Recherche fondamentale

Opérées du crâne dans les deux premiers jours de leur vie, des souris nouveau-nées reçoivent une greffe de cellules nerveuses assemblées en trois dimensions par lévitation acoustique. 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique que la séparation d'avec la mère peut conduire celle-ci à rejeter définitivement ses petits, et qu'un échec de la greffe peut diminuer la capacité de préhension de la patte avant gauche. L'étude pilote annoncée porte sur 120 animaux au maximum, sans que le reste de l'effectif demandé soit détaillé.

Objectifs

Le cortex cérébral est la partie externe du cerveau et est responsable de fonctions complexes telles que la perception sensorielle, la cognition, la génération de commandes motrices volontaires... Il est composé de six couches distinctes, chacune ayant des types spécifiques de neurones et des connexions uniques. Ces couches jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information en permettant une organisation et une transmission efficaces des signaux neuronaux à travers différentes régions du cerveau. Le cortex cérébral est souvent affecté en cas de traumatisme crânien en raison de sa position superficielle, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. En effet, le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la neurogenèse de nouvelles cellules ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Différentes technologies sont actuellement utilisées pour procéder à la reconstruction 2D ou 3D de tissus complexes à partir de cellules vivantes. Dans le champ des Neurosciences, de nombreux modèles in vitro sont actuellement en cours de développement. Cependant, l’objectif de ce projet n’est pas d'étudier la thérapie cellulaire par transplantation de cellules fœtales, mais plutôt d’évaluer un éventuel intérêt de la lévitation acoustique comme technique innovante pour améliorer cette thérapie. Des recherches récentes ont montré qu'il est possible, en utilisant la lévitation acoustique, de structurer en 3D des couches de neurones intégrées dans des blocs d’hydrogel. Le but de ce projet est donc de tester la capacité des structures neuronales 3D obtenues par lévitation acoustique à favoriser la restauration des différentes voies neuronales après transplantation dans un modèle murin de traumatisme crânien.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l'intérêt de la technique de lévitation acoustique sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de cellules chez le rongeur. Cette technique permet un positionnement extrêmement précis des cellules, ce qui est essentiel pour cibler des zones spécifiques du cerveau avec une grande exactitude. La lévitation acoustique offre une méthode innovante et potentiellement supérieure pour la manipulation précise et douce des cellules destinées à la thérapie cellulaire, améliorant la précision, la viabilité et l'efficacité de ces interventions thérapeutiques. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie chez l'Homme autour la transplantation cellulaire, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions corticales.

Procédures

Sur nouveau-nés anesthésiés : 1 chirurgie craniale pour transplanter des cellules : 1 fois (5 minutes par animal, 312 animaux). Sur animaux vigiles : au maximum une dizaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois par semaine, sur toute la durée du projet, 312 animaux maximum). Sur animaux anesthésiés (avec antalgie) : 1 chirurgie sans réveil pour le prélèvement du cerveau (5 minutes par animal, 312 animaux).

Impact sur les animaux

La séparation des nouveaux nés avec leur mère, le temps de la chirurgie, peut induire un stress modéré transitoire chez la mère et chez les petits. Cette séparation peut également induire un rejet définitif des petits par la mère. Pendant l’induction de la cryoanesthésie, une sensation de froid transitoire est attendue. Après la chirurgie crânienne, l’effet indésirable attendu est une douleur modérée transitoire atténuée par des antalgiques. Si la greffe est un échec, l’effet potentiellement attendu est une légère diminution de la capacité de préhension de la patte avant gauche. L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

