Recherche fondamentale

Une chirurgie de cinq heures au maximum ouvre le crâne pour y implanter des électrodes, puis les souris sont enregistrées pendant leur sommeil 48 heures par mois, de l'âge de deux mois à quinze mois. Certaines parcourent un labyrinthe ou apprennent à associer un indice visuel à une action pour obtenir une récompense, sous contrôle alimentaire. D'autres reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois mois. Le porteur présente le maintien des animaux pendant plus d'un an comme un moyen d'obtenir un maximum de données par animal. 220 souris transgéniques mimant la maladie d'Alzheimer vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer simultanément le décours temporel de l’apparition des altérations du sommeil d’une part et des altérations cognitives d’autre part dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 2- de tester si moduler l’activité des neurones du thalamus, une structure profonde du cerveau, en amont de l’apparition des symptômes cognitifs pourrait permettre de retarder l’apparition des symptômes cognitifs et de diminuer la charge d’Amyloïde Béta dans le cerveau des souris, 3- d’évaluer l’évolution de la connexion entre le thalamus et le cortex au cours du vieillissement, 4- d’évaluer le fonctionnement du thalamus et du cortex cours du vieillissement et en relation avec le sommeil, et enfin 5- de tester si activer les neurones du thalamus permet de réduire la charge en Amyloïde Béta chez les souris Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, la recherche fondamentale est indispensable à l’identification de nouvelles pistes de traitement et ce projet pourrait donner des pistes thérapeutiques à relativement brève échéance pour deux raisons : Tout d’abord, ce projet vise à proposer le sommeil comme piste de réflexion dans la prise en charge des patients. Le sommeil est souvent très dégradé chez les patients âgés et ce sommeil est indispensable pour le bon fonctionnement de notre mémoire et pour notre récupération. Améliorer la qualité du sommeil des patients pourrait avoir des conséquences immédiates sur l’amélioration des capacités de consolidation de la mémoire et sur les capacités d’attention. Ceci pourrait être très rapidement mis en place car il existe déjà un arsenal thérapeutique pour le traitement des problèmes de sommeil. D’autre part, ce projet va permettre de chercher à comprendre si la stimulation du thalamus, un ensemble de noyaux profonds du cerveau, pourrait permettre d’améliorer les performances cognitives dans un modèle de souris transgéniques mimant les symptômes de la maladie d’Alzheimer. On sait que la stimulation de ces noyaux permet de diminuer les micro-réveils qui sont très communs chez les patients et qui contribuent à une mauvaise qualité de sommeil. Les neurones qui composent ces noyaux présentent des signatures biochimiques très particulières qui leur permet d’être ciblés par des molécules médicamenteuses. Si les résultats de cette étude sont positifs, il serait alors assez facile et rapide de lancer une étude clinique qui permettrait d’évaluer si les résultats obtenus chez la souris sont aussi prometteurs chez l’homme.

Procédures

Les animaux subiront des chirurgies invasives pour l'implantation des électrodes d'enregistrement intra-cranienne. Cette chirurgie dure un maximum de 5 heures. Ils seront ensuite enregistrés pendant leur sommeil 48h tous les mois de 2 à 15 mois dans des caissons d’enregistrements spécifiques. Certains animaux effectuerons aussi différentes tâches de comportement comme un labyrinthe et une tâche d’association où l’animal doit associer un indice visuel avec une action à effectuer pour obtenir une récompense. Enfin, certains animaux subiront des injections intra-péritonéales tous les jours pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont un animal modèle transgénique de la maladie d’alzheimer. Ces animaux ont des troubles mnésiques qui se développent progressivement au cours du vieillissement mimant ainsi les troubles cognitifs des humains souffrant de la maladie d’Alzheimer. Toutes les procédures faites sur ces souris seront de degré́ de sévérité modéré du fait de la chirurgie nécessitant l’insertion d’électrodes dans le cerveau. Les douleurs péri- et post-opératoires sont minorées par l’administration d’antalgiques puissants. Les animaux effectueront des tests comportementaux qui impliquent une brève contention pour connecter l'implant au système d’enregistrement et un contrôle alimentaire, qui peuvent provoquer un stress chez l’animal. Ces paramètres sont minorés par une précautionneuse habituation des animaux à la manipulation par l’expérimentateur.

