Recherche fondamentale

Greffés de cellules tumorales sous la peau ou directement dans l'organe visé, 1 800 souris et 720 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 840 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie des animaux est immunodéficiente pour accepter des cellules humaines, et chacun subit des prélèvements sanguins deux fois par semaine sous anesthésie générale pendant toute la durée du protocole. Le projet cherche d'abord la dose maximale tolérée, puis l'efficacité de nouvelles molécules anticancéreuses, à raison de deux campagnes par an pendant cinq ans. Les atteintes attendues tiennent en cinq lignes, perte de poids, croissance tumorale et perturbations comportementales, pour un protocole qui range 840 individus en souffrance sévère.

Objectifs

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde et représente un énorme défi pour la santé publique. Cette maladie grave impose un lourd fardeau aux patients et à leurs familles à cause des traitements coûteux et des souffrances qu'elle engendre. Les traitements contre le cancer actuels, comme les chimiothérapies, peuvent avoir de graves effets secondaires. Il est donc crucial de développer de nouveaux traitements qui soient plus efficaces et moins nocifs. Pour cela, il est nécessaire de tester de nouvelles molécules sur des modèles animaux. Notre projet a pour but d’évaluer l’efficacité de ces nouvelles molécules contre le cancer. Nous avons déjà testé ces molécules en laboratoire sur des cellules, mais ces tests ne reproduisent pas entièrement la complexité du corps humain. Nous devons donc confirmer ces résultats sur des animaux. Voici comment nous procédons : Évaluation de la Dose Maximale Tolérée (DMT) : Nous déterminons la plus grande dose de chaque molécule qui peut être administrée sans provoquer de toxicité sévère chez les animaux. Étude Pharmacologique : Nous analysons comment la molécule est absorbée, distribuée, métabolisée et éliminée par l’organisme à la dose maximale tolérée. Essai d’Efficacité : Nous testons la molécule sur des modèles animaux de cancer pour vérifier son efficacité à différentes doses, inférieures à la DMT, en utilisant plusieurs types de tumeurs. Pour ces tests, nous utilisons soit des cellules tumorales provenant de l’espèce animale étudiée, soit des cellules humaines. Les animaux doivent être immunodéficients pour accepter les cellules humaines. Les tumeurs peuvent être implantées sous la peau ou directement dans l'organe cible pour mieux imiter la réalité de la maladie. Les procédures incluent des injections sous-cutanées ou des interventions chirurgicales mineures. Nous avons établi des critères stricts pour arrêter les expériences si les animaux montrent des signes de douleur ou d’inconfort, comme un volume tumoral trop important ou une perte de poids excessive. Ce projet se déroulera deux fois par an pendant cinq ans et nous permettra d’évaluer si ces nouvelles thérapies peuvent offrir une meilleure alternative aux traitements actuels.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples et significatifs pour la lutte contre le cancer. Les nouvelles molécules anti-tumorales que nous évaluons ont déjà montré un potentiel prometteur dans des tests cellulaires. Toutefois, pour déterminer leur véritable efficacité et sécurité, il est crucial de les tester sur des modèles animaux, qui simulent mieux la complexité du cancer humain. 1. Amélioration des Traitements : Ce projet vise à identifier des molécules capables de traiter efficacement les tumeurs tout en minimisant les effets secondaires. En testant ces molécules sur des modèles animaux, nous pouvons déterminer les doses optimales qui tuent les cellules cancéreuses sans nuire gravement aux tissus sains. 2. Réduction des Effets Secondaires : Les traitements actuels contre le cancer sont souvent accompagnés d’effets secondaires sévères. En évaluant la toxicité et l’efficacité des nouvelles molécules, nous cherchons à développer des traitements moins nocifs, offrant ainsi une meilleure qualité de vie aux patients. 3. Avancées Scientifiques : Ce projet contribue à une meilleure compréhension des interactions entre les molécules anti-cancéreuses et les tissus tumoraux. Cela nous permet de concevoir des thérapies plus ciblées et adaptées aux besoins spécifiques des patients. 4. Progression Vers des Essais Cliniques : Les résultats de ces études précliniques guideront les futures recherches cliniques, ouvrant la voie à des traitements innovants et potentiellement plus efficaces contre divers types de cancers.

