traitements, notamment des immunoth?rapies. Les r?sultats attendus pourraient ouvrir la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques visant ? rendre les traitements actuels plus efficaces et ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancer de la peau.
Procédures
Les animaux recevront, pendant l'?tude, des applications r?guli?res de substances sur la peau du dos afin de provoquer le d?veloppement de tumeurs cutan?es. Ils recevront ?galement des traitements exp?rimentaux administr?s par injection dans l'abdomen et par voie orale, selon un calendrier d?fini, afin d'?valuer leur efficacit? contre ces tumeurs. La dur?e totale des traitements sera de 18 semaines pour une premi?re proc?dure et de 10 semaines pour une seconde.
Impact sur les animaux
Au cours de l'?tude, les animaux seront manipul?s r?guli?rement pour l'administration des traitements, ce qui peut provoquer un stress l?ger et de courte dur?e. Le d?veloppement progressif des tumeurs cutan?es entra?nera des modifications de la peau, telles que des rougeurs, un ?paississement de la peau, des cro?tes ou une irritation. ? mesure que les tumeurs se d?veloppent, certains animaux pourront pr?senter un inconfort, une sensibilit? de la peau ou des d?mangeaisons. Dans les stades plus avanc?s, les tumeurs pourront devenir volumineuses et entra?ner une g?ne dans les d?placements, une diminution de l'activit? ou une perte de poids. Dans certains cas, des complications telles qu'une ulc?ration ou une infection locale pourront appara?tre. Les animaux seront examin?s tr?s r?guli?rement tout au long de l'?tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d'arr?t pr?d?finis seront appliqu?s afin de limiter au maximum les douleurs et les atteintes au bien-?tre des animaux.
Devenir
? l'issue de l'?tude, tous les animaux seront euthanasi?s de mani?re r?glementaire afin de permettre le pr?l?vement des tumeurs et des diff?rents organes n?cessaires aux analyses biologiques. Ces pr?l?vements sont indispensables pour comprendre les m?canismes de progression du cancer, ?valuer l'efficacit? des traitements test?s et r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne peuvent pas ?tre r?utilis?s dans d'autres ?tudes, car les traitements administr?s et le d?veloppement des tumeurs modifient durablement leur ?tat de sant?.
Remplacement
Ce projet ne peut pas ?tre r?alis? sans l?utilisation d?animaux vivants, car il est n?cessaire d??tudier simultan?ment le d?veloppement des tumeurs, les interactions entre les cellules de la tumeur et leur environnement, ainsi que la r?ponse globale de l?organisme aux traitements. Ces ph?nom?nes complexes ne peuvent pas ?tre reproduits de mani?re fiable avec des mod?les cellulaires ou informatiques seuls. Le mod?le murin de cancer cutan? est largement utilis? et bien caract?ris?. Il permet de reproduire des ?tapes essentielles de la maladie humaine et d??valuer l?efficacit? de traitements dans un contexte biologique complet, incluant le syst?me immunitaire. Lorsque cela est possible, des approches alternatives sont utilis?es en amont ou en compl?ment des exp?riences chez l?animal, afin de limiter leur nombre et de r?duire leur utilisation au strict n?cessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis? sera r?duit au minimum n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement fiables. Une planification statistique des exp?riences sera r?alis?e afin d??viter toute utilisation excessive d?animaux et de garantir une puissance suffisante pour l?analyse des r?sultats. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses seront effectu?es sur les m?mes animaux, notamment ? partir des m?mes tissus pr?lev?s, afin de limiter le nombre total d?animaux requis pour le projet. Les exp?riences seront ?galement organis?es de mani?re ? optimiser chaque groupe exp?rimental et ? ?viter les r?p?titions inutiles. Enfin, les donn?es d?j? disponibles dans la litt?rature et issues d??tudes ant?rieures seront prises en compte afin de r?duire au maximum le recours ? de nouveaux animaux.
