Recherche fondamentale

Mesurer si des lymphocytes régulateurs atténuent la douleur passe ici par la stimulation répétée des pattes de souris au chaud, au froid et à la pression. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinq tests comportementaux sont menés à une heure d'intervalle, avant puis sept jours après l'administration de tamoxifène par injections quotidiennes ou par gavage, avec contention de quelques secondes pour le test d'immersion de la patte. Le retrait de la patte est décrit comme le signe d'une douleur modérée, et les animaux sont tués pour prélever leur cerveau et leurs nerfs, d'autres organes étant stockés pour des études ultérieures.

Objectifs

Il a récemment été montré que les lymphocytes T régulateurs (ou Treg) étaient impliqués dans la modulation de la douleur en particulier inflammatoire, sans pour autant en décrire complètement le mécanisme. Or il a également été montré que ces Treg expriment le gène de production de la pro-enképhaline (Penk). Cette molécule étant un précurseur du peptide opioïde, l’enképhaline, l’effet antinociceptif médié par les Treg pourrait donc provenir de cette voie opioïdergique. Ainsi l’objectif du projet est de tester différentes modalités douloureuses (chaud, froid, mécanique) ou non douloureuses (touché et proprioception) chez la souris exprimant ou non la pro-enképhaline dans les lymphocytes T régulateurs. Cela permettra ainsi de démontrer un potentiel effet antalgique directement médié par les lymphocytes Treg et donc le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le potentiel effet antalgique des lymphocytes T régulateurs via la voie des pro-enképhalines. A moyen terme, ces manipulations permettront de comprendre si cela est modifié dans différentes pathologies ce qui pourrait expliquer certains types de douleur. Enfin cela permettrait à long terme, si les résultats sont concluants, de développer de nouvelles stratégies pour réactiver cette voie opioïdergique médié par le système immunitaire afin que les patients puissent ne pas développer de douleur chronique.

Procédures

Une mesure de la sensibilité nociceptive et non nociceptive cutanée au niveau de la patte (mécanique et thermique) sera faite chez tous les animaux, après une période d'acclimatation de 7 jours. 5 tests comportementaux seront réalisés avec un intervalle d’au moins une heure entre les tests. Ces stimulations durent au maximum 3 secondes pour les mécaniques et 20 secondes pour les thermiques. Ces tests comportementaux seront réalisés pendant une journée avant, puis 7 jours après, injection de tamoxifen. Administration de tamoxifen : 5 injections intrapéritonéales avec 1 injection par jour ou administration unique par gavage oral. A la fin des tests comportementaux, tous les animaux seront euthanasiés et perfusés et leurs tissus nerveux périphérique et central sera collecté pour analyse histologique et électrophysiologique.

Impact sur les animaux

Les stimulations mécaniques et thermique induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention à l’exception du test d’immersion de la patte où la contention est très temporaire (quelques secondes). La piqure d'aiguille ou le gavage pour l’injection de tamoxifen entraîne une douleur légère de courte durée.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Cette étude ne peut se faire que chez des souris permettant de supprimer génétiquement l'expression de la Penk spécifiquement dans les Treg.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Dix animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes (quantité de Treg sexe-dépendant) sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux euthanasiés, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera d'euthanasier de nouveaux animaux pour ces autres études.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant un groupe de males ou de femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière gégulier. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé. Les animaux seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les cages seront enrichies au minimum à l'aide coton et de tunnels. L'enrichissement pourra être supplémenté par des plateformes ou des roues d'exercice si des comportements agressifs sont observés. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des procédures décrites dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet.

Choix des espèces

La souche C57BL6 est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans le projet, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez une autre espèce. Les animaux seront âgés de 8-10 semaines afin que les souris soient considérées comme adultes et ayant atteint leur maturité cérébrale et un système sensoriel et locomoteur mature, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.

Opérées du cerveau pendant quatre heures au plus pour une injection, et pour 110 d'entre elles l'implantation de dispositifs d'enregistrement et de stimulation, des souris sont ensuite tuées sous anesthésie au cours d'une seconde chirurgie, sans réveil. 197 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Isolées en cage individuelle pendant environ quatre mois pour protéger leurs implants, les souris implantées passent jusqu'à trois mois de tests quotidiens de deux heures, à chercher des miettes de céréales au chocolat pendant que des zones de leur cerveau sont stimulées par la lumière. Ces tests ne sont pas décrits plus avant. L'objectif est de décrire les connexions entre cervelet et hippocampe impliquées dans l'orientation spatiale. Le porteur parle d'une "légère restriction alimentaire", destinée à leur faire ressentir la faim, et décrit ailleurs une ration réduite "à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids".

