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Identification du r?le d?un g?ne dans l?initiation et la progression des l?sions pr?canc?reuses pancr?atiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Pour identifier le rôle d'un gène dans l'apparition de lésions précancéreuses du pancréas, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Au stade souriceau, elles sont tatouées à la base des phalanges et amputées de moins de deux millimètres de queue pour le génotypage. À partir de cinq semaines, elles reçoivent quarante injections dans l'abdomen réparties sur neuf semaines, jusqu'à six par jour, destinées à déclencher les lésions et à en accélérer la progression. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer du pancréas, sont formulées au conditionnel, quand les lésions sont provoquées puis laissées se développer jusqu'à l'âge de quatre mois, soit environ un quart de la vie d'une souris.
Objectifs
La partie exocrine du pancr?as joue un r?le essentiel dans la digestion des aliments. Elle repr?sente la grande majorit? du pancr?as et est constitu?e principalement de cellules sp?cialis?es, appel?es cellules acineuses, qui produisent des enzymes digestives. Ces enzymes sont ensuite transport?es par les canaux pancr?atiques jusqu?? l?intestin afin de participer ? la digestion. La grande majorit? des cancers du pancr?as prennent naissance dans ces cellules exocrines, qui peuvent subir des modifications progressives les transformant en cellules canc?reuses. L?activation anormale d?un g?ne appel? KRAS est notamment l?un des premiers ?v?nements fr?quemment observ?s dans le d?veloppement de ce cancer. La pancr?atite chronique est une maladie du pancr?as caract?ris?e par une inflammation persistante et progressive de cet organe. Au cours de la maladie, cette inflammation entra?ne une perte des cellules acineuses ainsi que la formation de tissu cicatriciel (fibrose), ce qui perturbe progressivement le fonctionnement normal du pancr?as. Plusieurs facteurs peuvent ?tre responsables d?une pancr?atite chronique, notamment les calculs biliaires, la consommation d?alcool, le tabagisme ou certaines pr?dispositions g?n?tiques. Toutefois, un certain nombre de cas, aucune cause pr?cise n?est identifi?e. Les modifications du tissu pancr?atique observ?es lors d?une pancr?atite chronique peuvent favoriser l?apparition d?un cancer du pancr?as. Ce cancer, dont le nombre de cas augmente r?guli?rement, est l?un des plus agressifs. Son taux de survie ? 5 ans reste tr?s faible, principalement parce qu?il est souvent diagnostiqu? tardivement, lorsque les possibilit?s de traitement sont limit?es. Il est donc essentiel de mieux comprendre les m?canismes responsables de la pancr?atite chronique ainsi que les premi?res ?tapes qui conduisent au d?veloppement du cancer du pancr?as. L?objectif de ce projet de recherche est d??tudier le r?le d?un g?ne impliqu? dans le d?veloppement du cancer du pancr?as. Pour cela, nous utilisons des mod?les de souris permettant de d?sactiver ce g?ne de mani?re contr?l?e afin d??valuer son influence sur l?apparition des premi?res l?sions pouvant ?voluer vers un cancer. Ces travaux pourraient contribuer ? une meilleure compr?hension des ?tapes pr?coces de la maladie et permettre d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques pour d?velopper de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Ces mod?les de souris sont n?cessaires pour comprendre les causes de pr?disposition et de progression des l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques, ce qui a un int?r?t pour le d?veloppement de strat?gie de d?pistage et de strat?gie th?rapeutique du cancer du pancr?as.
Procédures
Les souriceaux sont marqu?s par tatouage ? la base des phalanges et un pr?l?vement d?un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectu? pour le g?notypage, c'est ? dire l'identification des modifications g?n?tiques induites chez chaque animal. La manipulation est tr?s rapide et n?induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise tr?s rapidement ? ce stade. Les souris sont trait?es par injections au niveau de l?abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours cons?cutifs ? l??ge de 5 semaines, puis 4 semaines apr?s elles sont inject?es 6 fois par jour pendant 2 jours cons?cutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La n?cessit? de ce nombre d'injection a ?t? ?tablie par des travaux de mise au point valid?s dans diff?rents laboratoires dans le monde). Ces injections servent ? induire les modifications g?n?tiques et ? favoriser le d?veloppement des l?sions pr?-canc?reuses pour ?tudier les causes de leur initiation et de leur progression.
Impact sur les animaux
Les souris sont trait?es par un certain nombre d?injections dans la cavit? p?riton?ale, au niveau de l?abdomen. Cela peut entrainer une l?g?re perte de poids le jour suivant l?injection. Les souris vont d?velopper des l?sions microscopiques pr?-canc?reuses au niveau du pancr?as. Les souris sont euthanasi?es pr?cocement pour l?analyse de ces l?sions avant le stade de cancer.
Devenir
Les animaux de la proc?dure sont euthanasi?s pour des analyses effectu?es sur le pancr?as (visualisation et ?tudes de mol?cules) afin d??tudier les l?sions pr?canc?reuses.
Remplacement
Les connaissances issues de cette ?tude sur l?animal ne peuvent pas ?tre actuellement obtenues par d?autres m?thodes compte-tenu de la complexit? physiologique du d?veloppement des l?sions pr?canc?reuses, nous obligeant ? travailler ? l'?chelle d'un organisme. Des ?tudes in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de pr?l?vements de l?sions humaines sont ?galement possibles en compl?ment mais ne peuvent pas remplacer cette ?tude avec ce mod?le physiologique. Les retomb?es de ce travail sont utiles du point de vue des implications th?rapeutiques ? terme chez l'homme.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determin? par des r?sultats obtenus pr?c?demment et dans les publications scientifiques pour ce type d?analyse, et qui permet d'obtenir des r?sultats statistiques permettant la validation de l'?tude.
Raffinement
Les m?thodes et les mesures choisies visent ? diminuer au maximum les contraintes impos?es aux animaux. Les souris sont plac?es dans des conditions optimales d'?levage, en portoirs ventil?s. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant ?tre isol?s car ce sont des animaux gr?gaires. La temp?rature, l'hygrom?trie, la nourriture et l'eau sont contr?l?es tous les jours. En plus de la liti?re, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi r?gulier de l'exp?rimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de diff?rents ?l?ments bien d?finis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'?viter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont pr?coces et concernent les phases de l?sions pr?-canc?reuses. Les souris sont euthanasi?es pour analyse avant de d?velopper un cancer.
Choix des espèces
Les souris modifi?es g?n?tiquement sont largement utilis?es dans l'?tude des m?canismes physiopathologiques de pathologie humaine. L?objectif du projet est d??tudier le d?veloppement et l??volutivit? de l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques gr?ce au mod?le de souris et d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Les souris seront utilis?es ? l??ge de 5 semaines car au tout d?but de l??ge adulte. On laisse les l?sions pr?- canc?reuses se d?velopper dans ce mod?le de souris jusqu?? l??ge de 4 mois (ce qui correspond ? environ 1/4 de la dur?e de vie de la souris). Cela permet d??tudier l?impact de notre g?ne d?int?r?t dans l?initiation et la progression de ces l?sions pr?canc?reuses.
Immunoph?notypage approfondi des souris d?pourvues de certains r?cepteurs de l?immunit? inn?e
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, 960 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un prélèvement de tissu sous anesthésie pour le génotypage, trois à cinq injections sur souris vigile, puis un prélèvement terminal sous anesthésie profonde. Ces souris sont dépourvues d'un ou de plusieurs récepteurs de l'immunité innée, et le porteur écrit qu'elles "sont uniques au monde", conçues pour cette seule étude. Après les injections, il attend un syndrome inflammatoire pouvant entraîner une hypothermie sévère, et s'en remet à des points limites "établis pour soustraire l'animal à la souffrance", sans en préciser le seuil.
Objectifs
Le syst?me immunitaire est charg? de prot?ger l?organisme contre les infections et d??liminer les cellules anormales. Pour accomplir cette mission, il s?appuie sur des m?canismes de reconnaissance qui permettent aux cellules immunitaires de d?tecter les signes de stress, d?infection ou de dysfonctionnement cellulaire. Certaines mol?cules pr?sentes ? la surface des cellules jouent un r?le important dans cette d?tection en activant des cellules du syst?me immunitaire. Cependant, les fonctions pr?cises de ces mol?cules restent encore mal connues, notamment parce qu?elles peuvent se remplacer partiellement les unes les autres. L?objectif de ce projet est de mieux comprendre le r?le de ces mol?cules en ?tudiant des souris g?n?tiquement modifi?es qui en sont d?pourvues. Plusieurs lign?es de souris seront d?velopp?es, chacune pr?sentant l?absence d?une ou de plusieurs de ces mol?cules. Les chercheurs analyseront ensuite l?impact de ces absences sur le fonctionnement et l?activation du syst?me immunitaire. Les connaissances obtenues permettront de mieux comprendre les m?canismes impliqu?s dans la r?ponse aux infections et aux inflammations. ? plus long terme, elles pourraient contribuer au d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques pour certaines maladies inflammatoires, auto-immunes ou certains cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet vise ? mieux comprendre comment notre syst?me immunitaire d?tecte et r?agit au stress ou aux agressions subies par nos cellules. Plus pr?cis?ment, il s?int?resse ? une mol?cule cl?, pr?sent ? la surface de certaines cellules immunitaires, qui joue un r?le central dans la reconnaissance des cellules endommag?es ou infect?es. Nous pourrons identifier quels signaux sont essentiels pour alerter le syst?me immunitaire quand une cellule devient anormale (par exemple, ? cause d?un virus ou d?un cancer). Cette ?tude nous permettra de comprendre comment l?absence de ces signaux perturbe la r?ponse immunitaire, notamment celle des cellules sp?cialis?es dans la d?fense de l?organisme et d?expliquer le r?le de cette mol?cule et des signaux qui l'active dans les maladies comme les infections virales, les inflammations chroniques, les maladies auto-immunes ou certains cancers. Ces d?couvertes pourraient ouvrir la voie ? de nouveaux traitements, comme des m?dicaments capables de bloquer ou de moduler sp?cifiquement ce r?cepteur pour mieux contr?ler les r?actions immunitaires excessives ou insuffisantes.
Procédures
Les animaux seront soumis ? un pr?l?vement de tissu pour g?notypage sur animal anesth?si? d?une dur?e de 1min , 3 ? 5 injections sur animal vigile d?une dur?e de quelques secondes et un pr?l?vement terminal sous anesth?sie profonde d?une dur?e de 1min.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris lors des exp?rimentations : le stress engendr? lors de la pr?hension et des injections. Apr?s injection, les animaux peuvent d?velopper un syndrome inflammatoire qui peut entraine une hypothermie s?v?re.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mise ? mort ? l'issue des diff?rentes proc?dures afin de pr?lever les organes pour les analyses biologiques.
Remplacement
Aujourd?hui, il n?existe aucun mod?le en laboratoire (comme des cultures cellulaires ou des simulations informatiques) capable de reproduire fid?lement la complexit? des interactions entre ces mol?cules et leur r?cepteur dans un organisme vivant, ni leur impact sur la sant?. Les souris utilis?es dans ce projet sont uniques au monde : elles ont ?t? sp?cialement con?ues pour cette ?tude. Les exp?riences pr?vues n?ont jamais ?t? r?alis?es auparavant, ce qui signifie qu?il n?y a ni r?p?tition ni chevauchement avec des travaux existants. Chaque ?tape apportera donc des connaissances enti?rement nouvelles.
Réduction
Afin d?obtenir des r?sultats scientifiques fiables tout en limitant l?utilisation des animaux, le nombre de souris incluses dans chaque groupe a ?t? r?duit au minimum n?cessaire (15 animaux par groupe). Ce nombre a ?t? d?termin? de mani?re ? garantir la qualit? et la robustesse des r?sultats. Les souris g?n?tiquement modifi?es d?velopp?es dans le cadre de ce projet seront cryoconserv?es et pourront ?tre mises ? disposition d?autres ?quipes de recherche. Cette d?marche permettra d??viter de recr?er les m?mes mod?les animaux et contribuera ainsi ? r?duire le nombre total d?animaux utilis?s en recherche. Par ailleurs, si les objectifs scientifiques du projet sont atteints avant que tous les animaux pr?vus ne soient utilis?s, les exp?riences seront arr?t?es et nous utiliserons moins d'animaux que pr?vu dans ce projet. Enfin, chaque ?chantillon recueilli sera analys? ? plusieurs reprises ? l?aide de diff?rentes m?thodes compl?mentaires, afin de maximiser les informations obtenues et de garantir la fiabilit? des r?sultats.
Raffinement
Les animaux sont h?berg?s en groupe sociaux, ce qui permet les interactions n?cessaires ? leur bien-?tre, avec comme enrichissement du milieu de vie des carr?s de coton pour l??dification du nid (changement toutes les semaines) et des b?tonnets de bois pour user leurs dents. Des tunnels de change sont ?galement ajout?s dans les cages pour diminuer le stress engendr? par la pr?hension lors du change des cages et des abris en polycarbonate rouge pour l??dification du nid. Toutes les proc?dures le n?cessitants seront r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale profonde et analg?sie. Des points limites ont ?t? ?tablis pour soustraire l'animal ? la souffrance.
Choix des espèces
La souris est l?animal le plus couramment utilis? en recherche pour ?tudier le r?le des g?nes, notamment gr?ce ? des mod?les g?n?tiquement modifi?s (appel?s ? souris Knock-Out ?). Les exp?riences seront men?es sur des souris ?g?es d'au moins 6 semaines, un ?ge o? leur syst?me immunitaire est pleinement mature et fonctionne de mani?re comparable ? celui d?un adulte (r?actions immunitaires et d?fenses contre les infections bien ?tablies).
Effets de la radioth?rapie sur le remodelage stromal et neuro-immunitaire dans un mod?le murin de cancer de la t?te et du cou
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Faire pousser une tumeur dans la bouche de souris pour observer ce que la radiothérapie change autour d'elle : 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales sont injectées dans leur muqueuse jugale, puis viennent six à douze séances d'imagerie, six à quinze injections intrapéritonéales et une séance d'irradiation localisée. Le porteur décrit une inflammation de la joue ou de la langue, un bourgeon tumoral pouvant s'ulcérer, des saignements, une infection locale et des difficultés à s'alimenter, sur une durée maximale de quatre à cinq semaines par souris, avec prostration et réduction des interactions sociales. Ce que le projet promet en retour reste au conditionnel et au long terme : de nouvelles cibles thérapeutiques, des biomarqueurs prédictifs de réponse à la radiothérapie, une meilleure stratification des patients.
