Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de deux peptides sur leur effet thérapeutique potentiel dans un modèle murin de maladie neurodégénérative impliquant la protéine Tau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet portent une mutation du gène Tau qui leur fait développer, à partir de quatre mois, une paralysie progressive des membres postérieurs. 676 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 436 et modéré pour 240. 240 subissent une biopsie de la queue pour génotypage et 304 une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, geste qui peut provoquer une ulcération de la cornée ou une exophtalmie, afin de faire produire dans leurs neurones un fragment de protéine censé bloquer l'agrégation de Tau. Certaines sont tuées un mois après l'injection, d'autres à cinq mois pour éviter des symptômes moteurs plus graves, et d'autres encore, écrit le porteur, "pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est notamment caractérisée par le dysfonctionnement de la protéine Tau dans les neurones du système nerveux central. Cette protéine, dont la dégradation normale est altérée dans la maladie, s’accumule et s’agrège de façon toxique dans les neurones et finit par entraîner la dégénérescence du cerveau. Nous avons mis en évidence qu’une protéine X interagissait avec Tau. Nous avons également constaté que l’expression de cette protéine X est faible dans le cerveau de patients atteint de la maladie d'Alzheimer et que cette baisse est associée à l’apparition des formes pathologiques de Tau dans les neurones. La partie de la protéine X impliquée dans l’inhibition de l'agrégation de la protéine Tau a été identifiée. Nous proposons dans ce projet d’étudier l’impact thérapeutique potentiel de cette partie de la protéine X sur la progression de cette maladie de Tau chez la souris. Pour cela, nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris porteur d’une mutation du gène de Tau générant une maladie proche de la maladie d'Alzheimer et présentant une accumulation de Tau dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière. Notre objectif à court terme est de produire dans le cerveau et la moelle épinière de souris deux formes plus ou moins longue de cette partie de la protéine X afin de déterminer à moyen terme leur efficacité à ralentir/guérir la maladie.
Bénéfices attendus
Si la production dans les neurones des parties de la protéine X, dont nous savons qu'elles sont capables d'empêcher l'agrégation de Tau, agit sur l'évolution de la maladie chez ces souris, de nouvelles perspectives thérapeutiques seraient envisageables chez l'homme atteint de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Une biopsie de la queue de courte durée sera effectué sur 240 animaux. Pour l'expérimentation, 304 animaux issus d'accouplement de souris homozygotes Tau seront soumis à une injection intraveineuse. Une injection rapide (moins de 20 secondes) est effectuée sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Certaines souris seront génotypées. La contention et la biopsie de queue sont des gestes bien maîtrisés mais qui peuvent générer de légères douleurs et un court moment de stress chez la souris. Le modèle de souris Tau présente un trouble moteur se développant spontanément et progressivement à partir de 4 mois d’âge et développe une paralysie légère et progressive des membres inférieurs pénalisant la mobilité de la souris. Les expériences d’injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire peuvent présenter dans de très rares cas une opacité/ulcération de la cornée ou une exophtalmie.
Devenir
Certaines souris seront euthanasiées pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt. D'autres seront euthanasiés à 1 mois post-injection et cela avant l'apparition des troubles moteurs (à partir de 4 mois) pour vérifier la présence de la partie de la protéine X dans les neurones. Enfin certaines souris vieilliront jusqu'à 5 mois d'âge pour vérifier l'effet de la partie de la protéine X sur l'agrégation de Tau dans les neurones, âge auquel elles seront toutes euthanasiées pour limiter l'apparition de symptôme moteur plus grave pour les souris.
Remplacement
Nos résultats obtenus sur des neurones en culture tendent à montrer un effet inhibiteur de cette partie de la protéine X sur l’agrégation et l’accumulation de la protéine Tau. Le passage sur un modèle souris est nécessaire pour évaluer les bénéfices potentiels de ces fragments de protéine au plan moléculaire et surtout au plan fonctionnel sur la motricité de l'animal. En effet, nous voulons voir dans ce modèle si ces fragments peuvent 1) être exprimé dans les neurones, 2) protéger ces cellules de la toxicité de Tau et 3) prévenir une perte fonctionnelle lié à la toxicité de ces neurones. N’ayant aucun autre modèle disponible pour cette évaluation indispensable avant des études possible chez l’homme, ce passage sur modèle animal est incontournable.
Réduction
Nous récupérerons les cerveaux et moelles épinières des animaux soumis aux tests de motricité pour l’analyse moléculaire. Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à notre étude, le cerveau et la moelle épinière de chaque souris seront coupés en deux. Chaque partie sera analysée par deux types d'analyses. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué par des tests statistiques et basé sur une comparaison de deux moyennes (témoins/traités) au cours du temps dans chaque expérience.
Raffinement
Le modèle de souris utilisé présente un trouble moteur léger à partir de 4 mois d’âge qui progresse jusqu’à 5 mois d’âge. Afin de limiter une possible souffrance de l’animal liée à un trouble moteur, la nourriture sera déposée directement et systématiquement dans la cage à partir de 4 mois d’âge. L’ensemble des expériences d’injection seront réalisées sur des souris anesthésiées. Une observation attentive de la douleur sera effectuée. Après réveil de l’animal, une évaluation hebdomadaire du mal être des animaux basée sur une observation attentive de 5 minutes du comportement de l'animal, sera effectuée par l’expérimentateur et/ou les animaliers sur différents critères (voir tableau scoring). Des analgésiques pourront être administrés par voie sous cutanée pour réduire au minimum une possible souffrance des animaux. Cette observation sera renforcée par un portoir dit "intelligent" dans lequel les souris seront analysées sur leurs motricité 24h/24h, 7j/7j. Cette activité nous permetta d’identifier les cages de souris présentant des niveaux de motricité anormales (agressivité, immobilité …) et d'intervenir précocément pour améliorer en conséquence le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Etant donné nos résultats positifs sur l’efficacité de la région de la protéine X à inhiber l’agrégation de la protéine Tau purifiée, nous avons choisi d’étudier ce modèle murin qui présente certaines anomalies observées dans la pathologie humaine aussi bien sur le plan moléculaire que comportemental. Ce modèle, déjà bien caractérisé, fait l’objet de nombreuses publications scientifiques et nous donne une bonne base de travail pour la mise en place de ce projet. La production de la région d'intérêt de la protéine X sera induite à 1 (stade précoce) et 3 (stade médian) mois d'âge; l’évolution de la tauopathie sera suivie au niveau moléculaire et fonctionnel sur la locomotion des souris et comparée à l’évolution des animaux témoins.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle d’embolie pulmonaire (EP) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un cathéter implanté par chirurgie dans la veine jugulaire, puis l'injection de caillots fabriqués à partir de leur propre sang pour boucher leurs artères pulmonaires : 1 615 rats vont être utilisés ainsi, dont 1 445 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'obstruction provoque une douleur et une détresse respiratoire plus ou moins marquée selon la zone touchée, suivie d'une baisse de mobilité, d'une perte d'appétit et d'une perte de poids. Il s'agit de mettre au point le modèle, puis d'y tester des candidats médicaments censés dissoudre les caillots. Tous les rats sont tués en fin de protocole, après une chirurgie qui expose le cœur et une mesure de pression dans le ventricule droit que le porteur juge "trop invasives pour envisager un réveil des animaux".
Objectifs
L'embolie pulmonaire est une pathologie cardiovasculaire résultant de l'obstruction d'une artère pulmonaire par un caillot de sang s'étant formé dans un vaisseau sanguin (appelé thrombose) éloigné, provenant généralement des veines des membres inférieurs. L'embolie pulmonaire est le 3ème syndrome cardiovasculaire aigu le plus fréquent dans le monde. Les facteurs de risques sont nombreux et incluent entre autres l’âge, les pilules contraceptives, l’insuffisance cardiaque, l’immobilisation, l’obésité, le tabagisme… La mortalité à la suite de l’embolie pulmonaire varie entre 2,5 et 30% selon les études. La plupart des décès par embolie pulmonaire surviennent quelques heures après l’événement, avant-même que le diagnostic ne soit réalisé dans 59% des cas. La prise en charge de la phase aigüe de l’embolie pulmonaire consiste à administrer des traitements qui vont venir dissoudre le caillot et rétablir la circulation dans l’artère pulmonaire obstruée tels que des anticoagulants, ou encore à effectuer le retrait du caillot par chirurgie. Cependant, cette dernière est réservée pour les cas les plus graves d'embolie pulmonaire et est une technique invasive alors que l'administration d'agent anticoagulant présentent des limites d'efficacité entre les individus et des effets secondaires tels que des risques d'hémorragie. L’objectif de ce projet est donc d'établir un modèle d’embolie pulmonaire chez le rat et de tester l’efficacité de nouveaux traitements pouvant dissoudre le caillot pour cette indication thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur le modèle rongeur d’embolie pulmonaire en agissant sur les paramètres des flux sanguins au niveau cardiaque (e.g., pression artérielle dans les cavités cardiaques ou vaisseaux sanguin pulmonaires) et anatomique/tissulaire. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’embolie pulmonaire.
