Recherche fondamentale

Anesthésiées, greffées avec des cellules cancéreuses humaines sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris aux défenses immunitaires réduites voient leur tumeur croître pendant huit semaines au maximum. S'ajoutent une séance d'imagerie sous anesthésie par semaine, une injection de nanoparticules, puis une séance de radiothérapie de vingt minutes. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et le porteur note que le modèle de souris immunodéprimée "est une nuisance en soi", tout en écrivant que la radiothérapie ne devrait pas provoquer d'effets indésirables. Elles sont tuées à la fin pour que la tumeur et les organes soient prélevés et analysés.

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

Pour comparer la digestibilité de protéines végétales fermentées ou germées à celle de la caséine, 50 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun est hébergé seul pendant les 38 jours du protocole, un isolement dont le porteur reconnaît qu'il induit chez ces animaux sociaux une détresse chronique. Les quatre derniers jours se passent en cage métabolique, plus petite, au sol grillagé. Les mesures de force et de coordination sont présentées comme faites sur la base du "volontariat", et une décision sera prise sur l'animal dès qu'il présentera trois points limites notables ou un point sévère.

Objectifs

La transition vers un régime plus végétal et durable fait partie des grandes évolutions de l’alimentation. Augmenter la consommation de sources protéiques végétales telles que les légumineuses et les céréales complètes devient un enjeu majeur. Ces sources végétales sont des vecteurs de fibres et de micronutriments dont la consommation est associée à une prévention des maladies chroniques. Cependant, la qualité nutritionnelle moindre des protéines végétales est à prendre en compte pour proposer des produits adaptés aux besoins de la population. Les protéines végétales issues des céréales et légumineuses ont souvent des profils en acides aminés incomplets par comparaison avec les protéines d’origine animale. De plus, ces protéines végétales contiennent des facteurs antinutritionnels interférant avec l’absorption des micronutriments et réduisant la digestibilité des protéines. Aussi, l’utilisation de bioprocédés tels que la fermentation et la germination permettrait de lever ce verrou tout en respectant le concept de « Naturalité » inscrit dans la transition alimentaire actuelle. Il est apparu récemment un intérêt pour la combinaison de ces deux procédés afin de parfaire la digestibilité protéique des aliments végétaux et d’optimiser la biodisponibilité de micronutriments. Alors que la germination est un processus biologique commençant à l’imbibition d’une graine quiescente et s’achevant au moment de la percée de la radicule, la fermentation résulte de l’action spontanée ou dirigée de communautés microbiennes endogènes, et/ou ajoutées, sur des matières premières d’origine animale ou végétale. Les aliments résultant de ces procédés sont profondément modifiés sur le plan biochimique et contiennent une biomasse microbienne élevée, le plus souvent vivante. La fermentation est bien maîtrisée sur les matrices liquides animales mais elle reste exploratoire et complexe sur les matrices solides végétales. De plus, l’utilisation de ce type de fermentation sur des graines germées n’a, à notre connaissance, jamais été investiguée pour l’alimentation humaine. Aussi, l’efficacité alimentaire de matrices végétales ainsi traitées doit être absolument évaluée chez l’animal avant toute consommation par l’Homme. Le projet a pour but d’évaluer l’impact de la fermentation solide sur la digestibilité protéique et les effets santé de différents prototypes d’aliments germés ou non germés à base de céréales et de légumineuses chez le rat en croissance.

Bénéfices attendus

A court terme, du fait de la composition équilibrée en acides aminés indispensables dans le mélange orge et pois chiche, comparable à celle de protéines animales, et de l’utilisation de façon associée de la fermentation et la germination pour limiter les facteurs antinutritionnels, nous postulons que le régime à base de protéines végétales issues de graines traitées par germination puis fermentation présentera une efficacité métabolique similaire au régime contenant la caséine en termes de croissance, d’accrétion protéique corporelle et de régulation du métabolisme protéique chez le rat jeune. A plus long terme, le projet aura un impact positif sur le plan environnemental et sociétal et contribuera à l’élaboration de nouveaux aliments à forte valeur ajoutée, grâce à l’optimisation des conditions de fermentation solide adaptés au contexte végétal combiné à la germination. Ses bioprocédés répondent pleinement aux attentes actuelles des consommateurs : naturalité, absence de conservateurs et potentiels bénéfices santé. Par ailleurs, la maîtrise croissante des communautés microbiennes et la possibilité de créer et optimiser des consortiums à fonctionnalités ciblées font de ces aliments une mine d’innovations pour l’avenir face aux défis qui attendent nos systèmes alimentaires. Les bénéfices attendus du projet devraient répondre à la fois à des enjeux environnementaux mais aussi de santé publique. En effet, ce projet devrait permettre d’augmenter la part des végétaux dans l’alimentation afin de contribuer à un rééquilibrage de la consommation de protéines animales versus protéines végétales dans le but d’aller vers un modèle alimentaire plus vertueux d’un point de vue nutritionnel et environnemental. Ceci permettra de diversifier l’alimentation et de prévenir les carences nutritionnelles. De plus, le développement de produits de bonne qualité nutritionnelle et sources de protéines pourrait prévenir le risque de dénutrition de populations spécifiques comme les personnes âgées en leur apportant des produits digestibles, ayant des goûts/textures adaptés et répondant à leurs besoins nutritionnels. De plus, ces nouveaux aliments pourraient également prévenir l’apparition de dysbioses intestinales via la consommation d’aliments vecteurs de microorganismes « positifs ». Pour finir, la valorisation par fermentation solide pour l’alimentation humaine permet une nette réduction des émissions de gaz à effet de serre ainsi qu’une sauvegarde des ressources en eau douce.