Objectifs
Les cancers de la cavit? orale repr?sentent un probl?me de sant? publique majeur. Malgr? les progr?s de la m?decine et l'utilisation combin?e de la chirurgie, de la chimioth?rapie et de la radioth?rapie, de nombreux patients font face ? des r?cidives ou ? une r?sistance aux traitements. Actuellement, seul un patient sur deux survit au-del? de cinq ans apr?s le diagnostic. Il est donc indispensable de comprendre pourquoi les traitements actuels ?chouent afin de proposer de nouvelles solutions th?rapeutiques. Une tumeur n'est pas seulement constitu?e de cellules canc?reuses ; c'est un ?cosyst?me complexe qui d?tourne ? son profit des cellules normales de l'organisme, appel?es cellules de soutien (ou cellules stromales), pour se prot?ger des attaques du syst?me immunitaire et r?sister aux traitements. De plus, des ?tudes r?centes sugg?rent que les nerfs situ?s autour de la tumeur jouent ?galement un r?le actif en favorisant la progression de la maladie. Ce projet de recherche poursuit trois objectifs principaux : Comprendre la r?sistance aux traitements : Nous voulons observer comment la radioth?rapie modifie l'environnement de la tumeur. L'objectif est de comprendre si certaines cellules de soutien ou les fibres nerveuses environnantes aident la tumeur ? se "r?parer" ou ? se cacher du syst?me immunitaire apr?s le traitement. ?tudier le r?le des cellules de soutien sp?cifiques : Nous ?tudierons les relations entre les cellules stromales, les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaires. Identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques : En analysant finement les interactions entre le cancer, les nerfs et les cellules de soutien, nous esp?rons identifier des signaux de communication que nous pourrions bloquer par de nouveaux m?dicaments. ? terme, les b?n?fices attendus de ce projet sont de fournir des bases scientifiques pour le d?veloppement de th?rapies innovantes qui pourraient ?tre combin?es ? la radioth?rapie classique ou ? l?immunoth?rapie, afin d'augmenter les chances de gu?rison des patients atteints de cancers de la t?te et du cou.
Bénéfices attendus
Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliqu?s dans la progression des carcinomes ?pidermo?des de la cavit? orale et dans leur r?ponse ? la radioth?rapie, pathologies pour lesquelles les options th?rapeutiques restent limit?es et les taux de r?cidive ?lev?s. Progr?s des connaissances scientifiques (Court et moyen terme) : Ce projet permettra d?acqu?rir de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales, le stroma tumoral et les structures nerveuses dans un mod?le murin immunocomp?tent. L?utilisation d?un mod?le orthotopique associ? ? des techniques d?imagerie in vivo permettra une analyse dynamique et non invasive de la croissance tumorale et de sa r?ponse au traitement. L??tude des effets pr?coces et tardifs de la radioth?rapie permettra notamment : ? de mieux caract?riser les modifications du microenvironnement tumoral induites par l?irradiation, ? d?identifier les m?canismes impliqu?s dans la r?ponse ou la r?sistance au traitement, ? d??valuer le r?le des cellules stromales et immunitaires dans ces processus. L?administration de mol?cules modulant le microenvironnement tumoral (agonistes, antagonistes ou anticorps monoclonaux) permettra ?galement d?explorer de mani?re fonctionnelle les voies biologiques impliqu?es. B?n?fices pour la sant? humaine (Long terme) : Les r?sultats issus de ce projet pourraient contribuer ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancers de la cavit? orale, par : ? l?identification de nouvelles cibles th?rapeutiques, en particulier au sein du microenvironnement tumoral, ? le d?veloppement de strat?gies associant radioth?rapie et modulation du stroma ou du syst?me immunitaire, ? l?identification de biomarqueurs pr?dictifs de r?ponse ? la radioth?rapie, permettant une meilleure stratification des patients. Ces avanc?es pourraient, ? terme, contribuer ? am?liorer l?efficacit? des traitements, ? r?duire les risques de r?cidive et ? limiter l?exposition ? des traitements inefficaces. B?n?fices pour la communaut? scientifique : Ce projet contribuera ?galement ? : ? valider un mod?le pr?clinique pertinent de cancer oral int?grant les interactions avec le microenvironnement, ? promouvoir l?utilisation de techniques d?imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal des tumeurs, ? g?n?rer des donn?es qui pourront ?tre partag?es avec la communaut? scientifique via des publications et des communications.
Procédures
Implantation tumorale : Une injection de cellules tumorales sera r?alis?e une seule fois (J0), sous anesth?sie g?n?rale Nombre : 1 injection par animal Dur?e : 2 ? 5 minutes (anesth?sie incluse : environ 5 ? 10 minutes) Imagerie: Le suivi tumoral sera r?alis? par imagerie non invasive apr?s injection de produit d?imagerie. Fr?quence : 2 ? 3 fois par semaine Nombre total : environ 6 ? 12 s?ances par animal selon la dur?e de suivi Dur?e : 5 ? 10 minutes d?acquisition (dur?e totale avec anesth?sie : environ 15 ? 20 minutes par s?ance) Injections de traitements et de substances d?imagerie Les animaux recevront des injections intrap?riton?ales r?p?t?es. Nombre : variable selon les groupes (environ 6 ? 15 injections au total par animal) Dur?e : quelques secondes par injection (< 1 minute), sans anesth?sie ou sous anesth?sie l?g?re si n?cessaire Radioth?rapie : Une irradiation localis?e sera r?alis?e chez les animaux des groupes concern?s. Nombre : 1 s?ance par animal Dur?e : 5 ? 15 minutes (dur?e totale incluant anesth?sie : environ 20 ? 30 minutes)
Impact sur les animaux
Le protocole exp?rimental est susceptible d?induire plusieurs types de nuisances et effets ind?sirables chez les animaux, principalement li?s ? l?implantation tumorale, ? la croissance de la tumeur, aux proc?dures exp?rimentales r?p?t?es et au traitement par radioth?rapie. Douleur, l?sions et maladies : L?injection de cellules tumorales dans la muqueuse jugale entra?ne une douleur aigu?, br?ve (quelques secondes) li?e ? l?introduction de l?aiguille fine. Le d?veloppement tumoral dans la cavit? orale est susceptible d?induire, ? partir de quelques jours apr?s l?injection et jusqu?? la mise ? mort : ? une inflammation locale (joue et/ou langue), ? l?apparition d?un bourgeon tumoral, pouvant ?voluer vers une ulc?ration de la muqueuse, ? des saignements, ? une infection locale. Ces l?sions peuvent entra?ner des cons?quences fonctionnelles, notamment des difficult?s alimentaires, avec un risque de perte de poids. Les injections peuvent induire une douleur de quelques secondes lors de l?introduction de l?aiguille et une g?ne de quelques minutes au point de ponction. La radioth?rapie localis?e est indolore dans les suites imm?diates mais peut induire des effets secondaires locaux quelques jours apr?s la s?ance jusqu?? la fin de l?exp?rience d?intensit? mod?r?e, comprenant : ? une inflammation de la muqueuse buccale, ? une irritation locale, ? une majoration des troubles alimentaires. Stress physique et effets li?s aux proc?dures : Les animaux seront soumis ? des manipulations r?p?t?es (contention, imagerie, injections intrap?riton?ales, irradiation), susceptibles d?induire un stress l?ger ? mod?r?. Comportement, peur et d?tresse : L?ensemble des proc?dures et la progression tumorale peuvent induire des modifications comportementales, telles que : ? une diminution de l?activit?, ? une r?duction de l?exploration, ? une prostration, ? une alt?ration des interactions sociales. Ces signes traduisent un ?tat de stress ou d?inconfort mod?r?. Dur?e et intensit? des nuisances Les nuisances d?crites sont d?intensit? s?v?re avec un risque d?aggravation li? ? la progression tumorale. Elles s??tendent sur une dur?e maximale de 4 ? 5 semaines par animal, correspondant ? la p?riode de croissance tumorale et de suivi post-traitement.
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de chaque proc?dure car ils ne peuvent ?tre ni r?utilis?s, ni replac?s, ni adopt?s car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des r?percussions sur leur bien-?tre si pas de mise ? mort.
Remplacement
L??tude des m?canismes de r?sistance aux traitements dans les cancers de la cavit? orale repose sur des interactions complexes entre diff?rents compartiments cellulaires et tissulaires. Des m?thodes alternatives non animales existent, mais elles pr?sentent des limites importantes au regard des objectifs de ce projet. Alternatives non animales disponibles et leurs limites : Des approches in vitro, telles que les cultures cellulaires en deux dimensions ou les mod?les tridimensionnels de type organo?des, permettent d??tudier certains aspects sp?cifiques de la biologie tumorale, notamment la prolif?ration cellulaire ou la r?ponse directe ? des traitements (radioth?rapie, agents pharmacologiques). Ces mod?les sont utiles pour des analyses m?canistiques cibl?es. Cependant, ces syst?mes ne permettent pas de reproduire la complexit? du microenvironnement tumoral in vivo. En particulier, ils ne permettent pas d?int?grer simultan?ment : ? les interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules stromales et cellules immunitaires, ? la vascularisation et les ph?nom?nes de perfusion tissulaire, ? la r?ponse inflammatoire syst?mique, ? ni les interactions avec le syst?me nerveux p?riph?rique. Or, ces param?tres sont essentiels dans l??tude des effets de la radioth?rapie et des m?canismes de r?sistance tumorale. Les mod?les in silico (mod?lisation informatique) constituent ?galement des outils compl?mentaires, mais leur capacit? pr?dictive reste limit?e par l?insuffisance de donn?es biologiques int?gr?es, notamment concernant le r?le du microenvironnement stromal et nerveux dans les cancers de la cavit? orale. Justification de l'utilisation d'animaux vivants : ? ce jour, l?utilisation d?animaux vivants reste indispensable pour r?pondre aux objectifs du projet. Seul un mod?le in vivo permet de conserver l?int?grit? de l?architecture tissulaire, de la vascularisation et du syst?me immunitaire, ainsi que les interactions dynamiques entre ces diff?rents compartiments. Le mod?le murin utilis? permet en particulier : ? l??tude de la r?ponse tumorale dans un organisme immunocomp?tent, ? l?analyse des effets locaux et syst?miques de la radioth?rapie, ? et l?exploration des interactions entre la tumeur, le stroma et le syst?me nerveux dans un contexte physiologique. Ces ?l?ments sont essentiels pour obtenir des donn?es biologiques pertinentes et transposables ? la pathologie humaine.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis?s dans ce projet a ?t? d?termin? de mani?re ? ?tre le plus faible possible tout en garantissant la robustesse statistique et la validit? scientifique des r?sultats. D?termination du nombre d'animaux : Le nombre de souris par groupe exp?rimental a ?t? estim? ? partir d?une analyse de puissance statistique, bas?e sur des donn?es issues de la litt?rature et de r?sultats pr?liminaires obtenus dans des mod?les comparables. Ce calcul conduit ? un effectif de 15 animaux par groupe, en tenant compte de la variabilit? biologique et des pertes potentielles (?chec de prise tumorale, exclusion selon les crit?res exp?rimentaux ou atteinte de points limites). Mesures prises pour limiter l'utilisation d'animaux : Plusieurs strat?gies sont appliqu?es afin de limiter le nombre d?animaux utilis?s : ? Suivi longitudinal par imagerie non invasive : L?utilisation de l?imagerie permet de suivre la croissance tumorale au cours du temps chez un m?me animal, ?vitant ainsi la constitution de groupes distincts pour chaque point temporel. ? Optimisation du design exp?rimental : Les groupes exp?rimentaux ont ?t? limit?s au strict n?cessaire (contr?le, effet pr?coce, effet tardif), permettant de r?pondre aux objectifs scientifiques sans multiplication des conditions. ? Standardisation des proc?dures : L?utilisation de lign?es cellulaires bien caract?ris?es et d?un mod?le murin homog?ne permet de r?duire la variabilit? interindividuelle et donc le nombre d?animaux n?cessaires pour atteindre une significativit? statistique. ? Mutualisation des pr?l?vements : Les tissus collect?s ? la fin des exp?riences seront utilis?s pour plusieurs types d?analyses (histologie, immunofluorescence, cytom?trie en flux, analyses mol?culaires), permettant de maximiser les donn?es obtenues ? partir de chaque animal. ? Partage des ?chantillons biologiques : Les tissus non utilis?s pour les analyses principales pourront ?tre conserv?s et mis ? disposition d?autres projets de recherche, contribuant ainsi ? limiter le recours ? de nouveaux animaux. M?thodes statistiques Les donn?es seront analys?es ? l?aide de tests statistiques adapt?s, notamment : ? comparaisons de moyennes entre groupes (tests param?triques ou non param?triques selon la distribution des donn?es), ? analyses de croissance tumorale (mod?les longitudinaux ou analyses de variance pour mesures r?p?t?es), ? analyses de survie si applicable
Raffinement
Toutes les proc?dures potentiellement douloureuses sont r?alis?es sous anesth?sie adapt?e : ? anesth?sie par isoflurane pour l?injection tumorale, les injections d?anticorps monoclonaux et les examens d?imagerie, ? anesth?sie g?n?rale pour la radioth?rapie, garantissant une immobilit? compl?te. Une analg?sie syst?matique par morphine ou d?riv? est instaur?e de mani?re pr?ventive d?s l?apparition d?une tumeur palpable et poursuivie jusqu?? la fin de l?exp?rience. Elle pourra ?tre adapt?e en fonction de l??valuation clinique (fr?quence et dose ajust?es si signes d?inconfort). Les injections intrap?riton?ales sont r?alis?es avec : ? utilisation d?aiguilles de petit calibre, ? respect des volumes recommand?s, ? contention douce et rapide. Une surveillance clinique rapproch?e est mise en place tout au long de l??tude : ? suivi quotidien de l??tat g?n?ral, ? pes?e r?guli?re (au minimum 2 ? 3 fois par semaine, voire quotidienne en phase critique), ? ?valuation du comportement (activit?, posture, interactions), ? surveillance de la prise alimentaire et hydrique, ? suivi de la taille tumorale et de son aspect (ulc?ration, n?crose, saignement, infection). Compte tenu de la localisation tumorale dans la cavit? orale, des mesures sp?cifiques sont mises en place de mani?re pr?coce : ? alimentation enrichie et ramollie (gel nutritif, p?t?e) d?s l?apparition de la tumeur, ? acc?s facilit? ? l?eau (biberons adapt?s, gels hydratants), ? r?hydratation sous-cutan?e si n?cessaire, ? adaptation de l?environnement avec une liti?re douce ? base de cellulose pour limiter les irritations et les risques de plaies. Ces mesures visent ? maintenir un ?tat nutritionnel et hydrique satisfaisant et ? limiter la douleur li?e ? la mastication. Une d?marche d?am?lioration continue est mise en place pendant toute la dur?e du projet : ? ?changes r?guliers avec le v?t?rinaire r?f?rent et la structure de bien-?tre animal, ? r??valuation des protocoles en fonction des observations cliniques, ? veille scientifique et technique pour identifier des m?thodes moins invasives ou plus efficaces en termes de raffinement. Toute am?lioration valid?e (optimisation de l?analg?sie, ajustement des points limites, am?lioration des conditions d?h?bergement ou des techniques exp?rimentales) sera int?gr?e en cours de projet, dans le respect des objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris est l?esp?ce la plus appropri?e pour r?pondre aux objectifs de ce projet. Mod?le largement utilis? et valid? en canc?rologie, elle permet l??tude du d?veloppement tumoral dans un organisme immunocomp?tent. Les souris poss?dent un syst?me immunitaire bien caract?ris?, comparable dans ses grands principes ? celui de l??tre humain, permettant d?analyser les interactions entre cellules tumorales, microenvironnement stromal et r?ponse immunitaire. Des mod?les tumoraux adapt?s ? ces souris assurent une bonne reproductibilit?. Aucune autre esp?ce ne permet actuellement de reproduire de mani?re aussi fiable ces interactions complexes tout en limitant les nuisances. La souris est par ailleurs adapt?e aux proc?dures pr?vues (imagerie in vivo, injections, radioth?rapie), r?alisables sous anesth?sie avec un bon niveau de ma?trise. Sa robustesse et sa tol?rance aux manipulations permettent un suivi pr?cis. Ainsi, son utilisation repr?sente le meilleur compromis entre pertinence scientifique et bien-?tre animal. Les animaux utilis?s dans ce projet sont des souris au stade adulte, ?g?es de 8 ? 12 semaines au d?but des proc?dures exp?rimentales. L'utilisation d'animaux adultes est scientifiquement indispensable pour plusieurs raisons : 1. Maturit? des syst?mes : ? cet ?ge, le syst?me immunitaire et le syst?me nerveux p?riph?rique sont pleinement d?velopp?s et fonctionnels. Comme notre ?tude porte sur les interactions complexes entre les nerfs, les cellules immunitaires de l'organisme et les cellules de soutien de la tumeur, il est crucial d'?tudier un organisme dont les fonctions biologiques sont stabilis?es et comparables ? celles d'un patient humain adulte. 2. R?ponse aux traitements : La r?action des tissus ? la radioth?rapie est influenc?e par la maturit? cellulaire. L'utilisation de souris adultes permet de mod?liser fid?lement la r?ponse clinique observ?e chez les patients atteints de cancers de la bouche et de la gorge. 3. Tol?rance aux interventions : Les souris adultes pr?sentent une meilleure tol?rance physiologique aux anesth?sies r?p?t?es n?cessaires pour le traitement et l'imagerie, ce qui participe au raffinement des proc?dures en limitant les risques de complications pr?coces.