Objectifs

Le cervelet a été classiquement considéré comme une structure impliquée dans le contrôle, la synchronisation et l'apprentissage des habiletés motrices. Cependant, un ensemble de preuves récentes ont également mis en évidence son rôle dans les processus cognitifs par ses interconnexions avec les régions du cerveau impliquées dans la cognition, notamment l'hippocampe. L'hippocampe est consideré comme le siége de la navigation, une fonction fondamentale qui permet aux individus de se repérer dans l'environnement et de la mémoire spatiale, la composante de la mémoire responsable de l'enregistrement des informations sur notre environnement et notre orientation. Des études menées sur des souris ont révélé que le cervelet est crucial pour l'activité neuronale de l'hippocampe et l'efficacité des comportements de navigation. Cependant, les voies reliant le cervelet à l'hippocampe et les mécanismes sous-jacents restent inconnues. Notre projet vise à caractériser les projections cérébelleuses vers l'hippocampe, tant sur le plan anatomique que physiologique, chez des souris au comportement libre.

Bénéfices attendus

Les fonctions cognitives, telles que la navigation et la mémoire spatiale, sont des processus complexes qui impliquent l'intégration d'informations provenant de différentes régions du cerveau. L'étude des connexions entre ces régions permet d’appréhender non seulement les bases neuronales de ces processus, mais contribue également aux domaines plus vastes des neurosciences et de la psychologie cognitive. Elle fournit une base pour développer et tester des théories sur la façon dont le cerveau traite les informations et décide du comportement. La navigation et la mémoire spatiale sont souvent altérées dans divers troubles neurologiques et psychologiques, tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Comprendre les circuits neuronaux en conditions normales, peut aider à détecter et à comprendre les altérations et les dysfonctionnements cérébraux qui surviennent dans ces conditions pathologiques. En étudiant les interactions entre le cervelet et l’hippocampe, ce projet permettra donc de mieux comprendre le réseau cérébral qui soutient la navigation et la mémoire spatiale en conditions normales, avec des applications potentielles dans les pathologies associées.

Procédures

Dans cette étude, deux groupes d'animaux suivront des interventions spécifiques - Premier groupe (87 animaux) : Ces animaux subiront une chirurgie au niveau du cerveau, avec une injection de solution, sous anesthésie et analgésie. La procédure durera au maximum 4 heures. Après un délai d’un mois maximum, ces animaux seront de nouveau anesthésiés et euthanasiés lors d'une chirurgie, sans être réveillés. Cette méthode permet d’éviter toute souffrance en fin d’expérience. - Deuxième groupe (110 animaux) : Ces animaux passeront également par une chirurgie au niveau du cerveau, avec une injection de solution et l’implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie. Cette intervention durera au maximum 4 heures. Après une semaine de récupération, ils participeront à des séances d’exploration comportementale dans une arène, à l’état éveillé, pendant 60 minutes maximum par jour pendant deux semaines. Ensuite, des tests comportementaux seront réalisés pendant 120 minutes maximum par jour, sur une période de 3 mois. Ces tests incluront l'observation de leur comportement et l’enregistrement de l’activité cérébrale, combinés à l’utilisation d’une technique appelée optogénétique (qui permet de stimuler des zones précises du cerveau grâce à la lumière). Pour motiver les animaux à explorer leur environnement (dans lequel sont éparpillées des céréales au chocolat), une légère restriction alimentaire sera appliquée certains jours de test. À la fin de l'étude, ils seront euthanasiés de la même manière que le premier groupe, sous anesthésie, lors d'une chirurgie, sans être réveillés.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certains effets indésirables peuvent survenir pour les animaux à différents moments du processus : Premièrement, les effets liés aux chirurgies : Les interventions chirurgicales, comme celles réalisées au niveau du cerveau, peuvent provoquer des effets indésirables tels que la perte de poids, une baisse de la température corporelle, de la déshydratation, ainsi que des douleurs ou un inconfort. Deuxièmement, le stress dû à l'hébergement en cage individuelle : Après les chirurgies, les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pour protéger les implants fragiles placés lors des chirurgies. Bien que ces cages permettent des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux, les souris sont des animaux qui vivent habituellement en groupe. Cette séparation peut donc provoquer un certain stress ou de l'angoisse, car elles se retrouvent privées de la compagnie de leurs congénères. Troisièmement les effets liés aux tests comportementaux : Pendant les tests comportementaux, les animaux seront récompensés avec de la nourriture. Afin d'augmenter leur motivation à réaliser ces tests, une légère restriction alimentaire sera mise en place avant les séances, afin qu'ils ressentent une sensation de faim. Bien que cette restriction soit légère, elle peut causer une forme de stress temporaire chez les animaux.

Devenir

L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem afin d'identifier les projections cérébrales d'intérêts, de valider l'emplacement exact de fibre optique d’optrode, et d’éléctrode dans le cerveau de l'animal, ainsi que de réaliser des tests immunologiques.