La technique d’impression des cellules par lévitation acoustique utilisée dans cette étude aura été testée au préalable in vitro. La différenciation et la survie des cellules seront vérifiées avant de commencer les tests in vivo. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser la complexité du cortex cérébral de mammifère in vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier la reconstruction des noies neuronales.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique. Nous commencerons par réaliser une étude pilote qui consistera à valider les bons paramètres de la technique de lévitation acoustique pour la viabilité du greffon. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6-8 animaux, c’est-à-dire une portée), répétés au maximum 15 fois, soit 120 animaux maximum au total. Si l'étude pilote donne des résultats satisfaisants, une étude comparative utilisant différentes techniques de préparation des neurones à transplanter sera réalisée. Les données de l'étude pilote seront alors exploitées dans cette étude comparative réduisant d'autant le nombre d'animaux utilisés. Si l’étude pilote ne donne pas de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les mères seront conditionnées aux manipulations et aux odeurs 7 jours avant la procédure pour éviter le rejet des nouveaux-nés. Lors de la chirurgie nous aurons recours à une anesthésie générale avec une analgésie. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. Les modèles de lésion/transplantation corticale chez le rongeur sont bien référencés et maitrisés. Les animaux seront utilisés au stade postnatal (jusqu'à 2 jours après la naissance). La réalisation de transplantations cérébrales chez les nouveaux-nés de souris présente plusieurs avantages : -Le cerveau des nouveau-nés est beaucoup plus plastique que celui des adultes, ce qui signifie qu'il est plus capable de réorganiser ses circuits neuronaux et d'intégrer les nouvelles cellules -Les nouveau-nés ont souvent une réponse immunitaire moins développée, ce qui réduit le risque de rejet des cellules transplantées par rapport aux adultes dont le système immunitaire est plus mature et réactif -Les cellules souches transplantées chez les nouveau-nés sont plus susceptibles de se différencier en types de cellules appropriés et de former des connexions fonctionnelles beaucoup plus rapidement

Les 960 souris de ce projet seront toutes tuées, au nom de la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, infectées par le virus respiratoire syncytial ou par une souche de SRAS-CoV-2 adaptée à la souris, inoculée dans le nez sous anesthésie gazeuse. Chacune subit jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant chaque vaccination puis avant l'épreuve virale. Le porteur décrit des symptômes légers à modérés et une perte de poids qui n'excède pas 15 % chez les jeunes souris, et affirme que l'efficacité vaccinale ne peut être évaluée sans administrer l'agent pathogène à un animal vivant.

Objectifs

Les infections virales respiratoires représentent un défi de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Parmi les virus responsables, on trouve notamment le virus respiratoire syncytial (VRS) et le SRAS-CoV-2. La prévention et le contrôle de ces infections virales constituent un enjeu crucial. L’étude des défenses immunitaires a longtemps été limitée aux poumons alors que les voies supérieures dont la muqueuse nasale sont les premiers tissus que rencontrent ces virus comme l'a très bien montré la pandémie de SRAS-CoV-2. Etudier les mécanismes d’infections et de défenses immunitaires dans la cavité nasale est donc indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui permettrons de lutter contre ces virus respiratoires et d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. La plateforme vaccinale à adénovirus émerge comme une stratégie prometteuse pour le développement de vaccins contre les infections virales respiratoires. Cette approche exploite la capacité des adénovirus à délivrer des antigènes viraux ciblés dans les cellules hôtes. De plus, l'administration nasale de vaccins à adénovirus vise directement les voies respiratoires, stimulant ainsi les réponses immunitaires locales et conduisant potentiellement à la protection contre ces maladies tout en limitant la transmission des virus. Le présent projet a pour objectifs principaux (i) l’étude de la physiopathologie de l’infection à SRAS-CoV-2 et à VRS au niveau de la cavité nasale chez la souris et (ii) l’évaluation d’approches vaccinales adaptées à l’administration par voie nasale.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et à VRS, et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre les infections respiratoires. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer les approches vaccinales à l’aide d’adénovirus et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans les infections virales respiratoires

Procédures

L’inoculation de la souche virale ou du vaccin est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Le vaccin est administré par injection intramusculaire à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié (isoflurane) avec ajout d’un collyre anesthésique.

Impact sur les animaux

L’infection de souris (> 5 mois) par le VRS ou la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne des symptômes légers ou modérés.L’infection par le VRS induit très peu de symptômes chez la souris (perte de poids très rare n’excédant jamais plus de 10%, pas de détresse respiratoire ni de changement de température corporelle, bonne apparence du pelage ni changement de comportement visible). L’infection de souris jeunes par la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne une perte de poids modeste, n’excédant pas 15% du poids initial. Le phénotype des lignées transgéniques Muc5b n'est pas dommageable avant l'âge de 6 mois car un problème de clairance mucociliaire peut se développer avec le temps aboutissant à un stress respiratoire. Cependant, les souris seront utilisées avant ce stade.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition à l’agent pathogène de groupe III utilisé dans ce projet.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre de souris par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les souris seront anesthésiées sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus ou du vaccin. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue après l’administration des souches virales (mesure du poids quotidien et détection des points limites) afin de déceler rapidement une détresse de l'animal nécessitant une fin de protocole précoce. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris est sensible à l’infection par les souches murinisées du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. La souris est le modèle rongeur pour les infections par le VRS, elle développe une infection productive et cette espéce permet d’utiliser des lignées transgéniques nécessaires à la réalisation du projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 2 et 5 mois d’âge. Ces souris ont un système immunitaire mature et sont sensibles à l’infection par une souche adaptée à la souris tout en présentant des symptômes modérés.

Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.

Procédures

Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.

Impact sur les animaux

Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.

Raffinement

Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.

Choix des espèces

La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.

Pour montrer qu'un implant posé sur les bulbes olfactifs peut restaurer des sensations d'odeur, 20 brebis vont être rendues anosmiques puis utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Dix subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt sessions d'apprentissage associant une odeur à une récompense sur quatre à huit semaines, avant une chirurgie de deux heures puis deux autres d'une heure. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif, annonce des douleurs post-opératoires, des saignements de nez et des fuites de liquide céphalo-rachidien possibles, et prévoit de tuer les brebis dont les complications seraient sévères.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4). 10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2).• 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection,. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Une partie des souris viendra d'autres protocoles de l'animalerie, où elles étaient déjà vouées à la mise à mort. 336 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ trente minutes pendant laquelle des particules chargées de médicaments et libérables par la lumière sont injectées dans une zone précise du cerveau, puis elle est suivie jusqu'à 28 jours avant d'être tuée. Le porteur affirme que la biocompatibilité de ces particules "ne peut être vérifiée que chez l'animal entier", tout en indiquant n'avoir jamais observé d'effet indésirable sur le comportement ou le tissu cérébral en plusieurs années.

Objectifs

Le projet de recherche dans lequel s'insère le présent projet consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de molécules dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif à long terme de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour plusieurs maladies du cerveau. De nombreuses étapes du projet sont réalisées sans le recours à l'expérimentation animale, en vue de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cependant, la validation de la sécurité biologique de notre technologie nécessite l'utilisation de souris, d'où la présente demande.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, la mise au point de cette technologie permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales de type stéréotaxique (à l'aide d'un atlas anatomique), visant à injecter des médicaments encapsulés dans des zones précises du cerveau. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies à réaliser présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.

Devenir

Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier la biocompatibilité des médicaments encapsulés injectés dans le tissu nerveux, jusqu'à 28 jours après injection. L'issue de la procédure est la mise à mort de l'animal.

Remplacement

Le projet scientifique dans lequel s'insère ce projet prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences du projet ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser les propriétés des particules développées pour le projet, sans avoir recours à l'expérimentation animale. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. A chaque fois que ce sera possible, nous utiliserons pour nos expériences des animaux déjà présents à l'animalerie, issus d'un autre protocole, et qui ne peuvent plus être utilisés différemment (donc destinés à l'euthanasie). Par ailleurs, des expériences de biocompatiblité ont déjà été réalisées avec un suivi longitudinal, chez des animaux suivis pendant une longue période avec de l'imagerie in vivo. Même si cette approche apporte des réponses essentielles, elle n'est pas suffisante pour quantifier avec précision le devenir des particules dans le cerveau, d'où la nécessité du présent projet.

Raffinement

Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les animaux, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les souris seront hébergées par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage. Dans le cas d'un score préoccupant (>9), l'animal sera euthanasié dans les 48h au plus tard si son état ne s'améliore pas malgré les soins délivrés.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, elles peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les outils utilisés (anticorps, microscopes etc.) sont les plus développés (et donc les plus efficients) pour la souris. En outre, nous sommes dans une démarche de ré-utilisation d'animaux déjà présents à l'animalerie pour nos expériences, or l'animal le plus présent dans notre animalerie est de loin la souris (pas de rats ou d'autres animaux actuellement pour notre laboratoire). Nous utiliserons des animaux adultes, car les chirurgies stéréotaxiques sont plus faciles à réaliser chez des animaux déjà adultes. Ainsi, nous utiliserons les animaux entre 8 semaines et 8 mois d'âge.