Recherche fondamentale

Placés quatre semaines dans un caisson d'hypoxie intermittente, huit à seize heures par jour pendant leur phase de sommeil, 434 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire chaque jour, une prise de sang entre le dix-huitième et le vingt-et-unième jour, puis une échographie de l'aorte sous anesthésie gazeuse après un transport entre deux établissements. Presque tous sont tués par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale pour récupérer leurs organes, quinze rats écartés en cours d'étude pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur justifie l'effectif en indiquant que le nombre d'animaux a été fixé à douze, sans dire comment on passe de ce chiffre aux 434 rats déclarés.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Greffées de cellules tumorales humaines dans le cerveau sous anesthésie générale, 135 souris femelles dépourvues d'une partie de leur système immunitaire reçoivent une lame de verre de 5 mm à la place d'un morceau de leur crâne. Elles passent ensuite une à deux séances d'imagerie par semaine, sous anesthésie à chaque fois, pendant six mois au plus, hébergées seules pour qu'elles ne rongent pas cette fenêtre crânienne. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur précise que ni la nanoparticule ni la radiothérapie évaluées ne sont administrées aux souris, l'irradiation étant faite sur cellules. Au terme des six mois, ou dès qu'un point limite est atteint, toutes sont tuées et leur cerveau prélevé.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales appelée glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. En clinique, actuellement le protocole de traitement de ces tumeurs cérébrales commence par une ablation chirurgicale, suivie de séances de radiothérapie et de chimiothérapie. En effet, dans la plupart des cas, l’ablation chirurgicale ne permet que de retirer partiellement la masse tumorale. Les cellules cancéreuses restantes après chirurgie sont ensuite traitées par radiothérapie et chimiothérapie. Ce projet se place dans le contexte clinique de traitement des tumeurs cérébrales, et plus particulièrement sur l’amélioration de l’efficacité du traitement par radiothérapie grâce à l’utilisation de nanoparticules. Dans ce projet nous chercherons à évaluer le potentiel thérapeutique de deux nanoparticules innovante (en cours de développement clinique), en association avec la radiothérapie, sur un modèle de tumeur cérébrale humaine. L’objectif du projet étant d'optimiser les modalités de traitement dans le traitement de tumeurs cérébrales. Nous utiliserons des techniques d’imagerie non invasive permettant notamment de réduire les souffrances de l’animal et de réitérer nos observations dans le temps sur un même animal.

Bénéfices attendus

Les nanoparticules que nous avons développées présentent de multiples intérêts. (1) elles permettront de décupler les effets toxiques du traitement de radiothérapie au sein de la tumeur (2) elles permettront un meilleur suivi par imagerie de la progression/régression tumorale au cours du traitement des patients L’objectif du projet étant ainsi d'optimiser les modalités de traitement des tumeurs cérébrales.

Procédures

-Procédure 1: Sous anesthésie générale, greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne (un lame de verre de 5 mm de diametre vient remplacer une partie du crane) : réalisée une fois au début de l'étude (durée de 30 min) - Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale sous anesthésie générale par des techniques d’imageries : réalisée 1 à 2 fois par semaine (durée 10 min) sur maximum 6 mois

Impact sur les animaux

Chirurgie opératoire classée modérée car la procédure est parfaitement maitrisée au sein de notre laboratoire, de plus nous utilisons des analgésiques pour limiter la souffrance des animaux et le traitement NPs + la radiothérapie n’est pas réalisée sur la souris mais effectuée sur cellules. Nous mettons en place des soins post-opératoire rigoureux. L’hébergement en cage individuelle après la chirurgie et durant tout le suivi par microscopie pour éviter que les animaux ne rongent la fenêtre crânienne ; ceci pouvant conduire à un stress des animaux par limitation des interactions sociales directes pour limiter cet effet indésirable nous accolerons les cages transparentes les unes aux autres ce qui permettra une communication visuelle entre les animaux. Suivi par imagerie classée légère : utilisation d'analgésiques pour limiter le stress de l’animal qui doit être maintenu immobile pour ne pas altérer la qualité des images.