Procédures

Pour induire le cancer chez l’animal, des cellules tumorales seront injectées sous anesthésie générale. Après cette intervention, les animaux seront surveillés et suivis tout au long de l’étude. Les traitements seront administrés selon un calendrier établi, et des prises de poids seront effectuées quotidiennement. La taille des tumeurs sera vérifiée régulièrement, deux fois par semaine. Des prélèvements sanguins d'une durée de 30 secondes, sous anesthésie générale, seront réalisés deux fois par semaine durant tout le protocole, chaque intervention anesthésique durant environ 3 minutes. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés, et des organes tels que les reins, le foie, les poumons, la rate et le cerveau seront prélevés pour une analyse approfondie.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être observée sur certains animaux. Une apparition de nouvelle tumeur peut être observée ou une croissance tumorale dans les groupes témoins. Une non-efficacité du traitement sur les animaux. Des perturbations comportementales peuvent apparaître. Une surveillance quotidienne sera mise en place et la mesure de la douleur sera effectuée.

Devenir

Les rongeurs seront euthanasiés à la fin de l’étude. La réutilisation ou l'adoption des animaux n’est pas envisageable en raison du risque d’interactions entre les molécules, particulièrement pour ceux ayant subi une procédure sévère.

Remplacement

Les protocoles présentés dans ce projet intègrent des réponses souvent complexes obtenues à partir d'expériences in vivo, menées dans diverses conditions physiologiques. Bien que l'évaluation des réponses de différentes lignées cellulaires puisse parfois être réalisée in vitro, ces modèles restent trop simples et limités pour capturer la complexité des processus biologiques, tels que l'angiogenèse ou l'interaction avec le système immunitaire, qui sont présents dans les modèles in vivo. Par conséquent, le passage de l'in vitro à l'in vivo est indispensable pour obtenir des données supplémentaires et essentielles sur les propriétés des médicaments testés dans des tissus vivants. Les espèces animales utilisées pour les tests, ainsi que le nombre d'échantillons à tester avant un essai clinique sur l'homme, sont strictement déterminés par les normes réglementaires. Ces directives garantissent que les résultats obtenus sont aussi précis et pertinents que possible pour les étapes ultérieures du développement thérapeutique.

Réduction

En accord avec la règle des 3R, des efforts seront mis en œuvre pour déterminer un nombre optimal d'animaux à utiliser pour chaque procédure, en veillant à minimiser leur utilisation sans compromettre la qualité des données obtenues. Ce nombre pourra être ajusté en fonction des résultats obtenus au cours de l’étude, afin de réduire au maximum le recours aux animaux tout en garantissant la pertinence scientifique des données recueillies.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel d'animalerie et par notre équipe. Ils seront anesthésiés sous anesthésie générale pour chaque procédure et prélèvement. Un système de scoring sera instauré pour attribuer une note journalière aux animaux, permettant d'évaluer leur état de santé (voir annexe). En fonction des résultats, des analgésiques pourront être administrés, ou nous procéderons à l'euthanasie si les points limites sont atteints. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un accès à la nourriture et à l'eau à volonté. Chaque cage sera équipée d'un enrichissement spécifique à l'espèce, et du diet gel pourra être ajouté si certains animaux éprouvent des difficultés à se nourrir ou à se mouvoir. Les paramètres environnementaux seront suivis quotidiennement pour garantir un hébergement optimal et assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation des rats et des souris dans ce projet est justifiée par leur pertinence comme modèles en recherche préclinique, en raison de leur représentativité pour certaines pathologies humaines. Le choix entre souris et rats repose sur plusieurs critères essentiels : disponibilité de lignées cellulaires tumorales / capacité de chaque espèce à subir les interventions chirurgicales nécessaires / prélèvements sanguins en volumes adéquats pour analyser les molécules administrées. Les animaux utilisés auront un âge de 5 à 6 semaines, correspondant à un stade adulte où la maturité sexuelle est atteinte. Cela permet de garantir la stabilité des résultats sans risque de perturbations physiologiques dues aux variations hormonales de la puberté.

Des souriceaux sont allaités par des mères infectées par le virus de l'encéphalite à tiques, d'autres reçoivent le virus par gavage ou à la pipette dans la bouche. 2 398 souris vont être utilisées, dont 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids, apathie et paralysie possibles, les mères allaitantes étant ponctionnées de leur lait sous anesthésie sans réveil. Le porteur annonce des points limites précoces, puis admet que chez les souriceaux ces points limites, moins visibles ou d'apparition brutale, ne préviendront ni les signes majeurs de souffrance ni la mortalité. Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure, le porteur indiquant qu'ayant été infectées en confinement de niveau 3 elles ne peuvent ni sortir de l'animalerie ni être réutilisées.

Objectifs

Les 4 objectifs de cette étude visent à mieux comprendre les mécanismes de cette voie de transmission (consommation de produits au lait cru ou allaitement), et à déterminer quels facteurs physiologiques et génétiques peuvent influer sur l’efficacité de transmission. Ces objectifs sont les suivants : (1) Etudier la dissémination du virus dans les glandes mammaires de souris non lactantes, quantifier la production virale dans cet organe et déterminer le tropisme cellulaire associé. Cette première étape, sur souris non lactantes (donc en l’absence de souriceaux) sera nécessaire à la mise au point du protocole optimal des procédures suivantes (choix des lignées de souris, des temps d’infection, des doses virales infectieuses), afin de réduire de manière raisonnée, au final, le nombre d’animaux utilisés. (2) Etudier la dissémination du virus dans les glandes mammaires de souris lactantes et quantifier la charge virale infectieuse dans le lait maternel, ainsi que son infectiosité et sa persistance dans l’estomac des souriceaux allaités par ces souris. (3) Mesurer l’efficacité de transmission par allaitement dans le modèle souris. (4) Evaluer l’impact du lait de chèvre, de vache ou humain (ou de certains de leurs composants) sur l’infectiosité et la transmission du virus par voie orale (alimentaire ou par allaitement).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux caractériser les voies de transmission qui sont encore largement sous-étudiées mais qui pourraient avoir un impact majeur sur la santé humaine et vétérinaire dans le contexte des maladies virales émergentes actuelles et futures

Procédures

Une partie des souris seront infectées par une injection sous-cutanée une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées par administration orale dans la bouche à l’aide d’une pipette ou par gavage avec une sonde souple une fois pour une durée de quelques secondes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 8 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. Certaines souris feront l’objet d’une injection intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes puis de prélèvement de lait maternel, sous anesthésie générale sans réveil, une fois pour une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections (par voie sous-cutanée ou par gavage à l’aide d’une sonde souple) et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention et une introduction d’une aiguille (ou d’une sonde souple pour le gavage) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. Par conséquent, l’impact principal de nos procédures proviendra de l’infection virale elle-même (même virus dans toutes les procédures). Dans certains cas (selon la souche virale, la lignée de souris, la dose infectieuse, la voie d’injection), l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Des points limites adaptés seront utilisés pour pouvoir mesurer précocement la pathogénicité liée à l’infection tout en limitant au maximum la souffrance des animaux et sans attendre la mort de l’animal. Dans le cas particulier de l’infection de souriceaux (et non de souris adultes), , il est possible, d’après notre expérience préalable avec d’autres virus de la même famille) que l’utilisation de points limites (moins visibles ou apparaissant plus brutalement) ne permettent pas de prévenir l’apparition de signes majeurs de souffrance ou de la mortalité chez tous les souriceaux, d’où une gravité potentiellement plus sévère des expériences chez quelques souriceaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ces animaux auront été infectés et manipulés en zone de sécurité biologique de niveau 3.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une vaste collaboration de recherche visant à mieux comprendre et mesurer les risques en santé humaine et vétérinaire liés à la transmission du s de la méningoencéphalite à tiques par le lait. Des expériences in vitro, utilisant des organoïdes et cultures de cellules primaires, seront réalisées en parallèle de ce projet pour caractériser le tropisme cellulaire de l’infection et les mécanismes de franchissement de barrières de l’hôte (animal ou homme) au niveau mammaire (franchissement qui conduit à l’excrétion de virus dans le lait) et au niveau digestif (franchissement qui conduit à l’infection d’un nouvel hôte). Cependant, aucune expérience in vitro ne peut permettre de répondre aux 4 objectifs de ce projet (étude de la dissémination du virus dans les glandes mammaires des individus infectés, de la charge virale, l’infectiosité et la persistance du virus dans le lait et l’estomac, l’efficacité de transmission par allaitement et l’impact du lait sur la transmission par voie orale) nécessitant l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

L'évaluation de la dissémination virale dans une lignée de souris ne devrait pas nécessiter plus de 5 souris d'après notre expérience avec des virus de la même famille. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour atteindre les résultats significatifs et conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience repose sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. Nous déterminerons tout d’abord le temps d’infection, la dose infectieuse, les deux lignées de souris et les deux souches virales les plus pertinentes pour notre étude, qui seront ensuite utilisés pour la suite du projet. De plus, si aucune différence significative entre lignées de souris et/ou souches virales n’est mesurée, une seule souche virale et/ou une seule lignée de souris seront utilisées pour certaines procédures.

Raffinement

Deux formes de raffinement seront utilisées dans toutes les cages contenant des souris lactantes et leurs portées : des igloos ainsi que du coton afin notamment que les mères puissent construire des nids pour leurs portées de souriceaux. Les mères ne seront jamais isolées dans les cages, avec présence d’une autre souris femelle adulte dans la cage (mère ou pas), ce qui selon notre expérience réduit considérablement leur stress et le risque que la(les) mère(s) mange(nt) ses(leurs) souriceaux. Tous les gestes techniques effectués sur les mères allaitantes et leurs portées ont été discutés avec la structure du bien-être animal et adaptés spécifiquement afin de garantir un maximum de bien-être pour tous les animaux durant toutes les expériences. Les expérimentateurs changeront également de gants entre les manipulations de chaque portée pour ne pas perturber la reconnaissance (par l’odorat) des souriceaux par leur mère. Concernant les expériences sur des souris uniquement adultes, toutes les règles normales d’élevage et d’enrichissement seront respectées, en évitant totalement la présence d’animaux isolés. Seuls des gestes techniques approuvés seront utilisés. Dans certains cas, l'infection se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante dont l’ampleur sera à déterminer, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie. Les animaux infectés seront surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire. Des points limites (précisés dans chaque procédure) spécifiques et précoces seront utilisés afin de minimiser la souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs constituent le réservoir naturel du virus étudié, le modèle souris est donc un modèle d’infection pertinent. D’un point de vue pratique et éthique, il est nécessaire de commencer cette étude sur modèle petit animal (la souris est un bon choix car les rongeurs sont le réservoir naturel du virus), avant de valider (dans un autre projet à venir, qui sera réalisé par des collaborateurs) les résultats les plus probants sur un gros animal (chèvre, vache…) plus pertinent concernant le risque de transmission à l’homme par l’intermédiaire de produits laitiers. La dangerosité du virus impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable aves l’espèce souris et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Les animaux utilisés dans les procédures seront : - Des souris adultes et des souriceaux. - Le choix des âges utilisés est lié à la nature du projet, qui est d’étudier la présence de virus infectieux dans les glandes mammaires et le lait, et la transmission soit par allaitement (donc aux souriceaux), soit la transmission par voie orale quel que soit l’âge (alimentaire : donc à la fois à des souriceaux et des souris adultes, afin de déterminer une éventuelle différence de sensibilité à l’infection)

Greffées de cellules d'ostéosarcome sous la peau ou dans la patte, mesurées au pied à coulisse jusqu'à sept fois par semaine pendant trente-cinq jours et scannées quatre fois, 236 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes sont tuées pour récupérer tumeurs et poumons, analyses que le porteur qualifie d'"indispensables" pour apprécier l'effet des composés. La tumeur peut provoquer une boiterie et une ulcération de la patte, et les métastases une gêne respiratoire, ce que le porteur prévoit de compenser en humidifiant la nourriture au fond de la cage. Il écrit que toutes les précautions seront prises pour stresser au minimum l'animal, dans un protocole qui prévoit jusqu'à sept manipulations par semaine sur des souris portant une tumeur osseuse à la patte.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os longs (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant le remodelage osseux ont été identifiées. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe en sous cutané (Durée geste : 1min). Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée geste : 5 min maxi). Évaluation de l’efficacité des composés : l'imagerie scanner (Durée geste : 8 min maxi par point d’acquisition 1x/semaine, 4x maximum. Traitement : 2 jours/7jours (un traitement 2min/souris) pendant 5 semaines maximum et mesure au pied à coulisse des tumeurs (maximum 7x/semaine, 2min/souris) pendant 35 jours maximum.

Impact sur les animaux

La réalisation de multiples contentions et manipulations (traitement, mesures, pesée) peut engendrer un stress chez l’animal. L’injection des cellules et des traitements peut provoquer une infection des points d’injection. Lors du développement tumoral (lyse osseuse) la tumeur peut entrainer une boiterie de l’animal mais aussi une ulcération de la patte. En cas d'apparition de métastases, une gêne respiratoire peut survenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée).

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour la récupération et l’analyse de tumeurs et poumons. Ces analyses sont indispensables pour apprécier l’effet antitumoral des composés

Remplacement

Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs sur des cellules en culture. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts. De plus, pour chaque modèle tumoral, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie Scanner. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet. Les animaux n’ayant pas développé de tumeurs seront traités comme le reste des animaux, les organes seront également prélevés pour servir de tissus contrôles sains.

Raffinement

Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupes de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L'utilisation de souris dans les modèles d’ostéosarcomes, est justifiée par l'absence de modèles équivalents chez les petits rongeurs tels que les rats. Passer directement aux chiens impliquerait l'étude de cancers spontanés, ce qui relève davantage des essais cliniques. Les souris, en revanche, permettent de créer des modèles d’ostéosarcomes contrôlés et reproductibles, offrant ainsi un cadre expérimental plus rigoureux pour tester l'efficacité des traitements avant de passer à des essais cliniques. Les souris sont greffées à l’âge de 5 semaines, âge approprié pour reproduire le caractère peri-adolescent de l’ostéosarcome chez l’homme.

Quarante minutes immobilisées dans une chambre de contention, le nez pointé vers un flux d'air chargé de bacilles tuberculeux : 560 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les autres sont infectées par instillation nasale sous anesthésie, puis toutes reçoivent par gavage une molécule à tester, une fois par jour, cinq jours par semaine. Le porteur indique que les bactéries se multiplient dans les poumons en provoquant inflammation et lésions, avec altération de l'état général et difficultés respiratoires, et que l'accumulation de ces actes entraîne des nuisances sévères. Il énumère macaques, ovins, bovins, porcs, cobayes, lapins, rats et poissons zèbres parmi les modèles existants de la tuberculose, retient la souris et la qualifie de modèle "incontournable".

Objectifs

Malgré l’existence d'un vaccin et de médicaments, la tuberculose fait encore 1,4 millions de décès chaque année et reste l’une des maladies les plus meurtrières dues à un agent infectieux unique, Mycobacterium tuberculosis. Le traitement est long (6 mois) et combine plusieurs médicaments antituberculeux de première intention découverts dans les années 1950 et 1960. De plus, l’émergence et l’expansion de formes de tuberculose multi, extrêmement ou même totalement résistantes aux antibiotiques soulignent le besoin urgent de développer de nouvelles molécules thérapeutiques possédant de nouveaux mécanismes d'action, en complément de l'antibiothérapie actuellement préconisée par l'Organisation Mondiale de la Santé. La structure chimique unique de ces composés suggère un mode d'action distinct de celui des médicaments antituberculeux classiques ce qui pourrait permettre de contourner le problème d’apparition de résistance et/ou réduire la durée du traitement. Des données préliminaires sur une nouvelle famille de composés, ont montré que ces molécules sont capables d’inhiber la croissance du bacille tuberculeux (Mycobacterium tuberculosis) dans des cultures in vitro mais aussi qu’elles permettent de réduire la charge bactérienne dans certains types de cellules immunitaires. De façon remarquable, ces composés à tester n’ont pas d’effet cytotoxique sur différentes lignées de cellules humaines aux concentrations qui sont actives sur la bactérie. Le projet a pour objectif : 1/ tester l’efficacité contre la tuberculose in vivo chez la souris de ces composés à tester à différentes doses, et 2/ évaluer l'éventuelle synergie de ce traitement avec l'antibiothérapie standard utilisée pour traiter la tuberculose chez l'humain. Ce projet permettra de valider que cette famille de composés possède une activité antituberculeuse dans un modèle de souris infectées et ouvrira la voie à des études complémentaires visant à améliorer cette activité en vue du développement de nouveaux médicaments antituberculeux.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider ces composés à tester comme nouveaux candidats prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments antituberculeux qui, de par leur structure innovante, pourraient prévenir le développement de souches résistantes et réduire la durée actuelle du traitement.

Procédures

Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois pendant 1h pour être infectées (durée d’environ 1 minute). Puis les animaux vigiles recevront par voie orale 1 fois par jour, 5 jours par semaine, la molecule ou le traitement (durée inférieure à 2 minutes).

Impact sur les animaux

Un stress modéré pourra être engendré par la préhension et la contention afin de procéder au gavage. Un stress léger sera engendré lors des pesées pour certains animaux. L’infection des souris peut se faire soit par voie intranasale soit par nébulisation: - Pour l’instillation intranasale, des nuisances modérées sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre) et lors de l’infection des animaux. -Pour l’infection par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres avec le nez pointant vers le flux d’air. Cette opération induit un stress modéré. Suite à l’infection des souris par le bacille tuberculeux, les bactéries se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Des nuisances modérées peuvent alors être observées: altération de l’état général et difficultés respiratoires L’accumulation de ces actes sur l’animal entraine des nuisances sévères

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène.

Remplacement

Différents modèles cellulaires sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour comparer l’efficacité thérapeutique potentielle de molécules. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain.

Réduction

Les expériences antérieures ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. La taille des lots d’animaux a été fixée à n=5 animaux par groupe, l'expérience devant être réalisée 3 fois pour s'assurer de sa reproductibilité Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est de 560 souris. Le nombre de bactéries nécessaires à l'infection a déjà été déterminé dans notre laboratoire permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les infections pouvant être douloureuses seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

S'agissant de la tuberculose, il existe, au-delà de l'utilisation de prélèvements humains, des modèles animaux communs divers : macaques, ovins, bovins, porc, cobaye, lapin, rat, souris, poisson zèbre pour citer les principaux ainsi que des modèles cellulaires. Le modèle le plus accessible est l'infection d'un type de cellules immunitaires par les bactéries. L’efficacité de ces molécules a été montré in vitro dans un modèle de cellules immunitaires infectés par Mycobacterium tuberculosis et elle doit être confirmer in vivo. En effet, s'agissant de réponses intégrées, celles-ci ne sont pas prévisibles sur ce type de cellules immunitaires. Le modèle murin devient alors incontournable. Parmi les différents modèles animaux de la tuberculose, nous avons choisi la souris qui est largement utilisée pour le développement de médicaments et de vaccins antituberculeux. Le stade de développement choisi est le stade adulte car toutes les fonctions de l’organisme sont matures (notamment système immunitaire et digestif pour la métabolisation des molécules). Pour cette raison, nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 8 semaines.

L'apparition d'une nécrose ou d'une ulcération de la tumeur irradiée déclenche la mise à mort de l'animal, comme un volume tumoral jugé critique. 112 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacune reçoit des cellules tumorales dans ses deux coussins adipeux mammaires, puis des prélèvements de sang hebdomadaires sous sédation pendant quatre mois au plus et des irradiations sous anesthésie. Des métastases pulmonaires peuvent apparaître sans être détectables avant l'autopsie, et le projet ne teste encore aucun traitement : il sert à caler le modèle et à trouver la dose d'irradiation utile à un projet ultérieur sur les nanoparticules.