Remplacement

L’étude des bases neurales qui sous-tendent les capacités de navigation requiert de manière indispensable l’utilisation d’animaux capables de telles performances de manière à en étudier les mécanismes sous-jacents. Étant donné que les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'investigation de comportements complexes, le rongeur demeure donc l'espèce la plus appropriée. La souris est un animal explorateur, ce qui se prête parfaitement à notre sujet de recherche. Ainsi, des travaux précédents de l’équipe ont montré la validité de ce modele animal dans l’étude de la navigation spatiale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 197 animaux. Ce nombre est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et réduit au maximum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ce projet utilisera des implants permettant des enregistrements électrophysiologiques simultanés d'une grande population de neurones localisés dans différentes structures cérébrales, permettant de collecter des données en plus grande quantité par souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux requis. L’analyse des données électrophysiologiques et comportementales s’effectuera avec des tests statistiques en ajustant des modèles à effets mixtes généralisés avec des effets aléatoires imbriqués pour tenir compte de la variabilité entre les souris ou les sessions au sein des souris.

Raffinement

À leur arrivée dans l’animalerie les animaux ont une periode d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils sont ensuite manipulés et surveillés quotidiennement par les mêmes experimentateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (Grille de scoring). Les souris subissant une chirurgie seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthesiant et receveront une injection d'analgésique et d'un anesthésique local au lieu de l’incision chirurgicale. De plus, un anesthésique local sous forme de créme est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au debut et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de déterioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront isolés pendant environ 4 mois. Néanmoins pendant cette période un nid végétal ainsi qu’un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Pour obtenir un comportement optimal, nous régulons la quantité de nourriture disponible pour les animaux durant les jours d’enregistrement (environ 3 mois) afin qu’ils soient plus motivés pour trouver les miettes de céréales au chocolat qui sont disposées aléatoirement dans l’environnement. Nous diminuons donc la quantité de nourriture d’ad libitum à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids. Les souris sont pesées chaque jour et nous surveillons que leur perte de poids ne soit pas excessive. Pendant le weekend les souris ont de la nourriture ad libitum ce qui leur permet de retrouver leur poids de référence.

Choix des espèces

La souris est le modèle traditionnellement utilisé au laboratoire. Nous disposons donc de tout le matériel réglementaire et nécessaire à son hébergement. Il s’agit d’un mammifère explorateur, qui est le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants en termes de performance de navigation qui est notre sujet de recherche. L'équipe a développé de nombreux tests de comportement pour cet animal au cours de travaux antérieurs, parmi lesquels ceux qui servent de fondement à nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Comme les procédures d'enregistrement électrophysiologique combinées à l'optogénétique prennent plusieurs semaines, elles ne peuvent être effectuées que sur un cerveau dont le développement est stable. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 8 mois maximum.

2 640 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est enfoncée dans un disque intervertébral du dos ou de la queue pour y créer une lésion, opération de dix à quinze minutes, suivie trois semaines plus tard chez certains d'une seconde injection dans le disque abîmé, pour tester des molécules ciblant les cellules sénescentes. Le porteur décrit une douleur discale pouvant conduire l'animal à la prostration, à l'isolement et à l'arrêt du toilettage social, et une douleur nerveuse liée au passage de l'aiguille le long des racines spinales. Il conclut qu'il est "inévitable" de travailler sur des animaux et que le recours aux rongeurs est "nécessaire", les explants de disque de queue de bœuf restant réservés à l'étude de la diffusion des molécules.