Biologie des ?pith?liums cili?s
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Sédatées dans un bain de benzocaïne puis injectées d'hormone gonadotropine sous la peau, des xénopes femelles sont massées le lendemain pour leur faire pondre, à raison de deux injections par an et de deux à trois massages par semaine d'expérimentation. 120 xénopes sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans mise à mort prévue : au-delà de dix-huit injections reçues depuis la naissance, une femelle est gardée en aquarium jusqu'à sa mort naturelle, sinon elle repart dans une autre procédure. Les embryons obtenus servent à étudier la formation de l'épithélium muco-cilié, un tissu que le porteur rapproche de celui des voies respiratoires humaines. Il déduit l'absence de souffrance de la ponte elle-même, écrivant que "la quantité et qualité des œufs est le signe de bien-être des animaux" et que les femelles "ne montrent aucun signe de douleur (cris, débattements)".
Objectifs
Ce projet vise ? comprendre les m?canismes de formation de l??pith?lium muco-cili?, un tissu essentiel pr?sent dans plusieurs organes humains, comme les voies respiratoires, le cerveau et les organes g?nitaux. Ce tissu est compos? de cellules s?cr?trices de mucus et de cellules multicili?es, qui forment une barri?re protectrice contre les pathog?nes et les polluants. Un dysfonctionnement dans sa mise en place peut entra?ner des pathologies graves, comme les ciliopathies, des maladies li?es ? des d?fauts de la ciliog?n?se (processus de formation des cils). Bien que la ciliog?n?se soit un processus biologique central pour le d?veloppement et le fonctionnement des organismes, certaines de ses ?tapes restent mal comprises. Cela limite la mise au point de traitements efficaces, notamment pour les maladies respiratoires chroniques, o? la r?g?n?ration de l??pith?lium muco-cili? est cruciale pour am?liorer les sympt?mes. L?embryon de x?nope est un mod?le id?al, car son ?piderme est un ?pith?lium muco-cili? tr?s similaire ? celui des voies respiratoires humaines. Chez le x?nope, cet ?pith?lium se d?veloppe pendant l?embryogen?se, recouvre l?embryon pr?coce et est compos? des m?mes types cellulaires (cellules s?cr?trices et multicili?es). Nous nous concentrerons ces 5 prochaines ann?es sur plusieurs m?canismes cl?s comme la r?partition r?guli?re des cellules multicili?es dans l??pith?lium, la diff?renciation des diff?rents types cellulaires (s?cr?trices et multicili?es) et l??tablissement d?un flux liquidien g?n?r? par le battement coordonn? des cils (qui recouvrent l?embryon). Comprendre ces m?canismes permettrait d?avancer vers des th?rapies cibl?es pour les maladies li?es aux dysfonctionnements de cet ?pith?lium, comme certaines maladies respiratoires chroniques.
Bénéfices attendus
Notre objectif ? long terme est de d?crypter les m?canismes mol?culaires et cellulaires qui r?gissent la formation, l'organisation et le fonctionnement de l'?pith?lium mucociliaire, afin d'en ?tablir une mod?lisation compl?te et applicable ? l'Homme.
Procédures
Les x?nopes femelles seront soumises ? une injection d'hormone gonadotropine par jour d'exp?rimentation puis mass?es le lendemain. Ces injections seront au nombre de deux par an et les massages de deux ? trois par semaine d'exp?rimentation.
Impact sur les animaux
La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les ans. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv? pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sous cutan?e seront l?g?rement s?dat?es puis seront plac?es dans le noir (avec un papier absorbant humide sur les yeux par exemple) pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements) lors des injections.
Devenir
? l'issue de la proc?dure, soit la femelle a re?u depuis sa naissance moins de 18 injections et elle est vou?e ? entrer dans une autre proc?dure, soit elle a atteint les 18 injections max et elle sera conserv?e en aquarium jusqu'? sa mort naturelle.
Remplacement
Notre ?quipe a mis au point une lign?e cellulaire stable de foie de xenope. Ces cellules sont capables de produire des centaines de cellules multicili?es sous l?induction d?un g?ne indispensable ? la multiciliog?se. Cette lign?e cellulaire nous permet de tester et appr?cier les effets en amont de drogues et ainsi de r?duire le nombre d?embryons utilis?s. Par contre ces cellules n?ont pas la capacit? de battement ciliaire coordonn?. Elles ne peuvent donc pas reproduire ce flux biologique puissant et indispensable ? la survie de l?embryon.
Réduction
La r?duction du nombre d'animaux se fait par la r?utilisation des femelles tous les 6 mois. Celles-ci produisant des ?ufs et de qualit?s montrent qu'elles ont retrouv?es pleinement leur ?tat de sant? et de bien-?tre g?n?ral. En effet la quantit? et qualit? des ?ufs est le signe de bien-?tre des animaux. Les femelles avant l'injection sont l?g?rement s?dat?e (niveau I) dans un bain de benzoca?ne ? 240mg/L et lors de l?injection sous cutan?e, elles sont plac?es dans le noir pour limiter leur stress, elles ne montrent aucun signe de douleur (cris, d?battements).
Raffinement
Pour limiter le stress des femelles, g?n?r? par la pr?hension, nous les anesth?sions dans un bain de benzoca?ne ? 240 mg/L entre 7 et 8 minutes ce qui permet d?atteindre le stade I de s?dation (l?g?re anesth?sie caract?ris?e par un retard du r?flexe de retournement, un d?lai dans le r?flexe de fuite et un tonus musculaire l?g?rement relax). Les femelles sont ensuite plac?es sur un linge humide recouvrant ?galement leurs yeux, ainsi plac?es dans l?obscurit?, elles sont plus calmes.
Choix des espèces
L'esp?ce Xenopus Laevis est un organisme mod?le important dans la recherche en biologie depuis un demi-si?cle. La documentation disponible et la large communaut? scientifique en font un mod?le amphibien de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caract?ristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'oeufs, temp?rature, etc.) de cette esp?ce permettent de pr?senter l'ensemble des manipulations ?l?mentaires r?alis?es lors des proc?dures exp?rimentales mises en oeuvre dans les projets de recherche. Les femelles doivent ?tre matures sexuellement soit des animaux ag?s de 2 ? 8 ans (l'animal a une longue dur?e de vie et la qualit? des ovocytes n'est pas alt?r?e). Nos recherches se feront sur les embryons de x?nopes, dans les soixante-douze premi?res heures de leur vie (avant le stade larvaire autonome). ? ce stade ils sont recouverts d'un ?pith?lium muco-cili? qui leur permet de lutter contre les agressions ext?rieures. Ce tissu ?tant tr?s proche de l'?pith?lium de la trach?e, l'embryon de x?nope est un mod?le de choix pour nos recherches.
F?condation : Etude des m?canismes de fusion spermatozo?de-ovocyte et de blocage de la polyspermie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
1 074 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et tuées douze heures après la seule intervention du projet. Cette intervention tient en deux injections d'hormones à 48 heures d'intervalle, chacune demandant d'immobiliser la souris une minute dans la main, pour déclencher une superovulation et récupérer trois à quatre fois plus d'ovocytes qu'un cycle spontané. Le projet cherche à comprendre comment un spermatozoïde fusionne avec un ovocyte et comment celui-ci bloque ensuite l'entrée des suivants, question que le porteur relie aux faibles taux de réussite de l'assistance médicale à la procréation. Des cultures cellulaires et des membranes artificielles seront employées quand c'est possible, mais le porteur écrit que "la production de gamètes in vitro n'est pas possible" à ce jour.
Objectifs
Chez l?homme, comme chez tous les mammif?res, la f?condation repose sur une r?gle simple : un ovocyte doit fusionner avec un seul spermatozo?de, puis emp?cher toute fusion suppl?mentaire. Si plusieurs spermatozo?des fusionnent avec l?ovocyte, cela ne donne pas des jumeaux, mais une situation pathologique appel?e polyspermie, incompatible avec un d?veloppement normal de l?embryon. Malgr? des d?cennies de recherche, on comprend encore mal comment cette fusion se produit et comment l?ovocyte bloque ensuite l?entr?e d?autres spermatozo?des. Ce manque de connaissances limite notre capacit? ? expliquer certaines infertilit?s et ? am?liorer les outils de diagnostic et les traitements. Dans un contexte o? l?infertilit? est de plus en plus fr?quente et o? les techniques d?assistance m?dicale ? la procr?ation progressent peu en termes de taux de succ?s, mieux comprendre ces m?canismes est devenu un enjeu important. Dans ce contexte, notre projet vise ? ?tudier, chez la souris, comment le spermatozo?de et l?ovocyte fusionnent, et comment l?ovocyte emp?che ensuite toute fusion suppl?mentaire.
Bénéfices attendus
On estime qu'une personne sur six en France est confront?e ? un probl?me d?infertilit? et a recours ? une assistance m?dicale pour concevoir un enfant. Pourtant, les causes de l'infertilit? restent encore mal connues, et les techniques d'assistance m?dicale ? la procr?ation affichent des taux de r?ussite faibles : un quart seulement des cycles d'AMP aboutissent ? une naissance. Ceci constitue une charge importante en raison de la lourdeur des traitements, du risque ?lev? de fausse couche, et des co?t ?lev?s de chacun de ces traitements (5000 euros par cycle d?aide m?diclae ? la procr?ation). Les r?sultats de ce projet contribueront de mani?re significative ? l?avanc?e des connaissances fondamentales en biologie de la reproduction, en r?v?lant certains des m?canismes qui r?gissent la fusion des gam?tes et le blocage de la polyspermie. Cette avanc?e constitue ?galement un levier essentiel pour am?liorer les outils diagnostiques et orienter le d?veloppement de strat?gies th?rapeutiques plus cibl?es. En permettant d?identifier plus pr?cis?ment certaines causes d?infertilit?, notamment celles li?es ? des d?fauts de fusion gam?tique ou de blocage de la polyspermie, ce projet ouvre la voie ? des approches plus rationnelles et potentiellement moins invasives en assistance m?dicale ? la procr?ation.
Procédures
Les souris vigiles seront soumises ? deux injections d'hormones r?alis?es ? 48 h d'intervalle pour stimuler l?ovulation. Chaque injection requiert d?immobiliser la souris dans sa main pendant environ une minute. 12 h apr?s la seconde injection, les souris sont euthanasi?es par une m?thode r?glementaire.