Procédures
Les animaux vigiles sont d'abord soumis à un prélèvement de sang au niveau de la veine caudale de la queue (durée 5min) entre 2 et 24h avant l'injection des caillots. Ensuite, les animaux sont anesthésiés quelques heures plus tard puis une chirurgie est réalisée pour implanter un cathéter dans la veine jugulaire, localisée au niveau du cou afin d'injecter des mini caillots dans la circulation sanguine en direction des petites artères pulmonaires et ainsi induire une embolie pulmonaire (durée de l'intervention environ 30min). Un composé de référence ou un candidat médicament peut être administré sur animal éveillé par voie intraveineuse au niveau de la queue. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage soit directement avec leur congénère soit de manière individualisée (au maximum 10h) lorsqu'ils devront être traités avec un candidat médicament afin d'éviter qu'ils ne s'arrachent le cathéter veineux (permettant l'administation du composé) entre eux. Quelques heures plus tard, les animaux sont à nouveau anesthésiés (une à plusieurs fois) avant d'être soumis aux imageries cardiaques (environ 20 min pour chaque passage) pour contrôler les répercussions et l'évolution de l'embolie pulmonaire ou pour évaluer l'efficacité du traitement. A la fin de la procédure, une chirurgie est effecutée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le ventricule droit et dans l'artère pulmonaire puis pourront être soumis à un prélèvement sanguin par ponction directe dans le coeur avant d'être mis à mort par surdose d'euthanasiant (durée 15min). En parallèle, ces animaux pourront subir un prélèvement sanguin par ponction directe de la veine jugulaire réalisée sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de sang sur rat vigile, permettant de créer les caillots sanguins, nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille de la veine de la queue pouvant générer une douleur. L’induction de l'obstruction des vaisseaux sanguins pulmonaires par l’administration de caillots (provenant du sang prélevé sur le même animal), se réalise sous anesthésie gazeuse, après l’ouverture chirurgicale de la peau au niveau du cou et peut donc provoquer des douleurs au réveil. L’obstruction des vaisseaux pulmonaires en elle-même engendre une douleur et provoque une détresse respiratoire plus ou moins sévère en fonction de la localisation et de de la taille de la zone obstruée. Dans les heures qui suivent l’obstruction des vaisseaux pulmonaires, une baisse de la mobilité peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. L’administration des composés dans le système veineux nécessite l'insertion d'un petit tube dans la veine de la queue pouvant être à l’origine de douleur et d’inconfort. Par ailleurs, ce tube peut être arraché par l’animal et entrainer un saignement plus ou moins abondant. Une nouvelle anesthésie générale sera nécessaire à chaque fois qu'une échographie cardiaque (pour suivre l'évolution de la pathologie) devra être réalisée (4 au maximum sur 24h toutes les 2h, avant et après l'occlusion des vaisseaux) ou pour réaliser des prélèvements sanguins à la veine jugulaire. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine dans le coeur et le poumon seront effectuées sur animal anesthésié après exposition du coeur par chirurgie et pouvant être suivi par un prélèvement de sang. Les prélèvements de sang (sans excéder les 20% du volume total sanguin) entrainent une diminution du volume sanguin ainsi qu'une déshydratation accompagnée d'une sensation d'inconfort et de stress plus ou moins marquées en fonction du volume de sang prélevé. Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du médicament à tester : un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (coeurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du coeur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet des composés sur l’évolution des paramètres de flux sanguin cardiaques et anatomique/tissulaire après l’embolie pulmonaire, le recours à un modèle animal est nécessaire, ce que ne peut pas reproduire le modèle in vitro.
Réduction
Ce projet débute par une étude pilote pour mettre au point le modèle d’embolie pulmonaire. L’induction de l’embolie pulmonaire sera évaluée par un suivi sur plusieurs heures de la réponse des flux sanguins au niveau cardiaque par échographie, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. Une fois la technique d’induction maîtrisée, un groupe d’animaux induits sera comparé à un groupe contrôle afin de valider statistiquement l’induction du modèle et les variabilités observées. Dans un second temps, 2 composés de références seront testés à 3 temps différents, afin de définir la fenêtre thérapeutique à laquelle l’administration de traitement permettant de dissoudre les caillots est efficace pour avoir des effets bénéfiques. Ces 6 groupes expérimentaux seront comparés à un groupe contrôle sain et à un groupe induit avec l'embolie pulmonaire et non traité afin de sélectionner le temps d’administration des composés le plus efficace et de limiter le nombre de groupes expérimentaux nécessaires pour tester ensuite l’efficacité de candidats médicaments. Les animaux seront répartis de manière aléatoire après l’induction de l’embolie pulmonaire à partir des mesures de flux sanguins par échographie cardiaque, permettant ainsi d’homogénéiser les différents groupes et de diminuer la variabilité entre ces derniers.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 6 jour est respectée. Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné, habitué à de la microchirurgie vasculaire. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2 par cage. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’anesthésiques chimiques, d’analgésiques ou de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration comme la voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée ou voie intraveineuse). Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie pour induire l’embolie pulmonaire consistant à administrer des caillots de sang au niveau de la veine jugulaire sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue en phase post-opératoire jusqu’à la fin du protocole (24h maximum). De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Les échographies cardiaques seront également réalisées sous anesthésie (i.e., gazeuse). Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et maintenus et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux.
Choix des espèces
Le rat, classiquement utilisé en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie pulmonaire, vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique du rat dans les modèles d’embolie pulmonaire est comparable à celle des humains notamment en termes de modifications des flux sanguins et de réponse inflammatoire. Des rats de 5 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Effet de programmations thermiques précoces sur le comportement et la physiologie des juvéniles de truites communes (Salmo trutta L.)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Ni relâchées dans les rivières voisines, au motif d'un risque de pollution génétique, ni reprises par l'écloserie qui les a produites faute de place, les 96 truites communes juvéniles de ce projet seront toutes tuées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus bas. Elles sont soumises à jusqu'à quatre séances de pêche à l'électricité de vingt minutes pour être recapturées, puis à trois tests enchaînés sans pause : exploration d'une arène inconnue, confrontation à un objet nouveau, réaction à une élévation de la température de l'eau. La mesure du métabolisme les enferme ensuite trois heures dans une chambre respirométrique individuelle. Le porteur justifie le choix de l'espèce par sa valeur de modèle en écologie évolutive et par ses "forts enjeux économiques, écologiques et culturels", la population étudiée se trouvant en limite sud de son aire de répartition.
Objectifs
Dans le contexte actuel de forte pression sur la biodiversité aquatique, il est important de caractériser les liens entre variabilité environnementale et évolution des populations de poisson, notamment à travers l’étude de la variabilité des comportements et de la dépense énergétique, en lien l’adaptation. Une des conséquences du changement climatique est de produire des conditions variables lors des phases de croissance sous gravier des salmonidés, notamment des bas débits hivernaux et printaniers. Un des effets attendus est d’abaisser la hauteur d'eau sur certaines frayères et de réduire les écoulements intra gravélaire qui participent au maintien de températures optimales pour le développement des œufs et des larves. Ces conditions peuvent induire du stress qui peut avoir des conséquences à moyen terme, notamment sur la croissance et la survie, paramètres liés aux comportements et au métabolisme. Ainsi, les individus émergents possédant des caractéristiques comportementales et métaboliques adaptées, maintenues dans le temps, pourraient avoir de meilleures croissances et mieux survivre dans les conditions futures, où la fréquence des températures élevées augmentera. Ce processus pourrait orienter et contraindre l’évolution génétique, du métabolisme et des comportements au sein des populations. L'objectif du projet est de caractériser, chez la truite commune, Salmo trutta L., l'effet de l’augmentation des températures en phase embryonnaire et larvaire, avant nutrition exogène, sur le développement, le comportement et le métabolisme des stades plus avancés (alevin). Par ailleurs, il vise à déterminer si les traits produits par ces augmentations sont maintenus dans le temps, et si certains procurent un avantage lors de la première phase de développement en eau libre (croissance, survie).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent les connaissances fondamentales et appliquées sur l'écologie et l'évolution des salmonidés juvéniles soumis aux variations thermiques durant la phase embryo-larvaire, en conditions d’élevage et en milieu naturel. Le projet déterminera si 1) les programmations thermiques en phase embryo-larvaire ont des conséquences en termes de développement, de comportement et de métabolisme, selon l’intensité de celles-ci 2) les paramètres comportementaux et métaboliques individuels sont conservés entre l’émergence du gravier et 30 jours après une phase de croissance en eau courante 3) la croissance et la survie sont impactées par la programmation thermique appliquée aux stades embryo-larvaires. Ces connaissances permettront de nourrir les modèles visant à prédire l’évolution des populations de truite impactées par les changements climatiques futurs. Elles pourront également aider les gestionnaires et la filière piscicole en révélant les impacts de périodes à forte variabilité thermique sur le développement sous gravier ou en incubateur, et améliorer la prise de décision pour la gestion des débits naturels (éclusées, débits réservés, …) ou des températures en élevage. La mise au jour de comportements et de métabolismes mieux adaptés aux variabilités thermiques futures pourrait orienter les choix de géniteurs et de croisements dans les actions de repeuplement ou en production salmonicole.