Objectifs

La lombalgie chronique constitue la principale cause d’années de vie vécues en situation de handicap et affecte plus de 600 millions de patients dans le monde. Si elle peut avoir plusieurs causes, la Dégénérescence du Disque Intervertébral (DDIV) en représente le contributeur majeur. La physiopathologie de la DDIV associe la mort cellulaire, l'inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire, mais n'est pas encore totalement comprise. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques pour limiter la douleur, il n'y a actuellement aucune stratégie thérapeutique permettant de freiner les mécanismes dégénératifs et d'atténuer l'inflammation à l'origine de la maladie. Parmi les acteurs centraux de l'apparition et de la progression de la DDIV, un mécanisme de survie aberrante des cellules discales, appelé « sénescence », semble directement impliqué et pourrait représenter une cible thérapeutique pertinente. L’objectif premier de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie de la DDIV en examinant la présence et l’activité des cellules sénescentes dans et autour du disque intervertébral, au cours du développement de la DDIV post-traumatique chez le rat, que ce soit dans le dos ou sur la queue. Le second objectif est d’évaluer la pertinence thérapeutique d’un ciblage spécifique de ces cellules sénescentes (élimination ou modulation). Ces deux modèles de dégénérescence discale post-traumatique sont induits chirurgicalement de manière mini-invasive afin de choisir le modèle avec les lésions les plus reproductibles et la dégénérescence la plus proche de la physiopathologie humaine, tout en limitant le risque de dommages liés à la procédure. Par la suite, des thérapies innovantes visant les cellules sénescentes, appelées 'sénothérapies' seront évaluées contre la DDIV du rat. Ces thérapies seront soit administrées à l’ensemble du corps, soit localement, dans le disque malade, à l’aide de gels injectables. L'évaluation se fera sur le modèle jugé le plus approprié, soit dans le bas du dos, soit dans la région de la queue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comparer les deux modèles dégénérescence discale post-traumatiques mini-invasifs décrits chez le rat et d’évaluer l’expression de cibles thérapeutiques au cours du développement de la pathologie. La prise en charge des patients atteints de dégénérescence discale reste insuffisante, ne traitant que les symptômes, ce projet permettra également de réaliser une preuve de concept avant les essais cliniques, pour évaluer l'efficacité de thérapies innovantes contre la DDIV post-traumatique chez le rat. Ces thérapies seront distribuées sous formes libres à l'échelle du corps entier ou bien transportées dans des gels injectables afin d’être administrées localement dans le disque malade. Ce traitement adapté pour la clinique pourra à terme être proposé pour des essais cliniques vétérinaires chez le chien malade, puis des essais en clinique humaine.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie d’environ 10-15 minutes consistant à introduire une aiguille dans l’espace intervertébral afin de créer une lésion dans des disques intervertébraux au niveau dorsal ou dans la queue de l’animal. Certains animaux entrant dans un protocole de test de molécules thérapeutiques seront 3 semaines plus tard soumis à une deuxième intervention: soit à une seconde chirurgie mini-invasive unique d’environ 10-15 minutes permettant l'injection intra-discale de molécules thérapeutiques à effet prolongé ; soit à une injection systémique unique intra-péritonéale de quelques secondes de molécules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Des nuisances modérées pour les animaux sont à attendre des procédures mises en place dans ce projet. Lors du développement de la dégénérescence, de la douleur discale peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, diminuer son activité, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions, par exemple le toilettage social. L'intervention mini-invasive et percutanée minimise les risques d'infection au niveau des points de piqûre les rendant très peu probables. De plus, une douleur secondaire d’origine nerveuse (neuropathie), due au passage de l’aiguille le long des racines des nerfs spinaux pourrait être observée, n'allant pas au delà de 5 jours suivant la procédure dans le bas du dos de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Cette étude prend en considération la règle des 3R. Les expérimentations in vitro ne permettent pas à l’heure actuelle de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs tissulaires du disque intervertébral (noyaux pulpeux, anneau fibreux, plaques cartilagineuse, os vertébral…) et du système vasculaire. Il est ainsi inévitable de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors du développement de la maladie discale. Le recours aux rongeurs est ici nécessaire afin de valider le potentiel thérapeutique de nouvelles biothérapies. Il n’existe pas, pour le moment, de solution de remplacement in vitro complet, ni de modèles invertébrés.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les potentielles biothérapies seront testées et sélectionnées pour leur efficacité en amont, in vitro, sur les différents types cellulaires du disque intervertébral. Un modèle ex vivo d’explants de disque entier de queue de bœuf sera également utilisé pour étudier la biodistribution des biothérapies dans le tissu spécifique du disque intervertébral. In fine, uniquement les biothérapies les plus prometteuses seront utilisées dans cette étude in vivo. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au strict minimum. Ce nombre, fixé ici à 10 animaux par groupe expérimental, est calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative entre les groupes expérimentaux si celle-ci à un sens biologique dans le contexte spécifique de la maladie discale.

Raffinement

Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage avec de l’enrichissement physique (tubes en carton) pour stimuler leurs comportements naturels. Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. De façon générale, un suivi hebdomadaire des rats permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi postopératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 5 premiers jours pour s’assurer de la bonne cicatrisation et de l'absence de douleur, puis une fois par semaine. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptées, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Dans le cas de la dégénérescence discale, plusieurs modèles animaux post-traumatiques ont été développés, le rat restant la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette maladie, devant la souris, le lapin et la brebis. Le rat présentant le double avantage de présenter une taille de disques intervertébraux compatible avec une injection intra-discale et une voie d’abord accessible à l’échelle expérimentale, sans le recours à de gros animaux. Notre protocole débutera chez des rats arrivés à maturité squelettique et âgés de 12 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de la dégénérescence discale est possible et documentée dans des études précédentes.

Surveillées chaque jour pendant vingt-huit jours et notées deux fois par semaine sur une grille de douleur, 336 souris portent sur le dos une mini-pompe qui leur délivre de l'angiotensine II. Elles vont toutes être tuées pour prélever leurs tissus vasculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'implantation dure une quinzaine de minutes sous anesthésie, et le porteur indique que la pompe peut limiter certains mouvements et que les points de suture peuvent s'infecter ou sauter. Le bénéfice annoncé se limite à compléter des expériences déjà commencées pour qu'un article sur la fusion mitochondriale puisse être publié.