Impact sur les animaux
Lors des injections d?hormones, les animaux vigiles pourront subir un stress d? ? la contention et ? la faible douleur lors du franchissement de la peau par l?aiguille. La procedure d'injection, de courtes dur?es (1 minute de contention, et quelques secondes d'injection), ne sont a priori pas de nature ? provoquer de douleur forte ou durable.
Devenir
Tous les animaux soumis ? l'unique proc?dure de ce projet (superovulation) seront euthanasi?s 12h apr?s la proc?dure pour pr?l?vement des ovocytes. Une intervention chirurgicale pour pr?lever les ovocytesdu vivant de l'animal serait inutilement traumatisante pour l'animal puisqu'il ne pourrait plus reservir pour l'?tude et devrait donc ?tre euthanasi?.
Remplacement
Chaque fois que cela sera possible, des approches alternatives seront privil?gi?es, incluant des mod?les in vitro cellulaires ainsi que des syst?mes synth?tiques non cellulaires, tels que des membranes artificielles. Ces approches permettront notamment d??tudier de mani?re cibl?e les interactions entre prot?ines gam?tiques, sans recours direct aux gam?tes. Cependant, les gam?tes constituant les cellules ? l?origine du processus de f?condation, leur utilisation demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. ? ce jour, la production de gam?tes in vitro n?est pas possible, ce qui ne permet pas de s?affranchir totalement du recours au mod?le animal. N?anmoins, le projet est con?u conform?ment aux principes des 3R, avec une r?duction maximale du nombre d?animaux utilis?s et un remplacement partiel d?s que les mod?les alternatifs sont scientifiquement pertinents.
Réduction
La proc?dure de superovulation mise en ?uvre dans ce projet permet de synchroniser l?ovulation et d?augmenter le nombre d?ovocytes r?cup?r?s d?un facteur 3 ? 4 par rapport au cycle spontan?. Elle contribue ainsi ? r?duire le nombre de souris n?cessaires ? la r?alisation des f?condations in vitro sur lesquelles repose le projet. Le nombre d?animaux a ?t? optimis? afin de limiter au maximum leur utilisation, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour l?analyse des six volets de l??tude. Au total, 1 074 animaux sont pr?vus sur une dur?e de cinq ann?es de recherche.
Raffinement
La proc?dure de superovulation par injection intrap?riton?ale d'hormones ?tant class?e l?g?re, elle est ? priori peu douloureuse. Toutefois deux injections ?tant n?cessaires ? 48h d?intervalle, elles seront r?alis?es ? deux endroits diff?rents, dans le but de minimiser la douleur ressentie par la souris en ne repiquant pas une deuxi?me fois une zone potentiellement encore endolorie suite ? la premi?re injection. Quant ? la souffrance et ? l?angoisse ?ventuelles g?n?r?es par cette proc?dure, elles sont minimis?es par la dur?e courte des 2 interventions (1 minute de contention, et quelques secondes d'injection les deux fois) et un retour imm?diat dans leur cage avec leurs cong?n?res apr?s intervention. Les souris sont ? un maximum de 5. Par ailleurs, l?enrichissement syst?matique des cages avec du papier kraft permet ? la souris de retrouver rapidement un environnement r?confortant apr?s la p?riode de stress subi. Les cages se trouvent en portoirs ventil?s. Les conditions d'h?bergement des animaux respectent les r?gles en vigueur : temp?rature (22 degr?s Celsius) et humidit? (55 pourcents) contr?l?es, intensit? et dur?e d'?clairage (7h-19h) avec acc?s ? l'eau et ? l'aliment ad libitum.
Choix des espèces
La souris est un mammif?re pr?sentant de fortes homologies avec l?homme en ce qui concerne les m?canismes d?interaction des gam?tes et de blocage de la polyspermie. Les mol?cules identifi?es ? ce jour dans ces processus sont conserv?es entre les deux esp?ces. Les r?sultats obtenus dans le cadre de ce projet chez la souris seront donc pertinents pour l?homme. Par ailleurs, la souris constitue le mod?le de r?f?rence pour l??tude des processus impliqu?s dans la f?condation. Cet animal se distingue par sa petite taille et son cycle reproductif rapide. Il s?agit d?un animal particuli?rement adapt? aux modifications g?n?tiques, et les lign?es transg?niques n?cessaires ? notre ?tude sont d?j? disponibles chez la souris. Les souris seront utilis?es entre l??ge de 5 semaines et 6 mois. 5 semaines correspondent ? l??ge minimum auquel les souris donnent des ovocytes matures permettant des rendements de f?condation in vitro satisfaisants. A partir de 6 mois, la qualit? des ovocytes peut s'av?rer moins bonne et donner de moins bons r?sultats de f?condation in vitro.
Etude de la morphog?n?se du syst?me nerveux au cours du d?veloppement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Des femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et y introduire du matériel génétique par électroporation, d'autres reçoivent des injections quotidiennes pendant six jours sur souris vigile. 3 388 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux et les fœtus sont placés sous anesthésie générale sans réveil pour le prélèvement du cerveau, une mise à mort que le porteur qualifie d'"indispensable" faute d'imagerie atteignant la résolution cellulaire voulue. La chirurgie des mères est donnée pour "environ 45 minutes" dans la description des procédures, et "limitée à 30 minutes maximum" dans celle des mesures de raffinement.
Objectifs
Comment se construit notre c?blage c?r?bral ? Vous ?tes-vous d?j? demand? comment les milliards de cellules de notre cerveau parviennent ? se ranger exactement au bon endroit pour nous permettre de penser, de bouger ou de ressentir ? Tout se joue avant la naissance. Au stade embryonnaire, de jeunes cellules (les futurs neurones) naissent et entreprennent un v?ritable voyage pour rejoindre leur destination finale dans le syst?me nerveux. Pour se guider dans ce labyrinthe, ces cellules utilisent des signaux chimiques appel?s morphog?nes. Imaginez ces signaux comme des phares dont l'intensit? diminue avec la distance : selon qu'une cellule per?oit un signal fort ou faible, elle sait o? elle se trouve et ce qu'elle doit faire. Cependant, nous ignorons encore comment ces cellules apprennent ? interpr?ter ces messages qui changent tout au long de leur croissance. L'objectif de notre projet est de comprendre comment les cellules nerveuses modifient leur mani?re de r?pondre ? ces signaux pour construire une architecture c?r?brale parfaite. Pour cela, nous utilisons des outils biologiques pour introduire avec une pr?cision chirurgicale des instructions g?n?tiques dans certaines cellules. Cela nous permet d'activer ou d'?teindre certains g?nes interrupteurs. Les ciseaux g?n?tiques (CRISPR) : Nous modifions l'ADN pour observer comment une petite modification change le comportement de la cellule et son d?placement. Pourquoi est-ce important ? Comprendre ces m?canismes, qui restent encore aujourd'hui un myst?re pour la science, est essentiel. De nombreuses maladies, comme les troubles du spectre autistique, les malformations du cerveau ou certaines d?ficiences intellectuelles, trouvent leur origine dans un bug lors de ce voyage des cellules. En d?couvrant comment le syst?me nerveux se construit normalement, nous posons les bases de futurs traitements capables de r?parer ou de pr?venir ces anomalies pr?coces.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche explore les myst?res de la fabrication du syst?me nerveux. Gr?ce ? des technologies de pointe, nous voulons comprendre comment les cellules s'organisent pour cr?er un cerveau fonctionnel. 1. Une meilleure connaissance de nos origines (Court terme) Le cerveau se construit gr?ce ? des signaux complexes que les cellules doivent apprendre ? lire. En utilisant des outils de pr?cision, nous pouvons modifier localement certains g?nes. Cela nous permet d'identifier les moments cl?s o? une cellule d?cide de se d?placer ou de se transformer. L'objectif est de passer d'une simple observation ? une compr?hension r?elle du mode d'emploi du cerveau. 2. Des pistes pour soigner les maladies (Long terme) M?me si les retomb?es m?dicales prendront du temps, elles sont porteuses d'espoir : a) Comprendre les causes : Beaucoup de maladies (autisme, ?pilepsie, malformations) naissent d'un probl?me durant le d?veloppement de l'embryon. Nos travaux permettront de comprendre l'origine de ces troubles. b) R?parer avant la naissance : En testant ces outils g?n?tiques, nous pr?parons les traitements du futur. ? terme, il pourrait devenir possible de corriger des d?fauts de d?veloppement tr?s t?t. c) Nouvelles cibles : Nous identifierons des prot?ines cl?s qui serviront de cibles pour de futurs m?dicaments ou des outils de diagnostic.
Procédures
Des femelles gestantes peuvent ?tre soumises ? une chirurgie abdominale sous anesth?sie g?n?rale d'une dur?e d'environ 45 minutes. Une injection d'analg?sique est administr?e avant l'intervention, et un traitement analg?sique est poursuivi 24 ? 48 heures. Par ailleurs, d?autres femelles re?oivent ?galement des injections de substances sur animal vigile, d'une dur?e d'environ 30 secondes, en une fois ou quotidiennement pendant six jours. En fin de protocole, les souriceaux ou f?tus sont places sous anesth?sie g?n?rale sans r?veil avec et un traitement analg?sique, par une proc?dure d'environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en p?riode post-op?ratoire, correspondant ? la cicatrisation. L?anesth?sie utilis?e peut induire dans de rare cas une hypothermie, une d?tresse respiratoire, voire un arr?t cardiorespiratoire. L?injection d?agents pharmacologiques peut induire une p?ritonite au niveau du site d?injection. Enfin, la manipulation r?p?t?e des animaux peut provoquer un stress.
Devenir
L'ensemble des animaux utilis?s dans ce projet seront euthanasi?s ? l'issue des proc?dures. Cette euthanasie est indispensable car les objectifs scientifiques reposent sur l'analyse des tissus c?r?braux embryonnaires et postnataux, qui ne peuvent ?tre pr?lev?s que post mortem. Aucune technique d'imagerie non invasive ne permet aujourd'hui d'atteindre la r?solution cellulaire n?cessaire pour ?tudier le d?veloppement cortical chez la souris. Les analyses r?alis?es comprennent des coupes histologiques, des marquages par immunofluorescence, des dosages de lipides c?r?braux, des analyses d'expression g?nique et du s?quen?age ? l'?chelle cellulaire. Toutes ces approches requi?rent l'acc?s direct au tissu c?r?bral.
Remplacement
Pourquoi ne peut-on pas se passer d'animaux ? Avant d'utiliser des animaux, nous avons examin? toutes les alternatives possibles. Malheureusement, aucune ne permet de r?pondre ? nos questions. Notre projet cherche ? comprendre comment les cellules s'organisent pour construire un cerveau fonctionnel. Ce processus repose sur des signaux chimiques qui se diffusent dans les tissus, sur des interactions complexes entre diff?rents types de cellules (neurones, cellules de soutien, vaisseaux sanguins), et sur une architecture en trois dimensions qui se met en place progressivement au cours de la grossesse. Or, les cultures de cellules en laboratoire, bien qu'utiles pour ?tudier des m?canismes isol?s, ne reproduisent ni cette organisation spatiale, ni ces interactions entre cellules. Les organo?des c?r?braux cultiv?s en laboratoire, repr?sentent une avanc?e prometteuse, mais ils ne poss?dent ni vaisseaux sanguins fonctionnels, ni l'organisation rigoureuse du cerveau r?el selon ses diff?rents axes. Ils ne permettent pas non plus d'?tudier les ?changes entre la m?re et l'embryon, notamment le passage de substances ? travers le placenta, qui est au c?ur de notre second volet de recherche. La mod?lisation informatique nous aide ? formuler des hypoth?ses, mais elle doit imp?rativement ?tre confront?e ? la r?alit? biologique pour ?tre valid?e. Le recours ? la souris est donc indispensable. C'est le mod?le de r?f?rence pour l'?tude du d?veloppement c?r?bral : sa grossesse est courte, son cerveau se d?veloppe de mani?re tr?s similaire ? celui de l'homme, et il existe des outils de manipulation g?n?tique ?prouv?s et sp?cifiquement adapt?s ? cette esp?ce. C'est le seul mod?le qui nous permet d'observer la construction du cerveau dans un organisme vivant complet, tout en restant au plus proche de la physiologie humaine.
Réduction
Comment avons-nous r?duit le nombre d'animaux au strict minimum ? Le nombre d'animaux a ?t? calcul? avec soin pour chaque exp?rience, en s'appuyant sur notre exp?rience pass?e et sur des m?thodes statistiques adapt?es. Pour la premi?re partie du projet, qui consiste ? modifier l'activit? de certains g?nes dans le cerveau d'embryons, la technique utilis?e ne fonctionne correctement que dans environ un tiers des cas. Nous avons tenu compte de ce taux de r?ussite pour calculer le nombre d'embryons n?cessaires, en veillant ? disposer de suffisamment d'animaux pour obtenir des r?sultats fiables sans en utiliser plus que n?cessaire. Par ailleurs, cette technique permet de tester le r?le d'un g?ne directement chez l'embryon, ce qui ?vite de cr?er des lign?es de souris g?n?tiquement modifi?es (une approche qui n?cessiterait beaucoup plus d'animaux sur plusieurs g?n?rations). Pour la seconde partie du projet, o? nous ?tudions l'effet d'un traitement sur la fabrication du cholest?rol dans le cerveau embryonnaire, nous avons adopt? une m?thode statistique avanc?e qui permet d'analyser chaque embryon individuellement tout en tenant compte du fait que les embryons d'une m?me m?re ne sont pas totalement ind?pendants. Cette approche nous a permis de r?duire de pr?s de moiti? le nombre de m?res n?cessaires par rapport ? une m?thode classique. De plus, nous analysons syst?matiquement tous les embryons de chaque port?e : aucun animal euthanasi? n'est perdu ou inutilis?, ce qui est en accord avec le principe de r?duction. Le nombre total d?animaux de ce projet est 3388.