Devenir

Procédure 1: Greffe cérébrale de cellules tumorales humaines avec pose de fenêtre crânienne : animaux gardé en vie. En effet, cette procédure ne menace pas leur intégrité physique et constitue le point de départ de notre étude. Procédure 2 : Observation de la croissance/régression tumorale par imagerie : animaux mis a mort à la fin de la période maximal de suivi soit 6 mois ou si un point limite est atteint. Les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélévé pour analyse macroscopique et histologique (mise en évidence des cellules tumorales en surface ou en profondeur).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque l’implantation de tumeurs cérébrales, la croissance ou la régression tumorale post-traitement dépend de phénomènes biologiques complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Les différents travaux déjà mener in vitro (sur cellules) et le désire d’évoluer vers la clinique implique une étude préclinique in vivo (sur un modèle animal) du protocole, ainsi que de disposer de tumeurs intracérébrales issues de cellules tumorales humaines pour se rapprocher au mieux de l’histologie tumorale retrouvée en clinique.

Réduction

L’utilisation du modèle de fenêtre intracrânienne permet le suivi sur plusieurs semaines sur un même animal de l’efficacité du traitement permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous pourrons suivre dans le temps sur chaque animal la croissance, la migration et la régression tumorale. Nous obtiendrons ces données sans avoir besoin de mettre à mort les animaux à différents temps. Cette procédure offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux car la prise d’image peut être réitérée au cours du temps.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d’une part lors de la procédure chirurgicale (analgésie avec réitération, opération sur tapis chauffant pour le maintien de la température corporelle, protection de la déshydratation oculaire par du gel ophtalmique, injection d’anti-inflammatoire pour éviter l’œdème cérébral, surveillance au réveil (vérification de l’alimentation et de l’hydratation)) ; Et d’autre part les jours suivant la chirurgie et jusqu’au sacrifice de l’animal (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) L'atteinte d'un point limite décrit dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier absorbant et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris nude (dépourvue d’une partie du sytème immunitaire) sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous privilégions des souris femelles plus sociables, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 7 à 9 semaines au moment de la chirurgie sont utilisées, à un stade où leur poids est suffisant compatible avec l'intervention

Toutes ayant reçu des cellules cancéreuses, aucune ne peut être gardée en vie selon le porteur : les 180 souris de ce projet seront tuées, leurs tumeurs analysées après la mort. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis une injection de traitement tous les deux jours pendant trois semaines. Trois à quatre fois par semaine, la tumeur est mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé, maintenu par contention. Le projet teste des promédicaments censés ne s'activer qu'en présence des fortes concentrations de radicaux oxygénés propres aux cellules cancéreuses, sans que le RNT nomme ces molécules ni précise le type de cancer greffé.

Objectifs

Les ROS (espèce réactives de l'oxygène) d'origine naturelle agissent comme des molécules de signalisation, par exemple pour stimuler la croissance des cellules. Cependant, lorsque la production de ROS augmente, des effets nocifs commencent à apparaitre sur des structures cellulaires importantes telles que les protéines, les lipides et les acides nucléiques. Les niveaux élevés de ROS sont une des caractéristiques typiques du cancer , ils favorisent la croissance et la progression de la tumeur. Mais, au-dessus d'un seuil ils deviennent toxique, le stress induit par les ROS peut entraîner l'apoptose ou la sénescence des cellules cancéreuses. Elles ont donc développé la capacité de s'adapter à des concentrations élevées de ROS en augmentant les niveaux d'antioxydants et donc à maintenir les niveaux de ROS en dessous d’un seuil toxique. Ces adaptations pouvent conduire à une résistance au traitement, entraînant ainsi une progression de la maladie ou une rechute. Des molécules thérapeutiques amplificatrices de ROS sont donc développées. Étant donné que les ROS sont hautement toxiques sur toutes les cellules, le défi dans l'application thérapeutique de ces médicaments est donc d'atteindre la spécificité des cellules cancéreuses pour éviter les effets néfastes attendus sur les cellules et les tissus normaux. Des agents ont été crées dans le but de s’activer uniquement en présence d’une concentration de ROS élevée, comme c'est le cas spécifiquement dans les cellules cancéreuses, et entraîner la mort de ces cellules. Nous souhaitons donc tester ces agents in vivo, pour vérifier leur effet ciblé anti-tumoral.