Objectifs

​​Le maintien de la pression artérielle normale est dépendant de l’équilibre entre le débit cardiaque et la résistance vasculaire. Lors de la pathologie d’hypertension artérielle, le débit cardiaque reste normal. C’est la résistance vasculaire, due à un remodelage des artères, qui augmente et induit ainsi une élévation de la pression artérielle. ​Lors de l’hypertension, il est observé une augmentation du stress oxydatif en grande partie d’origine mitochondrial. Celui-ci a un impact délétère sur toutes les composantes du vaisseau. Ce stress oxydatif contribue au remodelage vasculaire et donc à l’hypertension. ​Les mitochondries sont capables de fusionner entre elles ou de se séparer. L’équilibre entre fusion et fission est essentiel au bon fonctionnement des cellules. Moins de fusion entraîne une diminution de la fonction mitochondriale. Il nous paraît donc essentiel d’étudier l’impact de ce déficit sur la fonction vasculaire lors de l’hypertension artérielle, pathologie dans laquelle les mitochondries jouent un rôle important.​

Bénéfices attendus

Nos premiers résultats montrent l’implication de la fusion mitochondriale dans la fonction vasculaire lors de l’hypertension arterielle. Nous devons compléter plusieurs expériences pour qu’un article décrivant cette implication puisse être publié.

Procédures

- Pose d’une mini-pompe d’angiotensine II en sous-cutanée sous anesthésie générale : ce geste est réalisé une fois par animal, couplée à une analgésie. La durée d’intervention est d’environ 15 minutes. 336 animaux concernés.

Impact sur les animaux

A la suite de la chirurgie et jusqu’à la fin du protocole (28 jours), l’animal a une mini-pompe implantée sur le dos qui peut limiter très légèrement certains mouvements. Une douleur post-chirurgicale n’est pas attendue car l’intervention est peu invasive. Cependant, l’animal est surveillé jusqu’à la fin du protocole (28 jours) pour dépister une éventuelle douleur. Enfin, une petite infection des points de suture pourrait survenir ou que des points sautent, les animaux étant plusieurs par cage.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour récupérer les tissus vasculaires sur lesquels nous allons mener des expériences.

Remplacement

Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier la fonction vaculaire dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Le modèle prévu est un modèle standard bien documenté dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.

Réduction

​​Le nombre d’animaux pour les expériences a été précisément défini à l’aide d’un outil informatique pour avoir assez de puissance statistique lors de l’étude. Des tests statistiques adaptés sont utilisés.​

Raffinement

​​​La pose des pompes osmotiques est un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour ajuster au mieux l’anesthésie pendant l’intervention chirurgicale. ​Durant les 28 jours de cinétique, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter une éventuelle réaction cutanée ou une gêne. ​Même si elle n’est pas attendue, la douleur de l’animal sera évaluée 2 fois par semaine selon une grille d’évaluation de la douleur.​​

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifier pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser le poids de l’animal et la taille des vaisseaux.

Des femelles gestantes sont enfermées chaque jour dans une machine à enfumer, placées le matin dans un espace restreint, puis laissées le soir sur une litière humide en cage inclinée, le cycle lumineux étant inversé le week-end. 480 souris, 120 femelles et 360 souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les petits étant exposés à la fumée de cigarette jusqu'à leur trentième jour de vie. Le porteur affirme que les femelles "tolèrent bien" cette exposition, "sans nuisance particulière", tout en anticipant que le stress chronique quotidien peut conduire à un cannibalisme maternel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever notamment les poumons et mesurer les effets des deux expositions.

Objectifs

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. L'approche expérimentale qui fait l'objet de la présente demande vient compléter une approche épidémiologique réalisée sur une cohorte mère-enfant, avec pour objectif général d'identifier les mécanismes biologiques sous-tendant les interactions entre stress chronique et chimique. Le volet expérimental du projet va nous permettre de comprendre à quel(s) stade(s) du développement pulmonaire cette interaction exerce son effet, grâce aux analyses fonctionnelles et moléculaires qui seront réalisées sur les prélèvements pulmonaires notamment.

Bénéfices attendus

Ce projet explore la relation entre l'exposition aux polluants, en particulier le tabac, et la vulnérabilité induite par le stress sur la santé respiratoire. Il se concentre sur un problème majeur de santé publique qui a été peu exploré jusqu'à présent : comment l'exposition précoce à un événement stressant de la vie rend les individus plus susceptibles de développer des troubles respiratoires après une exposition à des polluants environnementaux tels que le tabac. L'identification de biomarqueurs enrichira la construction d'AOPs (adverse outcome pathways) et donc, au-delà de la science fondamentale, renforcera le panel d'outils de régulation dans ce domaine. Ces biomarqueurs seront aussi recherchés chez les patients, ce qui devrait conduire à terme à de fortes implications en santé publique grâce à l'approche pluri- et transdisciplinaire du projet dans son ensemble (volets épidémiologique et expérimental).