Raffinement
Comment prenons-nous soin des animaux ? Tout au long du projet, nous mettons en ?uvre des mesures pour minimiser la douleur, le stress et l'inconfort des animaux. Toutes les interventions chirurgicales sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale, avec un traitement contre la douleur administr? avant, pendant et apr?s l'op?ration. Un anesth?sique local est ?galement appliqu? au niveau de l'incision. Pendant l'op?ration, la temp?rature corporelle de l'animal est maintenue gr?ce ? un tapis chauffant, et les yeux sont prot?g?s par un gel pour ?viter le dess?chement. La dur?e de la chirurgie est limit?e ? 30 minutes maximum. Apr?s l'op?ration, les animaux sont plac?s sur un tapis chauffant pour leur r?veil et surveill?s ?troitement deux fois par jour pendant 48 heures. Un aliment enrichi est mis ? leur disposition d?s la veille de l'intervention. Pour les injections quotidiennes (seconde partie du projet), nous utilisons des aiguilles tr?s fines et une technique adapt?e aux femelles en gestation, afin de rendre le geste le plus bref et le moins stressant possible. Chaque manipulation dure moins de deux minutes. Dans les deux cas, les animaux sont h?berg?s dans des conditions optimales : cages ventil?es, liti?re adapt?e, mat?riel de nidification, temp?rature et humidit? contr?l?es. Les femelles en gestation b?n?ficient d'un compl?ment alimentaire. Une grille de suivi du bien-?tre est appliqu?e quotidiennement : poids, ?tat du pelage, comportement, signes de douleur. Tout animal pr?sentant des signes de souffrance significatifs est imm?diatement pris en charge ou, si n?cessaire, exclu du protocole et euthanasi? de mani?re rapide et indolore afin de lui ?viter toute souffrance prolong?e.
Choix des espèces
Chez la souris, la gestation est courte et chaque port?e compte beaucoup de petits. Autre avantage : au sein d'une m?me port?e, on trouve ? la fois les souris que l'on veut ?tudier (dites mutantes) et leurs fr?res et s?urs normaux (les contr?les). Comparer des animaux issus de la m?me port?e rend les r?sultats plus fiables, car ils partagent le m?me patrimoine g?n?tique et le m?me environnement. Le d?veloppement du cerveau de la souris est par ailleurs tr?s bien connu, ce qui facilite les ?tudes d'anatomie et de fonctionnement et aide ? rep?rer des effets nets et reproductibles. Surtout, la formation du syst?me nerveux chez l'embryon de souris ressemble beaucoup ? celle de l'humain : c'est ce qui en fait un excellent mod?le pour comprendre ce qui se passe chez nous. Pour ?tudier le r?le des g?nes pendant cette formation, nous utilisons l'?lectroporation. C?est une technique mise au point chez la souris qui permet d'introduire du mat?riel g?n?tique directement dans le cerveau de l'embryon. La m?thode est simple, rapide et efficace, elle ab?me peu les cellules, et elle pr?sente un avantage ?thique majeur : en traitant environ 6 embryons par port?e, elle n?cessite beaucoup moins d'animaux adultes que la cr?ation d'une lign?e g?n?tiquement modifi?e classique. Nous examinerons ensuite les effets de ces modifications ? plusieurs moments du d?veloppement : soit chez l'embryon (aux 14ieme, 15ieme et 16ieme jours de gestation), soit chez le souriceau apr?s la naissance. Ce suivi ? diff?rents stades est indispensable, car les mol?cules que nous ?tudions (les morphog?nes et leurs r?cepteurs) ne jouent pas le m?me r?le d'un stade ? l'autre : leur action ?volue au fil du d?veloppement. Il faut donc observer chaque ?tape pr?cis?ment pour comprendre l'ensemble de leurs fonctions.
Etude de l?impact d?un perturbateur endocrinien de la famille des fluorofactants sur la d?my?linisation et la remy?linisation chez le mod?le murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées à l'acide perfluorooctanesulfonique dans leur eau de boisson du quinzième jour de gestation au vingt-et-unième jour après la naissance, des souris femelles transmettent ce polluant à leurs petits. Devenus adultes à 90 jours, une partie de ces souriceaux reçoit pendant six semaines une molécule mélangée à une nourriture en poudre pour détruire leur myéline, avec perte de poids, baisse d'activité et risque de défaut d'usure des dents, puis deux séances d'IRM d'une heure sous anesthésie générale. 276 souris sont utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin pour les prélèvements de tissus, le porteur précisant que les mères ne peuvent pas être réutilisées "en raison de leur exposition à l'acide perfluorooctanesulfonique (PFOS)".
Objectifs
La scl?rose en plaques est une maladie du syst?me nerveux qui touche de plus en plus de personnes dans les pays d?velopp?s. Elle se caract?rise par une d?gradation progressive de la my?line, une substance qui entoure les fibres nerveuses et permet la transmission rapide des signaux dans le cerveau et la moelle ?pini?re. Si les causes exactes de cette maladie ne sont pas encore compl?tement connues, certains facteurs environnementaux pourraient jouer un r?le dans son apparition ou son aggravation. Ce projet vise ? ?tudier si une exposition pr?coce ? un type de polluants chimiques tr?s r?pandus dans notre quotidien, appel?s PFAS (utilis?s par exemple dans les rev?tements antiadh?sifs ou les textiles d?perlants), peut perturber la formation ou la r?paration de la my?line. Ces polluants, tr?s persistants dans l?environnement, s?accumulent facilement dans les tissus gras comme la my?line, ce qui pourrait en fragiliser la structure et nuire ? son bon fonctionnement. Nous chercherons d?abord ? comprendre si l?un de ces compos?s, le PFOS, influence la formation de la my?line chez le souriceau apr?s une exposition pendant la gestation et l?allaitement. Nous ?tudierons ensuite si cette exposition pr?coce entra?ne des effets durables ? l??ge adulte, en particulier sur la stabilit? de la my?line et sa capacit? ? se r?parer. Pour cela, nous analyserons si le PFOS s?accumule dans les r?gions riches en my?line dans le cerveau et si cela modifie sa composition, en utilisant des m?thodes de pointe bas?es sur la chimie analytique. Les r?sultats pourraient aider ? mieux comprendre comment certains polluants environnementaux influencent le d?veloppement c?r?bral et participent ? des maladies neurod?g?n?ratives comme la scl?rose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d?apporter de nouvelles connaissances sur les effets potentiels d?une exposition pr?coce ? certains polluants pr?sents dans notre environnement sur la sant? du cerveau. En particulier, il pourrait aider ? mieux comprendre si et comment une exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS), pendant la grossesse et les premi?res semaines de vie, perturbe la formation et la stabilit? de la gaine de my?line, qui prot?ge les fibres nerveuses. Une telle alt?ration pourrait rendre le syst?me nerveux plus vuln?rable ? certaines maladies, comme la scl?rose en plaques. Les r?sultats attendus pourraient permettre de mieux identifier les m?canismes par lesquels ces substances chimiques peuvent affecter durablement le fonctionnement du cerveau. Le projet permettra aussi de d?terminer ? partir de quelle concentration ces effets apparaissent chez la souris, ce qui est important pour ?valuer les risques pour la sant? humaine. Enfin, ces travaux pourraient alimenter des recommandations de sant? publique concernant l?exposition des femmes enceintes et des jeunes enfants ? ce type de polluants, et contribuer ? la compr?hension des maladies li?es ? une alt?ration de la my?line.
Procédures
Les femelles gestantes expos?es recevront de l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) dans leur eau de boisson entre le quinzi?me jour de gestation et le vingt-et-uni?me jour post-natal. Une partie des souriceaux obtenus suite ? cette exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) recevra ? l??ge adulte et pendant 6 semaines une mol?cule dans leur nourriture afin d?induire une d?my?linisation. Une partie d?entre eux aura ensuite une imagerie par r?sonance magn?tique sous anesth?sie g?n?rale (60 minutes maximum, deux fois) pour suivre l??tendu des l?sions de la my?line.
Impact sur les animaux
Le mod?le de d?my?linisation pourra provoquer de mani?re temporaire une perte de poids ou une baisse d?activit? chez les animaux. La modification de la texture de l?alimentation (poudre) pourra induire un risque de d?faut d?usure des dents des animaux. L?anesth?sie g?n?rale n?cessaire pour la r?alisation de l?imagerie par r?sonance magn?tique sera associ?e ? des risques d?hypothermie, de s?cheresse oculaire et de difficult?s cardiaque et respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasi?s en fin de proc?dure d?une part parce que des pr?l?vements de tissus post-mortem et des analyses sont n?cessaires pour r?pondre ? notre question scientifique. D?autre part les femelles ne pourront pas ?tre r?utilis?es en raison de leur exposition ? l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS).
Remplacement
Avant de recourir ? des exp?riences sur des animaux vivants, plusieurs ?tudes en laboratoire ont ?t? men?es sur des cellules en culture et des tissus isol?s du cerveau, ainsi que sur un mod?le animal alternatif, le t?tard de x?nope. Ces approches ont permis de d?montrer que l?acide perfluorooctanesulfonique (PFOS) perturbe la formation et la r?paration de la my?line ? court terme. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire les conditions r?elles d?exposition, comme cela peut survenir pendant le d?veloppement chez un individu vivant. Ils ne permettent pas non plus d??tudier l?accumulation du polluant dans le cerveau ni ses effets ? long terme sur la structure de la my?line. Nous aurons donc recours ? la souris, une esp?ce chez laquelle la composition de la my?line est bien connue, ce qui permet de faire des analyses pr?cises et fiables. Ce choix s?appuie directement sur les limites identifi?es dans nos approches pr?c?dentes. Il s?agit d?un prolongement n?cessaire pour r?pondre ? une nouvelle question scientifique, en s?appuyant sur un mod?le physiologique complet. Le recours ? l?animal est donc justifi? ici puisque les autres mod?les ne permettent pas de r?pondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d?animaux par groupe a ?t? optimis? en s?appuyant sur nos exp?riences ant?rieures, avec un effectif r?duit mais suffisant pour obtenir des r?sultats robustes et tenir compte de la variabilit? biologique entre individus. Les groupes exp?rimentaux incluent ? chaque fois des m?les et des femelles, ce qui permet d??valuer les ?ventuelles diff?rences li?es au sexe sans multiplier le nombre d?animaux. Le protocole inclut une r?partition ?quilibr?e entre m?les et femelles, afin d??viter d?avoir ? multiplier les groupes dans des exp?riences distinctes. Au total, 276 souris seront utilis?es dans ce projet. Ce chiffre tient compte d?une l?g?re marge de s?curit? pour pallier la variabilit? naturelle du nombre de petits par port?e notamment. L?ensemble de ces choix refl?te un souci constant de limiter l?utilisation d?animaux tout en garantissant la qualit? scientifique des donn?es. Pour analyser nos r?sultats sans compromettre la pr?cision statistique, nous utiliserons une m?thode adapt?e aux petits ?chantillons qui garantira la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
Les animaux b?n?ficieront d?un enrichissement de leur environnement (carr? de coton, b?tonnets de bois ? ronger). Ils seront observ?s quotidiennement par l??quipe zootechnique et 2 fois par semaine minimum par notre ?quipe. En cas d'anomalie celle-ci sera g?r?e en collaboration entre notre ?quipe, la Structure charg?e du Bien Etre Animal (SBEA) et le v?t?rinaire afin de mettre en place une prise en charge adapt?e pour l?animal. Des points limites sont d?finis et seront respect?s pour ?viter toute souffrance animale. Les femelles gestantes et en lactation d?un m?me groupe de traitement seront plac?es en duo par cage, afin d??viter tout isolement social, favoriser les comportements naturels de nidification et permettre une entraide maternelle pendant la lactation. Apr?s deux jours d?acclimatation, valid?s par le SBEA, l?exposition d?butera au quinzi?me jour de gestation (jour embryonnaire 15, E15). Cette organisation permet de garantir la gestation des femelles tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires au projet. Ce sch?ma exp?rimental a d?j? ?t? utilis? sans effet d?l?t?re observ? chez les femelles gestantes ni sur le d?veloppement des port?es. Elles seront pes?es ? leur arriv?e puis 5 jours apr?s afin de suivre le bon d?roul? de la gestation mais ne seront pas plus manipul?es afin de r?duire au maximum le stress g?n?r? par les manipulations. A leur naissance, une v?rification visuelle des petits sera r?alis?e pour s?assurer de leur bonne prise en charge par leur m?re puis ils seront pes?s 1 ? 2 fois par semaine ? partir de 7 jours d??ge afin de nous assurer qu?ils ne pr?sentent pas de croissance anormale et, ou, difficult?s ? s?alimenter. A partir de leur sevrage ils seront peser et et surveiller hebdomadairement en plus de l?observation quotidienne. Pendant la d?my?linisation, l??tat g?n?ral et le poids des animaux seront surveill?s 1 fois par semaine minimum. Une transition alimentaire sera assur?e sur 48h pour que les animaux s?habituent ? la nourriture en poudre et un enrichissement suppl?mentaire sera ajout? dans la cage pour qu?ils puissent assurer leur comportement naturel de rongeur (ajout de b?tonnets de bois ? ronger suppl?mentaires). Lors des imageries, les animaux seront plac?s sous anesth?sie g?n?rale. Leur temp?rature corporelle sera maintenue pendant l'anesth?sie et un gel ophtalmique sera appliqu? pour ?viter toute s?cheresse oculaire. Nous v?rifierons la profondeur de l'anesth?sie et les surveillerons jusqu'? leur r?veil complet.