Bénéfices attendus

Les agents testés sont des promédicaments activés par les ROS. Les ROS sont surproduites par de nombreux cancers. Ainsi, ces agents peuvent tuer sélectivement les cellules cancéreuses. Nous souhaitons exploiter cette capacité afin de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques très ciblées avec le moins d'effet secondaire possible sur les cellules saines.

Procédures

Toutes les souris recevront des injections de cellules tumorales une fois sous anesthésie (une seule par souris). Cette procédure durera en moyenne 5 min. Par la suite, les souris seront manipulées tous les 2 jours, brièvement (1min) à chaque fois pour mesurer la croissance tumorale. Tous les animaux recevront 1 injection de traitement sous anesthésie locale tous les deux jours pendant 3 semaines (n=10). L’injection prend 1 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements intra péritonéaux par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 à 4 fois par semaine. Ces différentes manipulations pouvant entrainer une contrainte légère chez l’animal. La croissance des tumeurs en sous-cutané et les traitements chimiotherapeutiques peuvent entrainer des contraintes modérées dont une perte d’appétit et donc une perte de poids.

Devenir

Toutes les souris auront reçu des cellules cancéreuses, il n’est donc pas possible de les garder en vie à la fin de la procédure. L’analyse des tumeurs après traitement, post-mortem, nous informera sur la capacité de ces molécules à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenus in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes d'une taille permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Le calcul de puissance nous a permis de calculer le nombre de souris nécessaires par groupe. Nous regrouperons les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux témoins.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, pratique et éthique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

470 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant douze heures sur une grille en cage à métabolisme individuelle et subissant, lors des tests de tolérance au glucose, une piqûre à la queue toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié d'entre elles est ovariectomisée au cours d'une chirurgie de trente minutes pour reproduire une ménopause, puis toutes alternent régime gras et régime standard pour provoquer des variations cycliques de poids. S'y ajoutent des gavages, des mesures de pression artérielle sur souris éveillées, un test d'effort sur tapis de course, des IRM sous anesthésie et, juste avant la mise à mort, un cathétérisme du ventricule gauche. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, afin d'évaluer chez la souris la finérénone, un médicament qui dispose déjà d'une autorisation de mise sur le marché et dont le porteur indique qu'il limite déjà l'insuffisance cardiaque chez les personnes obèses.

Objectifs

L’obésité centrale devient syndrome métabolique si elle est associée à 2 des 4 facteurs de risque suivant : hypertension artérielle, excès de sucre dans le sang, excès de triglycéride dans le sang, diminution de taux sanguin du bon cholestérol. Le syndrome métabolique dont la fréquence augmente de 60% après la ménopause est associé au risque de développer une Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée, forme d’insuffisance cardiaque la plus fréquente chez les femmes, silencieuse au repos mais se révélant lors d’efforts, de fatigue ou de stress. Le pronostic vital est engagé avec un taux de mortalité de 76% dans les cinq années suivant le diagnostic. Surpoids et obésité sont un problème majeur de santé publique et seuls 20% des individus concernés parviennent à une réduction pondérale durable, les autres courant le risque de variations cycliques du poids associées au diabète de type-2, à des fluctuations de pression artérielle, de rythme cardiaque et de filtration rénale, le tout induisant une surmortalité, en particulier chez les femmes. Après une perte de poids, les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé sont assujettis à une mémoire métabolique préjudiciable limitant le recouvrement des fonctions cardiovasculaires, tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans ce contexte, nous nous intéressons à l’aldostérone, hormone produite par les glandes surrénales, et à son récepteur minéralocorticoïde, notamment impliqués dans la régulation de la réabsorption de sel par les reins, du volume sanguin et donc de la pression artérielle. Il est établi que la finerenone, médicament antagoniste de ce récepteur, limite la progression de l’Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée chez les obèses. Nous voulons dorénavant tester si la finerenone administrée à des individus au cours de phases de perte de poids facilite le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire et réduit le risque de rebond d’insuffisance cardiaque en cas de reprise de poids. Nous réaliserons ces traitements chez des souris femelles en condition ou non de ménopause induite par la suppression des ovaires, dans un modèle de 3 cycles successifs de variation de poids : augmentation puis réduction provoquées par un régime riche en graisse (4 semaines par cycle) suivi d’un retour au régime standard (4, 6, 8 semaines pour les cycles successifs).