Procédures

Les femelles gestantes seront exposées à la fumée de cigarettes quotidiennement, selon une procédure non douloureuse (cage placée dans une machine à enfumer), et/ou à différents stress chroniques. Ainsi, un évènement de stress léger sera appliqué le matin (femelle placée dans un environnement restreint), ainsi que le soir (litière humide, cage inclinée). Les week-ends, seule une inversion du cycle de lumière (30 min de lumière toutes les 3 h) sera appliquée. La descendance sera exposée quotidiennement à la fumée de cigarette jusqu'au 30è jour de vie. Elle sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leur vie (Pléthysmographie).

Impact sur les animaux

D’après nos résultats antérieurs, les souris femelles exposées aux polluants au cours de la gestation tolèrent bien une telle exposition, sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. L’exposition des femelles au stress chronique chaque jour pendant la gestation pourrait induire un stress pouvant conduire à un cannibalisme maternel. Dans le cadre de ce projet, une attention particulière sera portée à la croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels. La mesure de la fonction pulmonaire par pléthysmographie corps entier est non invasive, elle est réalisée sur animaux vigiles et libres de mouvement, elle n’induit pas d’effets indésirables.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux différents stress (chronique et/ou chimique).

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. De cette co-exposition résulte une complexité impossible à modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 480 animaux (360 souriceaux + 120 femelles gestantes). Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire, du nombre moyen le plus bas de naissances par portée, et de données (publiées ou non), nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’effet ou non d’une condition expérimentale. Précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats précédemment obtenus au laboratoire sur les effets de l’exposition à la fumée de cigarette et/ou sur la période du développement pulmonaire pourront être comparés. En fonction du calendrier des expériences et de la réussite des accouplements, le nombre d'animaux utilisés pourra être revu à la baisse.

Raffinement

Les expérimentations seront réalisées conformément aux règles éthiques visant à respecter le bien être animal, c’est-à-dire dans un environnement contrôlé (stabulation dans des enceintes autonomes d'animalerie). Ces conditions expérimentales offrent de plus l’avantage de minimiser l’impact de stress non contrôlés sur les paramètres mesurés. Plus spécifiquement, pour la réalisation du protocole de stress, les animaux seront stabulés dans des enceintes autonomes. Ces enceintes permettent d'éviter aux animaux d'être dérangés par le bruit extérieur (source de stress que nous ne pourrions contrôler dans un projet qui s'intéresse à l'effet d'événement stressant). Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser le stress (non souhaité), notamment en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hébergées en groupes sociaux, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. L'exposition à la fumée de cigarettes se fait en placant directement les cages dans la machine à enfumer Teague, ce qui permet de ne pas avoir à changer les animaux de cages. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, nous maitrisons l'ensemble des techniques nécessaires à l'expérimentation. Les analyses seront réalisées à J21 (stade tardif de l'alvéolisation), J30 (jeune adulte) et J60 (adulte, maturité pulmonaire atteinte).

Quatre chirurgies de trois à six heures par animal, un examen IRM et trois scanners sous anesthésie générale: quatre macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué à l'issue, le porteur indiquant qu'ils pourront rejoindre un autre projet ou "gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite". Pendant environ un an et demi, ils travaillent cinq jours par semaine sur une tâche de choix entre deux mouvements du bras, motivés par un contrôle alimentaire puis, en dernier recours, hydrique, pour tester l'hypothèse d'un signal d'urgence fourni par les ganglions de la base. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'il est "impossible de répondre à la question" dans ce projet.