Devenir

Toutes les expériences seront terminées par la mise à mort des animaux pour prélèvement d’organes pour des études post mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude de plusieurs paramètres comportementaux chez la souris et enregistrement de plusieurs aires corticales simultanément pendant le sommeil. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques avancés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures qui sont prises plusieurs fois sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests permettent d'inclure des animaux qui n’auraient pas faits toutes les étapes du protocole et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées. Enfin cette étude comporte deux procédures pendant lesquelles les animaux seront gardés pendant plus d’un an, permettant d’obtenir un maximum de données par animal et de pouvoir comparer l’évolution chez le même animal de différents paramètres.

Raffinement

Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, les étapes d’habituation et de contention ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Les animaux implantés sont souvent isolés pour protéger les implants. Dans cette étude, les souris seront soit maintenues en groupe soit maintenues dans des cages spécifiques développées qui, grâce à une cloison avec des larges trous, permet aux animaux de se sentir et se côtoyer sans pour autant pouvoir ronger le connecteur de son compagnon de cage. La prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Enfin, un arbre décisionnel d’évaluation du bien-être de chaque souris a été mis en place comportant différents points limites afin d’abréger les souffrances de l’animal en cas de complications post-opératoires et tout au cours du protocole expérimental.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez la souris ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. Les souris possèdent une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines pour les injections et 8 semaines pour les implantations quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgies seront effectuées à 8 et les enregistrements entre 9 et 60 semaines. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours du vieillissement des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Infectées par Helicobacter pylori, elles subissent un gavage par jour pendant trois jours puis deux par jour pendant sept jours, sur animal vigile. Le porteur annonce une possible perte de poids liée au stress du gavage et à l'infection, et ne décrit aucun autre effet. Il indique que l'activité antibactérienne du composé a déjà été montrée en culture, et juge les expériences chez la souris "indispensables" pour confirmer sa biodisponibilité dans la muqueuse gastrique.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant responsable d'une grande majorité des cancers de l'estomac. L’objectif est de montrer l’efficacité anti bactérienne contre Helicobacter pylori du composé développé par notre collaborateur.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage : animaux vigiles, 1 fois par jour pendant 3 jours puis 2 fois par jour pendant 7 jours. Le gavage dure moins d'une 1 minute.

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour et à l’infection à H. pylori.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que leurs organes soient prélevés et analysés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé sur Helicobacter pylori a été montré in vitro par nos collaborateurs. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique, éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis. Une application permettant de déterminer le nombre d’animaux optimal a été utilisé.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière et maisonnettes en polycarbonate). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris et est parfaitement maitrisé. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.

3 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans une veine ou entre les côtes, avec dans ce dernier cas une plaie cutanée qui se forme nécessairement, ou onze injections hebdomadaires d'un agent cancérigène, puis jusqu'à quatorze injections de traitement sur quarante jours et deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus voisins et provoquer des douleurs et un inconfort important. Il affirme que les réponses immunitaires ne peuvent être comprises que dans un organisme vivant, et rappelle que 50 à 80 % des patients ne répondent pas de façon satisfaisante à l'immunothérapie actuelle.