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle murin robuste pour mimer des variations cycliques de poids chez les femmes dans des conditions de pré ou de post-ménopause permettra de déterminer comment des variations du métabolisme induisent des dysfonctions systémiques, et comment des mécanismes endocrines pathologiques et/ou associés au vieillissement influencent conjointement la progression de ces dysfonctions systémiques métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques, du tissu adipeux, du pancréas (producteur d’insuline et de glucagon) et des glandes surrénales (productrices d’aldostérone et de glucocorticoïdes). De plus, notre modèle préclinique rend possible l’identification de cibles pharmacologiques pour prévenir le risque de complications cardio-métaboliques chez les femmes sujettes à des variations cycliques de poids. En particulier, nous souhaitons prévenir le risque associé à une mémoire métabolique délétère qui se maintient au cours d’une perte de poids chez les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé, mémoire pouvant limiter ou ralentir le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans cet objectif, notre première hypothèse thérapeutique consiste à prévenir les conséquences de cette mémoire métabolique délétère, grâce un traitement par la finerenone, nouvel antagoniste du récepteur minéralocorticoïde, ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché. Nous testerons la possibilité de bénéfices fonctionnels métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques et endocrines après administration de ce médicament au cours des phases de restriction caloriques permettant une perte de poids, ou au cours du troisième cycle complet de variations cycliques de poids. Une approche préclinique faisant usage d’un médicament autorisé chez l’homme renforce notre projet dans sa dimension translationnelle et dans la perspective d’un transfert clinique chez les patientes. Ainsi, les données précliniques issues de ce protocole pourront améliorer l’arsenal thérapeutique proposé aux femmes qui ont des troubles métaboliques et sont à risque de développer une forme d’insuffisance cardiaque majoritaire chez les femmes, l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, dont l’incidence augmente après la ménopause.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ au cours de laquelle les ovaires seront retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Le traitement par la finerenone sera administré par gavage. Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées. Ces mesures durent environ 15 minutes. Des tests de sensibilité au glucose et de tolérance orale au glucose (gavage de glucose ou injection intrapéritonéale d’insuline, suivis du prélèvement d’une goutte de sang à la queue toutes les 15 min pendant 2h) seront réalisés chez des souris vigile. L’analyse de la composition corporelle est effectuée sur souris vigiles. L’étude des artères de résistance et du système périphérique se fera par tomographie en cohérence optique et angiographie rétinienne en microscopie confocale laser. Les souris seront suivies par échocardiographie sous anesthésie au gaz pour mesurer la fraction d’éjection sanguine du ventricule gauche à chaque battement ainsi que le débit cardiaque. La perfusion sanguine du ventricule gauche, via la circulation coronaire et la capacité du cœur à augmenter sa perfusion après injection d’un agent vasodilatateur seront mesurées par IRM sous anesthésie. Des souris vigiles seront soumises à un test d’effort sur tapis de course, pour mesurer si une amélioration fonctionnelle cardiovasculaire se traduit par une meilleure capacité d’exercice. La collecte des urines sera réalisée en cage à métabolisme pour évaluer l’activité rénale. Précédant la mise à mort des souris, le cathétérisme du ventricule gauche sous anesthésie permettra de déterminer la pression intraventriculaire gauche en diastole (relaxation) et systole (contraction) et des paramètres spécifiques de relaxation et de contractilité, uniquement mesurables en hémodynamique invasive. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Douleur post-opératoire après l’ovariectomie. Inconfort au point d’injection durant le test de sensibilité à l’insuline et l’évaluation de l’intégrité microvasculaire dans la rétine. Stress lié à la contention lors de la mesure de la pression artérielle. Stress et inconfort liés à la mise en cage à métabolisme individuelle pendant une nuit (12h00), les souris étant posées sur une grille permettant de collecter les urines au travers. Inconfort ou douleur lors des phases de réveil après anesthésie générale. Ces anesthésies générales suivies d’une phase de réveil concernent les opérations d’ovariectomie, les examens par IRM et la tomographie en cohérence optique de la rétine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