Procédures
1) Pêche à l’électricité : un maximum de 4 pêches à l’électricité, d’une durée de 20 minutes, sera réalisé sur une période de 4 jours pour tenter de recapturer les 96 poissons. 2) Tests comportementaux : jusqu'à 96 individus seront soumis aux tests et un maximum 32 poissons par jour sera testé pendant 3 jours consécutifs. Les 3 tests s’enchaîneront sur une durée totale de 20 minutes sans arrêt marqué entre chacun. A. Test exploratoire : après 2 minutes d’acclimatation dans un abri, ce test de 4 minutes vise à étudier le comportement d’exploration de l’arène inconnue (nage libre). B. Test du nouvel objet : ce test de 4 minutes vise à étudier le comportement d’exploration d’un objet auparavant inconnu de l’individu. C. Test de thermotaxie : ce test de 10 minutes a pour objectif d’étudier le comportement et les déplacements de l’individu face à une augmentation de la température de l’eau. 3) Mesure du métabolisme : La procédure consiste à mesurer la consommation d'oxygène en chambre respirométrique individuelle grâce à des sondes à oxygène. Les 96 individus pourront être soumis à cette mesure. La chambre est alimentée en eau de bonne qualité physico-chimique. L’alimentation est fermée durant 20 minutes pendant lesquelles la diminution de la concentration en oxygène est mesurée. Les phases de circuits ouvert et fermé de 20 min alterneront durant 3 h.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles sur les animaux sont majoritairement liées au stress impliqué par les manipulations (changement de bac, stabulation, transport) et lors des prises de mesures comportementales et métaboliques. Pour le comportement il s’agit d’exposer des individus à des situations inconnues (nouvel environnement ou objet) ou des variations de température dans une arène expérimentale éclairée par rétro-éclairage (sous l’arène) ou éclairage indirect (plafond). Par ailleurs, l’estimation du métabolisme de base requiert l’isolement des poissons dans des chambres métaboliques individuelles, ce qui pourrait induire un stress.
Devenir
Le remise en liberté des poissons issus de l’élevage sur le lieu de l’expérimentation (rivières proches) n’est pas possible car il y a un risque de pollution génétique. Les animaux ne peuvent pas retourner dans l’établissement fournisseur car ils ont été produits et élevés pour les besoins de cette étude et il n’a pas la capacité d’accueil suffisante pour continuer à les maintenir en hébergement.
Remplacement
Les œufs et larves de truite se développent sous le gravier pendant environ 80 jours ce qui les expose potentiellement à des variations thermiques défavorables puisque les possibilités de changements volontaires d’habitat sont impossibles à cette phase. L’impact à moyen terme de ces variations durant le développement sous gravier et jusqu’à 30 jours après émergence en eau libre ne peut être estimé que sur des animaux vivants, ayant réalisé une croissance postérieure à la variation thermique. Aucune méthode substitutive telle que le travail sur des lignées cellulaires ou des tissus entiers n’est envisageable pour obtenir de tels résultats, puisque c’est le développement, le comportement individuel (déplacement, exploration, réaction à un stimulus thermique) et le métabolisme (consommation d’oxygène) de l’individu entier au repos qui seront étudiés.
Réduction
Le projet vise à tester l’effet d’une programmation thermique (14°C et 16°C) sur la croissance, l’activité d’exploration et le métabolisme des poissons. Le protocole évaluera l’effet de la programmation sur les individus à la fin de la phase embryo-larvaire, puis 30 jours plus tard. Pour cela 32 individus par programmation seront testés. Sur la base de données publiées et à l’aide d’un calculateur de puissance, la taille d’échantillon estimée lors d’une simulation pour détecter une différence de métabolisme de routine entre deux groupes est de 31 individus. Par ailleurs, une synthèse méthodologique publiée récemment indique que les recherches comportementales utilisant des arènes connectées par un couloir nécessitent de tester plus de 20 individus pour optimiser la probabilité de détecter des différences comportementales significatives entre groupes.
Raffinement
Acclimatation : Les 96 individus seront transférés de l’écloserie à la rivière expérimentale pour être acclimatés dans des bacs équipés d’abris. Une acclimatation sera observée en circuit semi-ouvert (équilibrage des masses d’eau) puis ouvert. Le lendemain, ils seront déposés dans un bief du chenal au crépuscule, dans une zone abritée. Ils pourront alors se répartir librement et commencer leur nutrition naturelle. Ce chenal est conçu pour une croissance sans alimentation artificielle, grâce à des proies naturelles dérivantes (insectes, zooplancton). L’eau du ruisseau, de bonne qualité physico-chimique, est filtrée, ce qui empêche l’entrée de poissons extérieurs. Le débit est modulable et produit des vitesses et profondeurs caractéristiques des habitats naturels. Le bief d'accueil des poissons abritera une densité similaire à celle des conditions naturelles. Un substrat de galets et graviers est déposé dans les biefs sur une hauteur importante. Des abris constitués de tuiles et de blocs seront installés afin de réduire la compétition entre individus. Le chenal sera couvert par un filet pour éviter la prédation aviaire et il est bordé d’un brise-vue afin de limiter le stress causé par les observateurs. Un opérateur effectuera une inspection visuelle quotidienne. En cas de mortalité accidentelle, les individus seront extraits du bief pour éviter toute dégradation environnementale (pathogènes, champignons). Points limites lors des tests comportementaux : des signes de stress important entraineront l’arrêt du test et l’isolement du poisson dans un bac afin de suivre sa récupération. Points limites lors des mesures métaboliques : si un individu s’agite dans la chambre plus de quelques secondes, il sera retiré et remplacé par un autre. Si le taux d’oxygène venait à baisser de façon importante l’individu sera retiré de la chambre et replacé en stabulation.
Choix des espèces
La truite commune (Salmo trutta L.) est une espèce d'eau froide dont la population étudiée est en limite sud de l'aire de répartition. Connaître ses capacités d'adaptation au changement climatique est important pour sa conservation et pour comprendre son expansion dans les milieux plus au nord, sous l’effet du changement climatique. Cette espèce à forts enjeux économiques, écologiques et culturels est en régression dans son aire sud mais pourrait s’étendre au nord dans les zones arctiques. C'est par ailleurs une espèce modèle en écologie évolutive. L'interprétation des résultats obtenus bénéficiera de l'abondante bibliographie existante bien que cette dernière soit très restreinte sur le maintien des phénotypes sous influence de programmations thermiques au cours du temps et en milieu naturel. Le stade juvénile, à partir de la première nutrition exogène et jusqu’à 30 jours de développement post-nutrition, sera utilisé. Ce stade a été choisi pour permettre aux poissons de débuter une nutrition autonome sur des proies sauvages, tout en évitant qu’ils ne s’habituent à une alimentation artificielle (pellets ou proies vivantes d’élevage). Cela garantit une adaptation immédiate à des conditions de vie sauvage, ce qui présente plusieurs avantages. Le premier est d’éviter aux individus un changement nutritionnel susceptible d’entraîner des conséquences comportementales et physiologiques, telles que l’absence de recherche active de proies ou un métabolisme façonné par une alimentation d’élevage. Ces éléments pourraient biaiser les résultats des tests. Le second avantage est lié aux objectifs du projet, qui consistent à tester la stabilité des phénotypes en conditions naturelles, depuis l’émergence jusqu’à 30 jours de développement. Cette période, extrêmement critique pour les individus, englobe l’établissement de la nutrition exogène, des comportements sociaux et de nage, ainsi que la mise en place des territoires et les premières phases de croissance en eaux libres.
