Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Prélèvement de tissus pour génotypage des lignées de souris présentant un modèle expérimental de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Élever, génotyper et identifier une lignée de souris modèle de la maladie d'Alzheimer, pour fournir des animaux à des projets déjà autorisés : 2 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À quatre semaines, au sevrage, chaque animal vigile est contenu et l'extrémité de sa queue coupée, un geste de moins de trente secondes qui peut saigner et faire mal, le saignement étant arrêté par compression avec une compresse d'eau oxygénée. Le porteur annonce mettre au point un génotypage sur follicules pileux, tout en tenant l'usage d'animaux pour "indispensable" à la compréhension de la maladie. Aucune de ces souris n'est tuée dans le cadre de ce projet, toutes étant gardées vivantes pour alimenter les protocoles où elles serviront de modèle de la maladie d'Alzheimer.
Objectifs
L’objectif du projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie d’Alzheimer (MA) et de développer des nouvelles molécules qui pourraient ralentir le développement de la maladie. La MA est une maladie neurodégénérative, c’est à dire que les cellules du cerveau ne fonctionnent plus correctement et dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Dans l'équipe, nous avons généré une souris génétiquement modifiée qui développe la MA, et nous avons généré une autre souris génétiquement modifiée qui développe la MA, et qui en plus, est dépourvue d’une protéine qui participe à la progression de cette maladie. On a constaté que, en l’absence de cette protéine, les acteurs impliqués dans la MA semblent être moins virulents. L’objectif est de comprendre le mécanisme de fonctionnement de cette protéine, ses intéractions avec les autres acteurs de la maladie, et de trouver à terme, des cibles, c’est-à-dire des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA. L’objectif de ce projet est l’élevage, le génotypage et l’identification de cette lignée de souris modèle de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
-Caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages. -Production pour fournir des animaux pour nos projets scientifiques sur la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Après une légère contention de l'animal vigile, le zootechnicien procède à une biopsie de la queue. Un léger saignement de l'extrêmité de la queue est possible, une légère compression est appliquée sur l’extrémité de la queue à l’aide d’une compresse imbibée d’eau oxygénée pour arrêter le saignement. Cette intervention dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Ainsi la contention peut générer du stress et la biopsie de la queue peut entraîner une douleur et un saignement de l'extrêmité de la queue.
Devenir
Tous les animaux sont génotypés et gardés en vie pour être utilisés comme modèle d'étude de la maladie d'Alzheimer.
Remplacement
Pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissu. En revanche, nous prévoyons la mise au point de génotypage sur follicules pileux. D'autre part les animaux sont génotypés en vue d'être utilisés comme modèle d'étude de la maladie d'Alzheimer (MA) dans des projets déjà autorisés. Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. Ces souris modèle de la MA représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme.
Réduction
Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est le suivant : -souris (mâles+ femelles + sauvages + modèle de la MA) n= 240 x5ans = 1200 animaux -souris (mâles+ femelles + modèle de la MA modifié) n= 240 x5ans = 1200 animaux -souris nécessaires pour le rafraichissement génétique n=480 animaux Nombre d’animaux total : 2880 Nous travaillons sur des souris issues de reproductions dans notre élevage.
Raffinement
Les génotypages et les identifications sont faits par des zootechniciens expérimentés. Juste après la biopsie une compression est appliquée sur l’extrémité de la queue à l’aide d’une compresse imbibée d’eau oxygénée pour arrêter le saignement. Après le génotypage et l’identification, les souris sont hébergées par groupes de 4 à 5 souris par cage. L’enrichissement est constitué par des dômes en plexiglas ou en carton, et des fibres courtes de coton.
Choix des espèces
Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles, futurs médicaments. Pour étudier l’impact d’une protéine sur les acteurs de la MA nous utiliserons des souris sauvages contrôles et des souris génétiquement modifiées exprimant la MA. Tous les animaux seront générés à l'animalerie. Les animaux seront utilisés au stade juvénile (biopsie à l'âge de 4 semaines) pour le génotypage. Ce stade correspond au sevrage des animaux et l’identification avec une bague d’oreille. Ils feront ensuite partie de l’élevage.
Role des récepteurs P2X4 dans les douleurs chroniques et comorbidités
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Nerf sciatique exposé et ligaturé sous anesthésie, puis semaines de tests de sensibilité mécanique et thermique, puis splash test, labyrinthe en croix surélevé et enfin test de nage forcée la veille de la mise à mort : 3 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 2 112 d'entre elles subissent la chirurgie, les 1 056 autres une injection dans le coussinet plantaire. La douleur chronique ainsi installée ne sera compensée par aucun antalgique ni anti-inflammatoire, le porteur indiquant que le sujet même de l'étude l'interdit, et certains groupes seront maintenus deux mois pour observer l'anxiété qui accompagne la douleur. Toutes sont tuées dès la fin de leur procédure, leurs tissus alimentant une banque destinée à des analyses ultérieures.
Objectifs
La perception de la douleur, ou nociception, est une expérience multidimensionnelle qui affecte les capacités sensorielles, émotionnelles, motivationnelles et les fonctions cognitives. L’ATP est une molécule de signalisation présente dans le système nerveux central (SNC) qui module l’activité nerveuse via l'activation de protéines particulières (appelées récepteurs P2X4) exprimées dans les neurones mais aussi des cellules avoisinantes soutenant le fonctionnement des neurones, les cellules gliales. Les récepteurs P2X4 est impliqués dans des pathologies du système nerveux central comme les douleurs chroniques et les maladies neurodégénératives durant lesquelles son expression est augmentée. En revanche, l’effet distinct sur les 2 types cellulaires du SNC (neurones et cellules gliales) n’est pas connu et est le sujet principal de notre étude. De même il a été précédemment démontré chez l’humain que le développement de douleurs chroniques est associé avec l’apparition de symptômes d’anxiété et de dépression. Le but de notre projet est de déterminer le rôle respectif des récepteurs P2X4 neuronaux et de ceux présents dans les cellules gliales dans les douleurs chroniques mais aussi leur implication dans le développement de l’anxiété chez les souris des deux sexes, en combinant des approches cellulaires, électrophysiologiques et comportementales.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre la fonction de la signalisation médiée par l’ATP dans les neurones et les celules gliales dans la moelle épinière et le cerveau dans le développement et le maintien des douleurs chroniques et de l’anxiété associée. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin de mieux lutter contre les douleurs chroniques. Ce projet est financé par l’ANR.
Procédures
L’ensemble de ces 3168 animaux effectueront des tests comportementaux évaluant leurs sensibilités mécaniques et thermiques d’environ 10 à 30 minutes chacun sur une période d’une semaine. Parmi ces 3168 animaux : 1) 2112 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’exposition du nerf sciatique avec ligature pour la moitié d’entre eux et sans ligature pour le reste des animaux d’une durée de 10 à 30 minutes sous anesthésie générale précédée de 2 injections sous-cutanées d’antalgique général et local de 10 à 30 secondes chacune. Sur ces 2112 animaux, 1056 animaux (528 animaux groupe SHAM et 528 animaux groupe SNI) participeront à ces tests comportementaux aléatoirement sur 2 périodes d’une semaine parmi 3 possibles : J14+J30 ; J14+J60 ou J30+J60 pour effectuer un suivi au cours du temps tout en limitant le stress induit par ces tests. Ces mêmes animaux effectueront également des tests pour évaluer leur anxiété et dépression lié à la chronicité de la douleur. Ces tests ne seront effectués aléatoirement sur 2 des 3 périodes par ordre croissant d'impact sur l’anxiété et la dépression de l’animal soit dans l’ordre : le splash test, puis le labyrinthe en croix surélevé et enfin le test de nage forcée. Ces trois tests durent chacun 5 minutes (avec 15 min d'adaptation pour le labyrinthe) et seront séparer d’une journée minimum chacun afin de ne pas cumuler l’anxiété lié à ces tests. Le test de nage forcée ne sera effectué qu’une fois en fin de procédure le jour précédant la mise à mort étant très impactant pour l’animal 2) 1056 animaux seront soumis à une injection intra-plantaire dans la patte arrière d’une durée de 30 secondes. »
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux sont une augmentation des seuils de douleur mécanique et thermique provoquée par nos modèles de douleusr chroniques. Cette augmentation ne pourra pas être compensée par une prise d’antalgique ou d’anti-inflammatoire étant donné le sujet de notre étude. Nous limiterons donc au maximum la durée de maintien de ces animaux avec le plus d’enrichissement possible afin de limiter les souffrances. Nous maintiendrons certains groupes 2 mois afin de pouvoir voir l’impact à long terme sur les comorbidités associées à la douleur telle que l’anxiété des animaux.