Objectifs

Un des axes d’amélioration thérapeutique dans le traitement du cancer par radiothérapie consiste en une augmentation de la dose d’irradiation ciblant les cellules tumorales, tout en limitant au maximum l’irradiation des cellules saines localisées autour de la masse tumorale. . Après avoir réalisé des études in vitro sur le potentiel thérapeutique d’une approche combinant irradiation et présence de nanoparticules dans les cellules cancéreuses , il est désormais nécessaire d’évaluer l’effet in vivo, où le système immunitaire des animaux pourrait augmenter encore l’effet souhaité. Ainsi, dans le cadre de ce projet, nous cherchons à développer et caractériser un nouveau modèle murin de cancer du sein, pour l’utiliser afin d’évaluer l’action de nouvelles nanoparticules sur la sensibilité aux irradiations des cellules cancéreuses. Nous utiliserons également ce modèle pour étudier l’impact de la réponse immunitaire sur l’effet à distance suite à un traitement. Le développement de ce nouveau modèle nécessite la réalisation de greffes de cellules tumorales mammaires dérivées d’un type de souris génétiquement modifiée dans des souris receveuses/hôtes, pour mimer ainsi les différentes étapes de la progression tumorale du cancer du sein. Le premier objectif est d’évaluer les paramètres cliniques de la progression tumorale, après greffe de ces cellules de tumeurs mammaires. Le second objectif correspond à la détermination des doses optimales d’irradiations et de leurs fractionnements pour observer une régression tumorale dans ce modèle murin. Enfin, le dernier objectif est d’évaluer la réponse immunitaire sanguine et tumorale des animaux suivant l’irradiation.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre - d’évaluer la faisabilité d’un modèle de greffe de cellules tumorales du sein, qui puisse être reproductible et utilisable pour tester des traitements anti-cancéreux. - de déterminer les conditions optimales d’irradiation de ce modèle. Pour un projet ultérieur, testant l’efficacité d’un double traitement avec nanoparticules et irradiations, il est nécessaire de déterminer une fenêtre d’irradiation réunissant deux conditions : un effet de l’irradiation seule doit être observé d’une part, mais sans éliminer l’ensemble des cellules tumorales présentes d’autre part, afin d’évaluer objectivement l’effet d’un double traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois types d’intervention, à savoir des prélèvements sanguins, une injection de cellules tumorales, et une irradiation. Chacune de ces interventions ne dure pas plus de quelques minutes (anesthésie comprise) - Les prélèvements sanguins sous sédation seront réalisés à partir du jour de l’injection de cellules tumorales, au maximum une fois par semaine, et pour un volume maximal de 60µl de sang. Les prélèvements seront effectués au maximum pendant quatre mois, correspondant au temps d’inclusion des animaux dans les procédures. - L’injection de cellules tumorales sera réalisée en une fois, dans deux coussins adipeux mammaires par souris. - Les irradiations seront effectuées sous anesthésie dans un irradiateur pour petit animal. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique, et l’apparition de nécrose ou ulcération tumorale sera répertoriée, afin de détecter l’apparition d’un point limite

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits par les traitements peuvent être d’une part dus à l’injection de cellules, avec une possible réaction inflammatoire au point d’injection. Avec un suivi adapté et une analgésie si nécessaire, ces effets peuvent être limités à quelques heures. Si l’inflammation persiste, l’animal sera exclu de l’étude, cette réaction pouvant entrainer un biais dans l’analyse de la réaction immunitaire. Les cellules tumorales injectées sont censées former une masse tumorale en croissance. Cette croissance sera progressive et pourra atteindre un volume critique, qui sera considéré comme un point limite. Dès l’atteinte de ce point limite, l’animal sera euthanasié. De même, une croissance tumorale qui serait défavorable au comportement normal de l’animal sera considérée comme point limite. Des métastases (pulmonaires essentiellement) sont susceptibles d’apparaître chez certains animaux. Elles ne seront pas détectables avant l’autopsie. La croissance des tumeurs et métastases peut également mener à une perte de poids globale et des signes cliniques de mauvais état général. Dans ce cas, l’utilisation d’une grille de score (outil d’évaluation quantitatif de points limites) permettra d’évaluer la nécessité de procéder à une euthanasie. Enfin, l’irradiation peut favoriser, notamment avec de fortes doses, l’apparition d’une nécrose ou ulcération de la tumeur irradiée. Cet effet sera reporté dans le tableau de scoring et utilisé comme point limite menant à l’euthanasie.

