Recherche fondamentale

Injection sous la peau de la face d'un adjuvant qui déclenche une inflammation douloureuse, puis quatre jours de contentions au chiffon, jusqu'à trois par jour, le temps de photographier les grimaces : 12 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient six mâles et six femelles et se sert du côté non enflammé de leur face comme témoin, pour comparer expressions faciales et lésions selon le sexe. Il écrit ne pratiquer aucun test comportemental afin de limiter le stress lié à l'injection, et affirme que les résultats obtenus jusqu'ici ne montrent pas d'effets indésirables. Au quatrième jour, les rats sont profondément anesthésiés et mis à mort pour prélever les tissus.

Objectifs

Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer les différences sexuelles dans les expressions faciales et dans la lésion inflammatoire de la peau, avant et après l'induction de l'inflammation ; et 2) Évaluer les différences histologiques suite à l'induction d'un modèle de douleur inflammatoire au niveau de la peau de la face chez le mâle et la femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et d'améliorer sa mesure au laboratoire. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous-cutanée sous anesthésie générale (durée < 5 minutes). De brèves contentions à l'aide d'un chiffon seront réalisées (quelques secondes) pendant 4 jours, avec un maximum de 3 contentions par jour. Nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Le jour 4, ils recevront une injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique (durée de l'intervention < 1 minute ; durée de l’anesthésie = terminale). Les injections sont effectuées par du personnel compétent, conformément aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse de la region injectée. Afin de diminuer le stress lié à cette injection, nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Les résultats obtenus jusqu'à present ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.

Devenir

A la fin de la procedure, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus afin de réaliser une analyse histologique.

Remplacement

L’intégration de la douleur suite à l'induction de l'inflammation implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /sexe est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif en sachant que nous utilison le cote de la face sans inflammation comme temoin. Egalment, afin de limiter le nombre d'animaux, l'etude observationel (photographique) et histologique est realisé sur les memes animaux.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 1 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée après une période d’adaptation. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.

Choix des espèces

Le rat adulte est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les différents types de douleur inflammatoire sont majoritaires chez les adultes.

2 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pour certaines une chirurgie de deux heures pour implanter un émetteur de télémétrie et une autre d'une heure quarante-cinq pour poser une fibre optique dans le cerveau. Ces implants peuvent provoquer des douleurs pendant et après l'opération, et les souris opérées sont ensuite isolées. Viennent les tests comportementaux, dont un test aversif par groupe, sur quatre jours et jusqu'à une heure par séance, pour mesurer comment la fréquence cardiaque module la réponse à un signal de danger. L'effectif est justifié par "un logiciel statistique" et par l'expertise des deux équipes, sans qu'aucun chiffre de calcul ne soit donné pour ces 2 660 animaux.

Objectifs

Les parties centrales et périphériques du système nerveux autonome jouent un rôle clé dans la modulation de la fréquence cardiaque, cette dernière fluctuant en fonction de l’état émotionnel. Ainsi, des études cliniques suggèrent qu’une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) est fréquemment associée à des niveaux d’anxiété élevés. Cependant, nous ne disposons que de très peu d’information sur les mécanismes neuronaux sous-tendant la communication cœur-cerveau et la manière dont celle-ci influence les réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations dangereuses ou « menaçantes ». Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la communication cœur-cerveau, ce qui constitue une première étape importante pour le développement d’approches alternatives pour le traitement de troubles anxieux généralisés. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris mâles et femelles non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques ayant une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) ou diminuée (bradycardie) afin de déterminer l’impact de la modulation de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions.

Bénéfices attendus

A ce jour, les études visant à étudier l’impact de l’altération transitoire ou persistante de la fréquence cardiaque sur le traitement de stimuli prédictifs de menaces restent très parcellaires. De plus, la plupart des études ont été réalisées sur les mâles, alors que le dimorphisme sexuel cardiaque n’est plus à démontrer. Il est donc nécessaire de prendre en compte l’existence de ce dimorphisme sexuel cardiaque dans l’étude de l’impact de la fréquence cardiaque sur l’influence des réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations « dangereuses ». Cette étude va nous permettre à la fois de mieux comprendre certains des mécanismes qui sous-tendent l’apparition de troubles anxieux, mais aussi de proposer de nouvelles approches thérapeutiques se basant sur une régulation de la fréquence cardiaque pour contrôler des réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs.

