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Validation des paramètres expérimentaux d’irradiation pour la mise en place d’un modèle murin de toxicité rétinienne radio-induite 1/3
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Avant de créer un modèle de rétinopathie provoquée par les rayons, il faut régler les machines : 341 souris vont être utilisées pour caler le ciblage et la dose reçue par l'œil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une irradiation des deux yeux, puis est tué au plus tard une semaine après, après un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate, alors que la pathologie visée conduit chez les patients à une baisse de la vision et parfois à la cécité. Le suivi clinique est annoncé tous les trois jours au maximum, de quoi repérer l'apparition de points limites.
Objectifs
Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.
Procédures
Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.
Remplacement
Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.
Réduction
L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.
Rôles des peptides d’élastine sur les mécanismes de recrutement des cellules lymphoides innées dans l’inflammation pulmonaire de type 2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une ou deux injections dans l'abdomen, puis une goutte du même produit déposée dans le nez dix jours plus tard : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. L'inflammation pulmonaire ainsi déclenchée peut s'accompagner de difficultés respiratoires. Le projet cherche à comprendre comment certaines cellules immunitaires pénètrent dans les poumons, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Sur la réduction, le porteur écrit avoir calculé le nombre d'animaux "au plus juste", sans donner ni méthode ni effectif par groupe.
Objectifs
Les pathologies inflammatoires pulmonaires ont pour caractéristique commune une inflammation pulmonaire qui perturbe les échanges gazeux lors de la respiration.Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituer une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet a pour but d'étudier la façon dont certaines de ces cellules immunitaires (les cellules lymphoïdes innées) pénètrent dans les poumons.
Bénéfices attendus
A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur la façon les cellules du système immunitaire infiltrent les poumons. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer comment l'infiltration des cellules lymphoïdes innées participe aux maladies inflammatoires respiratoires. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans ces pathologies.
Procédures
Les souris subiront, selon la procédure, soit une soit deux injections dans l'abdomen des produits les sensibilisant. 10 jours après les souris devront absorber par le nez une goutte des mêmes produits.
Impact sur les animaux
L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. Le développement de l'inflammation pulmonaire pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.
Remplacement
Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.
Raffinement
La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.
Choix des espèces
Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats.
Etude du potentiel des nanoémulsions chargées de cryptophane pour la vectorisation du xénon hyperpolarisé en IRM.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
426 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 406 reçoivent une injection de nanoémulsions, 358 subissent des prises de sang étalées jusqu'à six mois, 252 une perfusion intracardiaque, et 68 passent en imagerie par résonance magnétique pour des séances de vingt à soixante minutes. Le projet vise à valider un agent de contraste au xénon destiné à détecter l'inflammation cérébrale, le diagnostic clinique restant annoncé comme une perspective. Le porteur affirme que ces procédures ne peuvent pas être remplacées par des méthodes n'impliquant pas d'animaux vivants et "susceptibles d'apporter le même niveau d'information".
Objectifs
L'inflammation joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de nombreuses maladies cérébrales, tels que les accidents vasculaires cérébraux (AVC), la maladie d'Alzheimer, ou la sclérose en plaques. Différentes techniques sont utilisées dans le but de détecter l'inflammation. Parmi ces techniques on trouve l'imagerie par résonance magnétique (IRM), une technique d'imagerie clinique puissante grâce à une résolution spatiale potentiellement élevée, un faible caractère invasif et un excellent contraste tissulaire. Cependant elle souffre d'une faible sensibilité. Afin de remédier à ces contraintes, l’utilisation de plusieurs types d’agent de contraste (AC) ont été proposés. Le xénon hyperpolarisé (Xe-HP) apparaît ces dernières années comme un agent de contraste prometteur. L'utilisation du Xe-HP en IRM présente plusieurs avantages grâce à son hyperpolarisation : son signal peut être amélioré jusqu'à cinq ordres de grandeur, et donc détectable à de très faibles concentrations. Le xénon est un gaz inerte et non toxique soluble dans les solutions organiques, aqueuses et les fluides biologiques comme le plasma sanguin. Cependant, comme ce gaz n'est pas spécifique, il doit être vectorisé pour atteindre sélectivement une autre cible biologique. Dans ce sens, le cryptophane A et ses dérivés ont été largement utilisés comme hôtes moléculaires pour concevoir un biocapteur à base de xénon. Néanmoins, ces molécules organiques ne sont pas optimales pour les applications biologiques surtout que leur solubilité dans l'eau a été rapportée comme étant basse, et que les dérivés de cryptophane A forment des agrégats dans l'eau à de faibles concentrations. Par conséquent, des nanoassemblages de cryptophanes ont été décrits afin à la fois de bien contrôler le comportement du cryptophane in vivo et d'améliorer sa concentration locale. Nous avons donc utilisés et testés des nanoémulsions chargées de cryptophane in vitro pour optimiser l’application de l’IRM du xénon dans le diagnostic de maladies inflammatoires. Ainsi, l’objectif principal de ce projet sera d’évaluer la capacité des nanoémulsions chargées en cryptophanes, utilisées en association avec du Xe-HP in vivo, à servir d’outil diagnostic IRM, et de breveter l’outil issu de cette évaluation pour un transfert vers l’industriel.