Devenir
Les animaux seront utilisés dans le cadre de la compréhension des mécanismes mis en jeu dans les douleurs chroniques, à ce titre les animaux subissent des procédures classées sévères. C’est pourquoi ces animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure à laquelle ils seront rattachés afin de ne pas engendrer de stress et de souffrance au-delà de la période nécessaire à l’étude. C’est également dans cet optique de bien-être animal que la mise à mort peut intervenir en cas d’atteinte des points limites décrits précédemment. De plus la mise à mort des animaux permettra le prélèvement de tissus pour intégrées une banque de tissus permettant d’effectuer des études anatomiques, immunohistologiques et biomoléculaires dans des conditions physio-pathologiques.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur la modification de l’expression de récepteurs dans des types cellulaires précis tout en étudiant les évolutions comportementales et fonctionnelles in vivo des circuits du système nerveux. L’étude de la douleur demandant l’étude à la fois de la composante sensoriellle (=nociception) et de la composante émotionnelle le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies.
Réduction
L’ensemble de ce projet nécessite l’utlisation de 3168 souris mâles et femelles, réparties en 12 lignées transgéniques différentes dont l’étude sera répartie sur les 5 années du projet. Afin de limiter le nombre d’animaux, chaque animal porteur d’un génotype d’intérêt sera utilisé pour les études comportementales et/ou électrophysiologiques mais aussi pour de nombreuses approches in vitro à partir de prélèvements effectués post-mortem. Cela nous permettra de réduire au maximum le nombre de souris utilisées tout en conservant une significativité scientifique statistique (hétérogénéité interindividuelle). Ainsi, le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux sera compris entre 10 et 12 animaux. Nous savons sur la base de nos travaux antérieurs sur la douleur que des groupes de 10 animaux sont suffisants pour assurer une bonne puissance statistique aussi bien pour les approches comportementales qu’histologiques mais qu’un minimum de 12 animaux sont nécessaires pour les approches électrophysiologiques in vivo et obtenir un nombre suffisant de neurones enregistrés. L’analyse de la normalité des données sera réalisée afin de choisir les tests. Les données seront analysées par analyse de variance suivie, si elle est significative, par un test post-hoc de comparaison entre groupes.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle pour lequel on dispose de nombreux modèles permettant de modifier le fonctionnement de gênes précis permettant des modifications spécifiques d’un type de cellule, d’une protéine, d’une région particulière de l’animal permettant d’analyser les mécanismes cellulaires jusqu’aux comportements complexes. Cela permet de créer des modèles de souris uniques permettant de répondre précisément aux questions posées. Cette grande adaptabilité n’existe que chez la souris. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Nous utiliserons ce modèle à l’âge adulte de 8 jusqu’à 26 semaines pour évaluer l’impact des douleurs chroniques sur un système bien développé et permettant un suivi au cours du temps
Etude des effets du changement climatique sur des larves et des juvéniles de poisson.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Nage erratique, spasmes, perte d'équilibre le ventre en l'air : dès l'apparition d'un de ces signes l'expérience s'arrête, et l'animal passe vingt-quatre heures dans un bassin de récupération avant d'être tué. 3 200 larves et juvéniles de poissons capturés dans l'estuaire de Cayenne vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, aucun ne retournant à l'eau. Ils sont exposés à des hausses de température et de salinité poussées jusqu'à des limites sublétales, pour estimer les seuils de tolérance d'une dizaine de groupes taxonomiques et alimenter des modèles de gestion halieutique. Le porteur justifie la mise à mort par le risque que le retour en milieu tidal soit fatal, et juge le nombre d'individus "négligeable" au regard d'une seule ponte, alors qu'il annonce par ailleurs des lots de dix puis cinq individus par espèce.
Objectifs
Le succès du recrutement des populations des poissons à l’état sauvage et l’état des stocks pêchés dépendent principalement des premiers stades de vie et de leur survie car les larves et juvéniles sont les stades les plus sensibles aux variations environnementales et avec les plus hauts taux de mortalité naturelle. Ce projet vise donc à étudier les effets du réchauffement climatique sur les larves et juvéniles des poissons vivants dans les zones nourricières estuarienne et côtières de Guyane. Ce projet combinera des expérimentations en laboratoire avec des mesures in situ pour : i) caractériser la variabilité naturelle des conditions environnementales actuelles, ii) estimer les limites de tolérances salines et de température des principales larves et juvéniles présentes dans le système.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, les résultats obtenus concernant la variabilité des paramètres environnementaux de l’estuaire et les limites thermiques et de salinité des principales espèces considérées seront utilisés pour simuler les effets du changement climatique sur le fonctionnement des réseaux trophiques de l’estuaire de la rivière de Cayenne. Grâce aux connaissances acquises en laboratoire sur les limites de tolérance thermique et de salinité des espèces principales, l’impact de différents scenarios à court terme (5-10 ans) de changement climatique sur les réseaux trophiques pourra être étudié en utilisant les scenarios prévus par le GIEC (Groupe d'experts Intergouvernemental sur l'Evolution du Climat). Ce projet fournira aussi les outils nécessaires pour le développent des futurs modèles couplant les dynamiques de recrutements des juvéniles des espèces à intérêt commercial avec les modèles de populations focalisés sur les adultes pêchés plus au large. Ce type d’outils permettra de mettre en place des mesures de gestion durable pour le maintien des ressources halieutiques et des pêcheries qui les exploitent.
Procédures
sans objet
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont le stress lié à la capture en milieu naturel, le transport, et lors des manipulations. Pendant les expérimentations, la hausse des températures et/ou salinité jusqu’à des limites sublétales va perturber l’animal et changer son comportement (nage erratique, mouvement operculaire réduit, spasme, perte d’équilibre – ventre en l’air). Dès l’apparition d’un symptôme, l’expérimentation sera interrompue et le spécimen placé dans un bassin de « récupération » (à T°C et salinité normales, viables). La mise à mort sera effectuée après 24h dans le bassin de récupération.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront surveillés dans un bassin de récupération pendant 24h et mis à mort. Les animaux ne seront pas relâchés car le transport et le choc environnementale (milieu tidale avec des très forts changement des paramètres de l’eau au cours de la journée) pourra lui être fatal et causer des stress ultérieurs. La quantité d’animaux sacrifié sur 5 ans peut être considérée négligeable par rapport à une ponte d’un seul géniteur et à la mortalité naturelle de ces animaux dans le milieu naturel (>90% la semaine suivant la ponte). Ces détails ont été expliqués dans le document.
Remplacement
Les seuils de tolérance aux variations de température et salinité étant dépendants des espèces, nous ne pouvons pas substituer les espèces et devons faire les expérimentations sur les espèces sauvages locales. Par contre, nous limiterons au maximum le nombre d’individus.
Réduction
Pour chaque espèce, un premier test sera effectué sur 10 individus témoins et 10 individus soumis au réchauffement/changement de salinité. Si les différences inter individuelles ne sont pas significatives, le nombre d’individus sera réduit à 5 pour les expérimentations suivantes. Il ne sera pas possible de réduire davantage le nombre d'individus testés pour des raisons de puissance statistique. Par ailleurs, pour certaine espèce, le nombre d’individus sera probablement tout simplement limité par le nombre d’individus capturés dans la nature. Si moins de 5 individus sont prélevés dans la journée, les animaux seront relâchés directement in situ.