Choix des espèces
L?esp?ce choisie pour ce projet est la souris, qui est largement utilis?e en recherche scientifique. Ce mod?le pr?sente de nombreux avantages, tant sur le plan scientifique que pratique. Sur le plan scientifique, la souris est l?un des organismes les mieux connus : son g?nome a ?t? enti?rement s?quenc?, et de nombreux m?canismes li?s au d?veloppement du cerveau, ? la formation de la my?line et aux effets des substances polluantes ont ?t? d?crits. C?est ?galement l?esp?ce de r?f?rence pour l??tude des effets des perturbateurs endocriniens et pour l?analyse fine de la composition en lipides de la gaine de my?line. Enfin, elle est particuli?rement adapt?e pour l?utilisation du mod?le de d?my?linisation choisi ici et valid? pour ?tudier les m?canismes de perte et de r?paration de la my?line. Tous les protocoles que nous utilisons sont bien ma?tris?s pour cette esp?ce, ce qui r?duit les risques de complications et favorise son bien-?tre. Les animaux seront utilis?s ? diff?rents stades de d?veloppement, selon les objectifs de chaque exp?rience. Les femelles gestantes seront de jeunes adultes ?g?es d?environ trois mois afin d??tre sexuellement matures. L?exposition au PFOS sera faite ? partir du 15e jour de gestation jusqu?au 21e jour apr?s la naissance, ce qui correspond ? une p?riode particuli?rement sensible du d?veloppement c?r?bral. Pour les animaux expos?s pendant la gestation nous r?aliserons ensuite nos analyses ? diff?rents stades : tout d?abord 21 jours d??ge, un stade o? la formation de la my?line atteint un pic important chez la souris, cela permettant de mesurer pr?cis?ment l?accumulation du polluant et ses effets pr?coces. Puis dans un deuxi?me temps ? 90 jours d??ge, un stade adulte permettant d??valuer si les effets de l?exposition pr?coce persistent ? long terme, lorsque le cerveau a atteint un stade de maturit?. Pour le mod?le impliquant une d?my?linisation celle-ci sera r?alis?e ? partir de ce stade de 90 jours et pendant 6 semaines pour induire la perte de my?line, suivi d?une p?riode d?une semaine de r?cup?ration afin d??tudier les m?canismes de r?paration naturelle de cette gaine nerveuse.
Etudes précliniques non-réglementaire d’une immunothérapie pour le traitement de l’endométriose
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système urogénital
Toutes les souris subissent un prélèvement de tissu à la queue sous anesthésie gazeuse, puis 219 d'entre elles une laparoscopie pour greffe orthotopique de lésions d'endométriose, un suivi hebdomadaire en imagerie et une prise de sang toutes les deux semaines. De la troisième à la huitième semaine, huit souris sont tuées chaque semaine pour observer la croissance des cellules, et 195 autres reçoivent une greffe suivie de gavages et d'injections à différentes posologies. 1 146 souris sont utilisées au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, modéré et sévère, toutes tuées par cohortes pour prélever utérus, estomac, foie et poumons. Le médicament testé a d'abord été mis au point contre des tumeurs cancéreuses, le porteur espérant "pouvoir traiter d'autres pathologie grâce à notre traitement", et le résumé n'explique nulle part comment il aboutit à l'effectif de 1 146 souris.
Objectifs
L’endométriose est une maladie chronique qui se caractérise par la présence de tissu semblable à l’endomètre en dehors de l’utérus, notamment sur les ovaires, les trompes ou le péritoine. Ce tissu réagit aux variations hormonales du cycle menstruel, ce qui peut provoquer des inflammations, des douleurs pelviennes intenses, des règles très douloureuses, de la fatigue et parfois des difficultés à concevoir. Souvent mal diagnostiquée en raison de la diversité et de la banalisation de ses symptômes, l’endométriose peut pourtant avoir un impact important sur la qualité de vie. Cette maladie touche environ 10 % des femmes et personnes menstruées en âge de procréer, ce qui représente environ 190 millions de personnes à l’échelle mondiale selon l’OMS. En France, la maladie concerne environ 1,5 à 2,5 millions de femmes en âge de procréer, soit près d’une femme sur dix. Il n’existe pas encore de traitement curatif de l’endométriose, seulement plusieurs options permettant de soulager les symptômes, ralentir l’évolution et améliorer la qualité de vie. Les options sont les traitements hormonaux visant à bloquer ou diminuer les règles, car les lésions d’endométriose réagissent aux hormones, les traitements antidouleur ou la chirurgie. Nous avons mis au point plusieurs médicaments qui ciblent directement un marqueur de surface surexprimé par les cellules des lésions d’endométriose. Nous voulons apporter la preuve que ce médicament peut diminuer via le système immunitaire les lésions, voir les éliminer totalement et maintenir ensuite une stabilité normale de l’endomètre..
Bénéfices attendus
Nous développons une nouvelle approche thérapeutique qui montre des résultats prometteurs dans la réduction des tumeurs locales du cancer. Les lésions d’endométrioses surexpriment le marqueur ciblé par notre médicament. Nous espérons donc pouvoir traiter d’autres pathologie grâce à notre traitement. Cette nouvelle thérapie pourra aider toutes les patientes atteintes d’endométriose et qui n’ont actuellement aucun traitement de disponible.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèvent de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie. 219 animaux vont avoir une injection intrapéritonéale. Chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 195 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal. 219 animaux vont avoir une laparoscopie pour la greffe orthotopique. Parmi, ces animaux chaque semaine, ils seront suivis en imagerie. Ils auront également un prélèvement de sang toutes les 2 semaines. Dès la 3ème semaine et jusqu’à la 8ème, 8 animaux seront euthanasiés par semaine pour observer la croissance cellulaire. Pour les tests d’efficacité du médicament, 195 animaux recevront une greffe. Pour chaque groupe, différentes posologies de traitements par gavage et/ou injections seront administrées. Le suivi sera réalisé en imagerie et par observation quotidienne de l’état général des animaux en accord avec une grille de score et le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les gestes de chirurgie entraînent au réveil des animaux de l'inconfort et du stress malgré la prise en charge de la douleur avec l'analgésie et des anti-inflammatoire. Cette douleur résultante peut être observée pendant 48h. Un léger stress sera observé sur les animaux sur la durée de la contention comme lors des gavages. Un léger stress sera observé lors des prélèvements sanguins sous anesthésie à l’isoflurane (induction à 3% puis maintien à 1,5%) ainsi que lors de l’anesthésie pour les observations en échographie où lors de l’implantation de l’implant hormonal avec légère douleur sur la zone d’implantation pendant quelques heures.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (uterus,estomac, foie, poumon…) pour observer la présence de cellules au niveau de ces organes. En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau des lésions mais aussi des autres organes permettant de valider l’action des anticorps médicaments
Remplacement
Les tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement (reconnaissance du marqueur, recrutement et activation des cellules immunes par notre molécule, induction de la mort cellulaire tumorale) cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire des lésions d’endométriose est primordial et la voie d’administration sur la biodistribution de notre molécule. En effet, le traitement testé a besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement aux lésions d’endométriose.).
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les procédures 2 et 3 permettront de déterminer la vitesse de croissance et le temps nécessaire pour une greffe orthotopique de cellules de lésions d’endométriose. Ces procédures nous permettront de limiter le nombre d’animaux dans la procédure tout en garantissant que ceux greffés et sélectionnés correspondent aux critères de l’étude et donc seront analysables à la fin de la procédure..
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimation à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Les procédures de chirurgie seront réalisées selon les dernières recommandations de l’afstal 2025 avec une anesthésie stable et contrôlée en isoflurane (3% induction puis maintien à 1,5%) avec prise en charge multimodale de l’analgésie avec buprénorphine, alpha2 agoniste et anesthésie locale. L’asepsie sera la plus importante possible. La gestion de l’analgésie post-opératoire sera stricte et suivie pour éviter toute douleur aux animaux. Un échange sera fait avec l'équipe de soigneur pour optimiser les soins en post-opératoire (éviter tout mouvement ou changement de cage aux animaux durant cette période, apport d'eau et nourriture gélifiée, augmentation des enrichissements de type nid pour conserver sa température). Tout au long des procédures de chirurgie et d’imagerie les animaux seront maintenus sur tapis chauffant à 37°C. Pour éviter toute sécheresse oculaire du gel ophtalmique de cyclosporine sera appliqué. L'apport de l'imagerie optique par bioluminescence dans le suivi du développement tumoral permet aussi de s'inscrire dans une démarche de raffinement puisque cet outil permet de réaliser un suivi de paramètres intrinsèques de manière très peu invasive pour les animaux. Durant toute la procédure, les animaux seront étroitement surveillés en applicant le suivis des points limites grâce à la grille de score mise en place pour ce projet.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux seront greffés entre 2 mois et demi et 4 mois car ces animaux possèdent un système immunitaire déficient qui peut se réactiver avec l’âge (supérieur à 6 mois) entrainant une prise de tumeur impossible.
Exploration de la plasticit? synaptique et de l?inflammation apr?s un AVC chez la souris adulte_MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 souris âgées de 16 à 24 semaines subissent une chirurgie de 45 minutes sous anesthésie générale destinée à provoquer un accident vasculaire cérébral dans une région précise du cortex, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite tuées par perfusion intracardiaque sous anesthésie, leur cerveau étant découpé en tranches pour analyse. Le projet est présenté comme une étude pilote : il s'agit de vérifier si un infarctus provoqué dans une zone donnée modifie aussi des régions qui ne lui sont pas directement connectées, une étude complète devant suivre si l'hypothèse se confirme. Le porteur écrit que cette méthode "typiquement ne s'accompagne pas de symptômes majeurs, ce qui rend le modèle facilement utilisable et limite la souffrance animale", tout en prévoyant douleur et perte de poids après la chirurgie, avec une évaluation quotidienne de la douleur pendant deux jours.
Objectifs
Les accidents vasculaires c?r?braux (AVC) sont une cause majeure de d?ficits moteurs ? long-terme et de d?ficits cognitifs. Certains sympt?mes se manifestent tardivement et ne sont pas forc?ment li?s ? la r?gion initialement l?s?e, sugg?rant qu?un AVC dans une r?gion sp?cifique peut aussi causer des modifications dans d?autres r?gions du cerveau. Des alt?rations dans des r?gions directement connect?es ? la zone infarcie ont d?j? ?t? corr?l?es ? l?apparition de troubles tardifs. Cependant, les r?gions associ?es aux fonctions impact?es (les fonctions de m?moire par exemple) ne sont pas toujours directement connect?es ? la r?gion l?s?e. Nous ?mettons donc l?hypoth?se que des modifications pourraient donc ne pas se restreindre aux r?gions connect?es ? l?infarctus primaire mais s??tendre spatialement et temporellement dans le cerveau. Dans cette ?tude pilote, nous voulons induire un AVC limit? ? une r?gion pr?cise du cerveau d?un mod?le murin afin d??tudier l?impact de la l?sion dans d?autres r?gions du cerveau, pas directement connect?es ? la zone infarcie. Si notre hypoth?se est confirm?e, nous aurions identifi? un des m?canismes qui pourraient sous-tendre la manifestation de sympt?mes fonctionnellement li?s ? des zones non connect?es dans un mod?le murin.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider notre observation pr?liminaire qui vise ? mieux comprendre les m?canismes sous-tendant les troubles de m?moire qui se manifestent tardivement apr?s un AVC, m?me quand la r?gion initialement l?s?e n?est pas impliqu?e dans les fonctions mn?siques. Nous ?mettons l?hypoth?se que l?alt?ration d?un m?canisme cellulaire associ? ? la m?moire ainsi qu?un ?tat inflammatoire pourraient ?tre pr?sents dans des r?gions non directement connect?es ? la zone infarcie. Si notre hypoth?se est confirm?e, nous effectuerons une ?tude compl?te qui pourrait avoir des r?percussions positives sur la recherche pr?-clinique s?int?ressant aux troubles cognitifs post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis ? une chirurgie peu invasive pour induire l?AVC sous anesth?sie g?n?rale (environ 45 minutes). Ils seront enfin soumis ? une perfusion intracardiaque toujours sous anesth?sie g?n?rale (20 minutes). Tous les animaux sont concern?s.
Impact sur les animaux
La m?thode utilis?e induit un infarctus cortical limit? et typiquement ne s?accompagne pas de sympt?mes majeurs, ce qui rend le mod?le facilement utilisable et limite la souffrance animale. Cependant, suite ? la proc?dure chirurgicale, une douleur ainsi qu?une perte de poids peuvent survenir. Les animaux seront observ?s quotidiennement pendant deux jours. La douleur sera ?valu?e jusqu?? J2 apr?s chirurgie selon une grille d??valuation, organis?e selon 5 grands crit?res : apparence physique, comportement non provoqu?, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l?aspect de la plaie. Si apr?s deux jours l?animal ne montre aucun signe de souffrance, il sera suivi ensuite une fois par semaine. En cas de d?t?rioration ou de souffrance animale, l?animal sera pris en charge par l?utilisateur ou par la v?t?rinaire.
Devenir
A l?issue de toutes les exp?riences, les animaux ne seront pas gard?s du fait des techniques/proc?dures subies et seront de ce fait mis ? mort.
Remplacement
L?AVC sera induit par la m?thode la moins invasive disponible actuellement pour reproduire certain aspects de la pathologie humaine. Aujourd?hui ils n?existent pas des mod?les in vitro (cultures cellulaires, organo?des) pour ?tudier des cons?quences anatomiques et cellulaires induites par un AVC dans les r?gions non l?s?es initialement et donc pas de m?thode alternative permettant de REMPLACER les animaux. En effet, cette ?tude n?cessite la complexit? et la connectivit? du cerveau adulte.
Réduction
Le nombre de souris a ?t? ?valu? sur la base de travaux pr?c?dents en tenant compte des divers probl?mes que nous pourrions rencontrer au cours des diff?rentes phases exp?rimentales (probl?mes au cours de la chirurgie, la perfusion,des exp?riences d??lectrophysiologie et d?immunohistochimie), ainsi que de la variabilit? des r?sultats. Le d?roulement des exp?riences est organis? afin de limiter au maximum le nombre d?animaux. Nous adapterons d?abord le protocole afin d?avoir une l?sion initiale reproductible, de taille maximale limit?e au cortex, et seulement ensuite les autres exp?riences seront r?alis?es.
Raffinement
Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la dur?e du projet. Les animaux seront h?berg?s au sein d'un ?tablissement utilisateur agr?? dans des conditions d?h?bergement favorisant leur bien-?tre. Ils seront plac?s dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 animaux par cage. Ils seront stabul?s dans une animalerie thermor?gul?e avec hygrom?trie. L?acc?s ? la nourriture et ? l?eau sera ad libitum et un changement de liti?re sera effectu? chaque semaine. Dans une ?tude pr?c?dente, le nombre d?animaux qui ont montr? des signes de souffrance d? ? l?induction de l?AVC ?tait tr?s limit? (moins de 3%). Nous nous attendons ? ce que la l?sion soit plus petite avec un temps d?illumination plus court et donc que ce pourcentage se rapproche de z?ro. Si l?animal pr?sente des signes de douleur au cours de l?exp?rimentation, l?animal sera pris en charge par l?exp?rimentateur. Si nous n?observons pas d?am?lioration de l??tat de l?animal, nous ferons intervenir la v?t?rinaire responsable.
Choix des espèces
Le mod?le envisag? a d?j? ?t? induit chez la souris et il a ?t? d?montr? que les AVC s?accompagnaient de modifications dans des structures du cerveau pas initialement l?s?es, mais connect? ? la r?gion infarcie. Ce mod?le permet de produire des tranches de cerveau pour r?aliser des ?tudes d??lectrophysiologie et d?immunohistochimie afin d?explorer des modifications dans d?autres r?gions du cerveau pas encore ?tudi?es. Nous utiliserons des souris ?g?es de 16-24 semaines. Cette tranche d??ge permet d??tudier les cons?quences d?un AVC chez un animal adulte et correspond ? un jeune adulte chez l?homme.
Maintien et cr?ation de lign?es de poisson-z?bre pour l??tude de g?nes responsables de formes rares de surdit? cong?nitale
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
Les poissons-zèbres de ces lignées portent des mutations responsables de formes rares de surdité humaine, et le porteur prévoit chez eux des malformations de la mâchoire gênant le nourrissage, des malformations des extrémités des membres, une nage circulaire et des difficultés à tenir une posture horizontale. 3 500 poissons-zèbres sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le seul geste décrit est le prélèvement d'un bout de nageoire caudale, une fois, en moins d'une minute, sous anesthésie et analgésie, l'analgésie étant maintenue 48 heures. Les individus qui ne portent ni la mutation ni le transgène sont tués dès le résultat du génotypage, les porteurs servant à la reproduction jusqu'à ce que leur descendance soit elle-même en capacité de se reproduire, moment où ils sont tués à leur tour.
Objectifs
Ce projet vise ? ?tudier, dans le mod?le du poisson-z?bre, des g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. Il a pour but de d?crypter les m?canismes pathologiques et d?ouvrir de nouvelles perspectives diagnostiques et th?rapeutiques. Le s?quen?age et l'analyse du g?nome chez des familles de patients a permis d'identifier diff?rentes mutations impliqu?es dans des formes rares de surdit? isol?e ou syndromique (associ?e ? d?autres signes cliniques). Des lign?es mod?les de poissons-z?bres permettant d?analyser l?impact de ces mutations sur le d?veloppement de l'oreille interne et sur l'audition seront cr??es et maintenues. Des lign?es transg?niques permettant de suivre le devenir de certains types cellulaires et de mesurer l'activit? de voies de signalisation au cours du d?veloppement de l'oreille interne seront utilis?es.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la fonction de g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. En permettant l?identification des g?nes impliqu?s et le d?cryptage des m?canismes pathologiques qui en d?coulent, il permettra d?am?liorer le diagnostique g?n?tique et d?identifier de potentielles approches th?rapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- pr?l?vement d'un petit bout de nageoire caudale sous anesth?sie et sous analg?sie: 1 fois, < 1 min
Impact sur les animaux
- anesth?sie : stress - pr?l?vement de nageoire caudale : douleur l?g?re soulag?e par l'analg?sie - isolement : stress - malformations de la m?choire : difficult? de nourrissage - malformation des extr?mit?s des membres : difficult? de maintien de posture et de locomotion - troubles ?ventuels du d?veloppement pouvant induire un stress
Devenir
Proc?dure 1 : les individus non porteurs de la mutation ou du transg?ne seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les individus porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction. Proc?dure 2 : - durant les 4 premi?res g?n?rations faisant suite ? la cr?ation du mod?le, tous les individus seront conserv?s en 2 lots (non porteur vs porteur de la mutation) pour le suivi du ph?notype dommageable. - ? partir de la 5?me g?n?ration, les individus non porteurs de la mutation seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les animaux porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction.
Remplacement
Le projet vise ? mieux comprendre comment l'oreille interne se forme pendant le d?veloppement embryonnaire, aussi bien dans des conditions normales que lorsqu?elle est touch?e par des maladies g?n?tiques rares. Ce processus est tr?s complexe et d?pend de nombreux facteurs, comme les interactions avec d?autres parties du cerveau et les influences de l?environnement. A ce jour, il n?est pas encore possible de reproduire compl?tement ce d?veloppement in vitro en laboratoire, car il s?agit d?un ph?nom?ne d?licat et interconnect? qui s'organise selon une architecture tridimensionnelle tr?s complexe. ?tudier des organismes vivants reste essentiel pour avancer dans la compr?hension de ces maladies et imaginer de nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d?animaux n?cessaire pour ce projet a ?t? rigoureusement calcul? selon les exp?riences ant?rieures, afin de limiter leur utilisation tout en garantissant la r?alisation du projet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement adapt? et enrichi. Les poissons sont ?lev?s ? 28?C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/nuit de 14/10h. Le bien-?tre des animaux est assur? au quotidien, par un contr?le pr?cis des param?tres d?eau, de lumi?re et de temp?rature et une observation journali?re des poissons. Le milieu des poissons est enrichi avec l'apport de nourriture vivante stimulant l'instinct de pr?dation. Nous veillerons ?galement ? l'enrichissement social des poissons et nous veillerons ? une mise en reproduction r?guli?re. Pour ?viter toute douleur, les pr?l?vements de nageoire caudale sont r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie. A la suite du g?notypage, les poissons sont maintenus en analg?sie pendant 48h. Pour les lign?es nouvellement cr??es, l?apparition d?un potentiel ph?notype dommageable sera suivi lors de la croissance des premi?res g?n?rations. Du fait de l?implication des g?nes ?tudi?s dans le d?veloppement de l'oreille interne, les poissons des nouvelles lign?es g?n?r?es pourraient pr?senter des difficult?s sp?cifiques dans la locomotion ou le maintien de posture (nage circulaire, mobilit? restreinte, difficult?s ? maintenir une posture horizontale), qui pourraient perturber la capacit? des poissons ? s?alimenter ou g?n?rer un stress. Le comportement des animaux face ? la nourriture sera observ? quotidiennement par les zootechniciens, qui seront attentifs ? un amaigrissement des poissons et ? des signes comportementaux de stress (immobilit? prolong?e, nage uniquement en surface ou au fond du bac). Des points limites stricts et sp?cifiques au projet seront mis en place.
Choix des espèces
Le d?veloppement de l'oreille interne du poisson-z?bre est tr?s similaire ? celui de l?Homme, notamment en ce qui concerne les g?nes impliqu?s, les types cellulaires intervenant et leur organisation. Cette esp?ce pr?sente plusieurs avantages pour la recherche : elle est tr?s prolifique, se d?veloppe rapidement et permet d??tudier le d?veloppement de l'oreille interne sur les embryons aux stades 1-5 jours post-f?condation, en utilisant peu d?animaux adultes reproducteurs. Les pr?l?vements pour suivi g?n?tique des animaux seront r?alis?s chez les adultes.
Humanisation et analyse du syst?me immunitaire de souris [MODIFICATION]
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont l'état général se dégrade sévèrement, dont la douleur n'est plus contrôlée ou dont le score clinique dépasse les seuils fixés sont tuées. 45 000 souris sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré : 36 000 tuées et 9 000 réutilisées, dont celles dont le taux d'humanisation reste sous 25 %, orientées vers un projet de formation interne aux gestes techniques. Elles reçoivent, sur souris vigile, un agent qui détruit les cellules souches de leur moelle osseuse et provoque une "forte douleur abdominale", avant une greffe de cellules souches humaines, les nouveau-nés étant anesthésiés par hypothermie sur glace pendant dix minutes au maximum. Sur l'effectif, le porteur écrit : "Aucune approche statistique n'a été réalisée", l'estimation reposant sur le nombre d'études des années précédentes et sur une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de greffer des cellules souches sanguines humaines et leurs d?riv?es (cellules d?riv?es de cellules souches ou d?riv?es de populations sanguines y compris des cellules pluripotentes induites) chez des souris immunod?prim?es, et ainsi permettre la reconstitution et l?analyse d?un syst?me immunitaire humain (physiologique ou pathologique) et pouvant ?tre modifi? par traitement, en vue d?essais pr?clinique chez la souris.
Bénéfices attendus
En greffant des cellules souches humaines, ou leurs d?riv?es, ? des souris immunod?prim?es, nous pouvons reconstituer un syst?me immunitaire humain. Ce faisant, nous apportons un mod?le d??tude sp?cifique qui peut jouer un r?le essentiel dans la compr?hension et le traitement de pathologies d?importance, comme certaines infections virales (virus de l?immunod?ficience humaine (VIH) ou h?patites), de nombreux cancers ou des maladies inflammatoires (asthme).
Procédures
IDENTIFICATION SOUS ANESTHESIE GENERALE. EN FONCTION DES BESOINS EXPERIMENTAUX, UNE PUCE CLASSIQUE ET/OU UNE PUCE PERMETTANT LA MESURE DE LA TEMPERATURE CORPORELLE. EN CAS DE PERTE OU DE NON-FONCTIONNEMENT, NOUVELLE PUCE AVEC AU MAXIMUM DEUX PU?AGES PENDANT LEUR DUREE DE VIE. SI LA FREQUENCE DES MESURES EST LIMITEE, LA TEMPERATURE CORPORELLE POURRA ETRE MESUREE PAR VOIE RECTALE. Des pr?l?vements sanguins seront r?alis?s sur souris avec ou sans anesth?sies. Les volumes maximaux de pr?l?vements seront proportionnels au poids et ? l??ge de l?animal selon un sch?ma ?tabli et une limite fix?e sur une p?riode glissante de 14 jours. Une r?hydratation avec du s?rum physiologique sera r?alis?e si n?cessaire. La r?partition des pr?l?vements figurera dans le protocole de l??tude et sera contr?l? par un v?t?rinaire. Chaque pr?l?vement durera quelques secondes. Pour les analyses n?cessitant un volume plus important, un pr?l?vement terminal sous anesth?sie gazeuse sera r?alis?. L?anesth?sie des nouveau-n?s sera r?alis?e par hypothermie avec de la glace pendant maximum 10 minutes. Des pr?l?vements vaginaux pourront aussi ?tre pratiqu?s quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caract?riser le cycle ?stral. L?humanisation inclura l?administration d?un agent, d?truisant les cellules souches de la moelle osseuse, sur souris vigile, suivie d?une greffe de cellules souches sanguines sur souris vigiles ou nouveau-n?s sous anesth?sie sur glace. Ces interventions dureront de quelques secondes ? quelques minutes. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la dur?e de l??tude. Ces injections, administr?es uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les injections pourront ?tre r?p?t?es selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines proc?dures n?cessiteront des actes chirurgicaux pour l?implantation de dispositifs sous-cutan?s, r?alis?s sous anesth?sie gazeuse avec une analg?sie pr?op?ratoire et un suivi post-op?ratoire rigoureux. L?implantation durera moins de cinq minutes et pourra ?tre r?p?t?e selon les besoins de l??tude. ? l?issue des ?tudes, les animaux non int?gr?s aux essais pr?cliniques seront euthanasi?s selon les m?thodes r?glementaires. Toutes les interventions seront r?alis?es sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.
Impact sur les animaux
-[MODIFICATION] Identification par puce ?lectronique classique ou thermopuce : stress, g?ne, douleur dans les heures suivants l?injection. -[MODIFICATION] Prise de temp?rature rectale : stress transitoire, inconfort ou l?g?re douleur ? l?insertion du thermom?tre, risque minimal de blessure rectale. -Injection de l?agent my?loablatif : induit une forte douleur abdominale disparaissant en quelques heures. -Injection(s) de solution saline isotonique contenant des plasmides (pour favoriser le d?veloppement de populations immunitaires humaines d?int?r?t) : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une alt?ration marqu?e de l??tat g?n?ral, pendant les minutes suivants l?injection. Peut engendrer un h?matome. -Pr?l?vements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, h?morragie, un d?faut du syst?me d?anesth?sie / analg?sie (ex : la souris se r?veille en cours de proc?dure), un ?tat clinique d?t?rior? au r?veil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements : effets potentiellement toxiques des compos?s ? vis?es th?rapeutiques, h?matome, douleur, l?sion au site d?administration (notamment si administrations r?p?t?es) - Pr?l?vements sanguins : an?mie, h?matome, douleur, l?sion au site de pr?l?vement (notamment si pr?l?vement r?p?t?s). -Rasage et cr?me d?pilatoire : microl?sions, irritations cutan?es, g?ne (sensation de br?lure de la cr?me), inflammation transitoire. -Anesth?sie : risque d?hypothermie et de s?cheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en pr?vention). -Pr?l?vement d?urine et de f?ces : stress, g?ne voire potentiellement douleur si pr?sence de tumeurs au niveau abdominal. La manipulation chez le nouveau-n? pourrait engendrer le rejet de la m?re. Afin d??viter cela, des ?l?ments sont d?crits dans la proc?dure exp?rimentale. Des nuisances peuvent ?galement ?tre induites par le stress d? aux contentions. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivit?, une prostration ou des difficult?s ? se d?placer.