Objectifs

Les cancers du poumon représentent la principale cause de décès par cancer chez les hommes en France, et leur origine complexe est influencée par une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux. Cette interaction crée des variations dans la susceptibilité au cancer du poumon parmi les individus. Les traitements de première ligne contre ce type de cancer incluent la chirurgie, la radiothérapie et divers traitements médicamenteux tels que la chimiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison. L'autophagie, un processus cellulaire essentiel pour l'élimination des composants endommagés et le recyclage des nutriments, joue un rôle clé dans la réponse au stress cellulaire. Des recherches récentes ont mis en évidence son influence sur l'immunité antitumorale, notamment dans le cadre de l'immunothérapie. Bien que le lien entre autophagie et immunothérapie ne soit pas encore totalement élucidé, des données croissantes suggèrent que l'autophagie pourrait moduler la réponse tumorale à ces traitements. Par conséquent, cibler l'autophagie et ses modulateurs au sein du microenvironnement tumoral est considéré comme une stratégie prometteuse pour améliorer les résultats de l'immunothérapie contre le cancer. Dans ce projet, nous visons à évaluer l'impact de la modulation de l'autophagie sur l'efficacité des traitements anticancéreux dans des modèles de cancer du poumon, en neutralisant une protéine clé impliquée dans ce processus. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires et la formation de la mémoire immunitaire dans le contexte du cancer.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer du poumon est d'une importance cruciale, tant en France qu'à l'échelle mondiale. Ce cancer, qui est l'un des plus courants en France, affecte un nombre croissant de personnes, incluant désormais de plus en plus de femmes. L'immunothérapie, explorée intensivement au cours des quinze dernières années, a montré des résultats prometteurs chez certains patients. Cependant, une grande proportion de patients, entre 50 et 80 pourcents ne répondent pas de manière satisfaisante à ces traitements. Il est donc essentiel de développer des options thérapeutiques supplémentaires, notamment des traitements administrés avant (néoadjuvants) ou après (adjuvants) la chirurgie, pour améliorer la prise en charge à long terme des patients. En résumé, l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques est impérative pour relever ce défi de santé publique et offrir un espoir tangible aux personnes touchées par cette maladie. Cette étude a pour objectif d'évaluer si la neutralisation d'une protéine impliquée dans le métabolisme cellulaire pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique contre le cancer du poumon. Il est également pertinent de noter que ce cancer touche environ 400 000 nouvelles personnes chaque année en Europe.

Procédures

Dans ce projet, les souris subiront diverses interventions en fonction de leur groupe expérimental : Pour les souris avec un fond génétique particulier, en plus des différentes interventions, elles recevront 5 injections consécutives d’un agent chimique pour induire la déplétion de la protéine. Chaque injection dure quelques secondes et sera administrée une fois par jour pendant 5 jours, 21 jours avant l’induction tumorale. Pour un groupe expérimental, les souris recevront d'abord une injection intraveineuse de cellules tumorales. Cette procédure prend quelques secondes à quelques minutes par souris, effectuée sous contention. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune. Jusqu’à 14 injections seront administrées, à raison de 2 injections par semaine sur une période maximale de 40 jours. Certaines souris seront anesthésiées pour le suivi de la croissance tumorale par imagerie bioluminescente, chaque session durant environ 10 minutes et réalisée 2 fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs. Pour un autre groupe, les souris recevront une injection intercostale de cellules tumorales, une procédure d'environ 15 minutes incluant l’analgésie, l'anesthésie, et le réveil. Ensuite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, qui dureront quelques secondes chacune, jusqu’à 14 injections réparties sur 40 jours. Un suivi par imagerie bioluminescente sera effectué, chaque session durant environ 10 minutes, 2 fois par semaine pour surveiller la progression tumorale. Pour un troisième groupe, les souris recevront des injections intrapéritonéales d’un un agent cancérigène, qui dureront quelques secondes chacune. Ces injections seront administrées une fois par semaine pendant 11 semaines pour induire des tumeurs. Par la suite, elles recevront des injections intrapéritonéales pour les traitements, jusqu’à 14 injections au total, réparties sur une période de 40 jours.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront des injections de cellules tumorales par voie intraveineuse ou intercostale. Ces injections, qu'elles soient intraveineuses, intercostales ou sous-cutanées, peuvent provoquer une légère douleur temporaire au site d'injection. Dans le cas des injections intercostales, une plaie cutanée se forme nécessairement, ce qui peut entraîner une douleur et un risque accru d'infection. Les injections intraveineuses, quant à elles, peuvent également causer une irritation locale et un stress pour l'animal. L'administration d'un agent chimique pour induire un cancer peut provoquer des effets secondaires tels que perte de poids, diminution de l'appétit, et léthargie. Ces symptômes peuvent être plus prononcés juste après l'injection, bien qu'ils tendent à se dissiper en quelques minutes. Les tumeurs en développement peuvent exercer une pression sur les tissus environnants, provoquant des douleurs et un inconfort important. De plus, les tumeurs peuvent induire des perturbations physiologiques et métaboliques, telles que des inflammations, des désordres de la fonction organique, et une altération générale de l'état de santé des animaux. Les injections intrapéritonéales (au niveau de l'abdomen) peuvent induire un stress lié à la contention ainsi qu’une douleur immédiate et transitoire au point d'injection. L'anesthésie utilisée pour certaines procédures peut réduire la capacité de l'animal à réguler sa température corporelle et peut entraîner un risque cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 3880 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu sera enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, afin de permettre une intervention rapide pour traiter tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. Par exemple, la perte de poids, l'apparition de signes cliniques sévères (comme une altération de l'état général ou des difficultés respiratoires), ou une augmentation rapide de la taille des tumeurs au-delà d'un seuil défini entraîneront une intervention immédiate. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. Les animaux présentant des signes de douleur recevront des analgésiques adaptés à leur état spécifique. En cas de problèmes empêchant les souris de se nourrir normalement, un gel alimentaire sera ajouté directement dans la cage. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront placés en hébergement individuel pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement si nécessaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de bénéficier d'une vaste expertise en termes d’élevage, de techniques d’expérimentation animale, ainsi que du suivi microbiologique et vétérinaire. - Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les différentes lignées utilisées dans cette procédure ne présenteront pas de phénotypes dommageables et seront immunocompétentes.