Les expériences réalisées in vivo ne peuvent être remplacées par des études in vitro en raison de la complexité de la pathologie (l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée) nécessitant des analyses fonctionnelles et physiopathologiques complexes, en particulier dans le contexte intégratif de comorbidités telles qu’un diabète de type 2, une dysfonction endothéliale, une dysfonction du tissu adipeux, le risque d’une insuffisance rénale ou hépatique, et en présence de remodelages tissulaires et d’une inflammation chronique. Dès lors, l'utilisation d'animaux ne saurait à ce jour être remplacée par des méthodes alternatives.

Réduction

L'ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d'animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire à mettre en évidence une différence entre les groupes. Le nombre d'animaux demandé pour tout le protocole est de 470 et correspond à une volonté de ne pas soumettre les animaux à une fréquence trop élevée d'actes expérimentaux qui génèrerait un excès de stress expérimental et un risque accru de souffrance.

Raffinement

Pour s'assurer de bonnes conditions de vie des souris, une observation rigoureuse est indispensable. Les souris sont hébergées dans une animalerie conventionnelle à 5 souris/cage, en portoirs ventilés avec accès ad-libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, plus un enrichissement du milieu (plaque de cellulose, tunnel cartonné). Pour le maintien des conditions d'hygiène, le change est réalisé une fois par semaine. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement par les soigneurs et au moins de manière hebdomadaire par le responsable du protocole et/ou ses collaborateurs, pour déceler le moindre signe de souffrance. Le protocole est initié une semaine après l’arrivée des animaux à l’animalerie pour respecter un temps d’adaptation suite au transport. Pour chaque procédure requérant l'usage d'une anesthésie, l'anesthésie est réalisée dans une cage individualisée, avec une humidification régulière des yeux et le maintien de la température corporelle grâce à une lampe chaude, dans un environnement contrôlé et stabilisé Une couverture analgésique sera proposée avant, pendant et après l’induction , avec une évaluation quotidienne la première semaine post-chirurgicale de la douleur, basée sur la "grimace scale de Langford". Couplé à un suivi de poids régulier, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite, notamment en période post-opératoire et vers la fin de l'étude. Pendant la chirurgie, nous injectons une solution préchauffée à 37°C de sérum physiologique stérile pour maintenir l'hydratation des animaux. En post-opératoire, une injection de glucose est réalisée ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Nous nous engageons à suivre le bien-être animal avec des feuilles de suivi individuelles, avec la "grille d'évaluation des signes cliniques" dont la "grimace scale de Langford" afin d’identifier des individus à risque de souffrance avant que les points limites soient atteints pour pouvoir appliquer la mise à mort planifiée. Pour les procédures réalisées avec des souris vigiles des phases d'habituation progressive au dispositif expérimental sans mesure sont réalisées.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale se justifie par une longue expérience du laboratoire concernant les modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, notamment l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, après administration d’un régime riche en graisse. Nous nous intéressons à l'impact de la ménopause sur le développement de ce type d'insuffisace cardiaque, pour cela nous utilisons des souris femelles, chez lesquelles la ménopause est induite par ablation des ovaires. Les souris ont 7 semaines à leur arrivée. De plus, nous disposons d’une animalerie moderne avec des portoirs ventilés facilitant l’hébergement et favorisant le confort et la sécurité sanitaire des souris. Enfin, nous disposons d’une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et vasculaires, in vivo et ex vivo, chez la souris.