Raffinement
Les individus capturés (larves, post-larves et juvéniles) seront placés dans des conteneurs équipés de bulleurs, par famille (afin d’éviter les attaques de certaines espèces et donc éviter ce stress, voire mortalité), puis rapidement transportés vers la plateforme expérimentale pour être mis dans des aquariums préalablement préparés quelques jours avant leur capture. Afin d’être au plus proche des conditions environnementales naturelles, l’eau des aquariums sera prélevée quelques jours avant sur le site de capture. Les installations et les filtres auront été mis en route avant le démarrage de l’expérimentation et tous les paramètres physiques (T°C, salinité…) contrôlés et stabilisés. L’ensemble des installations sera placé dans une pièce climatisée afin de pouvoir contrôler plus facilement la température des aquariums. Une surveillance accrue sera portée aux animaux à leur arrivée afin de savoir s'ils s'acclimatent et s’alimentent. En cas de comportement anormal, d’absence de prise alimentaire correcte (traduisant d'un état de stress), les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
L’objectif de l’étude est d’étudier les effets du réchauffement climatique sur les larves et juvéniles des poissons vivants dans les zones de nurseries estuariennes et côtières de Guyane. Les seuils de tolérance aux variations de température et salinité étant dépendante des espèces, nous ne pouvons pas substituer les espèces et devons faire les expérimentations sur les espèces sauvages locales. L’identification de certaines espèces de larves n’étant pas possible vivantes, à l’œil nu, les expérimentations se feront uniquement sur environ 10 groupes taxonomiques principaux, au niveau soit de l’espèce, du genre ou de la famille. L’étude portant sur la sensibilité des espèces aux variations de température lors de leurs premiers stades de vie, les individus utilisés seront au stade de larve- juvénile selon ce qui sera capturé le jour de l’échantillonnage (filet de mailles entre 500µm et 3mm). Les adultes ne seront ni capturés ni étudiés. Pour certaines espèces seulement, un seul stade de vie sera présent dans l’estuaire car les autres stades se développent dans d’autres types d’habitat.
Role de la protéine Mutated in Colorectal Cancer dans l’intégrité des barrières hémato-encéphalique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Des constricteurs posés autour des carotides pour réduire peu à peu le débit sanguin du cerveau, une pompe implantée sous la peau pour élever la pression artérielle : 894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont génotypés à dix jours par tatouage des phalanges, et les adultes passent cinq jours d'apprentissage d'une tâche avant une injection rétro-orbitaire de traceur et un prélèvement de liquide céphalo-rachidien. Le porteur qualifie l'hypertension et la baisse de flux sanguin qu'il provoque de pathologies "asymptomatiques", tout en listant comme complications possibles des accidents cérébro-vasculaires reconnaissables au déplacement en cercle et des infarctus cardiaques laissant l'animal prostré. Toutes sont tuées à la fin des trois procédures pour prélever leurs organes.
Objectifs
La découverte de barrières biologiques, telles que la barrière hémato-encéphalique (BHE), la barrière hémato-encéphalique (BCSFB) a montré comment le cerveau est séparé et protégé du reste du corps. La première barrière, BHE, est une structure spécialisée formée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, qui tapissent les capillaires cérébraux. Cette barrière est cruciale pour maintenir le microenvironnement cérébral en contrôlant l’entrée et la sortie de diverses substances. Le plexus choroïde est une autre structure critique du système vasculaire du cerveau, responsable de la formation de la barrière hémato-céphalorachidienne (BCSFB). Le plexus choroïde est constitué d'une couche de cellules épithéliales qui tapissent les ventricules du cerveau et produisent le liquide céphalo-rachidien (LCR). Elle se retrouve à l’interface entre le liquide cérébro-spinal et le cerveau. Ces barrières sont des composants essentiels des mécanismes de protection du cerveau, assurant un environnement contrôlé pour la fonction neuronale et protégeant contre les agressions toxiques. Lorsque cette intégrité est altérée, la fonction de barrière est compromise, ce qui peut initier des problèmes de dégénérescence neuronale. On parle alors de démence vasculaire. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes cellulaires régulant les fonctions physiologiques de la barrière hémato-encéphalique. Ce projet utilisera des modèles murins de souris mutées génétiquement pour des cibles régulant la fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous analyserons l’impact de cette délétion sur la formation postnatale de ces plexus, en physiologie et en pathologie (modèle de rétinopathie induite). Chez l’adulte, nous développerons des modèles pathologiques chez la souris créant soit (1) une hypertension modérée par une diffusion continue d'un vasoconstricteur puissant soit (2) une hypoperfusion graduelle du cerveau.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Ce projet élucidera les mécanismes moléculaires par lesquels le gène Mcc régule les voies de signalisation Wnt dépendante dans les cellules endothéliales et maintient l'intégrité de la barrière sang-cerveaux. Comprendre ces processus est crucial pour développer des thérapies ciblées contre les troubles neurologiques impliquant un dysfonctionnement de la barrière.
Procédures
Nous analyserons le développement des plexus vasculaires chez le souriceaux chez des animaux modifiés génétiquement et nous développerons 2 modèles pathologiques chez la souris adulte afin de créer (1) un stress d’hypertension systémique (2) un stress d’hypo perfusion cérébrale. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement (en analysant la mémoire et les fonctions exécutives à l'aide de test de déplacement), et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle de développement néonatal : Nombre d’animaux : 384. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 240. Les animaux auront une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse (durée 10 min) puis 3 semaines après lils seront évalués pour chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retroorbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gaseuse avec euthanasie des animaux. Modèle d’hypo perfusion cérébrale : Nombre d’animaux : 270. Les souris adultes (2 mois) auront une implantation de constricteurs autour des carotides sous anesthésie gazeuse (durée 10 min) puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retro orbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gazeuse . Tous les animaux inclus ont été génotypés à 10 jours après la naissance par une méthode de tatouage sur les phalanges.
Impact sur les animaux
Le modèle post natal : nos données préliminaires montrent que la délétion précoce du gène Mcc dans le lit vasculaire n’induit pas de retard de croissance. Mais les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Chez l'adulte, les pathologies d'hypertension artérielle générée et de baisse de flux sanguin sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigûes pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les manifestation aigues du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience. Le génotypage par tatouage induit une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des 3 procédures dans le but de prélever leurs organes sur lesquels nous ferons des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des barrières vasculaires du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles transgéniques de knockout de gènes d'intérêt. Pour réduire le nombre des animaux sacrifiés, aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, puis analyse de la permeabilite puis euthanasie pour analyse histologique).
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/ tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales (implantation de pompe, ajout de constricteurs, injection en retro orbital de traceurs) sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont le système vasculaire est très similaire à celui de l'homme. C'est actuellement la seule espèce de mammifère dont le génome peut être modifié en routine pour créer des modèles de maladies humaines. Des modèles d'hypertension artérielle et de modification du flux sanguin ont été développés et validés chez la souris, montrant leur utilité pour étudier les altérations cognitives et neuronales. Nous prévoyons d'utiliser : Des souriceaux, car la formation des nouveaux vaisseaux se produit dans les organes jusqu'à environ 4 semaines après la naissance. Des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 24 et 29 grammes, car leur réseau vasculaire est complètement développé, notamment dans le cerveau.
Suivis télémétriques et prélèvements biologiques sur des phoques dans leur milieu naturel
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés au filet puis maintenus contenus jusqu'à trente minutes avant la pesée, 94 phoques gris et veaux-marins subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, avant d'être relâchés en mer. Sous sédatif puis anesthésie intraveineuse, chaque individu subit une prise de sang, une biopsie de lard, le prélèvement d'une vibrisse et le collage d'une balise sur le poil, l'ensemble durant une à deux heures. Le porteur affirme que la balise n'occasionne "aucune nuisance" et que les captures ne provoquent qu'un stress ponctuel, y compris chez les autres phoques de la colonie dérangés par l'opération. Le choix de l'espèce tient à ce que ces mammifères marins protégés sont l'objet même du projet, un suivi télémétrique destiné aux gestionnaires de la conservation, et le poids minimal de 40 kg est fixé selon la taille des balises disponibles.