Rasées sous anesthésie puis greffées sous la peau avec des cellules de cancer du pancréas, 180 souris subissent, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, treize à dix-sept injections de médicaments anticancéreux et d'anticorps, plus quatorze mesures de leur tumeur au pied à coulisse. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs, rates et ganglions lymphatiques. L'objectif déclaré est de trouver la meilleure dose et la meilleure voie d'administration d'un composé, en vue d'un essai clinique chez des patients atteints d'un cancer du pancréas. Le RNT ne nomme ni ce composé, ni la protéine tumorale qu'il cible, ni l'immunothérapie à laquelle il est associé.

Objectifs

Le cancer du pancréas touche près de 500.000 personnes chaque année, et est la 4e cause de décès par cancer dans le monde. Récemment, une nouvelle catégorie de médicaments ciblant une protéine tumorale, a été mise au point. Nous souhaitons évaluer dans ce projet, les meilleures modalités d’administration (voie d’injection, dose et durée) d’un de ces composés, et son effet synergique avec une immunothérapie, dans un modèle de cancer du pancréas chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient permettre d’identifier la meilleure modalité d’administration d’un nouveau médicament anti-cancéreux et ainsi fournir un rationnel pour la mise en place d’un essai clinique chez les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

- Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – injections intrapéritonéales et sous-cutanées de médicaments anti-cancéreux et d’anticorps (13 à 17 x 5 secondes/souris) ; mesure des tumeurs au pied à coulisse (20 secondes souris x 14 mesures au maximum).

Impact sur les animaux

Les volumes tumoraux sont mesurés 2 fois par semaine, et le poids est évalué 3 fois pas semaine. Ceci nécessite une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger. Les injections peuvent entraîner des douleurs courtes au site d'injection au niveau de l'abdomen pour l'administration des traitements, et sur le flanc pour l'injection des cellules tumorales. Possible douleur légère ou gène autour de la tumeur et autour des sites d’injection des médicaments.

Devenir

Afin d’effectuer des analyses sur les tumeurs, rates et ganglions lymphatiques, les souris seront mises à mort et ces tissus seront prélevés pour analyse. Ceci permettra de documenter l’effet des médicaments non seulement dans la croissance tumorale mais aussi dans la composition et distribution du microenvironnement immunitaire.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro confirmant l’effet anti-tumoral du médicament d’intérêt. Néanmoins, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal pour évaluer l’effet des divers protocoles d’injection sur la pousse tumorale, ainsi que la synergie entre ces traitements et l’immunothérapie. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature.

Raffinement

Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de cancer du pancréas, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de glioblastome sous la peau, puis jusqu'à six injections de virus tueurs de tumeurs, certaines subissant avant chaque injection une irradiation par faisceau de protons, soit jusqu'à 82 minutes d'anesthésie cumulées sur quatre à quatorze semaines. Les tumeurs et les rates sont prélevées après la mise à mort pour analyser l'activation des cellules immunitaires. Le porteur indique que la greffe, le développement de la tumeur et l'imagerie n'induisent pas de douleur et conclut qu'une analgésie n'est donc pas "nécessaire", tout en prévoyant de mettre à mort les souris dont les tumeurs se nécrosent ou qui perdent plus de 20 % de leur poids.