Procédures

Les rats seront hébergés en cage individuelle pour contrôler précisément leur consommation pendant toute la durée du protocole depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à leur sacrifice soit 38 jours au total. Les animaux subiront diverses interventions au cours du protocole. Elles auront pour but de : (1) mesurer la composition corporelle sur animal vigile via une technique non invasive peu stressante réalisée 2 fois et d’une durée de 2 minutes à chaque fois. (2) mesurer la fonctionnalité musculaire de façon non invasive et sur animal vigile. Cette mesure fait intervenir 3 appareils. Ces mesures seront réalisées sur la base du « volontariat » car il est impossible d’obliger les animaux à réaliser les exercices. L’appareil 1 servira à mesurer la force et sera utilisé 2 fois pour une durée de manipulation de l’animal de 30 secondes à chaque fois. L’appareil 2 permettra d’évaluer l’équilibre et la coordination motrice et sera utilisé 2 fois. La durée dépendra de l’endurance et de la volonté du rat à réaliser l’exercice (5 minutes au maximum). Enfin, l’appareil 3 permettra d’appréhender l’activité ambulatoire totale et ne sera utilisé qu’à la fin du protocole. L’expérience dure 10 minutes et est non stressante. (3) mesurer la rétention azotée (azote ingérée – azote excrétée) au niveau corps entier. Cette mesure nécessite la récupération de la totalité des fèces et de l’urine produits. Les rats concernés hébergés dans une cage métabolique conçue pour permettre cette récupération. La durée du passage sera réduite au maximum (4 jours au total) sans compromettre les résultats du projet. (4) mesurer la synthèse protéique dans les muscles squelettiques en fin de protocole. Après avoir été mis à jeun la veille, les 50 rats subiront, le matin, une injection permettant de mesurer la synthèse protéique 50 minutes avant l’euthanasie. Tous les rats seront ensuite mis à mort sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

Dès leur arrivée à l’animalerie et durant toute la durée du protocole expérimental, tous les rats (50) seront hébergés en cage individuelle. Cet isolement affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant une détresse chronique. Lors de leur séjour en cage métabolique pendant les 4 derniers jours du protocole, les animaux seront soumis à un stress physique et une détresse supplémentaires par rapport à l’hébergement en cage individuelle. En effet, la taille des cages métaboliques est réduite comparativement aux cages d’hébergement standard. De plus, le sol est composé d’une grille qui affecte le bien-être des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir réaliser les analyses sur les différents tissus prélevés qui permettront de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet, est absolument nécessaire et ne peut être remplacée par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire ne permettant pas de mesurer simultanément la digestibilité des différentes sources de protéines, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et tissulaire. Pour l’instant, ce projet ne peut pas non plus être réalisé directement chez l’Homme. En effet, l’utilisation de la fermentation solide sur des graines germées de céréales et de légumineuses n’a, à notre connaissance, jamais été investiguée pour l’alimentation humaine et l’efficacité alimentaire de ces produits doit être absolument évaluée avant son application chez l’Homme. Les régimes alimentaires vont être confectionnés à partir de prototypes d’aliment réalisés à petite échelle spécifiquement pour le projet. Il est à noter qu’avant de réaliser les régimes fournis ensuite aux animaux les différentes farines seront analysées d’un point de vue nutritionnel et microbiologique garantissant leur innocuité.

Réduction

Les résultats d’études antérieures menées sur des rats nourris avec des farines produites à partir de protéines de différents végétaux ont permis de réduire le nombre d’animaux utilisés à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre total de rats nécessaires à la réalisation de ce projet est de 50. Pour analyser les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons plusieurs tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les rats seront hébergés individuellement dans des cages adaptées à leur poids et leur taille. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque rat, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision adaptée afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des rats Wistar âgés de 4 semaines au début de la mise sous régime car ces animaux présentent un métabolisme très proche de celui de l'Homme tout particulièrement au niveau de notre métabolisme cible, le métabolisme protéique. C’est pourquoi le choix de cette espèce est préconisée par l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) pour évaluer l’efficacité nutritionnelle d’un régime. Ce modèle est bien connu du laboratoire et de récentes études menées au sein de l’équipe de recherche l’ont utilisé. L’étude vise à évaluer l’efficacité alimentaire et à caractériser l’effet d’un régime à base de protéines végétales issues d’un mélange de graines germées ou non puis ayant été soumis à une fermentation ou non, sur le métabolisme protéique musculaire chez le rat en croissance. Les animaux seront donc âgés de 4 semaines et seront de poids homogène (environ 300g) au début du protocole. Ils seront âgés de 9-10 semaine à la fin de l’étude en tenant compte des 10 jours d’acclimatation