Objectifs

Ce projet, se déroulant dans deux EU, vise à mieux comprendre le fonctionnement neurophysiologique d’un ensemble de structures cérébrales sous-corticales, les ganglions de la base, chez le primate non-humain lors de la prise de décision entre actions, comportement typique de la vie quotidienne aussi bien pour ces animaux que pour les humains. Au-delà de l’apport en connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, cette problématique représente un enjeu de santé publique car un dysfonctionnement des ganglions de la base est associé à de nombreux déficits neuropsychiatriques et neurologiques liés à la prise de décision et l’exécution de l’action, dont les troubles obsessionnels compulsifs, l’impulsivité et la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Dans notre vie quotidienne, nous devons continuellement faire des choix entre actions potentielles, que ces choix soient guidés par des stimuli sensoriels externes (feu rouge = appui sur la pédale de frein ; feu vert ; appui sur l’accélérateur), ou par des indices de valeurs acquis par l’expérience (mouvement du bras vers la droite pour prendre une tasse de café, ou à gauche pour prendre la bouteille de jus d’orange). Les mécanismes neuronaux sous-tendant ces sélections et exécutions d’actions sont donc sollicités en permanence mais malgré des décennies de recherche, leur compréhension reste incomplète et controversée. Les données de la littérature les plus récentes indiquent que les décisions entre actions seraient déterminées dans les mêmes structures que celles impliquées dans la préparation et l’exécution de l’action, le cortex sensorimoteur, selon un mécanisme computationnel comprenant un signal d’urgence qui pousse les sujets à agir en situation d’incertitude. Elles suggèrent également que les ganglions de la base (BG) fourniraient ce signal d'urgence, permettant l’ajustement du compromis vitesse-précision en fonction du contexte dans lequel la tâche est effectuée. De façon importante, les BG sont interconnectés avec de nombreuses aires corticales et il est aujourd’hui admis que la compréhension du fonctionnement de ces noyaux nécessite l’étude du réseau cortico-ganglion de la base dans son ensemble. Ce projet vise donc à tester l’hypothèse novatrice selon laquelle les ganglions de la base régulent la prise de décision et l’exécution de l’action en fournissant aux structures cérébrales, notamment corticales, responsables du choix de l’action un signal « énergisant » appelé urgence, permettant de choisir et d’agir au moment opportun et à la bonne vitesse. En soutient de cette hypothèse, une incapacité à décider au bon moment ou à agir avec la vitesse appropriée est caractéristique de nombreux troubles neuropsychiatriques et neurologiques basés sur un dysfonctionnement des ganglions de la base, tels que l’impulsivité, les troubles obsessionnels compulsifs ou la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux recevront un entrainement sur une tâche comportementale avec renforcement positif (pastilles sucrées ou recompenses liquides) dans une salle de test (EU 1/2). Lors de cet entrainement, les animaux pourront être amenés à suivre un protocole de controle de la motivation pour les encourager à réaliser les séances comportementales. Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. La durée de l'entrainement et du controle de la motivation associé dépendront de la capacité des animaux à apprendre à réaliser la tâche comportementale, mais n'excède généralement pas un an et demi. Les singes passeront également des IRM (EU 1/2) et des examen de tomodensitométrie (CT-scan) (EU 2/2) sous anesthésie générale. Nombre : 1 IRM & 3 CT par animal. Durée : IRM 1 heure, CT 30 min. Les singes passeront quatre chirurgies - pour l'implantation de dispositifs d'enregistrement neurophysiologique et le retrait de ces dispositifs (EU 1/2). Nombre : Tous les animaux. Durée : de 3 à 6 heures. En cas d'infection suspectée, des prélèvements sanguins seront effectués chez l'animal sous anesthésie afin d'évaluer son état immunologique. En outre, des prélèvements locaux pourraient être réalisés sur un animal vigile maintenu avec la tête fixe, si nécessaire, dans le but de caractériser les souches bactériennes responsables de l'infection et de déterminer le traitement antibiotique approprié. Les singes fourniront des enregistrements intracérébàraux lors des sessions d'enregistrements électrophysiologiques avec renforcement positif (jus de fruit) dans une salle de test (EU 1/2). Nombre : les quatre animaux. Durée des sessions 1–3 heures. 5 jours par semaine. Pour la réalisation de ces enregistrements électrophysiologiques, les animaux seront habitués à un protocole de contrôle hydrique. La durée des enregistrements électrophysiologiques et du controle hydrique associé dépendront de la capacité des animaux à réaliser la tâche comportementale, et à notre capactité à collecter les données neurophysiologiques nécessaires pour répondre aux questions du projet. Nous anticipons une durée n'excédant pas une année et demi.

Impact sur les animaux

Durant la phase d'entraînement à la tâche comportementale, l'application d'un contrôle de la motivation (controle alimentaire ou hydrique) pour motiver les animaux à travailler peut occasionner un certain inconfort. Toutefois, les animaux comprennent rapidement que leur coopération et la réalisation de la tâche leur garantissent l'accès à leur ration journalière complète et des friandises en bonus. Concernant les acquisitions de données IRM ou CT-scan, réalisées sous anesthésie générale, un inconfort lié à l’anesthésie (fatigue, nausées, vomissements) peut survenir au réveil de l'animal mais il s'estompe rapidement. Pour ce qui est des interventions chirurgicales (i.e. l'implantation du plot de fixation de la tête et du dispositif d'enregistrements électrophysiologiques), des douleurs post-opératoires peuvent être présentes. Cependant, une médication appropriée, incluant des analgésiques, des anti-inflammatoires et des antibiotiques si nécessaires, est mise en place en collaboration avec le vétérinaire pour les minimiser.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Remplacement

Il est de nos jours impossible de recueillir les données nécessaires à la réalisation de ce projet à partir d'expériences qui n'impliqueraient pas les animaux, et les primates non humains en particulier. En comparaisons à d’autres espèces animales, les expériences menées chez le singe macaque présentent plus de pertinence pour la compréhension des fonctionnements et disfonctionnement de la cognition et de l’action humaine en raison des capacités cognitives et motrices de cet animal très proches de celles de l’humain, et des similarités structurelles du cerveau entre les deux espèces. Il est donc impossible de répondre à la question du remplacement dans ce projet.