Procédures

La procédure prévoit : - Des injections intrapéritonéales (une injection par jour de comportement, 30secondes) - Des tests comportementaux dont certains sont aversifs : durée 45min à 1h sur 4jours (1 seul test aversif par groupe de souris) - Des actes chirurgicaux : implantation de transmetteurs pour la télémétrie (2h) ainsi que la mise en place de fibre optique dans des régions précises du cerveau (1h45)

Impact sur les animaux

La procédure prévoit actes chirurgicaux avec pose d’implants pouvant entrainer des douleurs per et post-opératoires (interventions modérées). Il sera aussi effectué des tests comportementaux pouvant entrainer un stress léger chez l’animal (interventions légères) Enfin la manipulation des animaux peut entrainer une gêne chez ces derniers (interventions légères).

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus pour analyses cellulaires et moléculaires de nos différentes lignées

Remplacement

Notre projet repose sur la caractérisation des mécanismes neuronaux et moléculaires associés à la fois aux modifications de la fréquence cardiaque et aux comportements adoptés face à des situations de danger/menace. Nous ne pouvons donc pas valider notre étude sur des modèles in vitro, l'utilisation d'animaux demeure la seule option à ce jour. La souris est l'organisme modèle le plus pertinent pour cela. En effet la bibliographie disponible montre que les souris fournissent un excellent modèle pour étudier à la fois la fréquence cardiaque et les réseaux neuronaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à la fois à un logiciel statistique et à l’expertise acquise par les deux équipes. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différents tests afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal de l’étude

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Les souris seront isolées suites aux différents actes chirurgicaux. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies. Si l’animal atteint un des points limites il sera euthanasié. Cependant si l’animal montre des signes de « faiblesse » : la fréquence d’observation des animaux sera augmentée et un traitement adapté à la situation sera administré (désinfectant ou analgésique). Si aucune amélioration du bien être de l’animal n’est observé il sera alors ensuite euthanasié

Choix des espèces

Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux et des changements de fréquence cardiaque à la fois chez les mâles et les femelles. Nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 24 semaines), ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines

20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune anesthésiée trois fois en quatre ou cinq jours pour des séances d'IRM de deux heures à deux heures trente. Elles reçoivent aussi, sous anesthésie générale, une injection de manganèse dans la cavité abdominale, un métal neurotoxique à forte dose selon le porteur, et trois injections dans la veine jugulaire pour déclencher les anesthésies. Le porteur prévoit jusqu'à 20 brebis plutôt que 12 "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives". Toutes sont tuées sous anesthésie après les acquisitions, le porteur expliquant qu'elles ne peuvent être réutilisées faute de savoir combien de temps le manganèse reste dans leur corps. Le projet se limite à caler la fenêtre d'imagerie avant de futures études sur les circuits cérébraux des interactions sociales et sexuelles chez les moutons, et ses mises au point "bénéficieront à des appels à projet ultérieurs", écrit-il.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.

Procédures

Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (20 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques).

Raffinement

Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.

Une substance ajoutée à l'eau de boisson provoque chez elles une inflammation de l'intestin : 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur table sur une régénération complète de l'épithélium intestinal en trois jours et sur une expérience arrêtée une semaine après l'administration, et n'attend donc ni perte de poids ni effet prolongé. Le poids, la consistance des selles, la diarrhée et la présence de sang sont pourtant surveillés deux fois par jour au titre des points limites. La mise à mort sert à prélever organes et sang, avec l'annonce qu'un maximum d'analyses sera tiré des échantillons récoltés.

Objectifs

Cette étude est la continuité d’un autre projet : Il vise à déterminer l'importance d’un processus appelé "SUMO" pour "Small Ubiquitin-like Modifier" dans la régénération de l'épithélium intestinal après lésions. Dans un contexte pathologique où des lésions mal réparées de l’épithélium conduisent à des maladies intestinales chroniques, telles que la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, ce projet participera également dans le futur à contribuer à l’avancée des recherches pour l’élaboration de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux déterminer le rôle de la molécule appelée SUMO dans la régénération intestinale. En effet, on sait que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont dues à des lésions de la paroi intestinale qui ne sont pas réparées efficacement et qui conduisent ainsi à une inflammation chronique de l’intestin. Mais les mécanismes exacts à l’origine de ces maladies sont encore mal compris et les traitements actuels, qui soignent uniquement les symptômes, ne permettent pas de guérir réellement les patients. Comme il a déjà été montré que SUMO agit sur le maintien de l’identité cellulaire et que sa diminution favorise la plasticité des cellules, notre étude nous permettra de valider également du processus appelé « SUMOylation » comme un mécanisme important impliqué dans la régénération intestinale. Cette étape permettra in fine l’élaboration de nouvelles thérapies ciblant des patients atteints de MICI.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement par le DSS dans l’eau de boisson .