Des injections quotidiennes pendant cinq semaines, une tumeur greffée et jusqu'à deux séances d'imagerie par semaine : 4 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant comprimer les tissus voisins, se nécroser ou s'ulcérer. La question posée est de savoir si neutraliser un régulateur de l'autophagie renforce l'effet des immunothérapies anticancéreuses. Le choix de la souris tient à l'habitude et à la commodité, le porteur indiquant que les laboratoires en utilisent principalement, que c'est l'animal de laboratoire le plus couramment employé et que l'équipe en a la pratique.

Objectifs

L’autophagie est un processus naturel qui permet aux cellules de se débarrasser de leurs parties abîmées, comme les organites ou les protéines endommagées. En recyclant ces éléments, les cellules peuvent mieux s’adapter aux situations de stress. Ce mécanisme est important car il aide les cellules à se réparer et à se protéger. Des recherches récentes ont montré que l’autophagie joue un rôle crucial dans le soutien du système immunitaire pour combattre les tumeurs. Bien que nous ne comprenions pas encore complètement comment cela fonctionne, il semble que l’autophagie puisse influencer l’efficacité des traitements de l’immunothérapie contre le cancer. Par conséquent, explorer comment cibler ce processus dans le contexte des tumeurs pourrait améliorer l’efficacité de ces traitements. Certains régulateurs de l’autophagie, présents à l’intérieur des cellules, participent à des fonctions comme le métabolisme des graisses. Mais ils peuvent aussi agir à l’extérieur des cellules, étant libérés par divers organes tels que le foie, les graisses, le cœur, les reins et les muscles. Des études ont montré que bloquer ces régulateurs extracellulaires active l’autophagie dans plusieurs modèles de souris, notamment dans le foie et le cœur. Ce projet a pour but d’évaluer si la neutralisation de certains régulateurs de l’autophagie, qui circulent à l’extérieur des cellules, peut améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Nous cherchons également à comprendre comment cette neutralisation influence les réponses immunitaires, notamment la capacité du système immunitaire à se souvenir et à réagir de manière plus efficace face aux cellules cancéreuses. Enfin, nous souhaitons explorer le rôle de ces régulateurs dans le syndrome de Li-Fraumeni (SLF), une maladie héréditaire rare qui augmente le risque de développer plusieurs types de cancers dès le plus jeune âge.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer revêt une importance cruciale tant en France qu'à l'échelle mondiale. Tout d'abord, le cancer demeure l'une des principales causes de morbidité et de mortalité, constituant un défi majeur pour les systèmes de santé. Les données épidémiologiques montrent une augmentation de l'incidence de ces cancers, avec des variations significatives selon les régions et les populations, influencées par des facteurs génétiques, environnementaux et de mode de vie. L'immunothérapie, une approche anticancéreuse largement discutée au cours des quinze dernières années, produit des résultats remarquables chez les patients réceptifs. Cependant, entre 50 et 80 pour cent des individus ne manifestent pas de réponse positive à ces traitements. En somme, trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques est impératif pour répondre efficacement à ce défi de santé mondial et offrir de l'espoir à ceux qui luttent contre cette maladie dévastatrice. Cette étude permettra de déterminer si la neutralisation de la protéine impliquée dans l’autophagie pourrait être proposée comme une nouvelle stratégie thérapeutique anticancéreuse.

Procédures

Les souris seront partiellement rasées au niveau du dos (quelques secondes). Les souris de ce projet recevront une injection de cellules afin de provoquer le développement d'une tumeur. Une partie des souris recevra une seconde injection pour tester le système immunitaire. Les injections seront réalisées pendant que les souris seront endormies avec un anesthésiant léger, afin de minimiser leur stress et leur inconfort. Les traitements anticancéreux seront ensuite administrés quotidiennement pendant une période maximale de 5 semaines, par des injections qui seront faites rapidement et sans provoquer de douleur ou de symptômes majeurs. La taille des tumeurs sera mesurée régulièrement, au moins deux fois par semaine, avec un instrument précis, sans perturber les souris plus d'une minute à chaque mesure. Pour suivre l'évolution des tumeurs, certaines d’entre elles seront surveillées par une méthode d’imagerie spéciale, deux fois par semaine. Ce suivi par imagerie ne durera pas plus de 10 minutes par animal. Dans certains cas, les souris recevront seulement deux injections de traitements, qui seront effectuées rapidement et ne provoqueront pas de symptômes gênants. Enfin, certaines injections seront réalisées dans une veine de la queue de l'animal, toujours sous anesthésie légère, pour garantir leur confort.