Objectifs
Le projet consiste en le suivi par télémétrie (balises émettrices) de phoques sauvages dans leur milieu naturel, et de prélèvement de quelques échantillons biologiques réalisés lors de la capture, afin de mieux comprendre leurs stratégies d’utilisation de l’espace et des ressources marines et de répondre aux attentes des gestionnaires en charge de la gestion et la conservation de ces mammifères marins protégés et/ou de leur habitat naturel. Les animaux sont capturés dans leurs « colonies », terme défini ici au sens très général de zone de repos terrestre utilisée par un groupe de phoque toute l’année (impliquant ou non la présence de reproduction). Afin de réaliser les suivis individuels, les phoques sont capturés dans leur milieu à l’aide de filets, pesés, anesthésiés, leur poil est séché et dégraissé de façon à coller les balises sur le poil. Quelques prélèvements biologiques sont effectués afin de compléter les informations obtenues par les balises grâce à des marqueurs génétiques et écologiques, puis les animaux sont immédiatement relâchés en mer. Ces opérations, durant environ 1 à 2 heure(s) entre la capture et le relâcher, sont intégralement réalisées sur le terrain (sur le littoral) et les animaux ne sont pas transportés en captivité. Les balises utilisées permettent de suivre leurs déplacements et activités en mer comme à terre pendant plusieurs mois (localisations, détails des plongées, périodes de repos à terre, etc.). Les balises tombent au plus tard 9 ou 10 mois après la pose, pendant la mue annuelle des phoques (lorsque le nouveau poil remplace l’ancien, la balise tombe avec l’ancien poil).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre les stratégies individuelles de ces prédateurs supérieurs aux variations de leur environnement et leurs réponses aux pressions anthropiques (telles que les activités humaines en mer et les changements globaux), notamment par l’analyse des traceurs écologiques et génétiques issus des prélèvements biologiques.
Procédures
Les animaux sont capturés dans leur milieu naturel, contraints physiquement dans des filets pendant leur transport (quelques minutes à 30 minutes environ) puis pendant la pesée (quelques minutes). Afin de réduire le stress et l'agitation des phoques une fois dans les filets (notamment si le transport vers la zone de manipulation est long), une injection intra-musculaire de sédatif est réalisée. Les phoques sont ensuite anesthésiés par injection intra-veineuse, l'anesthésie dure généralement 15 à 20 minutes. Le prélèvement de sang est réalisé dans la foulée de l'injectionintra-veineuse de l'anesthésiant et ne dure que 10 secondes environ. La biopsie de lard, réalisée après injection d'anesthésique local, est réalisée en quelques secondes également. Un (exceptionnellement deux) prélèvement(s) de vibrisse est réalisé au début de l'anesthésie (il ne prend qu’une seconde). Du poil est prélevé sur environ 3 cm² et une balise est collée sur leur poil à l'arrière de la tête, n'occasionnant aucune nuisance. Exceptionnellement, un individu peut être recapturé et échantillonné plusieurs fois sur la durée du projet, toujours à plusieurs mois voire années d’intervalle.
Impact sur les animaux
Les captures occasionnent un stress ponctuel pour les phoques capturés ainsi que ceux de la même colonie importunés par les opérations de capture. L'anesthésie rapide des animaux capturés sert entre autres à réduire ce stress au minimum, pour les animaux capturés. La piqure liée à l’injection intra-veineuse de l’anesthésiant peut occasionner une légère douleur transitoire, souvent atténuée par une piqure intra-musculaire de sédatif peu après la capture. L’anesthésiant permet ensuite de réduire la douleur liée au prélèvement de vibrisse, et l’injection d’un anesthésique local permet de réduire la douleur générée par la biopsie de lard.
Devenir
Tous les animaux sont immédiatement relâchés dans leur milieu naturel à l'issue de la procédure.
Remplacement
Le Remplacement des animaux n'est pas possible puisque l'objectif même du projet est de mieux connaitre et décrire le comportement d'espèces sauvages à préserver, il est donc indispensable de suivre des animaux de ces espèces dans leur milieu naturel.
Réduction
La Réduction est réalisée par le choix de capture d'un maximum de 30 phoques par espèce, par colonie et par période de 5 ans : ces effectifs permettent de décrire la variabilité inter-individuelle, très forte chez ces prédateurs supérieurs, sans affecter une trop large proportion de la colonie (comptant généralement une ou plusieurs centaines d'individus). Actuellement, ce chiffre est néanmoins inférieur compte tenu des autorisations de capture en cours de validité : le nombre total d'individu est 94, mais ce chiffre pourra être revu à la hausse en fonction des nouvelles autorisations de capture, et feront l'objet d'amendements au projet déposés sur Apafis le cas échéant.
Raffinement
Le Raffinement des procédure est réalisé par une diminution des sources de stress chez l'animal lors de la capture (absence de gestes brusques et de bruit excessif autour des animaux, linge sur les yeux pendant la manipulation, etc.), par la prise en compte des sources possibles de douleur (utilisation d'analgésiques), par la limitation des prélèvements au strict minimum pour effectuer les analyses biologiques pertinentes, et par le suivi de l'animal pendant l'intégralité de la procédure, jusqu'à son réveil et son retour spontané dans le milieu naturel (rythme respiratoire, rythme cardiaque etc.). Les procédures mises en place réduisent par ailleurs les risques de blessure de l'animal, de la capture jusqu'au relâcher. Le prélèvement de sang est réalisé avec la même aiguille, déjà en place dans la veine, que celle ayant servi à l’injection de l’anesthésiant (pas de nouvelle piqure). En amont de la procédure ont été déterminés 1) des paramètres à prendre en compte pour exclure de la procédure des animaux affaiblis et 2) des paramètres à suivre lors de la procédure et des actions à faire immédiatement en cas d'anomalies mises en évidence.
Choix des espèces
Les animaux concernés par ces études, les phoques gris Halichoerus grypups et les phoques veaux-marins Phoca vitulina, sont l’objet même du projet, puisqu’il s’agit de mieux comprendre le comportement naturel de ces mammifères marins dans leur milieu, notamment pour mieux définir les mesures de gestion et de conservation à mettre en place au niveau local et national voire international. Ces espèces sont protégées en France et font l'objet d'un programme de suivi dans le cadre de la Directive-cadre Stratégie pour le Milieu Marin. Les phoques capturés, prélevés et équipés de balises sont majoritairement des sub-adultes ou adultes. Le poids minimum choisi est de 40 kg, en l’état actuel des balises utilisées (balises GPS/GSM et balises Argos), de façon à ce que le poids et surtout la surface des balises sur le corps des phoques n’entraine qu’une force négligeable de frottement lors de la nage.
Evaluation de la pharmacocinétique et de la pharmacodynamique de produits injectés par voie intravasculaire ou extravasculaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés par voie intraveineuse, sous-cutanée, intratrachéale, intranasale, intravitréenne ou intra-articulaire, des rats passent jusqu'à dix acquisitions d'imagerie le premier jour, puis trois par jour pendant trois jours. 900 rats vont être utilisés, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, pour caractériser la distribution de produits en vue de leur mise sur le marché. Le porteur indique que l'injection dans le coussinet du pied peut gêner la locomotion et l'accès à l'eau, et que l'injection dans l'œil peut provoquer un glaucome ou la perte de la vision de l'œil traité. 835 rats sont tués pour prélever leurs organes, 15 sont gardés en vie pour l'entraînement du personnel et 50 sont proposés à l'adoption.
Objectifs
L’autorisation de mise sur le marché d’un produit ou d’un médicament nécessite au préalable de caractériser sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique. La pharmacocinétique permet d’améliorer les dosages et la posologie du produit ou du médicament. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique après administration de produits chez le rat. Les produits impliqués dans ces projets auront déjà été testés in-vivo et aucune toxicité de ces produits n’est connu (en cas contraire, les produits devront faire l’objet d’une demande d’autorisation de projet spécifique). Le recours à l’imagerie médicale (imagerie à rayons X ou imagerie optique) dans ce projet permettra de suivre au cours du temps la distribution de produits radio-opaques, rendus fluorescents ou bioluminescents. Cette méthode d’analyse présente l’avantage d’être non-invasive, nécessitant seulement une anesthésie générale. Elle permet également de suivre un même animal au cours du temps et de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Il n’existe pas de méthode alternative à l’heure actuelle permettant de déterminer les dosages, la posologie, la voie d’administration et les effets sur l’organisme d’un produit ou d’un médicament dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire à l’objectif de ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à la mise sur le marché de nouveaux produits.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique ou répétée (selon la voie) du produit test par voie intravasculaire (intraveineuse) ou extravasculaire (sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale, pers os, intravitréenne ou intra-articulaire) en respectant les volumes d’injections recommandés. Lors d’injections répétées, un effort sera fait pour ne pas excéder 5 injections maximum par animal. Sur animaux vigiles, les injections sont réalisées en quelques secondes (temps inférieur à 1 minute), en comptant l’anesthésie la durée est d’environ 5 minutes. Des examens micro-scanner ou d’imagerie optique pourront également être réalisés sous anesthésie générale. Un examen micro-scanner peut aller jusqu’à 20 minutes, celui de fluorescence est d’en moyenne 5 minutes, la fréquence des examens sera de : - maximum 10 acquisition par jour le premier jour puis, - maximum 3 acquisitions par jour pendant les 3 jours suivants puis, - maximum 1 acquisitions par jour jusqu’au 10ème jour puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu'au 30e jour, puis maximum 2 acquisitions par semaine jusqu’à la fin de l’étude pour la procédure n°1. Pour les examens de bioluminescence, la durée est d’en moyenne 5 minutes, les fréquences seront de : - maximum 2 acquisitions par jour les 3 premiers jours puis, - maximum 3 acquisitions par semaine jusqu’au 30e jour, puis maximum 2 acquisitions par semaine la fin de l’étude pour la procédure n°2. Une injection de luciférine sera faite avant chaque acquisition de bioluminescence. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 1 fois par semaine jusqu’à la fin de l’étude en respectant les volumes éthiques. Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de déshydratation et pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation des sites d’injection). Certaines voies d’administration sont plus inconfortables que d’autres et nécessitent une prise en charge analgésique pré et post injection : sous-cutanée dans le coussinet du pied qui peut gêner la locomotion de l’animal et donc l’accès à l’eau et à la nourriture et les injections intravitréennes pouvant altérer la vision (glaucome ou perte de vision de l’œil injecté). Dans tous les cas, des mesures adaptées sont mises en place.
Devenir
Les animaux dont un prélèvement d’organe est nécessaire seront euthanasiés. Il sera possible de réaliser une quantification des produits ex vivo par organe grâce à de l’imagerie optique ex vivo ou par d’autres techniques in vitro. Les rats dont les organes ne doivent pas être prélevés pourront soit être gardés en vie et réutilisés pour la formation du personnel ou bien, être proposés à l’adoption.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.
Réduction
L’avantage de l’imagerie médicale est de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’étudier la biodistribution d’u produit testé, des groupes d’au moins 5 animaux seront constitués. Si nécessaire, des études pilotes pourront être réalisés sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum) afin de confirmer la visualisation d’un produit marqué en in-vivo par exemple.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours minimum sera respectée ou 7 jours si les animaux sont transportés par avion ou s’il y a un changement du cycle circadien ou si l’objectif est d’étudier l’activité enzymatique, la pression artérielle ou le rythme cardiaque. Les animaux seront hébergés en cage de manière collective durant toute la période d’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude (sauf dans certain cas si l'animal BKG est seul). En cas d’hébergement individuel, les cages seront organisées de manière à permettre un contact visuel et olfactif avec les animaux adjacents et un enrichissement supplémentaire sera apporté. Ce type d’hébergement présente l’avantage de mieux vérifier la prise alimentaire et l’abreuvement de chaque animal, et vérifier leur état général. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible, les mesures nécessaires : mesure de soutien ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera mesuré régulièrement et pourra être complété par un scoring des signes cliniques généraux comportement général de l’animal, réponse à la stimulation, état de son pelage, présence d’écoulement nasaux et occulaires, difficultés respiratoires) ou en lien avec la voie d’administration pour les injections dans les coussinets (inflammation, lésion, nécrose du site d’injection, difficulté dans la locomotion et le déplacement pour atteindre l’eau et la nourriture) et intravitréenne (inflammation, lésion au site d’injection, gêne à l’oeil injecté : oeil-mi-clos, fermé ou glaucome). Des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés (en fonction des connaissances des produits).
Choix des espèces
Le modèle rat a été choisi : - Car il s’agit d’une espèce couramment utilisée pour étudier la pharmacocinétique et pharmacodynamique en expérimentation animale et permettant de travailler sur des lots homogènes (âge et sexe fixés). - Pour leur gabarit permettant d’observer une taille d’articulation relativement grosse (par rapport à la souris) Des rats seront utilisés au stade jeune adulte (environ 6 à 8 semaines) afin de s’affranchir de la période de forte croissance de l’animal.
Décoder les réseaux neuronaux et moléculaires impliqués dans la chronicisation de la douleur et de l’apparition des troubles anxio-dépressifs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris subissent une chirurgie qui leur installe une douleur chronique, puis trois tests de douleur de vingt minutes jusqu'à trois fois par semaine et, à partir de la huitième semaine, six tests d'anxiété et de dépression. 3 992 souris vont être utilisées, 2 792 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 200 un niveau léger, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif sont "inévitables" et ne peuvent pas être soulagés, puisqu'ils sont l'objet même de l'étude. Ni les trois tests de douleur ni les six tests comportementaux ne sont nommés.
Objectifs
La douleur neuropathique est fortement associée aux troubles émotionnels et constitue la cause la plus fréquente d’invalidité affectant fortement la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur sur la société, estimé à plus de 800 millions d’euros en Europe. Le taux de prévalence des troubles anxio-dépressifs est de l'ordre de 30 % chez les patients neuropathiques. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes qui sous-tendent cette comorbidité. L’objectif de cette étude est de déceler les réseaux neuronaux et génétiques impliqués dans la chronicisation de la douleur et le développement des troubles d’anxiété et de dépression par une approche multidimensionnelle chez la souris.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous serons dans la possibilité d’identifier les réseaux neuronaux et les marqueurs moléculaires impliqués dans la chronicisation de la douleur neuropathique et le développement des troubles anxio-dépressifs. Cette avancée permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant cette comorbidité et sans doute la mise en place de stratégies thérapeutiques pour soulager et prévenir la chronicisation de la douleur neuropathique et le développement des troubles émotionnels.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les animaux subissent une injection unique pour administrer des composés pharmacologiques, induisant une légère douleur transitoire. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale avec une administration d’anesthésie locale et d’un anti-inflammatoire en post-chirurgie. - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur de 20 minutes maximum par jour, 1à 3 fois par semaine selon les procédures. - A partir de 8 semaines post-induction de la douleur, les animaux seront évalués avec 6 tests anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 24h minimum entre chaque test). - A la fin de chaque procédure, un prélèvement de tissu est effectué pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Nous étudions les réseaux neuronaux et génétiques impliqués dans la douleur chronique et les troubles émotionnels. La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont donc inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. Une caudectomie de moins d'1mm chez des souriceaux pour génotypage induit une douleur légère et transitoire.
Devenir
A la fin de toutes les procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem en biochimie et moléculaire
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période de 2 semaines, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Gestion de lignées de rongeurs immudéficients
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
450 000 souris privées de système immunitaire vont être élevées dans des enceintes filtrées, chacune pouvant subir au maximum deux biopsies de l'oreille. Le niveau de souffrance déclaré est léger, et le RNT indique qu'à la fin de la procédure les animaux sont soit expédiés, soit tués. Le porteur reconnaît que l'absence de défenses immunitaires se traduit par des infections en cas de défaut du système d'hébergement, et que la biopsie provoque douleur et stress. L'effectif n'est justifié que par le "besoin de la communauté scientifique", réévalué en continu.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’élever des lignées de rongeurs modifiés génétiquement leur supprimant leur système immunitaire et donc leur capacité de se défendre face aux maladies infectieuses. Afin de les protéger contre les maladies, ces animaux seront élevés dans des systèmes d’hébergement les isolant du milieu extérieur afin que tout ce qui est en contact avec eux (air, aliment, litière) ait été filtré ou stérilisé au préalable. Ces animaux sont très importants pour la communauté scientifique notamment dans des domaines comme la cancérologie ou l’immunologie où l’absence d’un système immunitaire permet de mieux comprendre certains mécanismes ou de tester l’efficacité d’un médicament.
Bénéfices attendus
Les animaux élevés dans le cadre de ce projet seront par la suite partie prenante de projets de recherche dans des domaines comme la cancérologie ou l’immunologie afin de mieux comprendre ces maladies ou de tester l’efficacité d’un médicament.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis au maximum 2 biopsies (à l’oreille), acte d’une durée maximale d’une minute. Les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées seront de phénotype dommageable mais l’expression de leur phénotype sera maîtrisée par un système d’hébergement permettant l’absence d’agent pathogène ou opportuniste.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable d’absence de système immunitaire et des signes cliniques associés (infections) en cas de défaut du système d’hébergement. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (2 biopsies maximum, oreille).