Jusqu'à six injections dans l'œil par animal, à raison de trois par semaine, et vingt-quatre heures d'exposition en cage individuelle à une lumière d'intensité comparable à une journée ensoleillée, pour détruire la rétine. 4 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever les rétines et les fonds d'œil. L'objet déclaré est de comprendre la dégénérescence maculaire et la rétinopathie diabétique, et de tester des molécules neuroprotectrices, sur des rats spontanément diabétiques suivis entre huit et dix-huit mois. Le porteur présente comme une réduction le fait de mutualiser un groupe témoin, ce qui économise 560 animaux sur les 4 600 prévus.

Objectifs

Les rétinopathies telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) font partie des principales causes de cécité chez l’Homme adulte avec une incidence croissante. Ces pathologies multifactorielles évolutives et invalidantes ne bénéficient pas de traitement efficace pour tous les patients face à la perte des cellules de la rétine. L'étude de la physiopathologie des rétinopathies ainsi que la recherche de nouvelles molécules pour les traiter, revêt un intérêt majeur dans le domaine de la santé et de la recherche médicale. Cette étude a pour but d’une part de mieux comprendre les mécanismes biologiques, cellulaires et moléculaires sous-jacents qui conduisent au développement de ces différentes maladies oculaires. Une connaissance plus approfondie de la physiopathologie des maladies oculaires nous permettra de mettre en évidence des cibles thérapeutiques ainsi que des marqueurs spécifiques aux différentes rétinopathies afin de rendre possible un diagnostic des pathologies à un stade précoce et ainsi favoriser une prise en charge plus efficace. D’autre part, la recherche de nouvelles molécules thérapeutiques s'inscrit dans la perspective de développer des traitements plus efficaces qui ciblent spécifiquement les voies biologiques impliquées, minimisant ainsi les effets de la maladie et maximisant l'efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont importants pour plusieurs raisons. Les rétinopathies telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge sont des pathologies évolutives et invalidantes pouvant aller jusqu’à la cécité touchant respectivement 103 et 196 millions de personnes dans le monde. Leur prise en charge vise à lutter contre les complications tardives des pathologies, mais encore beaucoup de patients répondent peu voire pas du tout aux traitements. Ce projet ouvre des perspectives pour des études translationnelles visant à lutter contre le handicap visuel lié aux principales rétinopathies de l’homme adulte. Les avantages à court terme sont d’évaluer le potentiel neuroprotecteur de diverses molécules thérapeutiques afin, à moyen terme, de permettre des études cliniques chez l’homme. Les avantages à long terme comprennent la réduction du handicap visuel lié aux rétinopathies et des coûts directs et indirects socio-économiques qui en découlent.

Procédures

Les animaux seront soumis à des examens et injections oculaires similaires à ceux pratiqués chez l’homme sous anesthésie locale. Les animaux seront sous anesthésie générale et locale et ne subiront pas plus de 2 examens oculaires (d'une durée de 20 minutes maximum) par animal espacés d’au moins 10 jours. Les traitements par injections oculaires (d'une durée de 5 minutes maximum) sont également réalisés sous anesthésie générale et locale allant de 1 à 6 injections maximum par animal (à la fréquence maximale de 3 fois par semaine). L'unique prélèvement sur animal vivant sera une goutte de sang prélevée sur la queue de l'animal sous anesthésie générale. Le modèle de dégénérescence par la lumière est induit par l'exposition des animaux à une lumière d’assez forte intensité (correspondant à une journée ensoleillée) pendant 24 heures maximum dans une cage adaptée en présence de nourriture et d'eau à volonté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : une augmentation du volume urinaire des animaux diabétiques ; un éventuel stress lié à l’isolement de 24 heures maximum des animaux du modèle de dégénérescence induit par la lumière ; à la suite de l’anesthésie générale, de possibles douleurs lors de l’injection et/ou irritation dans la zone injectée, inflammation, hallucination à l'endormissement et au réveil de l’anesthésie et hypothermie ; une éventuelle irritation et/ou inflammation liée à l’exploration in vivo des yeux et l’administration des molécules dans l’oeil.

