Recherche fondamentale

Opérées sous anesthésie gazeuse pour provoquer un lymphœdème du membre par la technique employée en chirurgie du cancer du sein, 256 souris femelles reçoivent ensuite une injection quotidienne cinq jours par semaine, pendant deux, quatre, six ou huit semaines. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Un transfert entre deux établissements précède la lymphographie finale, injection intradermique dans la patte saine et dans la patte gonflée sous anesthésie générale, à l'issue de laquelle les souris sont tuées sans réveil pour récolter les tissus. Le porteur annonce que le seul effet indésirable attendu est un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée, présent dès la première semaine et jusqu'à la mort de l'animal.

Objectifs

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce manque est en partie dû à l’absence de modèles expérimentaux permettant d’étudier cette pathologie. La mise au point d’un modèle de lymphoedème secondaire par l’utilisation des techniques de chirurgie du cancer du sein revêt donc un enjeu majeur pour déterminer des cibles afin de lutter contre cette pathologie. Les vaisseaux lymphatiques dépendent de leur environnement, notamment de la matrice qui les entoure. Si cette matrice se modifie, cela peut bloquer leur fonctionnement. Nous étudions comment la fibrose (une accumulation anormale de cette matrice) se développe, quels mécanismes la contrôlent et comment ces changements influencent la santé des vaisseaux lymphatiques. L'objectif est de trouver des solutions pour réparer cette matrice et traiter le lymphœdème. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal, réalisée dans le premier établissements utilisateur. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal, réalisé dans le premier établissements utilisateur. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure réalisée dans le second établissements utilisateur.

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Porteurs d'un infarctus chronique du myocarde, 48 moutons subissent angiographie, cartographie électrique par cathéter et stimulation intraventriculaire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur fréquence respiratoire et leur volume courant sont modifiés par paliers sous ventilation mécanique, pour observer ce que la respiration fait à l'activité électrique du cœur. Le porteur mentionne des saignements possibles aux points d'introduction des cathéters et des effets indésirables cardiaques lors de la cartographie ou de la stimulation, un défibrillateur restant disponible. Tous sont tués pour prélever le cœur, et le porteur avance que les données recueillies pourraient "réduire considérablement" le nombre d'animaux utilisés à l'avenir.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont une cause majeure de décès dans le monde. Les troubles du sommeil comme l'apnée, associés à des problèmes respiratoires pendant le sommeil, augmentent encore le risque de maladie cardiaque. Notre objectif est de mieux comprendre comment les troubles respiratoires affectent le cœur et de développer de nouvelles méthodes de traitement des rythmes cardiaques anormaux. Nous créerons de nouvelles techniques pour étudier l’activité électrique du cœur et testerons des solutions pour améliorer le fonctionnement du système cardio-respiratoire. Nous analyserons les changements dans le comportement cardiaque lors d'une respiration normale et anormale et développerons de nouvelles stratégies pour prévenir les rythmes cardiaques anormaux..

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous caractériserons les mécanismes à l'origine de l'infarctus du myocarde (mort du tissu cardiaque) et son interaction avec la respiration. L’infarctus du myocarde est l’une des pathologies les plus courantes dans le monde et la première cause de mort subite. L’étude de la relation entre les schémas respiratoires et l’activité électrique cardiaque au sein des tissus sains et l’infarctus est essentielle pour comprendre les mécanismes pouvant conduire à la mort des patients. Grâce à ce projet, de nouvelles techniques et technologies peuvent être développées et optimisées dans différents domaines de recherche : imagerie, physiologie, modélisation, traitement du signal et traitement clinique..