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort.
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux sans système immunitaire par modification génétique. Cela permet d’étudier toutes les conséquences de cette déficience ou d’utiliser cette déficience pour étudier des phénomènes cancéreux ou autres domaines de recherche nécessitant un modèle animal sans système immunitaire. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux est dépendant du besoin de la communauté scientifique. Ces besoins sont réévalués constamment afin d’être au plus près du nombre attendu. La maîtrise d’un système d’élevage dans des hébergements protégeant du milieu extérieur par nos équipes permet également d’utiliser le moins d’animaux possibles pour répondre à ce besoin.
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel au besoin au vétérinaire désigné. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté et un suivi particulier. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement non médicamenteux, ce traitement est mis en place. Dans le cas contraire, l’animal est mis à mort pour réduire toute douleur ou souffrance.
Choix des espèces
Les souris sont une des espèces pour lesquelles les manipulations génétiques permettant une absence du système immunitaire sont les plus développées, maitrisées et avec des nombreuses données scientifiques. Les animaux de ce projet seront hébergés et élevés de la naissance jusqu’à leur expédition selon les besoins des scientifiques, le phénotype d’immunodéficience étant acquis par une modification génétique et susceptible de s’exprimer tout au long de la vie de l’animal.
Etude de l’immunité innée dans l’autoinflammation et l’infection: gestion de souris à phénotype dommageable
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Élever et sélectionner des souris privées de défenses immunitaires, pour les faire entrer ensuite dans d'autres projets, doit conduire à en utiliser jusqu'à 47 400, réparties sur 37 lignées. Le niveau de souffrance déclaré est léger, chaque animal étant tatoué aux phalanges et soumis à une biopsie de l'oreille. Le porteur affirme que l'immunodéficience "ne se déclare pas" dans ces conditions d'hébergement, et que cet élevage est "indispensable" pour obtenir les souris utilisées ensuite dans les projets de recherche. Les reproducteurs sont tués après six mois, les hétérozygotes excédentaires le sont après génotypage, une partie servant à l'entraînement du personnel aux gestes techniques ou à des mises au point hors protocole, et 500 animaux sont réutilisés.
Objectifs
L'immunité innée est l'ensemble des mécanismes de première ligne qui permet de se défendre contre les infections. Pourtant, nous comprenons encore mal l'immunité innée dans les infections, les maladies autoinflammatoires (dans lesquelles le système immunitaire innée attaque l'organisme humain) et des maladies complexes dans lequel cette immunité innée peut jouer un rôle (par exemple le diabète). L'étude de l'immunité innée dans les modèles murins nécessite de générer diverses souris qui sont immunodéficientes (et donc plus sensibles aux infections). L'objectif de ce projet est de générer ces animaux qui seront ensuite utilisés dans des projets de recherche portant sur l'immunité innée dans les maladies à composante inflammatoire et les infections bactériennes. Ce projet ne concerne que la gestion (élevage, reproduction et sélection) des différentes lignées de souris, l'ensemble des projets expérimentaux menés sur ces animaux est validé en parallèle. Ce projet couvre la production d'animaux à phénotype dommageable de 37 lignées et nécessite l'utilisation de 47400 souris au maximum.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de générer les animaux qui rentreront ensuite dans différents projets de recherche ayant pour objectifs de mieux comprendre les voies de l'immunité innée dans les maladies à composante inflammatoire et dans les infections bactériennes. A moyen terme, cela pourrait déboucher sur de nouveaux traitements.
Procédures
Les souris seront tatouées au niveau des phalanges et soumises à une biopsie sur l'oreille. Une seule intervention de chaque type d'une durée de moins de 5 secondes sera réalisée par animal.
Impact sur les animaux
Les souris ont un phénotype dommageable (immunodéficience) mais qui ne se déclarera pas dans les conditions d'hébergement et de reproduction décrites.
Devenir
Les reproducteurs seront mis à mort à la fin de la période de reproduction (6 mois de reproduction). Les animaux de géntoype non pertinents (hétérozygotes) seront mis à mort suite au génotypage à l'exception des animaux qui seront prélevés pour renouveler l'élevage tous les 6 mois. Les animaux hétérozygotes seront très largement excédentaires par rapport aux animaux KO et WT et n'étant pas d'un génotype intéressant ne pourront pas être réutilisés. Les animaux de géntoype pertinents (sauvage ou muté) seront réutilisés dans les protocoles validés par le ministère sur ces lignées. Certains des animaux de génotype non désiré (la plupart des hétérozygotes) sont utilisés pour l'entraînement des utilisateurs aux gestes techniques sur animaux (dans le cadre d'une DAP portée par notre animalerie et validée par le ministère). Certains animaux de génotype non désiré sont utilisés hors protocole pour des prélèvements post-mortem permettant la mise au point et l'optimisation des expériences (par exemple, mise au point des immuno-marquages multiparamétriques sur des suspensions cellulaires de rate).
Remplacement
L'élevage de ces souris est indispensable pour générer les souris qui seront utilisées dans les projets de recherche.
Réduction
Des calculs d'effectifs ont permis d'établir le nombre minimal d'animaux à phénotype dommageable par lignée nécessaire pour permettre de réaliser les différents projets de cette thématique. La dimension de l'élevage sera dynamiquement évaluée pour prendre en compte l'objectif de réduction et s'adapter aux besoins des projets (notamment une réduction de l'élevage dans les phases de diminution des besoins des projets).
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cagées à portoirs ventilés et manipulés par un personel expérimenté en conditions stériles. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. Le phénotype dommageable (immunodéficience) ne se déclare pas lorsque les souris sont élevées dans ces conditions. La plupart de ces souris est hébergée dans notre animalerie depuis plus de 5 ans avec une observation quotidienne, nous avons donc le recul nécessaire pour affirmer que le phénotype d'immunodéficience sur les gènes de l'immunité innée considérés n'est pas dommageable en condition d'élevage classiques (c'est à dire sans pathogènes) mais requiert des conditions d'infections controlées pour s'exprimer expérimentalement.
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l'homme en terme de génétique, d'anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l'étude des réponses immunitaires et des réponses inflammatoires observées lors des maladies à composantes inflammatoires et des infections bactériennes. Des souris âgées de plus de 6 semaines et de moins de 12 mois seront utilisées pour la reproduction du fait de leur maturité sexuelle et avant la décroissance de la fertilité.
Etude de la carcinogénèse mammaire et de l’effet des anti-oestrogènes sur la progression tumorale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Comprendre pourquoi les cancers du sein hormonodépendants résistent aux anti-œstrogènes passe ici par des souris génétiquement modifiées que l'on fait allaiter pour déclencher un oncogène. 3 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires en vieillissant, subissent une ablation des ovaires de vingt minutes, la pose puis le retrait d'un implant sous-cutané, ou jusqu'à seize injections en huit semaines. L'effectif se déduit d'un empilement de conditions, 420 souris pour suivre la cinétique tumorale et 2 880 pour croiser six traitements, deux génotypes et quatre points de prélèvement.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus mortel chez la femme dans le monde. Ce cancer se caractérise par une forte hétérogénéité. En effet, il possède de nombreux sous-types moléculaires dont le sous type luminal (sous type le plus récurrent) caractérisé par l’expression du récepteur aux estrogènes et le récepteur aux progestérones. Ce dernier est traité par hormonothérapie à l’aide d’anti-œstrogènes. Cependant il existe peu de modèles murins de cancer du sein qui récapitulent ce sous type moléculaire. Ainsi nous avons créé un modèle qui se base sur l’expression d’un oncogène spécifiquement dans les glandes mammaires après la lactation. Cet oncogène est le plus fréquemment altéré dans les cancers. Ce modèle nous permet d’étudier les résistances aux traitements anti œstrogènes car en effet malgré l’efficacité de ce traitement, les patients développent des résistances à ce traitement au cours du temps. L’objectif est donc de caractériser ce modèle pour trouver de potentielles autres cibles thérapeutiques et étudier l’effet des anti-œstrogènes sur la progression tumorale afin de mieux comprendre les résistances à ce traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des nouvelles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer du sein hormonaux dépendants et d’étudier les mécanismes de résistance des traitements anti oestrogéniques.