Devenir

Les analyses seront effectuées sur les rétines et fonds d'yeux ce qui nécessite de prélever les tissus en post-mortem. Cela implique que tous les animaux devront être euthanasiés par une méthode réglementaire afin d'effectuer ces prélèvements tissulaires.

Remplacement

La rétine est un tissu complexe composé de nombreux types cellulaires qui fonctionnent en réseau, et interagissent en permanence avec les autres tissus oculaires et avec la circulation (vaisseaux rétiniens et choroïdiens). C’est pourquoi les études in vitro (culture cellulaire ou d’organoïdes) seules ne permettent pas de prendre en compte la multiplicité des interactions dans l'œil, ni la physiopathologie complexe des rétinopathies. Elles ne permettent pas non plus l’évaluation des différentes voies d’administration des nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, des études in vivo dans des modèles animaux mimant les rétinopathies telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge sont nécessaires dans ce projet translationnel visant à établir une preuve de concept thérapeutique. Au préalable, des études in vitro (culture cellulaire) et ex vivo (organo-culture) sur les caractéristiques physico-chimiques (solubilité, demi-vie, efficacité du principe actif) et la toxicité des molécules thérapeutiques ont été réalisées par les partenaires.

Réduction

Notre protocole expérimental a été validé scientifiquement par nos institutions, partenaires et financeurs. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum, sans toutefois grever la possibilité d’obtenir des résultats exploitables. Par nos expériences passées sur ces modèles animaux et les différences phénotypiques observées avec les animaux contrôles, il est estimé que des groupes de 20 yeux (soit 10 animaux) par condition sont suffisants pour une analyse statistique significative. Nous utiliserons donc pour chaque expérience un effectif de 10 animaux par groupe (soit n = 20 yeux par groupe). La réduction du nombre d’animaux passera par des analyses longitudinales non invasives, non douloureuses d’exploration structurale de l'œil par imagerie (angiographie en fluorescence et tomographie en cohérence) sous anesthésie générale et locale, remplaçant les analyses immunohistologiques sur des tissus prélevés nécessitant plus d’animaux. De plus, le nombre d’animaux sera réduit en combinant le maximum d’analyses biologiques (protéines et ARN) sur les mêmes échantillons de rétine (rétines coupées en deux). Enfin pour réduire le nombre d’animaux, le même groupe d’animaux contrôles (naïfs) sera utilisé pour l’analyse de l’efficacité des différentes molécules thérapeutiques, dans chacun de nos modèles de rétinopathie. On utilisera donc 180 animaux naïfs au lieu de 740 animaux (soit une réduction de 560) parmi les 4600 rats du projet.