Impact sur les animaux

Certains animaux de ce projet recevront une injection de cellules tumorales, ce qui peut provoquer une légère douleur de courte durée au site d'injection. Aucun autre effet indésirable n’est attendu, à part ceux liés à la croissance de la tumeur elle-même. Les tumeurs en développement peuvent comprimer les tissus environnants, entraînant un certain inconfort. Selon le type de cellules injectées, les tumeurs peuvent également présenter des complications telles que des nécroses ou des ulcérations. Toutes les souris recevront des injections régulières au niveau de l'abdomen, ce qui peut entraîner un stress dû à la manipulation et une douleur passagère au point d'injection. Certaines souris subiront également des injections dans une veine de la queue. L'utilisation d'anesthésiant peut parfois réduire la capacité des animaux à réguler leur température corporelle et peut entraîner un risque pour leur fonction cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L'impératif d'utiliser des animaux vivants découle de l'incapacité actuelle à reproduire in vitro ou ex vivo la complexité des effets des traitements anti-cancéreux sur la tumeur, les tissus environnants, les facteurs solubles et le système immunitaire. Les réponses immunitaires ne peuvent être pleinement comprises que dans le contexte d'un organisme vivant. Les modèles animaux reproduisent mieux la complexité du microenvironnement tumoral, y compris les interactions entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les vaisseaux sanguins.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4170 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique (Chlorhexidine). De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les mâles qui montreront des signes d'agressivité seront isolés pour prévenir les blessures et le stress causés par les combats. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Les laboratoires utilisent principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé. -La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Injectées dans la cavité abdominale avec un mélange de polluants perfluorés, 90 truites d'environ deux ans subissent deux prélèvements de mucus, deux pesées et un test comportemental mené sans anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que les interventions n'impliquent que des "stress légers", et s'appuie sur des études antérieures n'ayant relevé aucune mortalité pour justifier les concentrations retenues. La mise à mort sert à prélever le foie et à y doser des marqueurs de stress, afin de vérifier si le mucus pourrait un jour remplacer ces prélèvements.

Objectifs

Les substances per- et polyfluoroalkylées, également connues sous le nom de PFAS, sont une large famille de plus de 4 000 composés chimiques. Ces substances sont nommées polluants éternels en raison de leur persistance dans l’environnement dû à leur faible dégradation dans l'environnement. Ces composés sont utilisés pour largement utilisés dans l’industrie ; ils rentrent par exemple dans la composition du téflon, des mousse anti-incendie, des revêtements imperméables, le fart pour le ski, les produits antitaches…. Ces substances sont largement rependues à l’échelle mondiale en raison de leur utilisation variée, ainsi tous les milieux peuvent être concernés par des contaminations : l’eau, l’air, les sols, et la chaîne alimentaire. Depuis, 2023 certaines de ces substances sont classés « cancérogène pour les humains » pour le PFOA (acide perfluorooctanoïque) et « peut-être cancérogène pour les humains » pour le PFOS (sulfonate de perfluorooctane ) par Centre international de recherche sur le cancer. De plus, des concentrations plus élevées ont été retrouvé pour des poissons sauvages avec des concentrations supérieures à la teneur maximale de 450 μg/kg de poids frais. De précédentes études relatent une toxicité pour les organismes aquatiques, sur les systèmes endocrinien et immunitaire, sur la reproduction et le comportement. Néanmoins, il n’existe à notre connaissance pas d’études portant sur l’impact de ces substances sur les protéines de l’immunité et du stress chez les poissons. Un salminidé est choisi pour ce projet car elle présente de multiples intérêts : patrimonial, socio-économique et comme sentinelle de la qualité des rivières. De plus, de poisson est largement présent dans les rivières et est largement péchés et consommés. Ainsi, l’objectif sera de tester des marqueurs de l’activité immunitaire et de stress afin d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances. Le prélèvement de mucus apparait comme un bon candidat pour un marqueur moins invasif, en de précédentes études montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire ni sur la structure de la peau du poisson.Ces connaissances et mise au point sur le mucus pourront alors avoir des répercutions opérationnelles afin de proposer des stratégies de surveillance de la qualité des rivières moins invasives.

Bénéfices attendus

Ainsi, l’objectif sera d’observer les potentiels effets néfastes de ces substances per- et polyfluoroalkylées sur des marqueurs immunitaires et de stress.

Procédures

Pour l'ensemble des interventions les animaux seront sous anesthésies. Les interventions de ce projet n'impliquent que des stress légers : la premiére intervention (T0) sur le poissons fera l'ojet d'une pesée puis le prélévement de mucus et une injections intrapéritonéale. Une seconde intervention sur le poisson à 7 jours (T7) fera l'objet d'une pesée et d'un prélévement de mucus. Une troisiéme intervention sur les animaux aura lieu pour une étude de comportement à 9 jours (T9) , lors de cette derniére les poissons ne seront pas anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet n'impliquent qu'un stress modéré du aux manipulations. Un stress pourra également survenir lors des étape de pesée qui auront lieu 2 fois lors l'expérimentation à T0 et T7 , du prélèvement de mucus qui auront lieu 2 fois lors de l'expérimentation à T0 et T7 , lors de l’injection intrapéritonéal qui aura lieu 1 fois lors de l'expérimentation à T0 ainsi que lors de l'analyse comportmental qui aura lieu 1 fois lors de cette expérimentation T9. Pour cela les poissons seront anesthésiés afin de minimiser les nuisances pour les étapes d'injection intrapéritonéla, de pesée et de prélévement de mucus. Le prélévement de mucus est réalisés sour anesthésie afin de minimiser le stress. Cette opération à une durée inférieure à 1minutes par poissons. Le prélèvement de mucus ne devrait pas engendrer de stress ou de nuisance, en effet de précédente étude montrent que les prélèvements successifs de mucus n'ont aucun effet sur la réponse immunitaire (activité bactéricide) ni sur la structure de la peau du poisson . L’injection intrapéritonéal à une durée infériure à 30s par poissons. Les analyses de comportements qui seront rélisées 1 fois durant l'expérimentations (T9 le surlendemain de la premiére injection). Cette analyse peut engendrer du stress en raison du transfert des poissons entre les aquariums. Pour ces analyses les poissons sont seront placées par lot de 5 dans des aquariums de 200L et seront acclimatées durant 20 minutes puis filmées durant 15 minutes. L’eau de l’aquarium sera la même que celle des conditions d’hébergements (pompage -51m) afin de garantir la même oxygénation et la même température.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis. De plus, afin d’éviter le développement d’effet néfastes à long terme les individus sont mis à mort. Suite à leur mise à morts des prélèvements de tissus, foie permettront de réaliser des dosages classiques de marqueur de stress pour tester si la réponse dans le mucus est pertinente et permet de remplacer ces prélèvements classiques.

Remplacement

Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré (différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...). En effet, une etude précédente ne montre pas d'augmentation de la mortalité pour les concentrations des mélanges testés lors de ce projet , mais montre des différences de bioaccumulation de ces molécules.

Réduction

Les analyses statistiques envisagées seront des analyses de variances . L’effectif totale est de 90 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 15 individus par conditions = 15 *6 conditions. Ce nombre a été choisi sur la base d'études antérieures afin de réduire la variabilité individuelle observée. Des études antérieures portant sur des expositions individuelles aux PFOS n'ont révélé aucune mortalité au cours du mois d'exposition.

Raffinement

Les animaux seront visités au minimum quotidiennement durant la semaine et une fois durant les weekends. De plus, dans chaque bassin, des tiges flottantes (jeux) , des plantes en plastiques et des caches seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. La détermination précose de nos point limites permettront réduire la souffrance et le stress . Afin de minimiser les nuisances, les animaux seront anesthésiés avant les procédures, d’injections, de récoltes du mucus et de pesée.

Choix des espèces

Les salmonidés ont un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et de son intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . De plus, la truite est une espèce dont cycle de vie est maitrisé au sein de par notre organisme. Contrairement à d'autres modèles de poissons utilisés en laboratoire, comme le poisson-zèbre, les études sur la truite sont facilement extrapolables à d'autres espèces de poissons présentant un intérêt écologique. Les truites choisies pour cette expérimentation seront âgées d’environs 2 ans et pèseront environ 110 g afin d’assurer un prélèvement de mucus suffisant et de la non maturité sexuelle des individus.

Une plaie carrée de vingt millimètres de côté, sur toute l'épaisseur de la peau du dos, est pratiquée sous anesthésie sur chacune des 1 080 souris immunodéficientes du projet, puis recouverte d'un substitut cutané et de leur propre peau dévitalisée suturée. Toutes sont tuées 15, 30 ou 90 jours après la greffe pour prélever la zone greffée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les greffons testés sont des produits de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines, destinés au traitement de maladies génétiques de la peau. Le porteur compte six souris par temps de prélèvement et trente substituts évalués au maximum, sans expliquer comment il parvient à 1 080 animaux. Il présente l'usage de la peau dévitalisée comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, tout en isolant chaque souris en cage individuelle pendant trois à quatre semaines.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés et utilisés suivant différentes modalités. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué les premiers substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines. Ces substituts cutanés sont destinés au traitement de maladies génétiques. Les substituts cutanés seront préparés suivant les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain. Un maximum de 30 substituts cutanés, sélectionnées sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront transportés et utilisés dès réception ou conservés jusqu’à 5 jours dans l’attente de réalisation de greffes, afin de mimer au plus près les conditions cliniques qui seront utilisées chez l’Homme. Les greffes seront effectuées sur des souris avec un système immunitaire déficient afin d’éviter leur rejet, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes afin d’étudier la fonctionnalité des greffons et les interactions se mettant progressivement en place entre greffon et hôte. Des analyses seront effectuées sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des greffons et d’appréhender les interactions se mettant en place entre le greffon et l’hôte. Les résultats obtenus permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Certaines greffes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autre greffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de composés nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules humaines sont produits par ingénierie tissulaire. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre le traitement de maladies génétiques de la peau. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et le carré de peau prélevé, dévitalisé, sera suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par un pansement et la peau dévitalisée suturée permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané. Après cicatrisation complète, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 1080 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des Unités Thérapeutiques Cliniques sélectionnées sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière. L’utilisation de la peau excisée dévitalisée, suturée au-dessus de la greffe de substitut cutané, comme pansement de couverture, évitera l’utilisation d’un système de maintien avec des bandes de sparadrap, favorisant le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.

Les souris de ce projet portent des modifications génétiques qui leur permettent de recevoir un anticorps humain sans le rejeter. 144 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intrapéritonéales par semaine pendant quatre semaines, subissent quatre prélèvements sanguins et un régime enrichi en graisse qui peut provoquer des lésions cutanées par hypertoilettage. La mise à mort sert à prélever le foie et d'autres tissus, pour un anticorps que le porteur décrit comme déjà testé en oncologie clinique chez l'être humain.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie (MCF) sont des affections inflammatoires touchant entre un et deux milliards de personnes dans le monde et constituent un risque majeur de progression vers la cirrhose, puis vers une maladie du foie non alcoolique, une étape fréquente avant le développement d’un cancer du foie. Au cours des dix dernières années, la charge de santé publique associée aux MCF a connu une augmentation significative et durable. L’identification de nouveaux marqueurs impliqués dans le processus inflammatoire hépatique est cruciale. Une protéine spécifique, aux propriétés anti-inflammatoires potentielles, pourrait constituer une cible prometteuse pour réduire cette inflammation dans le contexte des MCF. Cette étude a pour objectif d’inverser l’inflammation hépatique in vivo dans deux modèles représentatifs de cette pathologie, en utilisant un anticorps dirigé contre cette protéine, déjà testé en oncologie clinique. Une analyse approfondie du foie et des marqueurs sanguins sera réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer, de manière préclinique, la capacité d’une protéine ciblée à interférer avec l'inflammation dans des modèles murins pertinents d’inflammation chronique du foie. Les résultats devraient aider à identifier les voies de régulation par cette protéine (et, potentiellement, de nouvelles cibles thérapeutiques) impliquées dans l'inflammation chronique hépatique. Plus important encore, en cas de succès, ce projet offrira des perspectives concrètes pour un plan de traitement anti-inflammatoire innovant en hépatologie clinique. Le régime enrichi en graisse peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hypertoilettage. Celles-ci seront traitées localement.

Procédures

Durant ce projet, les animaux subiront 3 prélèvements sanguins par contention et 1 sous anesthésie gazeuse et des injections intrapéritonéale du médicament 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Ces deux gestes ne durent que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront deux injections intrapéritonéales par semaine pendant 4 semaines. La piqûre de l'aiguille provoque une douleur légère et de courte durée. Des prélèvements sanguins seront effectués toutes les deux semaines, ce qui entraîne un stress physique et une douleur légère et passagère. L’accumulation des injections et des prises de sang justifie le classement de la procédure en catégorie modérée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de l'inhibition d'une protéine sur des fonctions métaboliques complexes en situation d'inflammation chronique. Ces fonctions ne sont modélisables que dans un organisme complet capable d'exprimer l'ensemble des mécanismes de régulation physiologique, incluant l’homéostasie glucidique et lipidique, ainsi que la fonction hépatique. Une approche sur un mammifère est donc nécessaire pour obtenir des données préliminaires concernant les mécanismes physiologiques complexes en jeu dans cette étude (régulation des lipides et des glucides, déséquilibres biochimiques, balance inflammatoire). Ces données fourniront une base solide pour une approche translationnelle, afin de mieux comprendre la physiologie humaine

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Les groupes expérimentaux comprendront 6 ou 12 animaux selon les conditions : 6 pour les groupes contrôles et 12 pour les groupes avec inflammation chronique du foie. Ces effectifs sont suffisants pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans le cadre des analyses prévues. Au total, 144 souris seront nécessaires pour ce protocole, permettant de comparer les effets de l'inflammation chronique et de l’inhibition de la Nétrine-1.

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans restriction de nourriture, d'eau et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Le site d’injection sera surveillé afin d’éviter toute infection/inflammation, l'animal sera soigné en cas de lésion.

Choix des espèces

La souris est l’animal modèle de choix pour cette étude préclinique. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement d'un modèle porteur de modifications génétiques capable d'accepter l'injection d'anticorps humain, fournissant ainsi un modèle unique pour tester in vivo les anticorps humains. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction hépatique, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 8 semaines. À ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique et immunitaire qui est mise en place.

Entretenir une souche de parasite conservée au laboratoire depuis 1982 : 20 veaux nouveau-nés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Âgés de deux jours au maximum, ils reçoivent par la bouche une dose de cryptosporidies, puis développent la maladie attendue, diarrhée, déshydratation, perte d'appétit et, rarement, la mort. Chaque veau est attaché et hébergé seul pour faciliter la récolte de ses selles, avec pour tout enrichissement la présence de deux poules de réforme. Le porteur indique qu'il n'existe pas d'autre méthode pour obtenir assez de parasites infectants, et qu'un veau tous les quatre mois suffit à produire la quantité utile à ses études.