Procédures
Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dont les mutations seront induites expérimentalement par la lactation. Ainsi nos souris seront mises en accouplement puis seront laissées en vieillissement où elles développeront des cancers du sein. Pour étudier l’impact du traitement anti oestrogénique dans notre modèle, les animaux recevront également un traitement anti-oestrogénique en sous cutanée jusqu'à 2 fois par semaines pendant 8 semaines (3 minutes pour chaque injection soit 3*2*8 = 48minutes) ou par un implant sous cutanée jusqu'à 90 jours (10 minutes pour l'insertion et 10 minutes pour le retrait de l'implant) et une ablation des ovaires (20 minutes). L'ablation des ovaires et la mise en place de l'implant sera réalisée en même temps sous sédation totale.
Impact sur les animaux
La mutation du gène oncogène induit la croissance tumorale dans les glandes mammaires de l’animal. Les injections par voie sous cutanée induisent une douleur de classe légère. Les implants ont été déjà utilisé dans de nombreuses publications chez la souris sans observation d'effets secondaires et la castration est réalisée en routine au laboratoire ce qui se rapporche de l'ovariectomie et ne pose pas de problèmes de majeur. Ces procédures seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries. Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Une réouverture des points est également possible en cas d'arrachement des points par la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Notre but est de mener des analyses sur plusieurs tissus (tumeurs et organes distants) prélevés après la mise à mort de chaque animal.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique, la complexité cellulaire et l’hétérogénéité impliquées dans la formation de tumeurs. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Plusieurs types d’analyses seront menées. Afin d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour effectuer des analyses statistiques, nous aurons besoin de : -10 souris par groupe pour les analyses moléculaires. -10 souris par groupe pour les études histologiques . - 10 souris par groupe pour les analyses des populations cellulaires. Ainsi, 30 souris seront utilisées pour chaque groupe, chaque traitement et chaque temps étudié. Pour étudier l'évolution des tumeurs mammaires dans notre modèle, nous aurons besoin de 420 souris : 2 génotypes ( avec ou sans tumeurs), 7 points de cinétique (7 phases différentes de la tumeur); et pour l'analyse des traitements anti oestrogéniques dans notre modèle murin, nous aurons besoin de 2880 souris : 2 génotypes( avec ou sans tumeurs), 6 traitements (différents types d'anti-oesotrègéniques et leur contrôles) , 2 point de cinétique du début du traitement (avant et au moment de l'apparition des tumeurs) et 2 points de cinétique de sacrifice post traitement (court terme et long terme) et 2 chirurgies (avec ou sans ovariectomie).
Raffinement
Durant la durée de l'étude, les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages agrémentées disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Après injection en sous cutanée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). On procèdera à l'anesthésie gazeuse des souris, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, un anti inflammatoire systématique par injection sous cutanée sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de l'analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux ovariectomisés et les animaux sham seront séparés: une cage sham versus une cage ovariectomisé par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Dans le cas d’induction de tumeurs l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé (score de 0 à 3) et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées. Spécifiquement, si posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif (score 2), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine dès l’apparition de tumeurs afin de suivre son évolution. Si une perte de poids supérieure à 20% est observée sur une période d’une semaine l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Ce modèle récapitule de manière fidèle le cancer du sein hormono-dépendant chez la femme qui est un sous type très fréquent de cancer du sein chez la femme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'impact du traitement anti-oestrogénique sur ces tumeurs, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitements sur la souris femelle ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro.
Effet des inhibiteurs de DYRK1A sur la sensibilité à l’insuline dans des modèles d’obésité et de diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Le bout de la queue est coupé chaque semaine pour prélever du sang, environ vingt fois sur cinq mois, chez 208 rats. Ils vont tous être tués pour prélever les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 192 d'entre eux reçoivent trois injections par semaine pendant quatre semaines d'un inhibiteur candidat contre le diabète de type 2, et 48 subissent un test métabolique de deux heures avec cinq prises de sang supplémentaires. Le porteur retient un rat rendu obèse par un régime riche en graisse et un rat GK spontanément diabétique, qu'il présente comme proches de la maladie humaine, l'inconfort lié à l'obésité étant qualifié de léger.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par un taux de glucose élevé dans le sang du à une diminution du nombre de cellules qui sécrètent l'insuline (les cellules bêta du pancréas) et à une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles (foie, tissus adipeux et muscle). La prolifération des cellules bêta du pancréas est modulée par une enzyme et les inhibiteurs de cette enzyme se présentent comme des candidats médicament prometteurs pour le traitement du diabète. Ce projet se situe dans la continuité des travaux en cours dans notre équipe sur un nouvel inhibiteur sélectif. Nos résultats de cette première étude montrent que le traitement à l'inhibiteur entraine une augmentation de la prolifération et donc du nombre de cellules bêta et une réduction des taux de glucose sanguin chez le rat diabétique. Nous proposons à présent d'étudier les effets de cet inhibiteur sur les tissus cibles de l'insuline afin d'établir si le traitement améliore l'action de l'insuline. Nous analyserons les effets de l'inhibiteur dans deux modèles : un modèle de diabète de type 2 spontané, le rat GK (Goto-Kakizaki), caractérisé par une légère diminution de la sensibilité à l'insuline sans obésité associée, et un modèle d'obésité avec une réduction importante de la sensibilité à l'insuline induit par un régime riche en graisse (HFD, High Fat Diet). Ces différents modèles sont nécessaires en raison de leur complémentarité (diminution de la sensibilité à l'insuline, obésité ...) pour disséquer au mieux les effets de l'inhibiteur sur ces maladies métaboliques présentes chez l'humain. De plus, cette étude sera effectuée à la fois chez le mâle et la femelle car il est important de déterminer si le traitement pharmacologique à l'inhibiteur peut améliorer l'action de l'insuline sur ses tissus cibles dans les deux sexes. Nous utiliserons le rat sain Wistar (mâle et femelle) comme contrôle de ces deux modèles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice majeur de cette étude sera d'identifier l'inhibiteur de DYRK1A comme candidat potentiel pour une pharmacothérapie ciblée chez les patients diabétiques de type 2. Les résultats positifs de notre projet en cours sur la croissance des cellules bêta pancréatiques implémentés par cette nouvelle étude sur la résistance à l'insuline nous permettront de proposer une stratégie thérapeutique "curative" plus complète, capable de limiter la progression du diabète grâce à la restauration d'une masse cellulaire bêta fonctionnelle et une amélioration de la sensibilité à l'insuline de ces tissus cibles chez le patient diabétique de type 2.
Procédures
Tous les animaux (208 rats) subiront plusieurs prélevements d'un très petit volume sanguin pour mesurer leur glycémie 1 fois par semaine pendant toute la durée du projet (environ 20 prélèvements sur 5 mois). Ce prélèvement dure quelques secondes et engendre une douleur légère. 144 animaux subiront 2 prélèvements de sang pour les dosages d'insuline: - un prélèvement avant et un prélèvement à la fin du regime. Ce prélèvement dure moins d'une minute. 192 animaux subiront des injections répétées de traitement pouvant engendrer une douleur légère (3 injections par semaine pendant 4 semaines). Durant les tests métaboliques d'une durée de 2 heures, 48 rats subiront une injection et 5 prélevements d'un petit volume sanguin pour le dosage de l'insuline plasmatique et la mesure de glycémie (prélèvement de la durée de moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Contrairement aux inhibiteurs "classiques" qui provoquent bradycardie et tachycardie, la nouvelle génération d'inhibiteur utilisée dans ce projet, n'induit pas de toxicité ni de neurotoxicicté du fait qu'il ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. Les légers effets indésirables pour l'animal seront liés à la piqure lors de l'injection du traitement mais également à la piqure lors de l'injection du glucose et de l'insuline pendant les tests métaboliques, ainsi qu'a la coupe de l'extrémité de la queue lors des prélèvements de sang. De plus, l'obésité générée par le régime riche en graisse peut induire un léger inconfort pour les animaux. L'étude sur la signalisation de l'insuline n'entraine pas de nuisance car les prélèvements sont effectués post mortem.
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux seront mis à mort pour permettre les prélèvements des tissus d’intérêt.