Raffinement

Les animaux sont accoutumés à l’animalerie 8 jours avant la date des expérimentations. L’animalerie a mis en place un programme d’enrichissement qui consiste à placer des nids végétaux, des tunnels en cartons, des bâtons en bois ou des abris dans les cages. Les animaux diabétiques urinant plus souvent, le change des litières est ajusté pour conserver les cages propres. Pour éviter stress, angoisse et douleur aux animaux, nous réalisons systématiquement tous les examens sous anesthésie générale et locale. Les interventions qui seront réalisées dans le cadre de ce projet sont également pratiquées chez l’homme sous anesthésie topique (gouttes anesthésiques) seule, sans douleur particulière. Afin de minimiser les risques liés à l’anesthésie générale, la dose d’anesthésiant est adaptée au poids de chaque animal, et les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour limiter le stress thermique. La surveillance des animaux sera assurée jusqu’à leur réveil par les expérimentateurs; puis quotidiennement par les animaliers et 1 fois par semaine minimum par les expérimentateurs. En cas de détérioration de l'état général de l'animal (diminution des déplacements, perte d'appétit, perte de poids, changement d’aspect physique, hypothermie, isolement), nous prendrons les mesures adéquates pour arrêter immédiatement sa souffrance (arrêt des essais, antalgiques quand l’expérience le permet, nourriture enrichie,..), l'euthanasie étant le dernier recours. L’ensemble du matériel utilisé pour les procédures (injections et prélèvements) sont stériles et à usage unique et les gestes sont réalisés par des expérimentateurs compétents.

Choix des espèces

La rétine est un tissu vasculaire et nerveux très complexe qui ne peut être reproduit en culture. Les études cliniques chez l’Homme nécessitent une phase pré-clinique dans un modèle animal. En dépit de l’absence de macula, le rat est une espèce de choix, combinant une structure et une physiologie oculaire similaires à l’Homme. Nous avons choisi d'utiliser un rat spontanément diabètique de type 2. Il développe avec le temps des lésions de rétinopathie diabétique typiques et bien décrites dans la littérature, à partir de 8 mois et jusqu’à 18 mois. Nous les utilisons donc entre 8 et 18 mois de façon à inclure au maximum tous les animaux de l’élevage. Des animaux de la même souche non diabétiques seront utilisés aux mêmes âges (entre 8 à 18 mois) comme contrôles. Les rats albinos et pigmentés seront utilisés à un stade jeune adulte (6-8 semaines) pour nos modèles de dégénérescence de la rétine par excitotoxicité des neurones ou par la lumière comme décrits dans la littérature. Il est nécessaire de coupler des analyses sur des animaux albinos et pigmentés, afin d’évaluer de possible différence de biodisponibilité oculaire du principe actif, comme cela s’observe souvent en pharmacologie oculaire.

Les souris utilisées ici sont génétiquement modifiées pour que l'ARN LincPint soit inactivé dans leurs vaisseaux lymphatiques, une lignée qui n'existe que dans cette espèce selon le porteur. 280 femelles de cinq semaines vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales sur cinq jours consécutifs, puis une greffe de cellules tumorales, une chirurgie provoquant un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, avant une lymphographie de moins de cinq minutes. Toutes sont tuées au terme de cette imagerie, pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

434 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité étant tuée par prélèvement complet du sang sous anesthésie. Pendant quatre semaines, ils passent huit à seize heures par jour dans un dispositif d'hypoxie intermittente, pendant leur phase de sommeil, pour reproduire les apnées obstructives, avec un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire, une prise de sang en troisième semaine et une échographie de l'aorte sous anesthésie. Le porteur qualifie de "léger" ou "modéré" chacun des stress attendus, y compris le passage en hypoxie et le transport entre les deux établissements. Quinze rats échappent à la mise à mort et seront réutilisés dans d'autres projets, parmi lesquels ceux qui auront servi à former le personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Mesurer l'effet d'une enzyme sur le drainage des vaisseaux lymphatiques et sur la dissémination des métastases : 360 souris femelles de six semaines vont être utilisées dans ce but, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de vingt à trente minutes qui lui provoque un lymphœdème, un gavage, une injection de cellules tumorales, puis une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elle est tuée sans réveil. La patte opérée gonfle de 10 à 15 % à partir d'une semaine après l'intervention, et reste ainsi jusqu'à la mise à mort. Un score évalue l'apparence, le poids, le comportement naturel et le comportement provoqué sur une échelle de 0 à 12, tout animal atteignant 10 étant tué immédiatement.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal). Enfin; dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines