Recherche fondamentale

Anesthésiés, entaillés au dos pour y créer une plaie en dix minutes environ, puis traités par injections intradermiques selon trois calendriers différents, 60 rats passent ensuite trois semaines seuls en cage pour éviter qu'ils ne s'arrachent les pansements. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le projet sert à choisir le rythme d'administration d'un traitement régénératif pour les études d'efficacité qui suivront, chez le rat sain puis chez le rat diabétique. À la fin des trois semaines, le sang est prélevé dans le cœur sous anesthésie profonde, puis les 60 rats sont tués pour prélever la peau et un ensemble d'organes.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de cette étude préliminaire est d’évaluer in vivo chez le rat le schéma de traitement optimal d’un nouveau traitement régénératif sur la cicatrisation de plaies cutanées. Des études in vitro sur des modèles cellulaires, cultures de fibroblastes et de kératinocytes, ont permis de démontrer une activité hyperproliférative cellulaire laissant envisager une régénération accélérée et donc une cicatrisation plus rapide de plaies cutanées, ainsi qu’une activité anti-inflammatoire associée. Ce projet constituera la toute première évaluation in vivo sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ce nouveau traitement régénératif, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués selon 3 schémas de traitement différents afin de déterminer le schéma de traitement optimal pour les études d’efficacité qui seront menées à la suite chez le rat sain puis chez le rat diabétique, avec différentes doses de ce nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif. A l’issue des 3 semaines de l’étude, des dosages hématologiques et biochimiques seront effectués sur un prélèvement de sang effectué en intracardiaque après placement des animaux sous anesthésie générale gazeuse, suivi après leur euthanasie du prélèvement de peau au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’organes pour la réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner le schéma de traitement du nouveau traitement régénératif montrant la meilleure efficacité sur la cicatrisation pour en poursuivre son développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. Les traitements par injections intradermiques, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, engendreront une douleur très localisée au niveau de chaque site d’injection. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 3 semaines, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Procédures

Les 60 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées suivant 3 schémas de traitement différents : 1 seule fois, 1 fois par semaine ou 2 fois par semaine après induction de la plaie cutanée, sous anesthésie générale, en 8 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements seront effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, et engendreront une douleur très localisée et transitoire. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes ouvertes, permettant à chaque rat de voir, sentir et entendre au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 60 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat mâle ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des briques en bois et un tunnel en carton de large diamètre seront placés dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité avec différentes doses du nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif, chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats mâles utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.

Objectifs

La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.

Procédures

Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.

1 995 souris vont être infectées par le nez avec un virus de la grippe H1N1, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection leur fait perdre en moyenne 20 % de leur poids entre le septième et le dixième jour, selon le porteur. 135 subissent une seconde infection par une autre souche, 1 755 une injection intraveineuse d'anticorps, 435 trois gavages, 1 575 deux prises de sang, et 180 des injections dans le tibia ou la trachée. Le porteur conclut que "les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux".

Objectifs

À travers l'histoire, l'humanité a été confrontée à plusieurs reprises à des épidémies de virus respiratoires qui se sont propagés rapidement dans le monde entier avant que nous ayons pu développer des vaccins efficaces. Par exemple, la grippe H1N1 a provoqué la mort de 50 millions de personnes lors de la pandémie de grippe espagnole en 1918, et le SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, a déjà causé au moins 7 millions de décès. Ces virus déclenchent des réponses immunitaires importantes dans notre corps, notamment la production d'anticorps comme les IgM, IgG et IgA. Ces derniers, en particulier, sont essentiels pour protéger nos voies respiratoires en neutralisant les virus et en les empêchant de s'attacher aux cellules pulmonaires. Cependant, malgré l'efficacité des vaccins actuels, ils ne parviennent pas à générer des niveaux suffisants d'IgA dans les voies respiratoires. Comprendre comment les cellules produisant des IgA agissent pendant une infection respiratoire est donc crucial. Ce projet se concentre sur cette question, en explorant comment les cellules B qui fabriquent des IgA sont recrutées et quel impact cela a sur notre réponse immunitaire. En utilisant le virus de la grippe H1N1 comme modèle d'infection, et en travaillant avec des souris génétiquement modifiées, les chercheurs cherchent à mieux comprendre comment les cellules IgA influencent notre immunité. Cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches de vaccination contre les maladies respiratoires.

Bénéfices attendus

Même si les IgA sont super efficaces pour protéger nos poumons contre les virus, les vaccins contre la grippe et le SARS-CoV-2 ne stimulent pas assez la production d'IgA dans nos voies respiratoires. C'est pourquoi il est crucial de comprendre comment les cellules qui fabriquent ces IgA agissent pendant une infection respiratoire. Dans ce projet, nous allons nous appuyer sur des découvertes récentes de mon équipe qui montrent que ces cellules sont dirigées vers un type spécifique de cellules immunitaires quand il y a une infection. On va développer des techniques sophistiquées pour comprendre comment les IgA influencent le comportement des cellules immunitaires, comme s'ils leur donnaient des instructions spéciales pour mieux combattre les infections. En comprenant mieux cela, on pourrait améliorer nos stratégies pour développer des vaccins plus efficaces.

Procédures

1) Infection intranasale primaire avec le virus de la grippe souche H1N1 : 1995 souris (1 fois - 1 heure). 2) Infection intranasale secondaire avec le virus de la grippe souche H3N2 : 135 souris (1 fois - 1 heure). 3) Injection par voie intraveineuse d'anticorps avant la mise a mort: 1755 souris (1 fois - 5 minutes). 4) Gavage oral d'un produit chimique pour induire la suppression de gènes dans de l'huile de maïs : 435 souris (3 doses - 20 seconds/dose). 5) Marquage des oreilles: 750 souris (10 seconds). 6) Prelevement sanguin: 1575 souris (2 fois - 20 seconds/fois). 7) Injection intratibiale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 1 heure). 8) Injection intratracheale d'un produit chimique: 90 souris (1 fois - 10 minutes). 9) Injection intratracheale des anticorps: 105 souris (1 fois - 10 minutes).

Impact sur les animaux

1) L'infection intranasale par le virus de la grippe induit une perte d'appétit transitoire et une perte de poids moyenne de 20 % entre les 7e et 10e jours de l'infection. 2) Le gavage des animaux s'il est mal fait peut provoquer de la souffrance de l’animal. 3) La petite perforation de l'oreille pour le génotypage peut stresser l'animal. 4) Le prélèvement sanguin chez les animaux, s'il est mal réalisé, peut entraîner des saignements excessifs. 5) Complications de l'injection dans la veine caudale et le dispositif de contention pour l'injection qui peut stresser les souris. 6) L'instillation intratrachéale, si mal réalisée, peut entraîner des problèmes respiratoires chez la souris. 7) L'injection intratibiale peut entraîner une réduction de la motilité chez la souris et causer une certaine douleur pendant la journée de l'injection.

Devenir

Les animaux seront mis a mort a la fin de chaque experience. Nous prélèverons les organes (poumons, rate et ganglions lymphatiques) pour la cytométrie de flux, une technologie qui permet d'analyser rapidement des cellules lorsqu'elles passent devant plusieurs lasers, et la microscopie de cellules productrices d'anticorps.

Remplacement

La recherche sur les animaux est effectuée lorsqu'aucune autre approche ne permet d'obtenir les avantages scientifiques escomptés. Dans cette étude, nous analyserons le positionnement spatial de cellules B mémoires spécifiques dans la muqueuse pulmonaire apres l'exposition au virus de la grippe. Malheureusement, cet objectif ne peut être atteint autrement qu'en utilisant un modèle in vivo. En raison de la nature et de la complexité des interactions cellulaires au cours des réponses immunitaires, les expériences basées sur un organisme modèle sont inévitables pour développer nos connaissances sur les réponses des cellules B pulmonaires et ne peuvent pas être imitées par des modèles in vitro ou in silico. Nous utiliserons des souches de souris génétiquement modifiées, en raison des similitudes entre la physiologie de la souris et celle de l'homme et de la large gamme de réactifs immunologiques disponibles chez cette espèce. Les résultats escomptés permettront non seulement d'accroître les connaissances médicales, mais aussi de fournir des indications médicales pour le développement de vaccins contre le virus de la grippe. Par conséquent, les avantages potentiels de ce projet à des fins médicales humaines justifient, d'un point de vue éthique, la réalisation d'expériences sur des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, nous réduirons le nombre d'animaux au minimum nécessaire. Nous utiliserons des tests statistiques lors de la planification des expériences afin de nous assurer que le nombre minimum d'animaux est utilisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour calculer la taille de l'échantillon requis, nous utilisons des logiciels, en tenant compte des considérations suivantes: a) puissance du test: 0,8; b) différence de rapport (taille de l'effet) à détecter / SD = 1; c) α = 0,05. d) test t bilatéral. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des T-tests non appariés et One-way anova. Nous allons utiliser les mêmes souris pour les expériences d'imagerie et de cytométrie de flux pour réduire le nombre de souris nécessaires au projet.

Raffinement

L'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et préalablement caractérisés est une bonne approche pour affiner les études sur les animaux, car elle évite l'utilisation de médicaments pour bloquer un processus biologique qui pourrait avoir des conséquences inattendues. Les souris seront hébergées dans des cages appropriées. La nourriture et l’eau seront à volonté. Des dômes et du papier absorbant seront misà disposition dans chaque cage pour enrichir le milieu. Nous pourrons fournir également des aliments semi-solides aux animaux au cours de traitment si necessaire. Nous surveillons les souris après chaque intervention pour nous assurer qu'elles retrouvent leur comportement normal après chaque intervention. Après une infection intranasale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du poids (environ 14 jours). Après injection intra-tibiale : surveillance jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie (1 heure) et une fois par jour jusqu'à la reprise totale du mobilité. Après instillation intratrachéale : 30 minutes. Après gavage oral : 30 minutes. Après injection intraveineuse : 10 minutes. Après un perçage d'oreille : 1 minute. Nous avons mis en place de points limites pour chaque precedure.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle d’étude des maladies infectieuses pulmonaires car l’obtention d’animaux génétiquement modifiés est bien contrôlée et les modèles expérimentaux bien calibrés. Or ces modèles sont les seuls permettant de tester la contribution génétique de modifications de certains gènes de susceptibilité au développement de ces pathologies. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 8 à 14 semaines seront utilisées.

Tester des molécules antiépileptiques pour le compte de clients suppose une lignée de rats sélectionnés de génération en génération pour faire des crises d'absence. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers d'entre eux subit une neurochirurgie d'une heure doublée d'une chirurgie abdominale pour la pose de capteurs, puis des enregistrements cérébraux de deux à quatre heures une à deux fois par semaine, des injections pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant 28 jours, et un hébergement en cage individuelle après l'implantation. Le porteur chiffre les effectifs d'après "l'activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années", l'utilisation réelle dépendant de "la demande".

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantesdans le monde. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, une forme généralisée d’épilepsie sera étudiée : l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requière tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes. Puis ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif ; Une étude pharmacologique sur ce modèle a montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients ainsi qu’une aggravation des crises chez le rat avec les mêmes antiépileptiques. Ce modèle, au cours des années, est devenu un modèle de référence pour évaluer les effets soignants et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Le but de se projet est d'identifier les nouvelles molécules pouvant soigner l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l'épilepsie et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Procédures

Environ 1/3 des animaux de ce projet vont subir : - une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. - une chirurgie abdominale (en simultané avec la neurochirugie) pour le placement de capteur - la pose de dispositif sous cutané sous anesthésie générale (1/4 heure) - des enregistrements une à deux fois par semaine pendant 2 à 4 heures. - Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. - des prélèvements sanguins pourront être faits.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Pour se faire la mise à mort des animaux en fin de chaque porcédure est nécessaire

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle vise à étudier des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, les animaux sont traités en plan d'étude croisé (tous les animaux reçoivent toutes les molécules avec à chaque fois une vérification de l’EEG avant une nouvelle administration - chaque animal est son propre contrôle). Chaque animal possède deux voies d’enregistrements permettant ainsi de réaliser les enregistrements même si un canal d’enregistrement devient inexploitable. Pour la procédure 1, nous pouvons l’estimer à 60 lots sur 5 ans (1 lot par mois). Un maximum de 14 rats par lot est prévu. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 120 lots (2x60) de 20 rats sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisé. Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’etude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 2400 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection d’analgésique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 heures après la première injection (0.05 mg/kg, i.p). Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements (= cours de récréation). Les animaux sont rassemblés dans une enceinte fermée avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. La lignée de rats utilisée a été développée en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et cérébrale que l’humain. Les activités neurologiques, visibles lors des enregistrements cérébraux ont des similitudes avec ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fasse sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises apparaissent à partir de l’âge de 30 jours post-natal et sont stables et bien établies à partir de 2 mois d’âge.

Une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, un jeûne de 24 heures, 48 heures d'hébergement individuel, puis deux séries de tests comportementaux sur deux semaines pour mesurer des troubles moteurs, cognitifs et anxieux. 318 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle porte une modification de la protéine Huntingtine, et le porteur annonce qu'il ne devrait provoquer ni point limite ni mort prématurée, tout en prévoyant la mise à mort de tout animal perdant plus de 20 % de son poids. Une chirurgie terminale clôt le parcours, le temps de prélever le cerveau et d'autres organes conservés pour des expériences ultérieures.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, un nouveau modèle a été développé afin de pouvoir étudier une modification de la protéine Huntingtine. Cette modification contribue au phénomène de neurodégénérescence et à la mortalité des neurones dans la maladie de Huntington. L'objectif de ce projet est de comprendre pourquoi et par quels moyens cette modification est toxique.

Bénéfices attendus

La technique utilisée dans ce nouveau modèle pour recréer cette modification de la protéine Huntingtine a déjà été validée sur des cellules en culture. Les résultats prometteurs obtenus sur des cellules en culture doivent désormais être testés et adaptés dans une étude animale. Ce projet a pour but de comprendre ce mécanisme de modification de la protéine Huntingtine et permettra à terme de développer des thérapies afin de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes chez les patients atteints par la maladie de Huntington.

Procédures

Au cours de leur vie, les animaux recevront une injection rétro-orbitale sous anesthésie (durée de l'injection = 30 secondes) puis effectueront au maximum deux séries de tests comportementaux pendant une durée maximale de deux semaines. L'objectif de ces tests comportementaux est de comprendre comment la modification de la protéine Huntingtine engendre des problèmes moteurs, cognitif et anxieux. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie sera pratiquée pour le prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Selon la littérature et des résultats préliminaires, la modification génétique du modèle murin utilisé dans ce projet ne devrait pas entraîner l'apparition de points limites ni de mort prématurée. Cependant, plusieurs effets indésirables peuvent être identifiés : 1) un stress léger lors de la manipulation des animaux afin de les anesthésier une seule fois pendant 5 minutes et de leur administrer un composé permettant de modifier la protéine Huntingtine (durée de l'administration = 30 secondes); 2) un stress modéré lors de la mise à jeun de 24h et 3) un stress modéré lors de l'hébergement individuel des animaux pendant une durée de 48h.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d'obtenir des résultats statistiquement analysables et interprétables. Des résultats sur cellules en culture ont déjà validé ce modèle ce qui a permis de réduire le nombre d'animaux testés dans ce projet. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de l'étude, plusieurs organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal et aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé conformément à la réglementation par l’apparition de stress/douleur selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, arrêt du toilettage). De plus, bien que la procédure soit peu invasive et très rapide (5min), des points limites suffisamment précoces et spécifiquement adaptés à ce projet tels qu'une perte de poids supérieure à 20%, un gonflement de l'oeil suite à l'injection ou tout autres signes de traumatisme seront mis en place. En présence de l'un de ces points limites, nous appliquerons une procédure d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Le modèle murin utilisé ici permet de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptômes neurodégénératifs se développant dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme, les tests comportementaux seront réalisés entre 4 et 7 mois une fois que le réseau neuronal des animaux est mature.