Procédures

Les animaux utilisés pourront subir des examens d’imagerie, d'angiographie, de cartographie de contact et de stimulation intraventriculaire. Toutes ces analyses seront effectuées sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée. Les techniques d’imagerie utilisées sont de types non invasives (IRM, scanner et/ou échocardiographie, 180 min au total). Le protocole d’angiographie est prévu afin de déterminer la présence ou pas d’irrigation sanguine dans l’infarctus (environ 90 min). Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des rythmes cardiaques anormaux. La cartographie électrique du cœur pourra être effectuée pour évaluer les effets de l’infarctus in vivo (environ 90 min). Une stimulation intraventriculaire pourra être effectuée pour déterminer la fonctionnalité ventriculaire à différentes fréquences de stimulation. Pour tester l'effet de la modification des paramètres pulmonaires sur l'électrophysiologie cardiaque, la fréquence respiratoire et le volume courant varieront par étapes incrémentielles.

Impact sur les animaux

La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impacter légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasif (IRM) ou mini-invasif (avec des cathéters), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters : au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact ou de stimulation intraventriculaire peuvent comporter des effets indésirables cardiaques.

Devenir

Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études sur sa fonction et sa structure qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront mis à mort.

Remplacement

Dans le contexte actuel, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux pour ce projet. Les techniques que nous développons nécessitent des études sur des animaux pour comprendre en détail comment les crises cardiaques affectent le cœur et provoquent des arythmies. Les données que nous recueillons grâce à des techniques d’imagerie et de mesures électriques nous aideront à améliorer notre base de données sur le cœur. Cela pourrait, à l'avenir, réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et la nécessité de telles expérimentations.

Réduction

48 animaux sont utilisés dans ce projet. Nous avons calculé statiquement que ce nombre est nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons également rassemblé dans le même projet plusieurs équipes de recherche : imagerie, physiopathologie, traitement des signaux, et modélisation cardiaque. Cette collaboration interdisciplinaire permet de développer et d’utiliser un maximum de techniques compatibles tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires, ce qui optimise notre approche. En plus, l'enregistrement d'une base de données à partir de ces sessions expérimentales permet de créer des modèles informatiques et donc de réduire l'utilisation d'animaux dans des projets connexes futurs.

Raffinement

Pendant les procédures, les animaux reçoivent un protocole antidouleur approprié et sont maintenus sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et surveillés par un ECG et un capteur de pression sanguine, niveau d’oxygène et température corporelle. Cela nous permet d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des médicaments pour prévenir les rythmes cardiaques anomales. Un défibrillateur est toujours disponible pour éviter tout problème grave pendant les tests. Lorsque les animaux sont hébergés, ils sont placés dans des conditions adaptées à leur espèce, avec des soins appropriés et un environnement social adéquat. Le personnel surveille leur état de santé quotidiennement et peut intervenir rapidement si nécessaire. Si à tout moment leur état de santé se détériore et qu'il n'est pas possible de revenir à la normale, le protocole sera interrompu et l’animal sera euthanasié selon les procédures établies en tenant compte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme, les ovins ont été retenus car : •Ces modèles sont une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles. Chez l’Homme, la plupart des infarctus se produisent à l’âge adulte. Pour cette raison, des ovins adultes (>12 mois) ont été choisis pour ce projet.

216 souris reçoivent une ou deux injections intrapéritonéales de psychédéliques agissant sur le récepteur 5-HT2A, puis sont tuées une heure plus tard. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et l'ensemble des animaux est mis à mort pour analyser la neurochimie de trente régions cérébrales. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu et qu'aucun point limite n'est rapporté pour ces composés, tout en prévoyant le cas d'une respiration altérée, d'une prostration, d'une immobilité en posture anormale ou de convulsions. Il précise alors que l'animal sera retiré du dispositif puis tué dans une chambre à dioxyde de carbone, rapidement s'il ne récupère pas, ou en fin de journée si les signes persistent.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l’effet d’agents pharmacologiques psychédéliques agissant sur le récepteur à la sérotonine 5-HT2A (psychédéliques classiques). Les agonistes de ce récepteur sont considérés comme des antidépresseurs et anxiolytiques potentiels, mais ils sont aussi des composés hallucinogènes. Compte tenu de l’expression diffuse de l’expression du récepteur 5-HT2A dans le cerveau, nous postulons que les effets de ces composés altèrent l’activité de nombreux systèmes de neurotransmissions et de réseaux neurobiologiques. Cette information n’existe pas. C’est la raison pour laquelle nous avons lancé ce projet de recherche en neuropharmacologie et qui s’insère dans le champ de la neurobiologie intégrative. Par ailleurs, ce projet vise aussi à inclure dans la question posée le rôle de l’environnement dans le mécanisme d’action de ces composés. Une analyse de la littérature montre en effet que ces composés ne sont pas évalués dans des protocoles d’exploration forcée, en d’autres termes, des protocoles qui mettent en jeu le comportement exploratoire de l’animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action des agents pharmacologiques psychédéliques sur l’activité des systèmes de neurotransmissions classiques dans le cerveau. Ces systèmes de neurotransmission jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information et les comportements. La réalisation de banque de données neurochimiques sur 30 régions cérébrales permettra de concevoir pour une première fois l’organisation fonctionnelle des systèmes de neurotransmission seuls ou en interaction sur plusieurs réseaux neurobiologiques dans le cadre du mécanisme d’action de ces composés. Cette permettra aussi de définir le rôle du récepteur cible des psychédéliques dans les effets neurochimiques de ces composés hallucinogènes, associés à des effets comportementaux (principalement le comportement exploratoire).

Procédures

Il y aura une voire 2 injections intrapéritonéales chez les souris qui seront réalisées par des expérimentateurs aguerris. La durée totale nécessaire à la préhension de la souris et à l'injection est estimée à moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Il n'y a à priori aucun effet indésirable attendu en dehors des effets de la préhension de l'animal et de l'injection sur les animaux qui sont euthanasiés 1 h après l'unique injection intrapéritonéale. Néanmoins, les effets des substances sont ambivalents nécessitant des études en dose réponse. Ils induisent des effets non toxiques sur la physiologie générale et ont des propriétés plutôt analgésiques. Il n’y a pas de points limites reportés pour ces composés dans la gamme des doses que nous avons déterminée. L’antagoniste MDL100907 a été caractérisé comme un antipsychotique de seconde génération, et est parfois administré chez l’homme. Il n’a pas d’effets secondaires connus. Les solvants contiennent parfois des composés potentiellement agressifs (Tween, DMSO), mais pas aux concentrations utilisées. L’utilisation de ces composés (Tween, DMSO) est nécessaire pour dissoudre les composés. Il n’y a pas de points limites mais il faut être vigilant. Dans le cas où une injection serait associée à des effets néfastes inattendus (respiration altérée, prostration, immobilité associée à une posture anormale, convulsions), l’animal sera retiré de la cage en plexiglas, et placé dans une cage d’hébergement classique contenant de la litière. L’animal sera euthanasié dans une chambre à dioxyde de carbone ultérieurement, c’est-à-dire rapidement si l’animal ne recouvre pas de la souffrance apparente, ou en fin de journée si les points limites ne disparaissent pas rapidement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure en vue d'une analyse neurochimique de différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé que chez l'animal, le modèle murin étant un des plus classiquement utilisé pour ce type d'étude. En effet il s'agit d'évaluer des effets pharmacologiques sur des paramètres comportementaux et neurochimiques dans plusieurs régions cérébrales.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont conçus avec le minimum d’individu pour pouvoir réaliser des études statistiques valables. Ces analyses tiennent compte de comparaison de moyennes ou d’analyses plus complexes (analyses en corrélations, analyse multivariées).

Raffinement

Pour limiter au maximum le stress des animaux, ceux-ci sont habitués à l'expérimentateur (le même pendant toute la durée de l'expérience) dès leur arrivée dans l’animalerie agrée du laboratoire. Le temps d’acclimatation des animaux aux lieux sera d’au moins 10 jours. Les animaux seront hébergés dans des cages par 4 en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas. Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement afin de réduire l’ennui et le stress comme des carrés de coton, un cylindre rigide en carton, jusqu’au jour de l’expérience. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler d'éventuelles souffrances entrainant des comportements particuliers: respiration anormale, agressivité vis à vis des congénères, auto-mutilation, diminution d'activité ainsi qu'un suivi de poids, une perte de poids anormale étant un indice de souffrance. Si un animal présentait des signes de souffrance, il sera isolé de ses congénères, la procédure sera arrêtée et il sera surveillé sur tous les paramètres précédemment cités. S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. En cas de lésions, un traitement analgésique local à la lidocaine pourra être envisagé.

Choix des espèces

La majorité des études sur le sujet sont réalisées sur des rongeurs de laboratoire, particulièrement chez la souris. L'utilisation de souris C57/ Bl6 permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Souris adultes de 3 à 6 mois

756 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant entre 5 et 74 séances d'imagerie sous anesthésie, d'une durée pouvant atteindre 1 h 30, sur une période allant jusqu'à 18 mois. Un nerf ciliaire leur est coupé pour léser l'innervation de la cornée, opération de 10 à 15 minutes, et un filament de nylon est posé sur leur œil une fois par mois pour déclencher le réflexe de clignement. Toutes sont tuées à la fin de la période de maintien, les yeux prélevés et les cornées disséquées, pour une étude qui cherche à comprendre comment les nerfs de la cornée se régénèrent, sans traitement candidat à ce stade. Le porteur justifie le choix de la souris en affirmant que "plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l'Homme".

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la régénération de l’innervation cornéenne en temps réel dans des modèles murin de lésion de l'innervation de la cornée. Nous avons ainsi pour objectifs d’étudier différents mécanismes lors de la régénération axonale (interactions entre les nerfs et les cellules immunitaires ; interactions entre les nerfs et les cellules gliales ; mécanismes de dégénérescence nerveuse ; implication des molécules de guidage axonale). Afin de comprendre l’ensemble de ces mécanismes ainsi que leur modulation en fonction de l’âge des animaux, nous souhaitons réaliser cette étude sur populations d’âges différents (comparaison groupe jeune et groupe agé. ).

Bénéfices attendus

Aucun traitement n’est actuellement disponible en routine malgré le nombre important de patients atteints (estimé à 1 personne sur 2000). Les causes du développement de la maladie sont diverses : d'origine virale ou bactérienne, mais également des affections secondaires dues à d'autres pathologies telles que le diabète ou encore à des atteintes traumatiques ou chirurgicales. Cette étude permettra de mieux comprendre l'innervation de la cornée et les mécanismes sous-jacents impliqués dans sa plasticité, son remodelage et sa régénération à la suite de lésions; et ainsi d’identifier de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de la kératite neurotrophique.

Procédures

Un partie des animaux recevra un traitement par gavage (réalisé une seule fois, sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). Les animaux subiront une chirurgie (lésion d'un nerf ciliaire) ; cet acte dure environ 10-15 min par animal et il est réalisé sur animal anesthésié et analgésié. Une fois par mois (soit 18 fois maximum selon les groupes), nous réaliserons un test de sensibilité de la cornée (réalisé sur animal vigile, l'acte dure environ 3 min par animal). Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. Chaque animal sera imagé 1x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 18 mois selon les objectifs du projet (soit entre 5 et 74 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 1h30 chacune).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux recevront un traitement par gavage (une seule fois). La contention au moment de sa réalisation peut être source de stress chez les animaux. L'introduction de la canule peut quelques fois provoquer des microlésions. Les animaux recevront deux injections par voie sous-cutané. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l’innervation cornéenne par ablation d’un nerf ciliaire. La contention de l'animal pour la réalisation du test de sensibilité de la cornée peut également être source de stress. Ce test est rapide et consiste à poser un filament de nylon sur l'oeil pour provoquer un reflexe de clignement de la paupière. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).