Remplacement
Cette étude sur la signalisation insulinique nécessite de travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in vitro, notamment sur des lignées de cellules immortalisées, ou ex vivo, sur des îlots de Langerhans isolés permettent uniquement de mettre en évidence des mécanismes spécifiques, mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements. Ainsi pour atteindre notre objectif spécifique, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable. Le choix du rat Wistar HFD et du rat diabétique GK pour cette étude réside dans le fait qu'ils présentent de grandes similitudes dans leur physiologie et leur physiopathologie avec la maladie chez l'humain.
Réduction
La stratégie expérimentale visera à étudier l’implication de DYRK1A sur les voies de signalisation de l'insuline. Dans ce sens nous constituerons des groupes expérimentaux comportant un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse à l’inhibiteur et de valider statistiquement les différences détectées entre les groupes. En référence à nos études précédentes et en accord avec les tests statistiques, nous utiliserons des groupes de 8 animaux. L'impact environnemental de cette étude n'est pas source d'angoisse et de souffrance particulière.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de deux par cage pour respecter leur comportement social naturel. Les animaux diabétique auront une litière adaptée et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux. Les biberons seront renouvelés 3 fois par semaine. Les cages comprendont des batonnets de bois afin que les animaux puissent satisfaire leur besoin naturel de rongueur. Les rats seront surveillés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance portant sur l'apparence physique, le comportement et les modifications de poids selon un grille de score établie préalablement avec l'utilisation de points limites et de critères d'arrêt de souffrance adaptés.
Choix des espèces
Nous développerons notre projet en utilisant le rats Wistar et le modèle de rat Goto Kakizaki (GK). Le modèle Wistar est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité et des comorbidités associées telles que le diabète. Le modèle des rats GK est dérivé du rat Wistar et présente spontanément un diabète de type 2 au stade adulte. Les animaux non vertébrés n'ont pas de pancréas organisé comme l'humain et les rongeurs. De ce fait, le choix du rat pour cette étude réside dans les grande similitudes que cette espèces présente dans sa physiologie et physiopathologie avec celle de l'humain. La génération de notre modèle nécessite l'utilisation de jeunes rats âgés de 6 semaines. Le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline chez ces rats nécessite au moins trois mois. De ce fait, le traitement pharmacologique ne pourra débuter que vers l'age de 4-5 mois. Les tests métaboliques et le test de signalisation insulinique seront effectués après 4 semaines de traitement pharmacologique, et donc les rats seront âgés entre 5 et 6 mois.
Rôle des macrophages dans le cancer colorectal (CCR) dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène par injection puis trois cycles d'une molécule dans l'eau de boisson pour déclencher des tumeurs de l'intestin et du colon, six injections d'anticorps, un gavage de glucose suivi de cinq prises de sang en deux heures, et pour une partie d'entre elles seize semaines de régime gras. Le porteur écrit que la compréhension de ces mécanismes "pourrait conduire" à de nouvelles approches thérapeutiques, alors que les tumeurs poussent sans pouvoir être mesurées du vivant de l'animal. Une perte de plus de 20 % du poids initial déclenche la mise à mort, et le volume des tumeurs n'est mesuré qu'après.
Objectifs
La lutte contre les cancers gastro-intestinaux est un enjeu majeur de santé publique. Malgré certaines améliorations en matière de dépistage et thérapie, l'incidence, la prévalence et la mortalité des cancers du colon restent élevées dans les pays développés. En particulier, le pronostic des patients atteints de cancer colorectal (CCR) métastatique reste mauvais, avec un taux de survie de 10 pourcents à 5 ans, en raison de l'inefficacité des traitements actuels. Il est donc urgent de développer des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cette maladie. Dans le CCR, un rôle clé des réponses immunitaires a été démontré dans la croissance de la tumeur et ce rôle est notamment influencée par les macrophages, des cellules immunitaires innées. Ce projet propose de s’appuyer sur l’étude de tumeurs colorectales murines afin (1) de caractériser les différentes populations de macrophages présentes dans la tumeur et en périphérie, (2) de déterminer le rôle fonctionnel de ces macrophages dans la réponse anti-tumorale et (3) d’étudier l’impact de différents traitements et conditions sur cette réponse. Notamment, nous nous intéresserons à l’influence de l’obésité (induite à l’aide de régimes alimentaires spéciaux) et l’influence d'un traitement sur la réponse innée dans le CCR. L’obésité est connue comme étant un facteur de risque de développement du CCR et reprogramme les macrophages intestinaux vers un phénotype pro-tumoral. Nous chercherons donc à caractériser l’impact de l’obésité sur l’efficacité d'un traitement via l’action des macrophages. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’implication des cellules myéloïdes dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer à long terme à améliorer la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.
Bénéfices attendus
En 2023, en France métropolitaine, l'incidence du cancer colorectal était de plus de 47 000 nouveaux cas par an. Même si la mortalité (taux standardisé) par cancer colorectal est en baisse depuis les années 1990, celui-ci demeure la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules myéloïdes dans un modèle tumoral de cancer colorectal ainsi que de déterminer l’influence de l'obésité et d'un traitement sur cette réponse immunitaire innée. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire intestinal et colonique dans des conditions normales et pathologiques. La compréhension des mécanismes qui régulent les premières phases de l'immunité innée lors de la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie des patients.
Procédures
Les souris seront soumises à : 1. un régime alimentaire riche en gras (animal vigil, tous les jours pendant 16 semaines), 2. un traitement pour induire des tumeurs intestinales et colorectales consistant en une injection intra-péritonéale (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) suivi de 3 cycles d’une semaine d’administration de traitement dans l’eau de boisson (chaque cycle est suivi d'au moins une semaine de repos sans traitement), 3. des traitements par injection d’anticorps en intra-péritonéal (6 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 4. un gavage oral de glucose (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) accompagné de prélèvements sanguins sur animal vigil (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures, durée de quelques secondes par prélèvement) afin d’évaluer la capacité à réguler la glycémie après 4 semaines de régime gras, 5. des injections intrapéritonéales de molécule permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (animal vigil, durée de quelques secondes par injection, 2-3 injections par semaine pendant un maximum de 16 semaines), 6. un gavage oral d'un agent permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (5 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 7. une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Notre projet propose d’étudier les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur et nécessite donc d’induire le développement de tumeurs chez les souris via des modèles induits chimiquement (par deux molécules de traitement) ou via l’utilisation du modèle murin génétique. La première molécule est un carcinogène connu et son administration promeut le développement de tumeurs. L’administration de la seconde molécule peut lui entraîner une perte de poids. La localisation des tumeurs pourrait impacter la mobilité des animaux, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. Dans le phénotype du modèle murin génétique, les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs intestinales. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs. Les injections de molécules par voie intra-péritonéale pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de courte durée de l'œsophage. Les manipulations des animaux pourront également induire un stress de courte durée. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime enrichi en graisses. Ce régime entraîne une prise de poids qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude pouvant altérer la mobilité. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant quelques heures, le gavage de glucose et les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires pour les animaux.
Devenir
Afin de répondre aux questions et enjeux scientifiques soulevés au cours de notre projet expérimental, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et impliquent donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse du cancer colorectal (CCR) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation du modèle murin est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
En prenant en considération les publications antérieures, notre expérience dans le domaine et en utilisant une méthodologie de calcul de la taille des échantillons basée sur un test de puissance, notre estimation est de 12 souris par groupe. Le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation a été déterminé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins. Le nombre total d’animaux prévu est de 3552 souris.
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long du projet afin de minimiser la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et de taille réglementaire contenant des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois). La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour-nuit sera réglé de manière automatique. Le change de la litière et de la nourriture se fera une fois par semaine minimum. Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris est effectuée par le personnel animalier. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne sont pas censés être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal conformément aux directives éthiques. Une grille de suivi sera mise en place avec une pesée hebdomadaire des animaux et deux pesées lors de chaque de cycle de traitement. Une perte de poids de plus de 20 pourcents du poids initial à l’initiation du traitement des animaux sera considérée comme point limite. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après l'euthanasie afin de contrôler la pousse tumorale.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle des macrophages dans la pathogénèse et l’évolution du cancer colorectal (CCR) ainsi que d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement du CCR. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude du CCR et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 12 semaines à leur entrée dans les procédures. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme et un système immunitaire matures.