Etude de la neuro-inflammation et du rôle de l’axe intestin cerveau dans un modèle murin d’anorexie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une perte de poids de 25 % imposée sur quarante-quatre jours, chaque animal isolé en cage individuelle pendant toute la durée du protocole : 432 souris sont soumises à cette dénutrition chronique, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Elles passent un test clair-obscur de quinze minutes et un test de construction de nid, 144 d'entre elles reçoivent en plus une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq jours, et 36 boivent un cocktail d'antibiotiques pendant quarante-sept jours. Le porteur décrit pourtant ce modèle comme entraînant des "altérations du bien-être animal plus faibles" et un "taux de mortalité nul", par comparaison avec la version aiguë du même protocole. Toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs tissus, une partie des prélèvements pouvant être échangée avec d'autres projets travaillant sur le même modèle d'anorexie.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont, premièrement, de rechercher la présence d'une inflammation au niveau cérébral (neuroinflammation) dans un modèle d'anorexie chronique chez la souris : le modèle Activity-Based Anorexia. Le second objectif de ce projet est d'évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal dans ce phénomène inflammatoire, via l'axe microbiote-intestin-cerveau. Deux zones d'intérêt seront particulièrement étudiées, au niveau du cerveau : l'hypothalamus, de par son rôle majeur dans le contrôle du métabolisme énergétique et de la prise alimentaire, mais aussi le circuit de la récompense, impliqué dans la composante du plaisir de la régulation du comportement alimentaire. En effet, les patients souffrant d'anorexie mentale présentent des atteintes cérébrales telles qu'une diminution des facultés cognitives, une baisse du volume cérébral et des anomalies de sécrétions d'hormones du métabolisme énergétique, ce qui justifie l'étude du cerveau dans le modèle murin d'anorexie. Ce projet permettrait d’apporter de nouvelles connaissances sur le fonctionnement du cerveau de ces patients et le rôle du microbiote intestinal dans le contexte de l'anorexie, afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques innovantes pour dépasser ces freins à la renutrition.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mettre en évidence l'existence ou l'absence de processus inflammatoires au niveau cérébral dans un contexte d'anorexie. Si de tels phénomènes sont montrés, nous pourront alors caractériser le rôle du microbiote intestinal, et notamment d'une molécule reliant le microbiote intestinal et la structure de l’intestin, dans la neuroinflammation associée à l'anorexie. Cette molécule étant connue pour son implication dans la régulation du comportement alimentaire. Il n'est pas possible de montrer de tels phénomènes chez l'Homme, l'accès au tissu cérébral étant nécessaire. L'utilisation d'un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. D'un point de vue fondamental, ces recherches permettront également de décrire l'activité et le phénotype des cellules gliales, les cellules non neuronales du cerveau, en condition de restriction sévère, ainsi que leurs interactions avec les centres cérébraux de régulation de la prise alimentaire. Il est également à noter que ce projet permettra de mieux caractériser le modèle ctivity-based anorexia sous sa forme chronique (44 jours), modèle moins bien décrit dans la littérature que le modèle aigu (17 jours), bien qu'il soit plus pertinent quant à sa comparaison avec la pathologie chez l'Homme, et moins sévère pour les souris (score de mortalité nul). De plus, il est habituellement observé chez les souris activity-based anorexia femelles une augmentation de la prise alimentaire et du poids corporel en fin de protocole, les souris s'éloignant ainsi de la pathologie anorexique souhaitée. Ce phénomène est évité dans le modèle chronique, puisque la prise alimentaire est contrôlée par l'expérimentateur. Le poids corporel cible des souris est ainsi maintenu stable tout le long du protocole. Sur le long terme, ce projet permettra une meilleure compréhension de l’interconnexion des acteurs de l'axe microbiote-intestin-cerveau dans un contexte de dénutrition chronique, et plus particulièrement le rôle du microbiote intestinal dans la neuroinflammation et le comportement alimentaire, ce qui permettra de proposer des solutions thérapeutiques innovantes pour aider à la renutrition des patients anorexiques, par exemple avec des probiotiques ou par la modulation directe de facteurs de l'inflammation.
Procédures
100% des animaux, soit 432, seront manipulés tous les jours pour la pesée et le relevé des critères de bien-être animal. Les 432 animaux seront en état de dénutrition chronique (perte de poids cible de 25% sur 44 jours). 100% des animaux, soit 432, subiront une injection d'anesthésique/analgésique de 3 secondes, ainsi qu'une contention de 2 min pour la mesure de la composition corporelle deux fois, au début et en fin de protocole, sur animal vigile. Les 432 animaux suivront des tests comportementaux afin d'évaluer leur état d'anxiété et de dépression, à savoir un test clair-obscur de 15 minutes (animaux placés dans un dispositif infra-rouge enregistrant leurs déplacements) qui peut générer un stress dû au nouvel environnement, et un test de formation de nid (nouveau coton placé dans la cage, évaluation par observation au bout de 24h, le coton est laissé aux souris jusqu’à la fin du protocole en tant qu’enrichissement) qui n'engendre ni stress ni douleur. 144 animaux recevront une injection intrapéritonéale de 3 secondes une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, afin d’évaluer le rôle d’une molécule clé dans le dialogue bactérie-cellules intestinales. 36 souris auront un cocktail d'antibiotiques dans leur eau de boisson sur l'ensemble du protocole de restriction et 3 jours en amont, soit 47 jours.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux seront isolés le temps du protocole, avec un faible impact sur le score de bien-être animal pour les animaux contrôles, comme observé dans nos protocoles précédents. Les animaux dénutris, quant à eux, peuvent présenter une diminution de la prise hydrique, et une hyperactivité anticipatoire (avant l'accès à l'alimentation), particulièrement les premiers jours de restriction. Cependant, ce modèle chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Les animaux dénutris ont tout de même une perte de poids importante au cours du protocole, en accord avec ce qui est observé en clinique, cet aspect fait l’objet d’un suivi quotidien. Le suivi du bien-être animal est en effet effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique et activité physique, baisse de la température corporelle. Lors des mesures de composition corporelle, la contention de 2 minutes engendre également un stress aigu. La réalisation des tests comportementaux peut également engendrer un stress, de par le changement de pièce d'expérimentation, et la découverte du dispositif. Les animaux dont le microbiote intestinal a été supprimé par antibiothérapie peuvent présenter des signes de douleurs intestinales, de la même manière que précédemment, ces animaux sont surveillés quotidiennement sur la base de critères de bien-être animal. Concernant les animaux génétiquement modifiés, aucune nuisance n'est donc observée sur ces animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée, soit la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet ou inversement sur d’autres projets activity-based anorexia ne récupérant pas le cerveau.
Remplacement
Ce travail est un projet de recherche intégré, la dénutrition étant la conséquence de relations métaboliques inter-organes complexes. Il permettra d’analyser les différents signaux mettant en jeu des relations importantes entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour prendre en compte cet aspect multi-organes. De plus, l'anorexie mentale étant une pathologie psychiatrique, l'étude du comportement (prise alimentaire, activité physique, tests d'anxiété) est nécessaire à l'interprétation des résultats. Ces paramètres comportementaux nécessitent l'emploi de modèles de rongueurs. Cependant pour des études plus mécanistiques telle que l’étude des relations microbiote-cellules intestinales, nous avons recours à des techniques de culture cellulaire in vitro.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, en prenant en compte les résultats de la littérature et de notre équipe sur le modèle activity-based anorexia aigu, nous avons fait le choix de ne pas réaliser certains groupes contrôles et notamment les animaux ayant un accès libre à l’alimentation et à une roue d’activité. En phase terminale du protocole, le maximum de tissus est prélevé et certains peuvent être partagés pour d'autres projets. Les analyses ont été préalablement optimisées et nous permettent de limiter le nombre d’animaux par groupe à 12. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Il n'est donc pas nécessaire de prévoir plus d'animaux pour compenser une éventuelle perte au cours du protocole. Plus précisément, nous nous sommes basés sur de premiers résultats antérieurs du laboratoire dans le modèle activity-based anorexia aigu et avons calculé à l’aide de formules statistiques qu’il faudrait 12 animaux par groupes pour obtenir un pouvoir statistique suffisant pour la comparaison des groupes entre eux.
Raffinement
Après la période d'acclimatation à l'animalerie d'une semaine, les animaux sont transférés individuellement dans leur cage d'expérimentation. Ce transfert peut s'avérer stressant pour les animaux, c'est pourquoi une nouvelle période d'une semaine d'acclimatation à ces nouvelles conditions est appliquée. Concernant l'enrichissement, du papier kraft est ajouté dans toutes les cages, ainsi qu’un carré de coton ce qui permet la construction de nids pour compenser l'isolement des souris. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Le suivi du bien-être animal est tout de même effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique, activité physique et baisse de la température corporelle. Ces critères permettent de décider de l'atteinte ou non des points limites. De plus, comme indiqué dans les dernières recommandations, les souris sont manipulées quotidiennement en les faisant monter dans le creux de la main de l'expérimentateur de manière volontaire, et non pas en les attrapant par la queue. En effet, il a été montré que cela réduit significativement le stress et l'anxiété des souris. Un seul et même expérimentateur réalise les manipulations des animaux au quotidien, ce qui permet une meilleure habituation des animaux aux gestes pratiqués et à la présence d'un individu, réduisant le stress. L’antibiothérapie, pour les animaux concernés, est réalisée dans l’eau de boisson et non par administration orale comme fréquemment retrouvé dans la littérature, ce qui limite le stress des animaux et les risques liés à l’administration orale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée dans ce projet est communément utilisée dans les modèles soumis à des interventions nutritionnelles. De plus, il s’agit d’une souche ayant un bon taux de réponse dans le modèle activity-based anorexia. C’est un modèle validé au sein du laboratoire et à l’échelle internationale. Les modèles génétiques utilisés dans ce projet sont d’ailleurs construits sur ces mêmes souris. L'anorexie mentale touche majoritairement les adolescents et jeunes adultes avec 75% des patients déclenchant leur pathologie avant l'âge de 22 ans. Pour mimer au mieux les conditions d'apparition de la maladie nous utiliserons donc des souris de 6 semaines à leur arrivée au laboratoire. En tenant compte des deux semaines d'acclimatation, à l'animalerie puis aux conditions expérimentales, le protocole de restriction débutera sur des souris âgées de 8 semaines, ce qui correspond bien à un stade adolescent. La réussite du protocole activity-based anorexia chronique sur des souris de cet âge a d'ailleurs été montrée dans un article. De la même manière, les animaux arriveront à l'âge de 5 semaines pour les protocoles avec antibiothérapie et pour les animaux génétiquement altérés, afin de tenir compte de ces traitements avant de débuter le protocole de restriction à l'âge de 8 semaines.