Objectifs

L'objectif majeur de ce projet est d'étudier in vivo l'effet immunostimulant et anticancéreux contre le glioblastome, un cancer du cerveau actuellement incurable, de traitements associant dans une première phase, une radiothérapie (faisceau de protons) suivie d'une infection par un virus tueur de tumeurs (MVMp), puis par une deuxième phase, 2 jours plus tard, associant à nouveau une radiothérapie (faisceau de protons) suivie elle aussi d'une infection, mais cette fois, par un autre virus tueur de tumeurs à savoir une souche vaccinale du virus de la rougeole. Dans notre projet, l'irradiation ionisante est appliquée juste avant que les tumeurs soient infectées par un virus oncolytique (MVMp ou souche vaccinale du virus de la rougeole). Cette procédure est utilisée parce que nos résultats montrent que l'irradiation ionisante de cellules murines de glioblastome (GL261) avant leur infection par MVMp, permet d'augmenter la réplication lytique de de ce virus et qu'elle permet également, in vivo, d'augmenter l'action anticancéreuse de la souche vaccinale (Schwarz/Moraten) du virus de la rougeole, sans que l'on sache actuellement quels sont exactement les mécanismes impliqués dans ces phénomènes.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de découvrir et valider une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du glioblastome. La souche vaccinale du virus de la rougeole et le parvovirus de rat H-1PV (un cousin très proche en séquence et en comportement antitumoral, de MVMp) ont déjà fait l'objet de plusieurs études cliniques qui ont démontré le potentiel prometteur de ces deux agents contre certains cancers tel que le glioblastome. Elles ont toutefois également révélé que l'action immunostimulante et anticancéreuse de ces agents infectieux n'était pas encore assez puissante pour qu'ils puissent représenter une alternative crédible et efficace pour lutter contre des cancers tels que le glioblastome ou l'adénocarcinome pancréatique, dont le pronostic reste actuellement, malgré de nombreux progrès réalisés ces dernières années dans différents types de traitements, très sombre.

Procédures

Tous les les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales (100 µl) ce qui correspond à une anesthésie de 5 min sous isoflurane 2%. Certains subiront en plus 6 injections de 2 min chacune d'une solution de 10 à 100 µl de PBS ou de virus oncolityque (MVMp ou Souche Schwarz/Moraten du virus de la rougeole). Ceci correspond à une anesthésie de 5 min/injection donc à 6 x 5 = 30 min d'anesthésie. Ainsi, chaque animal subira entre 5 et 35 min d'anesthésies sur une période allant de 4 à 14 semaines, en fonction de la procédure et des groupes considérés. Certains animaux subiront préalablement à chacune de leurs 6 injections, une irradiation par faisceau de protons d'une durée maximale de 3 min (6 Gy). Etant donné que l'irradiation de leur tumeur sera immédiatement suivie par une injection, nous proposons d'attribuer 12 min d'anesthésie à ce type de protocole. Ceci correspond donc pour ces animaux a un total de 6 x 12 min d'anesthésie= 72 min. Etant donné qu'une anesthésie sera également nécessaire pour les mettre tous à mort (5 min) et que certains subiront une deuxième greffe (injection) de cellules tumorales, nous pouvons affirmer que les animaux de notre étude subiront entre 10 et 82 min d'anesthésie sur une période allant de 4 à 14 semaines d'étude.

Impact sur les animaux

Nous suivrons par des mesures et observations réalisées 2 fois/semaine, le poids des animaux et analyserons leur comportement (toilette, mobilité, etc...) et l'évolution de la taille des tumeurs. Une baisse au-delà de 20% du poids de l'animal après soustraction du poids des tumeurs (1g/cm3) ou l'apparition de signes d'affaiblissement, de perte de mobilité avant atteinte du point limite, de nécrose des tumeurs, nous conduirons à chaque fois à mettre à mort, sous anesthésie à l'isoflurane 2 %, ces animaux. Il est à noter que les doses de radiation appliquées sur les tumeurs ne devraient pas induire d'effets indésirables sur la durée de l'étude.

Devenir

mise à mort car prélèvement post-mortem des tumeurs et des rates pour des études in vitro sur l'activation de cellules immunitaires.