Objectifs

Les cryptosporidies (Cryptosporidium) sont des parasites protozoaires qui se multiplient uniquement dans l’intestin et sont rejetés dans le milieu extérieur avec les selles. Elles sont responsables de la cryptosporidiose, une maladie conduisant à des diarrhées sévères chez les ruminants ou les enfants de moins de 5 ans. Nous étudions plus particulièrement les réponses immunitaires qui se développent dans l’intestin en réponse à l’infection dans le but de mettre au point des stratégies immunitaires pour réduire l’incidence des infections. Par ailleurs, nous réalisons des infections expérimentales in vitro et in vivo pour tester l’efficacité de certains traitements pour tenter d’enrayer la maladie. Nous avons besoin pour tous nos projets de recherches et toutes nos expérimentations in vivo et in vitro d’une quantité importante de cryptosporidies. Comme il n’existe pas de système in vitro pour les multiplier nous devons les propager chez l’animal sensible : le veau nouveau-né. D’autres mammifères pourraient nous fournir des parasites mais en trop faible quantité. Par ailleurs, la souche de Cryptosporidium parvum (C. parvum) ne peut être congelée et nécessite d’être conservée à 4°C, mais au-delà de 2 mois, il est observé une diminution progressive de la capacité du parasite à infecter les cellules in vitro. Nos études exigent des parasites fraîchement multipliés aussi 4 multiplications/an maximum sur veau sont nécessaires pour conserver la souche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de multiplier la souche Cryptosporidium parvum pour la conserver (souche de laboratoire isolée et conservée depuis 1982 par cette méthode de multiplication in vivo).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Chaque animal recevra une administration unique. Cette intervention durera une dizaine de secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis à une administration orale du parasite, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes sont la déshydratation, la diarrhée, perte d’appétit et dans de très rares cas la mort. L’hébergement individuel et l’attache du veau sont nécessaires pour le projet. Cela réduit la liberté de mouvement de l’animal (nécessaire pour que les selles soient plus facilement récoltées). L’attache, l’isolement et la contention peuvent engendrer du stress.

Devenir

Le veau sera mis à mort à l’issue de la procédure. Des prélèvements d'intestins peuvent être réalisés afin de constituer une banque.

Remplacement

Pour obtenir suffisamment de parasites infectants, il n’y a à l’heure actuelle pas d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a minima pour pouvoir conserver la souche au-delà de 2 mois.

Raffinement

Afin de limiter les effets de l'infection, les animaux recevront préventivement un réhydratant par voie orale. L'hébergement sera enrichi par la présence de 2 poules de réforme, les animaux recevront au moins 2 visites quotidiennes. En fonction de l’état de l’animal, les visites seront plus nombreuses. Une grille de score clinique est mise en place pour le suivi de l’animal. Un anti-spamodique est utilisé en cas de douleurs ou de spasmes.

Choix des espèces

Le veau nouveau-né est une espèce très sensible à Cryptosporidium. Un seul veau (par souche) tous les 4 mois produit la quantité de parasites nécessaires à nos études. Des veaux nouveau-nés de 2 jours maximum sont utilisés. Au-delà de cet âge, ils sont moins sensibles à l’infection et multiplient moins bien le parasite.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant une semaine avec une roue d'activité, jusqu'à 45 minutes sur un tapis roulant menant à l'épuisement musculaire, et vingt à trente minutes sous anesthésie pour la mesure de la force de ses muscles. Les procédures, d'un niveau de souffrance modéré, comprennent aussi des tests de marche, de coordination et d'agrippement sur animal vigile, et l'enregistrement de l'activité électrique du nerf vers le muscle par piqûre d'aiguilles de stimulation, avec un risque de détresse respiratoire, d'hypothermie et de douleurs au réveil. Les muscles et les autres tissus sont prélevés après la mise à mort, sur des souris alors âgées de trois à neuf mois. Le porteur annonce de nouvelles cibles thérapeutiques "utilisables chez l'homme" contre la fonte musculaire, quand l'objet immédiat du projet est d'identifier des mécanismes chez la souris.

Objectifs

Le système neuromusculaire joue un rôle essentiel dans les fonctions motrices de l'organisme, incluant la respiration, la locomotion, la mastication et d'autres activités quotidiennes. Cependant, diverses situations telles que le vieillissement, les périodes d'hospitalisation prolongée, les pathologies chroniques (les maladies cardiovasculaires, le diabète, etc…), le cancer, ainsi que les maladies neuromusculaires génétiques comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, peuvent entraîner une perte de masse musculaire. Les cellules souches musculaires, nichées dans le tissu, jouent un rôle crucial dans le processus de régénération pour réparer les fibres musculaires endommagées, en réponse à l'exercice intense ou au cours de maladies neuromusculaires. La compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation des muscles et de leurs cellules souches associées, ainsi que des processus d'appariement des nerfs (motoneurones) sur les fibres musculaires en croissance, est essentielle pour envisager des interventions thérapeutiques ciblées sur l'axe neuromusculaire. Il existe une diversité de types de fibres musculaires, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. La complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans l’équilibre du système neuromusculaire. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le maintien de cet équilibre à la fois dans les éléments contractiles musculaires et dans les motoneurones, et pouvant potentiellement être perturbés dans diverses conditions pathologiques. Ce travail de recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques visant à préserver la fonction neuromusculaire et à traiter des pathologies associées.