Eclairage sur MafB : Le chef d’orchestre qui oriente les cellules souches vers la voie myéloïde.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris qui perdent 20 % de leur poids maximum, ou dont le score sur la grille de douleur atteint 10 à 12, sont mises à mort. 4 233 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 4 113 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse, des injections mimant une infection, et pour certaines une destruction de la moelle osseuse par rayons X suivie d'une greffe de cellules, avec fatigue, hypothermie et perte de poids pendant une quinzaine de jours. Le porteur cherche à établir le rôle d'un facteur de transcription dans la fabrication des globules blancs, et indique que les animaux issus de l'élevage passent d'une procédure à la suivante, les reproducteurs mis à part, avant d'être tués.
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'explorer les mécanismes moléculaires permettant la différenciation des cellules souches sanguines, appelées cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment vers la différentiation en globules blancs. Les CSH, résidant dans la moelle osseuse, sont des cellules à longue durée de vie dotées d'une capacité d'auto-renouvellement, nécessaire pour renouveler les différentes cellules composant le sang. En raison de ces caractéristiques, les CSH doivent relever le défi de maintenir un équilibre délicat entre auto-renouvellement et différentiation extensive pour reconstituer les cellules sanguines épuisées. Cet équilibre délicat est crucial pour maintenir l'homéostasie et répondre aux demandes évolutives de l’organisme. Les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs ne sont pas totalement compris. De par nos résultats antérieurs, le facteur de transcription MafB pourrait jouer un rôle dans cette différenciation. Nous avons montré que les CSH possèdent la capacité de conserver une mémoire des signaux infectieux précédents. Cette mémoire, caractérisée par un ensemble de modifications épigénétiques, a été appelée "immunité entraînée". Ce phénomène a des implications significatives dans la mise en place d’une seconde réponse adaptée à la suite d’un même stimulus. Nos résultats suggèrent que le facteur MafB 1/ joue un rôle dans la différenciation des CSHs en condition homéostatique et inflammatoire (notamment en favorisant la production des cellules myéloïdes (hématies, polynucléaires, monocytes et plaquettes en urgence), 2/ serait impliqué dans la mécanistique de mise en place de la mémoire entrainée des CSH. Alors que MafB est une protéine qui intéragit avec elle-même, dans certains contextes inflammatoires, elle peut former un complexe avec un autre facteur Fos qui pourra potentiellement impacter la différenciation des CSHs et la mise en place mise en place de la mémoire entraînée. Notre projet aura donc pour objectifs: 1/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions homéostatiques ; 2/ l’étude du rôle de MafB dans les mécanismes impliqués dans la différenciation des CSHs en conditions inflammatoires de type myélopoïèse d'urgence et dans l’immunité entrainée au niveau des modifications épigénétiques induites par la primostimulation, 3/ la capacité des CSHs à reconstituer totalement une moelle osseuse en absence de MafB ou en présence du complexe MafB/Fos
Bénéfices attendus
L’étude de la différenciation des CSHs présente de nombreux bénéfices potentiels, tant pour la recherche fondamentale que pour les applications cliniques. Sur le plan scientifique, elle permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent la transformation des CSH en différents types de cellules sanguines, notamment les hématies, les polynucléaires, les monocytes et les plaquettes. Cette connaissance approfondie pourrait aider à identifier des dysfonctionnements immunitaires responsables comme par exemple des formes graves du SARS-Cov2 ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques modulant l’activité de ces cellules. En clinique, une meilleure maîtrise de la différenciation des CSH pourrait améliorer les thérapies cellulaires, notamment les greffes de moelle osseuse, et favoriser le développement de traitements régénératifs pour réparer les tissus endommagés. En outre, ces avancées pourraient contribuer à la création de thérapies personnalisées, en optimisant l'utilisation des cellules souches pour répondre aux besoins spécifiques des patients. Finalement l’immunité entrainée représente un concept novateur et sa modulation une alternative thérapeutique en tant que solution de remplacement aux antibiotiques en favorisant la création de vaccins à large spectre.
Procédures
Cette procédure a pour but de produire les animaux d’intérêt utiles au projet à savoir des souris issues des lignées MafB flox CSF1R Cre, MafB flox Vav1 Cre, MafB Flox Vav1 Cre PU1 KI GFP et MafB Flox/MafB E269R Vav1 Cre. D'après nos études précédentes, nous considérons qu'environ 3% des animaux necessiteront un second génotypage fait par prélèvment caudal (--28 jours et sera effectué sous anesthésie gazeuse isofluorane 4%. Le génotypage du modèle PU1 KI GFP se fait de par l’analyse de la protéine PU1 KI GFP présente dans les souris issues de la lignée MafB Flox Vav1 CRE PU1 KI GFP par analyse sanguine en cytométrie en flux. Pour cela, un prélèvement sanguin d'un volume de 100µL effectué en retro-orbital sera effectué sur des souris âgées de 5-7 semaines. . Certaines souris pourront subir en vigile injection intra-veineuse qui entraine une légère douleur de courte durée pour l’injection d’un traceur avant mise à mort, Certaines souris recevront une stimulation inflammatoire soit en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse soit en injection intrepéritonéale sur animaux vigiles. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’une semaine) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Pour les stimulations inflammatoires, cela varie de 1 à 3 jour en fonction du type de stimulation. Certaines souris subiront une myéloablation par irradiation aux rayons X sur animaux vigiles (quelques 5 min) puis une transplantation en injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie gazeuse d’une suspension de cellules de moelles osseuses. Les souris subiront un prélèvement sanguin (entre 1 et 4 prélèvements séparés d’un mois) au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse puis une injection intrepéritonéale unique pour l’injection d’un traceur avant mise à mort. Les injections ou prélèvements entrainent une légère douleur de courte durée (quelques minutes) localisée au niveau de la zone d’injection ou de prélèvements.
Impact sur les animaux
La myéloablation peut rendre les animaux plus susceptibles aux risques infectieux. La répétition des gestes techniques et l’inconfort que peut ressentir l’animal après une injection mimant une infection ou après une myéloablation pourront engendrer une souffrance modérée. Les souris pourront présenter une fatigue, une légère hypothermie et une perte de poids pendant 2 jours (injection mimant une infection) ou 15 jours (transplantation suivant une myéloablation). Les animaux peuvent présenter des signes de stress liés à leur contention
Devenir
Animaux conservés pour la suite des procédures après la procédure 1 (excepté pour les réproducteurs) et mise à mort pour les autres procédures.
Remplacement
Afin d'étudier le potentielle rôle du gène MafB dans la régulation de la différenciation des cellules souches hématopoiétques, nous ne pouvons pas remplacer le modele murin. En effet, les cellules souches hematopoiétiques étant particulièrment régulées par leur environement, d'un point de vue physique via des interactions directes cellules-cellules mais aussi de part l'ensemble des médiateurs chimiques régulant leur communication, l'utilisation de lignée cellulaire est impossible. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons autant que possible leur utilisation.
Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaires pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilatéral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance bêta de 80%). Nous avons également choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.
Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'améliorer le bien être de l'animal pour obtenir des données fiables. Une anesthésie générale sera utilisée durant les procédures expérimentales (prélèvement sanguin et transplantation). Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si le score de la grille de douleur atteint 10-12, soit le cas sévère, les animaux seront alors mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement est enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Disponibilité de modèles génétiquement modifiés nécessaires aux études réalisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés entre 8 semaines et 2 ans sachant qu’il n’est pas exclu que l’impact de la délétion de MafB évolue au cours du vieillissement.
Étude métabolique chez des souris modèles des maladies neurodégénératives (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, en deux séries de six réparties sur deux heures et espacées d'une semaine : 1 019 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit aussi une chirurgie sous anesthésie pour injecter des composés dans le cerveau, jusqu'à seize jours d'isolement en cage individuelle pour la mesure du métabolisme, et jusqu'à douze séances d'imagerie. L'objectif déclaré est de relier dérèglement métabolique et neurodégénérescence chez des souris porteuses de mutations liées à la maladie d'Alzheimer, l'une des lignées développant en outre des troubles musculaires ou une paralysie à partir de neuf mois. Le porteur retient la souris parce que la régulation métabolique y serait proche de celle de l'humain et que les modèles existants ont été construits sur cette espèce, tout en annonçant que la méthode d'imagerie validée ici "pourra réduire significativement le nombre d'animaux" plus tard.
Objectifs
Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.
Procédures
- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.
Impact sur les animaux
- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.
Remplacement
L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.
Choix des espèces
L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.