Remplacement

Du fait de la complexité de l'oeil, de l’innervation cornéenne et des interactions entre les nerfs et les cellules, il n'est pas possible de modéliser les mécanismes de la pathologie que nous étudions par des modèles in vitro. L'utilisation de l'animal nous est donc indispensable pour étudier de façon complète les mécanismes du développement de la pathologie que nous étudions ainsi que les processus de régénération de l'innervation de la cornée.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables (nous utiliserons dans notre étude un test statistique adapté pour l'analyse de nos études) et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Le nombre d'animaux requis pour ce projet a été déterminé à l'aide d'un logiciel.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température et l’hygrométrie sont régulés. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour les étapes chirurgicales et les analyses par imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie générale complémenté par une anesthésie locale de la cornée.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98 pourcent de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. Nous réaliserons les expérimentations sur 2 groupes d’âges différents. Un premier groupe nommé jeune (animaux âgés d’environ 3 mois) et un groupe agé (animaux âgés d’environ 15 mois). Cela nous permettra de comparer les processus et capacités de régénération en fonction de l’âge.

La récompense qui fait tenir la tâche repose sur une restriction d'eau de moitié, laquelle fait perdre aux souris jusqu'à 10 % de leur poids, et leur tête reste immobilisée jusqu'à 45 minutes par séance. 480 souris sont utilisées dans ce premier volet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après 49 jours d'introduction de congénères inconnus dans leur cage pour installer un état anxieux. Le porteur qualifie pourtant la tâche de "non aversive et non douloureuse" et classe la restriction hydrique parmi les effets indésirables "mineurs". Toutes sont tuées à l'issue, leur cerveau prélevé pour des analyses post-hoc.

Objectifs

La phobie sociale, ou trouble de l'anxiété sociale (TAS), est une forme de trouble anxieux définie récemment, actuellement classée parmi les troubles psychiatriques les plus fréquents. Ce trouble se caractérise par une peur intense et persistante d'une évaluation négative potentielle par les autres lors d'interactions sociales, ce qui conduit souvent à l'évitement social et au repli sur soi. L'une des principales altérations du TAS, souvent considérée comme une cause sous-jacente, est une perturbation du traitement de l'information sociale. En effet, les individus socialement anxieux présentent des réponses exagérées et ont du mal à contrôler leur attention face aux stimuli socialement menaçants. Le toucher est une forme essentielle d'interaction sociale, et il a été observé que la perception tactile est altérée chez les personnes socialement anxieuses, qui semblent ne pas tirer profit de ses bienfaits et manifestent une aversion pour le toucher social. Cependant, les réponses neuronales et les processus attentionnels nécessaires pour filtrer les informations tactiles, lorsqu'elles deviennent non pertinentes, n'ont pas encore été étudiés. Dans cette étude, nous visons à caractériser la perception des stimuli tactiles, qu'ils soient sociaux ou non-sociaux, ainsi que le contrôle attentionnel dans le contexte du TAS. Nous proposons de développer et d'utiliser une nouvelle tâche de prise de décision perceptive, combinée à des mesures physiologiques de l'activité neuronale dans un modèle murin du TAS. Le projet est un multisite, et se déroulera dans deux EU differents. Nos résultats permettront d'approfondir la compréhension de la perception tactile et du contrôle de l’attention face aux stimuli tactiles dans le TAS, tout en révélant les mécanismes neuronaux sous-jacents. En utilisant une tâche adaptable pour des études humaines mesurant les réponses tactiles chez les individus socialement anxieux, nous espérons obtenir des résultats susceptibles d'améliorer la qualité de vie des personnes souffrant de TAS.