Devenir

Les animaux du projet seront tous euthanasiés, selon deux critères : - soit l’animal a atteint un point limite fixé dans ce document et sera euthanasié. - Soit l’animal n’a pas atteint de point limite dans le cadre de l’étude, mais est porteur de tumeurs, donc sera euthanasié en fin d’étude (soit au plus tard quatre mois après inclusion) car ne pourra pas être réutilisé.

Remplacement

Le projet présenté s’inscrit dans le cadre d’un programme plus large, visant à évaluer l’efficacité antitumorale d’un double traitement associant des nanoparticules à des irradiations. De nombreuses études sur l’augmentation des effets des irradiations par les nanoparticules métalliques ont été réalisées in vitro, et parfois sur des modèles 3D. Les résultats obtenus, très contrastés, sont la plupart du temps éloignés des résultats obtenus in vivo chez la souris, voire en essais cliniques. En effet, il est désormais admis que cet effet potentialisant est au moins en partie dû à la survenue d’une réponse inflammatoire et l’intervention de cellules immunitaires. De plus, le projet cherche également à mettre en évidence l’effet à distance d’un tel traitement, c’est-à-dire la régression d’une tumeur à distance du lieu d’irradiation. Ainsi un modèle in vitro, même de type organoïdes, ne permettrait ni de réellement évaluer l’efficacité de radiosensibilisation des nanoparticules, ni d’estimer le potentiel abscopal de ce type de traitement. Par conséquent, il est nécessaire de mettre en place un modèle pertinent de tumeurs du sein, objet de cette demande .

Réduction

Ce projet va permettre de déterminer les fenêtres de caractérisation et d’irradiations (doses et fractionnement) optimales dans ce modèle pour observer un effet sur la régression tumorale. Ce projet nous permettra de réduire le nombre d’animaux au minimum pour déterminer la dose d’irradiation optimale. Le modèle développé pour ce projet permet également de générer des tumeurs homogènes chez les souris receveuses/hôtes, assurant ainsi une meilleure reproductibilité dans la réponse thérapeutique.

Raffinement

Dès l’injection des cellules tumorales dans les souris, les animaux seront surveillés les lundis, mercredis et vendredis, chaque semaine. Chaque animal fera l’objet d’une observation dans la cage tout d’abord, puis sera anesthésié à l’isoflurane pour être caractérisé plus précisément. Les observations seront répertoriées dans des feuilles de suivi (de scoring) afin de pouvoir assurer un suivi et détecter une évolution défavorable des signes. L’observation du comportement des animaux d’une part, et la mesure du poids et de la taille des tumeurs d’autre part, nous permettra d’évaluer la nécessité d’apporter une solution analgésique ou de procéder à l’euthanasie des animaux si leur condition l’indique (amaigrissement important, prostration, etc...). Des aspects supplémentaires seront répertoriés (réaction à l’anesthésie et aux prélèvements sanguins, aspect clinique de la tumeur), afin de déterminer l’apparition d’autres points limites menant à l’euthanasie. Les animaux seront maintenus en groupe selon les conditions habituelles d’hébergement dans l’établissement utilisateur.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en cancérologie. Les cellules tumorales utilisées proviennent du modèle murin génétiquement modifié qui développe des tumeurs mammaires spontanées comparables aux tumeurs humaines, en matière de carcinogénèse, et de types histologiques et moléculaires. Les cellules seront greffées dans des souris receveuses/hôtes, qui ont donc le même fond génétique que les cellules greffées, afin d’éviter tout rejet de greffe ou réaction inflammatoire indésirable. Enfin, les souris receveuses sont immunocompétentes (capables de produire une réponse immunitaire face à un corps étranger), critère indispensable dans notre étude qui cherche à déterminer les modifications de la réponse immunitaire. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines. Le développement de cancers étant évalué à l’âge adulte, nous utiliserons des femelles âgées de 6 à 8 semaines.