Étude des mécanismes contrôlant la formation et le remodelage de l’os chez la souris (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
936 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 552 d'entre elles et modéré pour 384. Entre le septième et le douzième jour de vie, chaque souriceau subit une biopsie de la queue pour établir son profil génétique, puis viennent un recueil d'urine par contention, deux injections de marqueurs et une imagerie osseuse haute résolution sous anesthésie profonde. Le sang et les organes sont prélevés après mise à mort. L'objet déclaré est de décrire un défaut osseux lié à une mutation rare, à six âges différents et sur seize animaux par sexe et par profil génétique, ce qui commande l'effectif, et le porteur conclut que les modèles cellulaires ne reproduisant ni la chronologie du développement osseux ni les interactions entre tissus, le recours à l'animal est "nécessaire".
Objectifs
La maladie rare étudiée est associée chez l'homme à un défaut de croissance. Une mutation génétique particulière associée à la maladie entraine un défaut de l’os chez la souris et des taux anormaux dans le sang de composés associés à la biologie de l’os. Il apparaît donc nécessaire d’étudier les conséquences de cette mutation dans le modèle murin, qui récapitule des défauts observés chez les patients. Dans ce cadre, les objectifs du projet seront de réaliser des dosages à partir de prélèvements sanguins et d’urine ; et d’utiliser une technique d’imagerie sur des animaux placés sous anesthésie générale pour obtenir des images haute résolution de l’os, facilitant les mesures et la visualisation d’anomalies de l’os. La réalisation de ce projet, sur deux établissements utilisateurs (EU) différents, permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le développement et la croissance de l’os, et de mieux comprendre la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet renforcera les connaissances de base sur le mécanisme de formation osseuse et les fonctions développementales de ce gène. Ces découvertes pourraient également être utiles en clinique pour anticiper les problèmes de santé liés au vieillissement chez les patients atteints de cette maladie rare et chez d'autres patients présentant des maladies osseuses.
Procédures
Le profil génétique des animaux sera établi à l’aide d’une biopsie de queue (durée de 30 secondes) entre 7 et 12 jours post-natal (EU1). Un recueil des urines sera effectué par simple contention des animaux, une seule fois (1 minute - EU1). Les deux injections de marqueurs (30 secondes par injection - EU1), nécessaires à l’analyse par imagerie (5 minutes par radiographie - EU2) , seront réalisées sur animaux avant leur anesthésie profonde (EU2) pour l’analyse par imagerie (EU2) et le recueil de sang (EU2).
Impact sur les animaux
La biopsie de queue entre 7 et 12 jours post-natal peut entrainer un stress dû à la contention et une légère douleur. Le prélèvement d’urine se fait par contention de l’animal et peut également engendrer un stress pour les animaux du fait d’être manipulé. Les injections par voie intra-péritonéale peuvent entrainer une douleur minime ou un inconfort passager. Le transport des animaux vers un autre centre parisien peut lui aussi engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et de sang pour analyse.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de récapituler les processus impliqués dans la formation et le vieillissement osseux, la chronologie des processus développementaux et les interactions des cellules osseuses avec leur environnement et les autres tissus, ainsi que l’analyse de la structure de l’os. Le recours à l’animal est donc nécessaire.
Réduction
Nous estimons la taille de l’échantillon à 16 animaux par sexe et par profil génétique souhaité à chaque temps pour réaliser des analyses statistiques fiables et obtenir des résultats scientifiques robustes aux différents âges de 6, 12, 15, 18, 20 et 52 semaines. Toutes les procédures expérimentales sont réalisées sur les mêmes lots d’animaux à un âge donné grâce notamment à l’utilisation successive de plusieurs techniques permettant le recueil d’urine et de sang pour l’analyse de plusieurs paramètres en une seule observation et l’analyse de plusieurs paramètres de l’os grâce à l’imagerie sur des animaux placés sous anesthésie générale.
Raffinement
Tous les animaux seront surveillés quotidiennement. Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Plusieurs points limites sont mis en place dans le but d'identifier une éventuelle souffrance ou détresse des animaux et si nécessaire de les mettre à mort. L’imagerie sera effectuée sur des animaux placés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
La souris est un animal dont les processus de formation de l’os sont semblables à celui de l’Homme, permettant un parallèle avec la maladie humaine. De plus, de nombreux appareils et techniques sont adaptés et disponibles pour le modèle souris. Cette espèce présente donc tous les avantages pour répondre à l’objectif de ce projet, soit étudier la dynamique et les fonctions de l’os liés à un défaut génétique au cours du vieillissement. Ce projet a donc pour objectif de mieux décrire le phénotype osseux au cours du vieillissement en utilisant des animaux âgés de 6, 12, 15, 18, 20 et 52 semaines au moment des analyses.
Évaluation du rôle de l’adipocyte dans la régulation du métabolome systémique au cours du vieillissement et de son implication dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge – EU2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant repasser la même batterie de tests jusqu'à trois fois au cours de sa vie. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant douze semaines, des prises de sang à la queue, des gavages au glucose, et sont isolées 48 heures en cage de calorimétrie. S'y ajoutent une course sur tapis roulant et une suspension à une grille inversée, dont la durée dépend des capacités de chaque animal, jusqu'à quarante-cinq minutes pour la première et trente pour la seconde. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs tissus, au bénéfice de cibles thérapeutiques contre la fonte musculaire liée à l'âge que le porteur situe au conditionnel et à distance.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous étudierons l'impact de la perte d'adipocytes chez la souris jeune et âgée (en utilisant une souris transgénique) afin d'étudier l’implication du tissu adipeux dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement et dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser l’implication de l'adipocyte dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du tissu adipeux ayant un impact délétère sur la physiologie musculaire, l’identification d’un pool de métabolites appartenant à l’axe tissu adipeux-muscle dérégulés avec l’âge devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter dans le contexte de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge.
Procédures
Nos animaux recevront un traitement pharmacologique tous les 3 jours par injection intra-péritonéale (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 12 semaines (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pourront également être réalisés (prélèvements de sang pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 3 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 4 semaines entre deux tests.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 2. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 3. Des injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une douleur au niveau du site d'injection (les sites d'injection seront changés à chaque intervention) 4. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 5. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
Ce projet vise à démontrer l’existence d’une communication inter-organes via les métabolites entre le tissu adipeux (et plus particulièrement son type cellulaire majoritaire : l'adipocyte) et le muscle squelettique au cours du vieillissement. Bien que nos données préliminaires obtenues in vitro et les données bibliographiques actuelles suggèrent l’existence d’un tel axe, le démontrer nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier. En effet, notre objectif est d’étudier l’impact d’une manipulation de l'adipocyte à la fois sur les compartiments sanguin et musculaire. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir leur stress et permettre aux animaux de faire un nid. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour les expériences de calorimétrie indirecte). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins deux fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. Lors du transport des animaux entre les établissements utilisateurs, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 12-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de déterminer la contribution du tissu adipeux dans la régulation du métabolome circulant et la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.
Évaluation du rôle de l’adipocyte dans la régulation du métabolome systémique au cours du vieillissement et de son implication dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge – EU1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
720 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à trois fois la batterie complète de tests au cours de sa vie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le programme comprend une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant douze semaines, des prises de sang à la queue, 48 heures seule en cage de calorimétrie, une suspension à une grille retournée jusqu'à trente minutes, une course sur tapis roulant jusqu'à quarante-cinq minutes et huit prélèvements successifs pour les tests au glucose et à l'insuline. Certaines ont 18 à 24 mois, l'étude portant sur le vieillissement, et toutes sont tuées à la fin pour collecter leurs tissus. Le porteur attend de ce travail de futures cibles thérapeutiques contre la fonte musculaire liée à l'âge, quand les jeûnes, les isolements et les épreuves d'effort sont, eux, déjà programmés.
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous étudierons l'impact de la perte d'adipocytes chez la souris jeune et âgée (en utilisant une souris transgénique) afin d'étudier l’implication du tissu adipeux dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement et dans la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l'âge. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser l’implication de l'adipocyte dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du tissu adipeux ayant un impact délétère sur la physiologie musculaire, l’identification d’un pool de métabolites appartenant à l’axe tissu adipeux-muscle dérégulés avec l’âge devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter dans le contexte de la sarcopénie et des désordres métaboliques liés à l’âge.
Procédures
Nos animaux recevront un traitement pharmacologique tous les 3 jours par injection intra-péritonéale (moins de 15 secondes par souris) pour une durée maximale de 12 semaines (EU1/2). Ces animaux pourront être soumis à des prises de sang à la veine de la queue (durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris) (EU1/2). Leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte (isolement en cage individuelle pendant 48h) (EU2/2). Leur fonction musculaire pourra être évaluée à l'aide de différent tests non invasifs (mesure de l'équilibre (durée: 5 minutes maximum, répétée 2 fois avec 15 minutes de repos entre 2 essais ; analyse de leur démarche (durée approximative: 5 minutes), mesure de leur force musculaire (durée totale approximative: 5 minutes, 3 mesures consécutives séparées par 1 min de repos, expérience répétée une fois après 15 min de repos), test de suspension sur une grille inversée (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques secondes à 30 minutes), course sur tapis roulant (durée dépendante des capacités de l'animal: de quelques minutes à 45 minutes) (EU1/2). Des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pourront également être réalisés (prélèvements de sang pour la mesure de la glycémie à 8 temps donnés espacés de 15 minutes minimum (8 x 5 secondes) suite à un gavage au glucose (moins de 15 secondes par souris) ou une injection intra-péritonéale d'insuline (moins de 15 secondes par souris) (EU1/2). L'ensemble de ces tests pourront être répétés jusqu'à 3 fois dans la vie de l'animal, avec une période minimale de 4 semaines entre deux tests.