Remplacement

Notre approche scientifique et les objectifs que nous nous sommes fixés ne nous permettent pas hélas de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le recrutement sur une periode de plusieurs semaines de cellules immunitaires au sein d'un glioblastome par des traitements d'immunothérapie, basés sur l'utilisation d'une radiothérapie et/ou d'infections par des virus oncolytiques (MVMp et/ou souche vaccinale du virus de la rougeole), n'est envisageable que chez un animal vivant. Notre étude cherchant à caractériser au niveau immunitaire, l'impact de ces traitement sur une tumeur sous-cutanée, il nous est impossible de travailler dans un autre modèle que celui de l'animal vivant.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux à étudier, le projet sera réalisé étape par étape et les données obtenues à l'étape précédente conditionneront toujours la mise en oeuvre de l'étape suivante sur les animaux. Une approche statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux necessaire pour réaliser l'étude.

Raffinement

En dehors des périodes d’examen les animaux sont manipulés régulièrement afin de minimiser le stress induit par la manipulation et la présence du personnel du laboratoire. Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Le protocole expérimental prend en compte un éventuel impact sur la souffrance animale. Les animaux sont observés quotidiennement, pesés 2 fois par semaine. Les injections de cellules et les séances d'imagerie sont réalisées sous anesthésie. L'injection de cellules en sous cutané, le développement de la tumeur et l'imagerie TEP n'induisent pas de douleur. De ce fait, une analgésie n'est donc pas nécessaire.Les données issues de ces observations ( perte de poids, apparence générale, comportement alimentaire, apparition de zones nécrotiques sur les tumeurs) sont reportées dans une grille de score afin de déceler tout signe précoce de mal être et de mettre en place une surveillance. Si l'état général atteint un point limite dont les critères ont été établis préalablement, celui-ci sera immédiatement mis à mort. En fin de protocole, tous les animaux sontmis à mort pour permettre un prélèvement des tumeurs et des anlyses ex vivo. Les doses d'irradiation ionisante délivrées lors des séances d'irradiation n'induisent normalement pas de douleur ni de rougeur cutanées. Toutefois, en raison des anesthésies répétées, les animaux seront observés quotidiennement notamment pour controler le poids et l'apparition de rougeur au niveau du site d'irradiation. En cas d'apparition de rougeur, de la biafine sera appliquée sur la zone.

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé depuis de nombreuses années dans le domaine de la recherche préclinique en cancérologie. Il est à noter également que les cellules GL261, un modèle de glioblastome, sont syngéniques des souris C57BL/6 et sont souvent employées in vivo comme modèle de glioblastome. Pour toutes ces raisons il nous parait impossible de réaliser de telles expériences sur des modèles in vitro ou ex-vivo. La souris C57BL/6 est de ce fait le modèle le plus adapté à notre projet. Les animaux seront greffés à un âge de 10 semaines, âge optimal pour la prise tumorale d'après notre expérience. C'est aussi un stade auquel le système immunitaire et les mécanismes physiologiques sont potentiellement matures.

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un premier groupe subit une obstruction chirurgicale de l'uretère, un deuxième la même obstruction puis une reconnexion à la vessie deux jours plus tard, un troisième un pinçage de quinze minutes des vaisseaux qui alimentent le rein, avec douleur postopératoire et risque d'infection de la cicatrice. Les deux reins sont prélevés après la mise à mort pour suivre des fibroblastes rendus fluorescents, dans l'espoir de repérer les cellules qui déclenchent la maladie rénale chronique, les outils de diagnostic n'étant évoqués que pour le long terme. Le porteur conclut qu'il est "impossible" de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux, les modèles cellulaires ne rendant pas selon lui la complexité de la maladie.

Objectifs

La maladie rénale chronique est une maladie fréquente (10% de la population mondiale) et grave (elle est estimée devenir la 4ème cause de mortalité d’ici 2040). Les événements précoces dans le développement de la maladie rénale ne sont pas bien connus. Identifier des types de cellules qui participent à l’initiation des phénomènes de dégradation du rein est l’objectif de ce projet. En particulier, nous analyserons des animaux qui présentent des cellules fluorescentes, c'est à dire qui émettront une lumière vive lorsqu'observées avec un microscope particulier, permettant ainsi de les suivre durant le développement de la maladie rénale. Ces cellules sont appelées fibroblastes, et sont impliquées dans la maladie rénale chronique. Ce projet cherchera à évaluer leur rôle de manière très précoce