Raffinement
Toutes les proc?dures seront mises en ?uvre de mani?re ? limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?, selon des techniques standardis?es et valid?es. Une surveillance r?guli?re sera assur?e tout au long de l??tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d?observation pr?cis permettront d?intervenir rapidement si n?cessaire, notamment par une prise en charge adapt?e ou une euthanasie anticip?e lorsque le bien-?tre de l?animal est compromis. Des mesures de confort seront mises en place, incluant l?adaptation des conditions d?h?bergement, la limitation des manipulations au strict n?cessaire et l?utilisation de proc?dures anesth?siques ou analg?siques lorsque cela est pertinent. L?ensemble du protocole est con?u afin de respecter les principes ?thiques et de r?duire au maximum l?impact sur le bien-?tre animal.
Choix des espèces
La souris a ?t? choisie car elle constitue un mod?le de r?f?rence pour l??tude des cancers de la peau. Elle permet de reproduire de mani?re fiable les ?tapes de d?veloppement tumoral observ?es chez l?humain, tout en offrant un cadre exp?rimental contr?l?. Ce mod?le pr?sente ?galement l?avantage de disposer d?un syst?me immunitaire fonctionnel, indispensable pour ?tudier les interactions entre les cellules tumorales, leur environnement et les r?ponses aux immunoth?rapies. Les animaux seront utilis?s ? un stade adulte, lorsque leur d?veloppement est complet. Ce choix permet de garantir des r?sultats biologiquement pertinents tout en ?vitant d?interf?rer avec des processus de croissance ou de d?veloppement pr?coce.
Etude des r?ponses immunitaires chez la vache laiti?re vaccin?e contre le parasite Besnoitia besnoiti
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Déjà utilisées dans un autre protocole, 6 vaches laitières taries sont reprises pour tester un vaccin nasal contre la besnoitiose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tête bloquée au cornadis, chacune subit quatre prises de sang de trente millilitres, quatre écouvillonnages nasaux, trois instillations du vaccin et jusqu'à vingt-huit prises de température rectale. L'effectif tient à la disponibilité de ces six vaches, le porteur indiquant qu'il n'est pas modulable puisqu'elles proviennent d'un protocole antérieur. Toutes seront mises à mort à l'issue, au motif qu'elles auront été soumises à des produits expérimentaux.
Objectifs
La besnoitiose, caus?e par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), repr?sente une menace significative pour l??levage bovin. Maladie r?-?mergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites pr?sents dans la peau peuvent ?tre transmis par l?interm?diaire d?insectes ou d?aiguilles avec une progression jusqu?? 20% de nouveaux animaux infect?s par an dans les troupeaux touch?s. La phase f?brile est caract?ris?e par un larmoiement, un jetage nasal, une congestion des muqueuses, de la fi?vre ; puis la phase des ?d?mes touche toutes les r?gions du corps rendant les d?placements difficiles ; puis vient la phase de d?pilation et scl?rodermie accompagn? d?amaigrissement. La mort, spontan?e ou provoqu?e, peut atteindre jusqu?? 10 % des animaux infect?s. Cette maladie est ?galement une cause d?infertilit? des m?les pouvant impacter des taureaux de grande valeur g?n?tique. Aucun traitement curatif n?est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limit?s au d?pistage et ? l??limination des animaux malades, ce qui est difficile pour les animaux asymptomatiques, ou au contr?le des insectes. Le d?veloppement d?un vaccin efficace offrirait aux ?leveurs une meilleure strat?gie de contr?le de cette maladie. Le but de ce projet est d??valuer l?immunog?nicit? et l?efficacit? d?un vaccin sous-unitaire ? administration nasale contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitu? de prot?ines de B. besnoiti associ?es ? un muco-excipient ? base d?amidon. Les vaches seront immunis?es par voie intranasale pour d?clencher une r?ponse immunitaire muqueuse et syst?mique. Ces r?ponses seront ?valu?es par le suivi de l?apparition d?anticorps muqueux et s?riques sp?cifiques de B. besnoiti et par la production de mol?cules inflammatoires par les cellules sanguines. Le vaccin sera test? sur 6 vaches r?utilis?es et h?berg?es conform?ment aux directives europ?ennes, avec un enrichissement appropri? aux bovins. Toute m?dication interf?rant avec la r?ponse immunitaire est ? ?viter.
Bénéfices attendus
Les b?n?fices attendus sont la mise en ?vidence du d?veloppement d?une immunit? contre Besnoitia besnoiti, ? l?aide d?un vaccin nasal. Ces r?sultats sont essentiels pour envisager le d?ploiement de la vaccination de bovins dans les zones end?miques en France. Cet outil de lutte est attendu par les acteurs du secteurs (?leveurs impact?s, groupement de d?fense sanitaire qui soutient les ?leveurs dans la gestion de la besnoitiose).