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : 1. L’isolement des souris pour la calorimétrie indirecte (48h au total, acclimatation puis mesure) est une source de stress. Les animaux gardent toutefois un contact visuel avec leurs congénères dans les cages voisines et sont rapidement remis dans leur cage d’origine ; 2. stress au moment des manipulations pour les tests de caractérisation de la fonction musculaire et métabolique (habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux); 3. Des injections intra-péritonéales répétées peuvent induire une douleur au niveau du site d'injection (les sites d'injection seront changés à chaque intervention) 4. la mise à jeun des animaux représente une source de stress (le temps de jeûne sera limité à 6 heures). 5. les prises de sang à la queue sont source d'inconfort (prélèvement d'un volume restreint de sang).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.
Remplacement
Ce projet vise à démontrer l’existence d’une communication inter-organes via les métabolites entre le tissu adipeux (et plus particulièrement son type cellulaire majoritaire: l'adipocyte) et le muscle squelettique au cours du vieillissement. Bien que nos données préliminaires obtenues in vitro et les données bibliographiques actuelles suggèrent l’existence d’un tel axe, le démontrer nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier. En effet, notre objectif est d’étudier l’impact d’une manipulation de l'adipocyte à la fois sur les compartiments sanguin et musculaire. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes problématiques scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques actuelles et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet. Compte tenu de la variabilité des capacités physiques et des paramètres métaboliques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 10 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Ce nombre d’animaux est classiquement utilisé dans la littérature pour réaliser ce type d'études, en particulier dans un contexte de vieillissement, où la variabilité inter-individuelle tend à augmenter avec l'âge. Dans un souci de réduction, le projet a été designé de façon à réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes d'animaux dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour l’analyse du métabolome (par spectrométrie de masse) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques. Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement dans les cages pour amoindrir leur stress et permettre aux animaux de faire un nid. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour les expériences de calorimétrie indirecte). Les cages seront passées en revue deux fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur, problème de dentition, et pesés au moins deux fois par semaine. Les tests fonctionnels seront réalisés suite à une habituation des animaux aux expérimentateurs ainsi qu'aux dispositifs expérimentaux utilisés, afin de réduire le stress engendré et améliorer la reproductibilité des résultats. Lors du transport des animaux entre les établissements utilisateurs, l’enrichissement de leur cage sera multiplié afin de les occuper pendant le trajet (coton salivaire et bouts de bois à ronger en plus du matériel de nidification). Les animaux seront protégés en permanence des intempéries, des rayons du soleil ou des écarts de température. Leur exposition au bruit et aux vibrations sera limitée au maximum et les souris ne seront jamais transférées en présence d’espèces différentes – hors rongeurs – dans le même véhicule. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris de différents âges : 3-6 mois pour les souris « jeunes », 12-14 mois pour les souris adultes d'âge moyen et 18-24 mois pour les souris « âgées » afin de déterminer la contribution du tissu adipeux dans la régulation du métabolome circulant et la mise en place de la sarcopénie et des désordres métaboliques qui lui sont associés au cours du vieillissement.
Effets des ingrédients alimentaires olfactifs sur la physiologie intestinale et le microbiote
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour tester un ingrédient alimentaire odorant, 874 souris vont être utilisées, dont 677 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. On leur implante sous la peau une pastille qui libère en continu l'hormone du stress, on les force sept jours durant à éviter l'eau une heure par jour, on leur supprime l'odorat par un traitement, on les prive de nourriture dix-huit heures et on les héberge seules quatre jours. Trois distensions colorectales par souris mesurent la douleur viscérale, avec un risque de perforation du côlon repéré à la présence de sang. Le porteur annonce comme bénéfice de "mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs" sur la physiologie intestinale.
Objectifs
Ce projet visera à tester différents ingrédients olfactifs sur la physiologie intestinale (motricité intestinale, perméabilité intestinale, la distension colorectale et le microbiote) en condition contrôle et pathologique (modèle de stress chronique). Nous allons tester un ingrédient olfactif. Nous avons déjà obtenu des effets bénéfiques au niveau émotionnels de l’ingrédient olfactif. Nous souhaitons par la suite mettre en évidence un dialogue cerveau-intestin par le biais de cette modalité sensorielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude préclinique sont de mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs via l’olfaction sur la physiologie intestinale.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation d’un pellet (=pastille qui libère en continu l'hormone du stress) (chirurgie 5minutes, 1 intervention). Ils subiront un stress aigu (stress dû à l’évitement de l’eau; 7 jours pendant 1heure). Ils vont recevoir un traitement (2 administrations), cela va entrainer une perte de l’olfaction. Ils subiront 1 prélèvement sanguin (1 fois sous anesthésie gazeuse). Ils subiront la distension colorectale 3 fois par souris étalé sur 1 semaine afin de regarder la douleur. Les animaux seront aussi soumis à 5 tests comportementaux afin d’étudier l’olfaction, l’anxiété, la résignation. Les souris recevront un seul gavage (10 secondes). Les souris vont subir une mise à jeun de 18heures une fois. Les souris seront en hébergement individuel pendant 4 jours."
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être dus aux chirurgies et / ou au traitement avec la corticostérone et/ou aux tests comportementaux. Ils peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : hyperactivité puis isolement et indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal. Si une présence de sang est décelée en fin de distension, les animaux sont surveillés dans les heures qui suivent ainsi que le lendemain pour vérifier une éventuelle perforation du colon.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de faire dex expériences post-morterm.
Remplacement
L’objectif de cette étude préclinique est de mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs via l’olfaction sur la physiologie intestinale et d’émettre des hypothèses sur le lien cerveau intestin. Il est donc indispensable de travailler sur un modèle animal. Des expériences préliminaires ont été réalisées. Nous avons validé le modèle de stress chronique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les comparaisons intergroupes : 24 animaux seront utilisés pour à la fois faire des études comportementales et pour les études post-mortem. À la suite de l’expérience de motricité, des tissus vont être récupérés afin de compléter les analyses (colons, fèces, liquide de rinçage, structures cérébrales). La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.
Raffinement
En ce qui concerne la douleur, la souffrance ou l’angoisse, nous avons identifié cinq risques principaux. Les chirurgies liées à l’implantation d’un pellet au niveau sous-cutané afin d’induire un modèle de stress chronique, l’introduction d’un ballonnet afin d’étudier les effets sur la distension colorectale, le prélèvement sanguin, le traitement chronique par l’hormone de stress. Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h avant chaque manipulation afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Les actions de soin prévues par cette grille seront appliquées en accord avec le vétérinaire. Par exemple, pour la douleur, un anti-inflammatoire non stéroidien pourra être administré en intrapéritonéal. De plus, s’il y a une plaie à la suite de bagarres ou aux chirurgies, une pommade cicatrisante pourra y être appliquée. 30 minutes avant la chirurgie, un analgésique sera administré. Enfin en cas de perte de poids, de la nourriture sera déposés dans la cage afin que la nourriture soit plus accessible.
Choix des espèces
Le modèle de corticostérone (CORT, hormone de stress) chronique est bien validé chez la souris. Il permet de reproduire un certain nombre des symptômes dépressif observés chez l'homme et répond aux antidépresseurs utilisés en clinique. Il s’agit d’un modèle de stress chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines.
Evaluation d’un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Génétiquement modifiées pour porter l'hémoglobine drépanocytaire, 1 608 souris Townes vivent avec une anémie, des globules rouges de très courte durée de vie et une nécrose du foie. Elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 492 d'entre elles et sévère pour 1 116. Le protocole prévoit un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois, des injections intrapéritonéales quotidiennes alternées, une injection dans le sinus de l'œil et des prélèvements sanguins répétés, le porteur indiquant que le stress de ces manipulations peut déclencher des crises vaso-occlusives et la mort de certains animaux. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever le sérum, les érythrocytes et les organes, dans une étude demandée par un partenaire industriel.