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension de ces phénomènes précoces, et plus particulièrement l’identification d’un type de cellule impliquée dans le développement des lésions permettra, à terme, de développer des outils diagnostics et thérapeutiques de la maladie rénale chronique. En effet, à ce jour, les tests diagnostics identifient la maladie à un stade souvent avancé, et les thérapeutiques permettent d’éviter l’aggravation de la maladie mais ne permettent pas sa régression. Identifier puis traiter à un stade précoce permettrait de lutter contre le développement de cette pathologie

Procédures

Trois types de chirurgie sous anesthésie générale auront lieu. Un premier lot d’animaux subira une obstruction de l’uretère (conduit reliant le rein à la vessie), durée de l’acte 5 minutes. Un 2e lot subira aussi une chirurgie d’obstruction de l’uretère puis 2 jours plus tard, nous le reconnecterons à la vessie afin d’étudier les capacités de réparation du rein – durée de l’acte : 30min. Et enfin sur un 3e lot, on pincera pendant 15 mn les vaisseaux sanguins qui alimentent le rein pour ensuite observer les dommages causés après quelques jours ou semaines

Impact sur les animaux

Les chirurgies risquent d’induire des nuisances, en particulier une douleur post opératoire, une irritation ou une inflammation au niveau de la cicatrice, voire une infection du site opératoire (exceptionnel). Uniquement dans ces cas, une perte de poids et/ou une modification du comportement pourrait survenir.

Devenir

Tous les animaux du projets seront euthanasiés afin de prélever en post-mortem les 2 reins et ainsi étudier les tissus.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie rénale chronique. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présent dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés est appliquée pour répondre aux différentes questions du projet scientifique. Une analyse statistique estime qu’un nombre total de 208 animaux est nécessaire. Ce nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement (c'est à dire l'apport de structures permettant d'améliorer le bien-être animal, comme des petites maisons en plastique, du coton...) , change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et ceux du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie. En cas d‘atteinte d’un point limite et selon le signe clinique observé, un antidouleur pourra être administré durant deux jours. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié

Choix des espèces

La souris est la seule espèce permettant à ce jour de suivre l’évolution des fibroblastes grâce à la présence de cellules fluorescentes, en particulier suite à une intervention permettant de reproduire la maladie observée chez l’homme. Les interventions seront réalisées chez des souris adultes, la maladie rénale chronique chez l'homme concernant principalement des adultes.

Dépourvues de système immunitaire pour ne pas rejeter des greffons faits de cellules humaines, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit sous anesthésie l'ablation d'un disque de peau de 12 millimètres sur toute son épaisseur, au milieu du dos, puis la suture d'un substitut cutané dans la plaie. Les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie, et les souris greffées vivent seules en cage quatre à cinq semaines pour qu'elles ne s'arrachent pas mutuellement les greffons. Elles sont tuées par groupes de six à 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après la greffe, et celles qui perdent trop de poids ou dont la plaie s'infecte le sont avant ces termes.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés nouvellement développés afin de sélectionner celui ou ceux qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané et la revascularisation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué 15 premiers substituts cutanés. Les substituts cutanés, préparés à partir de cellules humaines, seront greffés sur des souris dépourvues de système immunitaire afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront utilisés "jeunes" = dès la fin de leur préparation, "âgés" = 5 jours maximum après la fin de leur préparation, ou "cryoconservés" = après congélation et décongélation selon un mode opératoire défini en collaboration avec des chirurgiens plasticiens spécialisés en chirurgie reconstructrice de la peau. Le but est d’évaluer les différentes conditions opératoires qui seront suivies pour la réalisation des greffes cutanées chez l’Homme. Des prélèvements seront effectués à différents temps précoces et prolongés après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors des phases précoces et tardives de la cicatrisation. Les substituts cutanés nouvellement développés vont en effet permettre d’accélérer le processus de cicatrisation grâce à l’ensemble de ces interactions complexes. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés nouvellement développés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés produits par biosynthèse sont aujourd’hui disponibles. Ils sont constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et des facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité. Ils sont utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, pour les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle ou des plaies chirurgicales, les ulcères du pied diabétique…, et également les maladies génétiques de la peau. Il est donc important de tester de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées ou le remplacement de tissu cutané.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau circulaire de 12 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des pansements et compresse changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements et la compresse et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 4 à 5 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble pansements, compresse et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 540 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutanée, suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).