Bénéfices attendus
Ce projet qui vise à transformer les avancées scientifiques fondamentales en produits /services utiles au monde socio-économique. On s’attend donc à valider nos nanoémulsions chargées de cryptophane comme un outil innovant de l’IRM du Xénon. Ceci permettra de les utiliser en toute sécurité pour le diagnostic clinique de diverses maladies tel que les maladies inflammatoires.
Procédures
IInjections vigiles des nanoémulsions (NE) ou du chlorure de sodium (NaCl 0.9%) (Jour 0 (J0) ; Durée : 1min/injection ; n=406) Prélèvements de sang (premier jour après l’injection J1, premier mois M1, troisième mois M3, sixième mois M6 ; Durée : 1min/prélèvements ; n=358 Imagerie IVIS® (Spectrum in vivo imaging system) (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1, M6 ; Durée : 5min/session ; n=252) Perfusion intracardiaque (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1 ; n=252) Imagerie par Résonance Magnétique (IRM ; Durée : 20-60min/Session ; n=68)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient du stress léger lié à la manipulation pour l’ensemble des procédures. Une hypothermie Modérée lors des phases d’anesthésies.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus nécessaires pour des analyses cytologiques et histologiques
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies de diagnostic chez l'animal. Les principaux tests réalisés in vitro sont des tests de viabilité cellulaire au WST-1 (Water-Soluble Tetrazolium-1) évalués à 1h, 24h, 48h et 72h d’incubation avec des nanoémulsions chargées ou non de cryptophane. Les résultats ne montrent aucune mortalité cellulaire associée. Une évaluation de la stabilité métabolique (microsomes et plasma) des cryptophanes a été aussi effectuée. Le cryptophane montre une bonne stabilité plasmatique (t1/2> 6h) et est dégradé au niveau des microsomes hépatiques de souris. Ces résultats semblent indiquer que si le cryptophane était relargué dans la circulation sanguine, il serait néanmoins métabolisé.des tests in vivo sont nécessaires pour confirmer ces résultats. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’imagerie et de l’inflammation ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal.
Réduction
Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assuré d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées et la littérature. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et surtout des données disponibles dans la littérature (des expérimentations qui ont été appliquées avec des procédures et des buts similaires à ce qui est dans notre projet ). Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues). L’ensemble des échantillons prélevés lors des procédures pourra être partagé et utilisé, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons la litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les souris seront pesées et acclimatées pendant une semaine dans le laboratoire avant le debut de protocoles. Une fois entrés en protocole, les animaux de la première procédure seront pesés tous les trois jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7. Toutes injections auront lieu en intraveineuse en vigile avec une application d’un antalgique local en spray pour minimiser la douleur. Pour toutes les imageries in vivo, Les animaux seront sous anesthésie générale induite par isoflurane. Pendant l’imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie générale avec un masque en respiration spontanée et ils seront thermo-régulés. Après toute anesthésie, Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage dans des enceintes chauffées où leur réveil spontané se fera sous surveillance régulière de l’expérimentateur. Ils seront ensuite pris en charge par l’équipe animalière.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues (notamment en imagerie par IRM) et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la molécule soluble CSF1R-Fc dans des modèles murins de xénogreffe de cellules tumorales de mélanome.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
178 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant sous la peau une greffe de cellules de mélanome mesurée au pied à coulisse deux à trois fois par semaine. Une fois la tumeur passée 50 mm3, les injections de traitement se succèdent tous les deux jours, avec une séance de bioluminescence hebdomadaire sous anesthésie. La molécule testée bloque un récepteur immunitaire, dans l'espoir déclaré d'un transfert vers la clinique pour les patients en échec thérapeutique. Le projet déclare un niveau de souffrance léger, tout en indiquant qu'une tumeur à un stade avancé peut gêner les déplacements des animaux.
Objectifs
Des études ont montré que les patients atteints de mélanome malin avancé présentaient des concentrations sériques élévées de la protéine CSF1, et une corrélation de cette expression avec la progression de la maladie. L'analyse de biopsies de mélanomes primaires et métastatiques ont révélé une corrélation de l’expression de cette protéine CSF1 et de son récepteur avec l'abondance de lymphocytes T spécifiques de la tumeur. Des études in vitro ont également montré que les lymphocytes T spécifiques de la tumeur, induisaient après activation, la sécrétion de CSF1 par divers types de cellules du microenvironnement tumoral. Enfin, des études précliniques ont montré que le blocage du récepteur du CSF1 combiné au blocage d'un point de controle immunitaire retardaient la croissance tumorale dans certains modèles de cancer de souris, dont le mélanome. L’ensemble de ces données suggère que l'induction de la protéine CSF1 dans le mélanome représente un mécanisme de résistance adaptatif conservé déclenché par des lymphocytes T activés, qui est corrélé à la progression de la maladie. L’objectif de cette étude est donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique d'une molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur dans deux modèles de mélanomes, réfractaires à d'autres thérapies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont dans un premier temps la mise en place d’un modèle de mélanome le plus représentatif de la pathologie et de la problématique thérapeutique qui permettra l’évaluation thérapeutique de notre molécule bloquant le CSF1R mais qui pourra également par la suite servir à tester d’autres stratégies en développement dans notre équipe ou par des collaborateurs. L’étude de l’efficacité de notre molécule soluble bloquant le CSF1 Récepteur nous permettra dans un premier temps de l’optimiser en fonction des résultats obtenus puis dans un second temps d’envisager un transfert vers la clinique afin de proposer un nouveau traitement au patients atteints de mélanome, particulièrement ceux en échec thérapeutique.