Bénéfices attendus

Le trouble d'anxiété sociale (TAS) est un trouble psychiatrique chronique qui peut constituer un véritable handicap au quotidien. La prévalence estimée du TAS au cours de la vie est d'environ 4 %. Dans le trouble d'anxiété sociale (TAS), les personnes réagissent souvent de manière exagérée aux situations sociales perçues comme négatives et éprouvent des difficultés à contrôler leur attention face aux stimuli sociaux. Ces caractéristiques sont bien connues et pourraient être une des causes de ce trouble. Egalement, les individus socialement anxieux semblent ne pas tirer profit des bienfaits de l’interaction sociale. Comprendre les altérations neuronales à l'origine de ces difficultés sociales pourrait fournir des informations cruciales sur les modifications du fonctionnement cérébral dans le TAS. Ces recherches pourraient révéler de nouvelles cibles pour le développement de traitements pharmacologiques visant à améliorer les symptômes du TAS, ou encore identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux dans un cadre préclinique. Ces types d'études nécessitent cependant des approches invasives et des manipulations qui ne peuvent être réalisées dans un cadre clinique. Nous pensons que notre étude contribuera à une meilleure compréhension des types de cellules et des circuits impliqués dans l'altération de la perception sociale dans le TAS. Il s'agit de la première étude à caractériser ces altérations neuronales en utilisant une tâche adaptable aux études humaines, et elle a le potentiel de fournir des informations qui, à terme, amélioreront la qualité de vie des personnes diagnostiquées avec un trouble d'anxiété sociale.

Procédures

Pour étudier le trouble de l’anxiété sociale, les animaux soumis à un protocole d'instabilité sociale pendant 49 jours au cours de l'adolescence et de l'âge adulte, similaire à celle des personnes qui se déplacent fréquemment (EU 1). Leur anxiété, réponses sensorielles et interactions sociales seront évaluées par les taches comportementales (EU 1). Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes (EU 1). Pour comprendre les mécanismes neurobiologiques du control de l’attention, les animaux apprendront à effectuer une tâche comportementale non aversive et non douloureuse, basé sur les récompenses, pendant 45 minutes par jour (EU 2). En même temps, nous effectuons des mesures physiologiques afin d'enregistrer l'activité des neurones du cerveau (EU 2). Afin de permettre cet enregistrement, les animaux sont entraînés à accepter une contention partielle (immobilisation de la tête) (EU 2). Pour s'assurer que les animaux ne ressentent ni stress ni anxiété, ils seront progressivement habitués à l'installation et à l’immobilisation de la tête d’une minute à 45 minutes, pendant 5 jours. Cela permet aux animaux apprendre que cette immobilisation est réversible et pas douloureuse. Lorsqu'ils seront à l'aise dans le dispositif (pas de signes de détresse, capables de manger et boire), l'entraînement à la tâche comportementale commencera (EU 2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables mineurs pouvant être rencontrés dans cette étude seront liés à : 1. Induction du trouble d'anxiété sociale : Le paradigme du stress d'instabilité sociale (SIS49D) qui consiste à introduire des partenaires inconnus du même sexe dans la cage d'accueil (deux fois par semaine) sera mis en œuvre et provoquera du stress. 2. Immobilisation partielle : Une fixation au niveau de la tête pendant la tâche de prise de décision n'est pas douloureuse mais va entrainer du stress aux animaux pendant les premières séances. 3. Restriction hydrique : La mise en place d’une récompense hydrique implique une restriction d'eau (50 % de la consommation ad libitum) qui va entrainer une perte de poids maximale de 10 %.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Les expériences proposées dans cette étude nécessitent des circuits intacts et des mesures à la fois physiologiques et comportementaux. Un modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité de ces interactions neuronales et ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas adaptées à notre objectif expérimental car il s’agit d’une population clinique fragile et car les approches invasives sont nécessaires pour répondre à notre question scientifique. Les circuits neuronaux sont bien conservés chez les différentes espèces mammifères et sont donc susceptibles d'être fonctionnellement similaires chez les rongeurs et les humains. Utiliser des modèles plus simples, comme la mouche du vinaigre, n’est pas adaptée à notre projet, car cet organisme n’a ni les structures du cerveau ni les comportements nécessaires pour étudier le contrôle de l’attention.