Réduction

Pour des questions de robustesse et de reproductibilité des résultats, chaque question posée doit être abordée en fournissant des données complètes sur plusieurs animaux, selon la pratique habituelle en électrophysiologie sur primate non humain. Ce projet a été planifié afin de maximiser la quantité de données que l’on peut obtenir avec chaque animal et donc minimiser le nombre d'animaux nécessaires à cette étude. Plusieurs types de données seront collectées sur chaque animal : comportementales, psychophysiques, électrophysiologie musculaire et neuronale. De plus, la technique d’enregistrement neurophysiologique employée pour ce projet, technique largement utilisée par de nombreux laboratoires et ayant demontré son efficacité pour caractériser l'activité cérébrale, permettra de collecter de nombreuses données en un minimum de temps, réduisant ainsi le risque de recours à des animaux supplémentaires afin de guarantir la puissance statistique des résultats.

Raffinement

L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est spécialement étudiée pour favoriser le bienêtre animal. L'animalerie dispose de lumière naturelle, de distractions grâce aux vues sur l'activité humaine, de contacts sociaux, d'activités quotidiennes et un espace plus vaste dans lequel les animaux peuvent non seulement bouger mais aussi s'échapper comme ils le feraient dans la nature en cas de tension entre eux. Le contrôle de la motivation des animaux est choisi afin d’avoir le moins d’impact possible sur leur bien-être (mise en place progressive et individualisée du contrôle de la motivation, par contrôle alimentaire en priorité et hydrique en dernier recours). Dans tous les cas, les singes seront incités à coopérer et participer aux manipulations par le biais du renforcement positif. Les enregistrements électrophysiologiques sont conçus pour supprimer les gênes quotidiennes associées à ce type de procédure et les implants chirurgicaux seront fabriqués « sur mesure » pour diminuer les risques de complications post-chirurgicales. La pose de ces implants sera faite sous anesthésie générale et contrôle antidouleur permanent, en condition aseptique stricte. La chaise dans laquelle les singes effectueront la tâche est large et de type « ouverte », conçue pour que la contention soit minimale. Le matériel permettant de mesurer et enregistrer le mouvement des yeux et la taille de la pupille est basé sur l’analyse d’images vidéo et ne constitue donc aucune gêne pour l’animal. Des CT scan seront réalisés une fois que le singe sera implanté avec le dispositif d'enregistrements électrophysiologiques, dans le but de vérifier la position des électrodes en superposant ces images aux clichés d'IRM anatomique de l'animal. Lors des examens d’imageries, l'animal ainsi que ses paramètres physiologiques sont surveillés pendant toute la durée de l’examen. Cette procédure constitue un raffinement majeur, puisqu'elle permet d'éviter des analyses histologiques post-mortem et évite donc la mise à mort des animaux à la fin des procédures. Enfin, les implants chirurgicaux seront retirés à la fin de la procédure et les animaux pourront participer à un autre projet ou gagner un lieu de vie approprié pour leur retraite.

Choix des espèces

Les expériences proposées dans ce projet reposent sur des questions qui peuvent seulement être résolues par des études chez le singe, et ce pour les raisons suivantes : La prise de décision entre actions et un comportement dit « interactif », qui nécessite souvent l’utilisation des bras et des mains guidés la vision pour atteindre et manipuler les objets qui nous entourent. Cette caractéristique exclue de fait le modèle rongeur (animaux se basant principalement sur l’olfaction pour l’exploration, comportement de transport des membres supérieurs et préhension pauvre) ainsi que les animaux plus anciens phylogénétiquement comme modèles préférentiels pour l’étude des bases neuronales de la prise de décision entre mouvements du bras dirigés vers un but. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte (le developpement du cerveau doit être complet).

Tous mis à mort pour une analyse post-mortem de leur cerveau, sept macaques, quatre à longue queue et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de quatre à six heures, parfois refaite sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois, sous contrôle hydrique maintenu de douze à vingt-quatre mois. Le porteur indique que la descente d'électrodes dans le cerveau expose à une infection ou à un accident vasculaire, et que la chirurgie crânienne peut provoquer un œdème cérébral. Il affirme qu'il est "indispensable" d'étudier ces fonctions chez le singe pour extrapoler à l'humain, et retient des animaux de 6 à 12 kg dont la morphologie du crâne est compatible avec l'implant.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.

Impact sur les animaux

1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.