Devenir
Le processus d?humanisation pourra ?tre accompagn? d?une phase de modulation ou de renforcement in vivo du syst?me immunitaire humain en fonction des objectifs exp?rimentaux. Cette ?tape vise ? pr?parer les animaux aux ?tudes pr?cliniques envisag?es en optimisant la r?ponse immunitaire du mod?le humanis?. Les animaux n??tant pas jug?s comme aptes ? entrer en ?tude pr?clinique en projet de formation ou en projet de recherche interne seront euthanasi?s. C?est-?-dire les animaux avec un ?tat de sant? jug? moyen et/ou avis v?t?rinaire d?favorable. Dans le cadre d?une utilisation continue, pour r?aliser les ?tudes pr?cliniques, les animaux pourront ?tre int?gr?s aux autres projets autoris?s par le Minist?re dans l??tablissement utilisateur. Des souris issues de cette proc?dure pourront ?tre r?utilis?es dans le projet ? Formation interne aux proc?dures et gestes techniques appliqu?s aux souris ?, sous r?serve d?un avis v?t?rinaire favorable. Les animaux concern?s seront ceux ayant un taux d?humanisation < 25%. Un nouveau-n? mal humanis? pourra ?tre nouvellement humanis? en ?tant plus ?g?. La d?cision est prise par le v?t?rinaire.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisag?s si ceux-ci sont appropri?s. Dans le cadre d?une utilisation continue, les souris humanis?es seront impliqu?es dans des ?tudes de recherches pr?cliniques impliquants le syst?me immunitaire. Il n'est actuellement pas possible de recr?er in vitro un environnement complexe comme le syst?me immunitaire tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d?une mol?cule en d?veloppement. La souris constitue un mod?le scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le d?veloppement et la mise au point de th?rapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 45 000 souris seront utilis?es, couvrant [MODIFICATION] la dur?e du projet et permettant de r?aliser 720 ?tudes pr?cliniques de 50 souris, en se basant sur un taux de succ?s de l?humanisation de 80%. Aucune approche statistique n'a ?t? r?alis?e, l?estimation du nombre d?animaux est r?alis?e sur base du nombre d??tudes effectu?es les ann?es ant?rieures et anticipant une croissance chaque ann?e, en accord avec le plan commercial. Le nombre d?animaux utilis?s dans chaque ?tude sera r?duit au maximum.
Raffinement
Les souris seront h?berg?es pr?f?rentiellement par groupes sociaux stables compos?s de 5 individus ? partir du sevrage. Des compl?ments alimentaires pourront ?tre administr?s suivant l??tat de sant? des animaux (dietgel). La cage contiendra ? minima une couche de liti?re permettant aux souris de creuser, de se cacher et de r?aliser un nid, ?l?ment essentiel ? leur bien-?tre. Cette couche de liti?re pourra ?tre suppl?ment?e par un ?chantillon de liti?re provenant de cages m?les dans le but de synchroniser le cycle ?stral de la souris. En outre, des enrichissements de qualit? seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. ? leur entr?e dans l?animalerie, les souris b?n?ficieront d?une p?riode d?acclimatation de minimum 4 jours. Lors d?un changement de zone au sein de l?animalerie, les souris b?n?ficieront d?une p?riode d?acclimatation d?une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l?angoisse, une ?chelle de scores cliniques (pelage, mobilit?, ?tat g?n?ral, activit?, comportement etc) sera appliqu?e d?s le premier geste invasif ou d?s qu?un signe d?alt?ration est observ? lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques pr?ventifs et curatifs seront mis en ?uvre d?s que n?cessaire, sous avis v?t?rinaire notamment bupr?norphine 0,1 mg/kg (voie IP ou SC), administr?e avant intervention chirurgicale ou toute proc?dure potentiellement douloureuse. Un rappel sera envisag? toutes les 4?6h selon l??valuation. Le v?t?rinaire aura pleine autorit? pour euthanasier un animal pour raison ?thique ou mettre en ?uvre un traitement anti-douleur s?il/elle le juge n?cessaire. Les fr?quences sont limit?es et une r?hydratation est pr?vue pour tout pr?l?vement unique ? partir de 8 mL/kg. Les points limites d?clenchant l?euthanasie incluent : atteinte s?v?re de l??tat g?n?ral, douleur non contr?l?e, ou tout score clinique d?passant les seuils d?finis.
Choix des espèces
Le s?quen?age complet du g?nome de la souris a d?montr? la proximit? phylog?n?tique des souris et des humains : 90 % des g?nes humains ont un ?quivalent chez la souris, permettant d??laborer des approches g?n?tiques et fonctionnelles valides. Lorsque les g?nes orthologues produisent des effets diff?rents entre souris et humain, le remplacement dans le g?nome du g?ne de la souris par son ?quivalent humain ou de mani?re fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lign?e immunod?ficiente permet la cr?ation de lign?es humanis?es. Depuis de nombreuses ann?es, l'entreprise d?veloppe une expertise dans l?humanisation du syst?me immunitaire de multiples souches de souris, notamment les NCG, NXG, NOG et BRG. Fort de cette exp?rience, il est pertinent de poursuivre le processus d?humanisation sur cette m?me esp?ce. La proc?dure exp?rimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-n?s La proc?dure exp?rimentale requiert l'utilisation de souriceaux nouveau-n?s jusqu'? [MODIFICATION] jusqu'? l'?ge de 3,5 - 4,5 semaines, car leur immunit? immature favorise la prise de greffe et limite le rejet, garantissant ainsi une reconstitution optimale du syst?me immunitaire humain. ? cet ?ge, le thymus et la moelle osseuse offrent un environnement propice ? la maturation des cellules immunitaires humaines, permettant d'obtenir un mod?le plus fonctionnel et reproductible.
Imager les interactions claustro-corticales au cours des ?tats de conscience.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six examens d'imagerie de quatre heures au maximum, trois sur souris éveillée la tête fixée et trois sous anesthésie, après une à deux chirurgies crâniennes de quatre heures : 300 souris subissent ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que la contention de la tête peut provoquer des mouvements brusques, une locomotion anormale et une absence de toilettage, et que la chirurgie entraîne des douleurs modérées, une inflammation et une perte de poids pendant deux à trois jours. L'objectif est de mesurer en même temps l'activité d'une structure cérébrale profonde et celle des neurones du cortex, pendant l'éveil, le sommeil et l'anesthésie. La souris est retenue parce que le cortex y est conservé, alors qu'il est "absent ou très différent chez des organismes plus simples" comme C. elegans, la drosophile ou le poisson-zèbre.
Objectifs
Une petite structure profonde du cerveau projette vers de larges r?gions du cortex. Elle est impliqu?e dans des fonctions li?es ? l??veil, comme l?attention et la s?lection de l?information, et pourrait ?galement jouer un r?le dans les ?tats de conscience.Des travaux r?cents sugg?-rent qu?elle pourrait aussi intervenir dans la consolidation de la m?moire pendant le sommeil, en modulant l?activit? corticale lors du sommeil.Cependant, les interactions entre cette struc-ture et le cortex restent mal caract?ris?es. La plupart des ?tudes in vivo se limitent aux couches superficielles, sans prendre en compte les neurones des couches profondes. Or, des r?sultats r?cents sugg?rent l?existence de circuits parall?les reliant cette structure au cortex, avec des effets oppos?s selon la profondeur : inhibiteurs en surface et activateurs en profondeur.L?hypoth?se test?e est que ces circuits parall?les existent in vivo et permettent une modulation diff?renci?e de l?activit? corticale selon la couche et l??tat de vigilance.Gr?ce ? un microscope de pointe, l?activit? des projections de cette structure et celle des neurones corticaux seront mesur?es simultan?ment ? travers diff?rentes couches corticales, chez la souris, au cours de l??veil, du sommeil et de l?anesth?sie.Ce projet apportera une vision int?-gr?e des interactions entre cette structure et le cortex, ainsi que de leur r?le dans la dyna-mique corticale, avec des implications pour la compr?hension de la m?moire, de la cognition et des ?tats de conscience.
Bénéfices attendus
Ce projet fournira des donn?es in?dites sur la mani?re dont les noyaux c?r?braux profonds communiquent avec le cortex, et sur la fa?on dont ces ?changes ?voluent selon les ?tats de conscience : ?veil, sommeil et anesth?sie. Il permettra d'abord de cartographier pr?cis?ment les projections d'un de ces noyaux vers les diff?rentes couches corticales. Gr?ce ? l'optimisation d'une approche d'imagerie ? haute r?so-lution, il sera ensuite possible de suivre en temps r?el la dynamique de ces interactions noyau-cortex dans des conditions physiologiques. Au-del? de ces aspects m?thodologiques, l'?tude apportera des ?l?ments nouveaux sur le codage neuronal, en identifiant les conditions qui favorisent ou limitent la synchronisation entre ces structures. Ce m?canisme est susceptible de jouer un r?le dans la consolidation m?morielle et, plus largement, dans les fonctions cognitives. Enfin, en d?finissant pr?cis?ment comment ces noyaux influencent l'organisation de l'activit? corticale, ce projet posera les bases pour mieux comprendre - et ? terme peut-?tre mieux traiter- des troubles li?s ? la conscience ou ? la m?moire.
Procédures
Toutes les souris subiront une ? deux interventions chirurgicales sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie, permettant l?injection de marqueurs permettant d?identifier sp?cifiquement la struc-ture ?tudi?e (dur?e maximale : 4 heures par intervention). Chaque souris aura 3 examens d?imagerie en ?tant ?veill?e, 3 autres sous anesth?sie, d?une dur?e maximale de 4h, espac? entre 24 et 48h selon la dur?e de l?examen. Les souris seront ?galement occasionnellement expos?es ? une anesth?sie gazeuse de la m?me dur?e, ? r?cup?ration rapide, afin d?enregistrer l?activit? c?r?brale dans un ?tat de conscience alt?r?. Enfin, une chirurgie terminale sera r?alis?e sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie pour le pr?l?vement des tissus (dur?e maximale : 10 minutes).
Impact sur les animaux
D'une mani?re g?n?rale, les effets ind?sirables principaux attendus d?coulent de la chirurgie qui peut engendrer des douleurs mod?r?es, une inflammation et une perte de poids pendant 2-3 jours. Le mod?le de t?te fix?e peut induire un stress chez l'animal, qui pourraient se manifester par des mouvements brusques, une locomotion anormale et/ou une absence de toilettage.
Devenir
Tous les animaux sont mis ? mort pour pr?l?vement de tissus et analyse
Remplacement
Cette ?tude vise ? caract?riser in vivo les dynamiques complexes des r?seaux neuronaux, en particulier la connectivit? fonctionnelle entre une structure c?r?brale profonde et le cortex, ? travers les diff?rentes couches corticales et selon les ?tats de vigilance. Des travaux ant?rieurs in vitro sugg?rent l?existence d?une organisation fonctionnelle d?pendante de la couche, mais ces r?sultats n?ont pas encore ?t? valid?s in vivo, notamment dans les couches profondes. Le recours ? des approches alternatives ne permet pas de r?pondre ? ces questions. Les mod?les in vitro, bien qu?informatifs, ne reproduisent ni l?int?grit? des circuits ? longue dis-tance ni leur modulation par des ?tats c?r?braux globaux tels que l??veil, le sommeil ou l?anesth?sie. De m?me, les approches in silico ne permettent pas encore de simuler de ma-ni?re fiable la dynamique multi-?chelle d?un r?seau complet de ce type, en raison du manque de donn?es exp?rimentales contraignant ces mod?les. Dans ce contexte, l?utilisation d?un mod?le animal appara?t indispensable. Le mod?le murin permet de pr?server l?int?grit? anatomique et fonctionnelle des circuits neuronaux, tout en donnant acc?s ? l?enregistrement de leur activit? en temps r?el dans des conditions physiologiques et comportementales pertinentes.
Réduction
Le nombre d?animaux a ?t? d?termin? ? l?aide de calculs statistiques afin de garantir la robustesse des r?sultats tout en limitant leur nombre. Une approche s?quentielle sera mise en ?uvre, s?appuyant sur les r?sultats obtenus au cours des premi?res proc?dures pour ajuster et optimiser les suivantes, ?vitant ainsi l?utilisation d?animaux dans des conditions exp?rimentales non adapt?es. Par ailleurs, des enregistrements longitudinaux seront r?alis?s sur plusieurs sessions chez un m?me animal, permettant de maximiser la quantit? de donn?es recueillies et de r?duire le nombre total d?animaux n?cessaires. Les tissus seront syst?matiquement r?utilis?s pour des analyses anatomiques compl?mentaires, et le partage des donn?es brutes avec d?autres ?quipes sera encourag? afin de limiter le recours ? des exp?rimentations suppl?mentaires.
Raffinement
Si les animaux proviennent d?un ?tablissement agr?? ext?rieur, 2 semaines d?acclimatation aux nouvelles conditions d?animaleries sont pr?vues. Les souris sont h?berg?es en groupes sociaux dans des cages enrichies (mat?riel de nidifica-tion, b?tons ? ronger, tunnels) et font l?objet de suivis r?guliers de leur ?tat de sant?.Le change des cages se fait ? l?aide des tunnels. Les interventions invasives (chirurgies) sont r?alis?es sous anesth?sie profonde et analg?sie. La temp?rature corporelle des animaux est maintenue ? l?aide d?un tapis chauffant thermosta-t?. Apr?s chaque intervention, une p?riode de r?cup?ration post-op?ratoire est pr?vue, avec un suivi quotidien de l??tat de sant? ? l?aide de grille de score o? sont indiqu? des points limites pr?dictifs adapt?s permettant d?arr?ter la proc?dure d?s que n?cessaire. Pour les exp?riences impliquant un mod?le restreignant partiellement leurs mouvements, les animaux sont progressivement habitu?s ? l?exp?rimentateur et au site d?enregistrement afin de r?duire le stress li? ? cette posture. La dur?e de r?cup?ration post-session est adapt?e ? la dur?e de l?exp?rimentation : au moins 12 heures pour une session de moins d?une heure, 24 heures pour une session de deux heures, et 48 heures pour une session de plus de trois heures.
Choix des espèces
L?esp?ce animale choisie est la souris. La question scientifique ?tudi?e n?cessite un mod?le pr?sentant une structure neuroanatomique et des m?canismes physiologiques comparables ? ceux du cerveau humain. En particulier, le cortex, cible principale de la structure ?tudi?e, est conserv? chez la souris, mais absent ou tr?s diff?rent chez des organismes plus simples tels que C. elegans, la drosophile ou le poisson-z?bre. Le mod?le murin permet ainsi une approche cibl?e et pr?cise, tout en offrant une extrapolation possible ? d?autres esp?ces de mammif?res. L?ensemble des animaux sera utilis? ? un stade correspondant ? celui de ? jeunes adultes ?, avec des proc?dures d?butant entre 7 et 13 semaines. ? cet ?ge, le syst?me nerveux central est pleinement d?velopp?, garantissant la pertinence des observations exp?rimentales.