Bénéfices attendus

Le système neuromusculaire nous permet de nous mouvoir mais est aussi associé à des fonctions vitales comme la respiration et la déglutition. Les muscles squelettiques et les motoneurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans de nombreuses myopathies d’origine génétique. La compréhension de la physiologie et de la physiopathologie neuromusculaire liée à de nouveaux acteurs, comme les protéines spécifiques étudiées dans ce projet, pourrait aboutir à la mise en évidence de nouvelles voies ou cibles thérapeutiques utilisables chez l’homme.

Procédures

Pour une première partie des animaux : L’évaluation des paramètres de la marche, de la respiration, de la coordination et de la force d’agrippement se réalisent sur animaux vigiles, elles seront faîtes 1 seule fois par animal et dure de 5 à 25 minutes. L’évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et l’enregistrement de l’activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux se réalisent sous anesthésie et analgésie adéquat, 1 fois par animal et elles durent de 10 à 20 minutes. Pour la seconde partie des animaux : Le test de l’activité volontaire s’effectue par les animaux de manière volontaire, la roue est maintenue pendant 1 semaine. Le test de tolérance à l’effort avec le tapis roulant est réalisé par les animaux eux-mêmes, 1 seule fois par animal et dure environ 45 minutes au maximum. Les mesure de force musculaire (sans réveil) s’effectuent sur animaux anesthésiés et sous analgésie adéquat, 1 fois par animal et durent 20 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (cages à roue, tapis de course, test d'équilibre, test d'agrippement) sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement de courte durée des souris dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Pour certains tests, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir comme pour le test d’activité volontaire et l’évaluation des paramètres respiratoires. Les effets indésirables pouvant survenir pour les actes sous anesthésie sont la détresse respiratoire et l’hypothermie puis des douleurs post opératoires lors du réveil dues aux stimulations et à la contraction musculaire involontaire. . Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (mesure de l’activité volontaire, test d’effort sur un tapis roulant, test d'équilibre, test d'agrippement) sont la peur liée à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement des souris dans les appareillages de mesure qui peuvent générer un léger stress. Un épuisement musculaire peut survenir pour le tapis de course. L’évaluation de la marche et l'évaluation des paramètres respiratoires ne nécessitent aucune contention, les souris se déplacent librement dans les équipements. Seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Les effets indésirables pouvant survenir pour l'évaluation non invasive de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et de l’activité électrique du système nerveux périphérique sont le réveil spontané, l’hypothermie, la détresse respiratoire, les douleurs post opératoires lors du réveil dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire, et du stress au réveil de l’anesthésie. Pour les mesures de force, les risques sont le réveil spontané, l’hypothermie et la détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisés ultérieurement en laboratoire de recherche.

Remplacement

Il existe une diversité de type de fibre musculaire, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. Malheureusement, la complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans le maintien de l'homéostasie neuromusculaire. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal. Néanmoins, nous utilisons en parallèle des approches in vitro, notamment des cultures cellulaires de myoblastes et de myotubes contrôles et mutants pour étudier l’impact de la délétion des protéines d'intérêt dans la différenciation, le typage et le métabolisme des cellules musculaires, ainsi que pour l’étude les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Réduction

640 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Pour limiter le nombre d’animaux, les animaux seront analysés de manière longitudinale (un même animal pour plusieurs tests et donc plusieurs résultats).

Raffinement

Lors du transport entre les deux animaleries, les animaux pourront subir du stress dû aux mouvements des cages de transport, dû au transfert dans les nouvelles cages ou encore dû au changement d’environnement et d’alimentation, une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera réalisée. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérées par les techniciens de l’animalerie. Elles consistent à un contrôle quotidien des cages, de la température et de l’hygrométrie. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. Les cages sont placées sur un portoir ventilé. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum (abreuvement automatique). Pour que les animaux puissent faire leur nid, des lanières de papier kraft seront utilisées comme enrichissement ainsi que des bâtons à ronger ou des maisonnettes pour se cacher (ou équivalent) afin d’éviter le stress. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum. Si nécessaire, la nourriture pourra être placée sur le plancher de la cage. Afin de permettre une interprétation fiable des résultats avec le respect du bien-être animal, une surveillance quotidienne sera réalisée pour détecter tout signe d'inconfort. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé 2 jours avant les tests. A l’exception de l’évaluation des paramètres respiratoires dont le stress doit être réduit au maximum, une session par jour pendant 5 jours sera nécessaire. Pour les actes le nécessitant les souris recevront l’anesthésie et l’analgésie adéquat afin d’éviter toute douleur et stress.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car elle représente un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris est un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, l'utilisation de modèle de souris transgéniques permet une étude approfondie de de protéines d’intérêts dans la fonction neuromusculaire. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes à partir âgées de 2 à 8 mois chez lesquelles le système neuromusculaire est complètement développé. A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et seront âgés de 3 à 9 mois environ.