Procédures
Les animaux seront soumis ? des pr?l?vements sanguins sous contention de la t?te au cornadis (environ 5 minutes par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des pr?l?vements nasaux par ?couvillonnage sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; d?instillation du vaccin par voie intranasale sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 3 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des prises rectales de la temp?rature (environ 5 minutes par animal, entre 16 et 28 fois avec un maximum de 2 fois par jour pendant 3 jours apr?s vaccination).
Impact sur les animaux
Les prises de sang peuvent ?tre source de stress et de douleur mod?r?e. Au total, 4 prises de sang de 30 mL chacune, ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. L??couvillon dans la narine peut provoquer une sensation de d?mangeaison limit?e ? la dur?e du geste. Au total, 4 ?couvillonages ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. La prise rectale de la temp?rature peut occasionner une g?ne passag?re. Le pr?l?vement de sang au niveau de la veine jugulaire n?cessite une contention de la t?te ? l?aide d?un cornadis et d?un licol. Le pr?l?vement nasal se fera ? la suite pour profiter de l?immobilisation de la t?te de l?animal.
Devenir
A l'issue de la proc?dure 1, les 6 animaux seront mis ? mort ?tant donn? qu?ils auront ?t? soumis ? des produits exp?rimentaux.
Remplacement
Il n?existe ? ce jour aucune alternative non animale permettant d??tudier les r?ponses immunitaires. L??tude des r?ponses immunitaires n?cessite d?immuniser et de faire des pr?l?vements sur des animaux vivants. Le bovin est l?h?te de B. besnoiti. C?est donc la seule esp?ce pertinente pour ?tudier les r?ponses immunitaires d?un vaccin ? destination des bovins.
Réduction
Il s?agit d?une ?tude exploratoire sur des animaux r?utilis?s issus d?un autre protocole afin de ne pas en utiliser d?autres (r?duction). Le nombre d?animaux n?est donc pas modulable. Le fait que chaque animal soit son propre t?moin n?gatif permet d?avoir un lot unique et d?augmenter la robustesse des r?sultats. Pour les dosages de cytokines produites par les cellules sanguines stimul?es ex vivo, le test statistique non param?trique (2 ?chantillons appari?s) pourra ?tre utilis? pour d?terminer si la diff?rence entre le point avant vaccination (J0) et chaque point apr?s vaccination (J14, J28, J47) est significative. Une simulation r?alis?e avec l?outil de calcul de puissance de ce test indique que 6 individus sont n?cessaires pour atteindre 95 %, sans tenir compte de la grande variabilit? individuelle d?j? observ?e avec les cellules bovines et pour une augmentation attendue d?au moins 50 % de cytokines produites.
Raffinement
Les animaux ayant d?j? ?t? utilis?s, ils resteront dans leur environnement habituel. Ils ont d?j? ?t? acclimat?s et habitu?s aux pr?l?vements sanguins. Les prises de sang et les immunisations intranasales ne n?cessiteront qu?une contention minimale (au cornadis). Dans leur pr?cedent ?levage, les animaux ont d?j? ?t? habitu?s ? l?alimentation au cornadis. Un renforcement positif (granul?s pour vaches par exemple) sera appliqu? apr?s chaque immunisation et pr?l?vements. La vaccination ne devrait pas entrainer d?effet ind?sirable grave et toute m?dication pouvant interf?rer avec les r?ponses immunitaires (tels que les anti-inflammatoires) est proscrite. Enrichissement du milieu par : des brosses de grattage, des blocs de sels min?raux et de la paille r?guli?rement chang?e pour le couchage. Enrichissement social : les animaux seront h?berg?s en groupes stables et auront au minimum deux visites quotidiennes des animaliers.
Choix des espèces
Le bovin est l?esp?ce cible du vaccin test? dans cette exp?rimentation. Les vaches laiti?res sont au stade adulte et taries qui correspond au stade majoritairement infect? par B. besnoiti. En effet, le risque est li? aux piq?res d?insectes et il augmente avec l??ge des animaux.