Objectifs
La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie autosomique récessive. L'espérance de vie des patients atteints de cette maladie génétique est fortement réduite. Cette maladie génétique la plus fréquente en france est due à une substitution d'une glutamine par une valine à la sixième position du gène codant pour la béta-globine. L'expression de ce gène chez les individus homozygotes donne une hémoglobine anormale (HbS) qui dans certaines conditions (température, stress, hypoxie, deshydratation) favorise la formation de globules rouges de forme allongées en faucille induisant des phénomènes vaso-occlusifs, une anémie et des prédispositions aux infections bactériennes. A la demande d'un partenaire industriel, l'objectif de ce projet est de compléter une étude partielle réalisée dans d'autres laboratoires sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamique d'un candidat médicament de la drépanocytose très prometteur en utilisant un modèle murin in vivo spécifique de la drépanocytose (souris Townes homozygote pour HbS). Ces animaux présentent une anémie, une demi-vie des érythrocytes très courte et expriment un phénotype commun à la maladie humaine (augmentation des leucocytes, nécrose hépatique avec des infiltrats de neutrophiles et de macrophages, augmentation de l'érythropoïèse, splénomégalie, légère glomérulopathie). Ce projet est composé de 10 procédures qui complètent des travaux réalisés dans différents laboratoires relatifs à l'activité d'un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes. Ce projet comparera également l'effet de notre composé avec des molécules déjà commercialisées.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux et une caractérisation de la cinétique et de la dynamique de la molécule utilisée. Celle- ci devrait pouvoir être proposée à des patients qui expriment des formes sévères de la maladie.
Procédures
Des animaux pourront être soumis à des prélèvements de sang qui respecteront la volémie grâce au volume et à la fréquence. Des animaux pourront êtres soumis à un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois selon la procédure. Des animaux pourront subir une injection intra-péritonéale quotidienne alternativement gauche et droite pendant plusieurs dizaines de jours. Des animaux subiront une injection intra-veineuse d'un marqueur spécifique des glogules rouges (sinus retro-orbital, volume 50µl). Chacune de ces interventions dure au maximum 2 minutes ( contention de l'animal et exécution du geste technique). Un stress pourra être induit pendant la réalisation de ces gestes techniques et au cours de la pesée des animaux toutes les 2 semaines (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
Concernant la molécule utilisée dans ce projet, les études toxicologiques n'ont pas démontré une activité toxique à la dose utilisée. Toutefois nous attendons l'expression de symptômes de la drépanocytose (anémie, inflammation, phénomènes vaso-occlusifs) sous l'effet d'un stress au cours de la manipulation des animaux qui expriment un génotype drépanocytaire. Des crises peuvent conduire au décès d'animaux. Toutefois nous attendons une amélioration chez les individus traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever et étudier le sérum, les érythrocytes et les organes.
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, rein, poumons, rate, cerveau) et comme il n'existe pas de modèle capable de mimer les relations complexes entre ces organes, un organisme entier vivant est incontournable.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes puisque cette maladie est autosomique. En tenant compte d'une possible mortalité d'animaux et de la puissance de 0,8 de nos tests statistiques, nous avons déterminé des groupes de 4 à 8 individus de chaque sexe.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et de manipulation des animaux ne doivent pas exacerber les symptômes de la drépanocytose. Les animaux seront manipulés le plus souvent par cup handling ou par tubing. L'enrichissement par des buchettes à grignoter et du matériel de nidification sera présent. Les animaux seront observés pour la détermination du score sans les manipuler. Des points limites ont été établis et l'administration d'analgésique sera envisagée si le score est atteint. L'anesthésie gazeuse (vetflurane) sera utilisée au cours des prélèvements de sang.
Choix des espèces
L'espèce murine a été choisie puisque plus de 90% des gènes humains ont un orthologue direct chez la souris. Cette espèce animale est facilement et rapidement reproductible. Le modèle murin est modifiable génétiquement pour lui donner des caractéristiques humaines. De nombreux réactifs ainsi que des techniques variées sont disponibles pour réaliser les études biologiques. Les animaux choisis sont des animaux génétiquement modifiés (gènes de la globine alpha et beta) qui démontrent une grande homologie de symptômes avec ceux observés chez l'homme atteint de drépanocytose. Nous utiliserons des animaux âgés de 3-4 semaines et des animaux âgés de 6-8 semaines pour nous permettre d'étudier les stades précoces (adolescence) et tardifs de la maladie (adulte).
Etude des symptômes de douleur dans des maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris passent d'abord des tests comportementaux, un tous les deux jours pendant quinze jours, de cinq à trente minutes, pour mesurer leurs seuils de douleur. Une partie est ensuite opérée du cerveau, trente minutes pour installer le modèle parkinsonien, quarante pour enregistrer l'activité des neurones, trente pour colorer les circuits. 2 205 souris sont concernées, dans des procédures allant du léger au sévère et dont 446 relèvent du niveau sévère, avec une perte de poids attendue chez les parkinsoniennes et des défauts de mémoire à partir de huit mois chez les souris Alzheimer. Toutes sont tuées à la fin pour analyse des tissus.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, le vieillissement de la population s’accélère partout à travers le monde. Combiné à l'allongement de l'espérance de vie, il en découle une augmentation des problèmes de santé liées au vieillissement, notamment les douleurs chroniques. En effet, la prévalence de la douleur chronique augmente avec l’âge. Elle passe de 6 pourcents chez l’enfant à 19 pourcents au sein de la population adulte, et dépasse les 30 pourcents après 65 ans pouvant aller jusqu’à 75 pourcents dans la maladie d’Alzheimer et de 86 pourcents dans la maladie de Parkinson. Ces symptômes de douleurs sont donc fortement accentués lors du vieillissement pathologique. Ils aggravent les symptômes de ces pathologies et de ce fait, impactent négativement la qualité de vie des patients, représentant un problème sociétal majeur. L’objectif de ce projet est d’étudier les réseaux cérébraux de la douleur dans des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson afin de mieux de comprendre les mécanismes du développement des douleurs chroniques favorisant l’identification de stratégies thérapeutiques efficaces.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer se caractérisent par de nombreux symptômes incluant des douleurs chroniques qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients, entre autre, en aggravant les autres symptômes connus dans ces pathologies. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent le développement de ces douleurs chroniques car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre les mécanismes de développement de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces. Ces travaux auront également pour bénéfice de mettre en lumière l’existence de ces symptômes, encore peu reconnus lors de la prise en charge clinique de ces pathologies, en particulier chez les patients Alzheimer.
Procédures
1) L’ensemble des souris participeront à des tests comportementaux, pour évaluer leurs capacités sensorielles pouvant être impactées par les modèles pathologiques (un test tous les deux jours pendant 15 jours, durée 5 à 30 minutes). 2) La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie). 3) Sur une partie des souris, l'activité des neurones du cerveau sera évaluée nécessitant une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 40 minutes incluant l'anesthésie). 4) Sur une partie des souris, l'étude permettant de colorer les neurones pour mieux connaitre leur organisation nécessite une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie).
Impact sur les animaux
- L’ensemble des souris participera à des tests comportementaux qui peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales et induire une douleur légère lors de l’évaluation des seuils de douleur des souris. - La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau pouvant induire un stress modéré lors du déplacement des souris vers la salle chirurgicale, lors de l’anesthésie et du réveil post-chirurgical. - Le modèle de souris parkinsoniennes implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur induisant une perte de poids. - Le modèle de souris Alzheimer présente des défauts de mémorisation à partir de l’âge de 8 mois. - Les deux évaluations mesurant l'activité des neurones du cerveau peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissues.
Remplacement
Il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tels que dans ce projet. Les études comportementales prévues ne peuvent se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe de manière à le réduire au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats, et sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été estimé par des expériences antérieures ayant permis d’obtenir un nombre de données sur chaque animal suffisant pour réaliser les analyses statistiques prévues. Les souris seront testées individuellement (une souris par jour) et les résultats analysés rapidement suite au test. Si les résultats obtenus permettent de conclure nos hypothèses, l’ensemble des animaux prévu ne sera pas utilisé.
Raffinement
1) Les souris auront une semaine d'habituation à la salle où elles sont hébergées avant de commencer les expériences. 2) Les souris seront habituées à la nouvelle pièce expérimentale une heure avant la réalisation des tests évaluant le comportement des souris et ceux permettant l'étude de l'activité des neurones afin de réduire le stress léger lié aux changement d’environnement. 3) Les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur des animaux seront arrêtés dès les premiers signes de gênes de la souris. 4) les chirurgies sur le cerveau seront effectuées sous anesthésie générale avec une double couverture anti-douleur (générale et locale). 5) Un soin spécial (hydratation et nourriture enrichie) est mis en place pour limiter l'impact du modèle parkinsonien sur la perte de poids des souris. 6) les souris Alzheimer présentent des problèmes de mémoires à partir de l'âge de 8 mois et un vieillissement précoce à partir de l'âge de 12 mois. Les souris utilisées dans ce projet ne seront pas testées après l'âge de 8 mois pour minimiser l'impact de la pathologie sur leur bien être. 7) une échelle de cotation basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles génétiquements modifiés mimant certaines pathologies humaines. Dans le cas des souris Alzheimer, le modèle génétiquement modifié de ce projet exprime des mutations génétiques connues chez l'humain impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie. De plus, les parties du cerveau impliquées dans la mémoire sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Le modèle de souris parkinsoniennes est également justifié par des similarités des parties du cerveau impactées dans la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6 et 8 mois pour évaluer l’impact du développement de la pathologie sur la sensibilité à la douleur et le fonctionnement des parties du cerveau impliquées dans la réduction de la sensation de la douleur chez les souris Alzheimer et parkinsoniennes.