Réduction

Une conception expérimentale soignée garantira la reproductibilité des résultats et, avec des techniques d'analyse statistique appropriées, l'utilisation d'animaux sera réduite au minimum. Partie des protocoles comportementaux, physiologiques, et pharmacologiques ont déjà mis en place pour une étude précédente sur la perception tactile. Cette première étude nous a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour réaliser ces expériences et avoir des résultats statistiquement valides. Cela nous a permis d'assurer la crédibilité de nos résultats avant de procéder à l'étude principale. Les données comportementales, physiologiques, et pharmacologiques seront recueillies auprès des mêmes animaux. Les neurones pyramidaux et inhibiteurs seront suivis simultanément et distingués par l'expression de rapporteurs spécifiques. Les injections du traitement seront suivies des injections contrôles dans les mêmes animaux. Ces mesures nous permettront de réduire le nombre d'animaux utilisés dans l'étude et de mesurer simultanément plusieurs paramètres.

Raffinement

Tous les résultats scientifiques concernant les facteurs influençant le bien-être des animaux, ainsi que leur capacité à ressentir et à exprimer la douleur, la souffrance, l'angoisse et les dommages durables, seront pris en compte. Les expériences seront conçues et réalisées de la manière la plus éthique possible. Le matériel adéquat sera mis à disposition des personnes autorisées, compétentes et dûment qualifiées, qui respecteront rigoureusement les procédures mises en place. Tous les animaux seront manipulés en utilisant les techniques les moins stressantes possibles, conformément à la littérature : l'utilisation d'un tunnel ou des mains en forme de coupe. L’hébergement en cages collectives garantira des interactions sociales pendant et après l’induction du TAS. Le paradigme pour l’induction du TAS débutera pendant l’adolescence, car il est souvent associé à une plus grande agressivité lorsqu'il est appliqué à des souris adultes. Deux tubes en carton et du matériel de nidification seront placés dans chaque cage afin de garantir la poursuite de tous les comportements normaux des animaux et de réduire les incidents d'agression. La nourriture sera également disposée dans la cage pour diminuer les conflits pendant l’induction du TAS, et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront transférés entre les deux sites dans leurs cages d'origine, pendant leur phase active, et placés dans l'obscurité à l'intérieur d'un chariot. Ils disposeront d’une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant la restriction en eau, les animaux seront pesés chaque jour, et leur alimentation en eau sera ajustée afin de s'assurer qu'ils ne dépassent jamais une perte de poids de 10 %. L'hydrogel, fourni comme source d'eau, est considéré comme un enrichissement, car les animaux peuvent le manipuler avec leurs pattes avant. Avant les tâches comportementales, les animaux seront habitués à la pièce d’expérimentation. Pour la tâche de prise de décision, ils seront progressivement familiarisés avec la fixation de la tête pour garantir un stress minimal. Des stimulations tactiles non douloureuses seront utilisées pendant la tâche perceptuelle. L'anxiolytique sera administré par voie orale, dissous dans la boisson des animaux. Pour euthanasier les animaux, les souris seront d’abord anesthésiées. Des points limites spécifiques et des mesures conservatoires seront définis pour chaque phase de la procédure.

Choix des espèces

La souris a été choisie afin de rester cohérente avec les études antérieures sur le stress chronique induit par les interactions sociales. Les souris soumises au modèle de stress chronique d'instabilité sociale, qui sera utilisé dans cette étude, présentent une augmentation de l'anxiété et des perturbations dans les interactions sociales. Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour l'étude du traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, les souris sont capables d'apprendre et d'exécuter des tâches de prise de décision perceptive, indispensables pour mieux comprendre les réponses tactiles. Conformément aux études précédentes, le protocole d’induction du TAS débutera à l’adolescence et se terminera à l’âge adulte. Toutes les autres étapes de l’expérience seront menées chez les souris adultes.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.