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la régénération intestinales, nous induisons des lésions intestinales en administrant un produit dans l’eau de boisson des souris. Le mode d’administration par l’eau de boisson n’induit pas de douleurs au moment de l’ingestion. Le produit entrainera ensuite une inflammation de l’intestin qui peut occasionner des effets indésirables de nature modérée. Il est possible que les animaux puissent souffrir d'une légère colite, dérivée de la perte transitoire de la capacité d'absorption de l’intestin. Cependant, l'épithélium intestinal a la capacité de se régénérer complètement en seulement 3 jours à la suite d’une blessure, de telle sorte que les animaux ne subiront pas d'effets indésirables sur une durée prolongée. De plus, les animaux étant maintenus en expérience seulement une semaine au maximum après l’administration du produit, nous n’attendons donc pas de perte de poids des animaux ni d’effets secondaires additionnels durant cette courte période.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour pouvoir prélever les organes et sang nécessaires à nos analyses et évaluation de l’inflammation. Un maximum d’analyses sera effectué à partir des échantillons récoltés.

Remplacement

Il n'existe pas et il ne peut y avoir d'alternatives non animales dans l'étude du processus de régénération de l'épithélium intestinal, car il s'agit d'un processus auquel participent une multitude d'organes et de types de cellules, ainsi que le microbiote lui-même, présent à l'intérieur de la lumière de l'intestin, qui joue un rôle clé. Pour cette étude, des animaux vivants sont nécessaires car le maintien de l'ensemble du microenvironnement intestinal est essentiel, afin d'établir le rôle de chaque élément dans le dit processus.

Réduction

Les animaux auront le même fond génétique pour limiter les variations entre les lignées. - Le plus grand nombre d'analyses possible sera effectué sur chaque animal, afin d'éviter d'en utiliser inutilement. - Chaque expérience sera réalisée 3 fois de manière indépendante les unes des autres pour assurer la reproductibilité des expériences. Cependant, si les deux premières expériences génèrent des résultats identiques, la troisième ne sera pas effectuée. -La deuxième procédure ne sera faite que si la première confirme un rôle du processus appelé « SUMOylation » dans la régénération intestinale. - Les analyses statistiques seront effectuées en prenant en compte la structure des données (cages et répétitions principalement) en utilisant des modèles statistiques à effets mixtes. Les animaux contrôles seront comparés aux animaux traités par groupes de 10 (5 mâles + 5 femelles), ce qui permettra de mettre en évidence les effets attendus (d~1, effets importants) avec suffisamment de puissance (80%). - La deuxième répétition d'une expérience ne sera réalisée que si les effets néfastes sur l'animal sont minimes. En cas de découverte d'effets secondaires sévères au cours d’une expérience, le traitement sera interrompu. Les animaux ne peuvent pas être réutilisés car ils seront mis à mort au cours du processus.

Raffinement

Les symptômes attendus sont ceux de la colite. Tout au long de l’étude, les animaux seront donc surveillés tous les jours deux fois par jour pour les points limites spécifiques dans le cas de la colite (poids corporel, consistance des selles, présence de sang dans les selles et diarrhée). Afin de minimiser la douleur liée à la colite, -Du gel hydrique sera mis à disposition dans la cage pour éviter la déshydratation et faciliter le rétablissement des animaux.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est l’espèce indispensable dans la réalisation de ce projet. Il s'agit tout d’abord d'un mammifère, dont le système digestif est essentiellement composé des mêmes structures et des mêmes types de cellules que ceux de l’Homme. L’étude de la régénération intestinale dans cette espèce est donc tout appropriée. De plus, la création de lignées génétiquement modifiées est un processus établi et relativement facile à mettre en place. Elle génère ainsi des modèles spécifiques pour étudier par exemple des types cellulaires donnés, ici cellules épithéliales intestinales et cellules souches, nous permettant ainsi de répondre à plusieurs questions. Les souris sont également faciles à entretenir et à manipuler et se reproduisent relativement rapidement. Toutes ces caractéristiques font de la souris de laboratoire un modèle idéal pour nos besoins. De jeunes souris adultes (entre 8 et 12 semaines) seront utilisées car il est nécessaire que le développement et la maturation de l'animal soient terminés, afin qu'ils n'interfèrent en aucune façon dans l'obtention de résultats, et avec un âge inférieur ou égal à 12 semaines de sorte que, de la même manière, le processus de vieillissement n’interfère pas.

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.