Procédures
Injection des cellules tumorales en sous-cutané (15 minutes par souris, animaux anesthésiés). Suivi de la croissance tumorale 2-3 fois par semaine par mesure avec un pied à coulisses et prise de poids (animaux anesthésiés). Injection des traitements tous les 2 jours lorsque la tumeur est >50mm3 (animaux vigiles). Suivi de la croissance tumorale par mesure bioluminescence 1 fois par semaine (animaux anesthésiés).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont principalement liés à l’implantation de la tumeur. L’implantation de la tumeur, bien que réalisée sous anesthésie et analgésie, peut conduire à une douleur légère et de courte durée aux animaux. Une fois la tumeur développée à un stade avancé il est possible qu’elle provoque une gêne aux déplacements des animaux mais sans conséquence sur leur alimentation …. Les points limites de l’expérience seront bien sûr adaptés dans le cas, peu probable, où le développement de la tumeur induirait un changement important du comportement lié à la douleur ou autre. De plus, la réalisation du traitement nécessitera de multiples injections qui peuvent également induire une douleur légère et éphémère ainsi qu’un stress.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à l'atteinte de points limites. Des prélèvements sanguins et post-mortem (tumeur, rate) seront effectués sur l'ensemble des animaux afin de réaliser une analyse comparative entre les groupes, et ainsi évaluer les effets de notre molécule sur les réponses anti-tumorales intervenant dans ce modèle.
Remplacement
La nature de cette étude ne permet pas de s’affranchir de l’utilisation d’animaux ; le même niveau d’information ne pouvant être apporté par des études in vitro ou in silico, étant donné la complexité de la réponse immune. Toutefois, l’utilisation d’animaux démarrera seulement une fois que notre molécule sera parfaitement caractérisée et son efficacité validée in vitro dans plusieurs modèles en 2D de mélanome.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étape sera réalisée successivement et les modèles/protocoles les plus pertinents seront finement sélectionnés à chaque étape. Chaque protocole sera réalisé dans un premier temps sur un petit nombre d’animaux avec le nombre minimum de groupe. Si la stratégie fonctionne, elle sera alors reproduite pour confirmer les résultats et le cas échéant des groupes contrôles seront ajoutés et le nombre d'animaux augmenté à 10 animaux final par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser des tests statistiques pour évaluer la survie des animaux. D’autres tests statistiques seront également réalisés sur les données de mesure au pied à coulisse, de bioluminescence ainsi que les analyses sur organes en fin de protocole, afin d’exploiter au maximum les résultats obtenus.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum le stress des animaux, les souris sont maintenues en groupe sociaux, dans un environnement enrichi (frisottis + tunnels) et observées quotidiennement afin d’identifier tout changement de comportement lié au stress ou à la douleur et sacrifiées en cas de souffrance. L’implantation des cellules tumorales et le suivi des animaux par bioluminescence seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie locale. Les points limites seront définis sur de nombreux critères incluant le poids et le comportement des animaux en plus de la taille/aspect de la tumeur et résumé dans un tableau pour obtenir la définition des poids limites la plus précise possible et éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer le bénéfice de nouvelles stratégies antitumorales, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement,...). Ce projet sera réalisé sur des souris immunocompétentes afin de pouvoir analyser le système immunitaire infiltrant la tumeur. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8-12 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant les gestes liés aux greffes de cellules tumorales, à la réalisation du traitement et renforçant également la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la neuropathie chimioinduite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues douloureuses par administration répétée d'un anticancéreux, les souris de ce projet portent une neuropathie chimio-induite depuis la mise en place du modèle jusqu'à leur mort, soit deux semaines. Elles sont 552, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur est mesurée par application d'un filament sur la patte, 64 animaux subissant en plus l'immersion de la patte dans un bain thermostaté et 16 une chirurgie de trente minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie cette douleur de modérée, quand le projet déclare l'ensemble des 552 souris en souffrance sévère. Toutes seront tuées, la souffrance de l'animal ne pouvant pas être supprimée selon le porteur.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif, qui représente environ 17% des cancers du sein, a un pronostic très défavorable. Plus de 50% des patientes recevant une chimiothérapie développent des douleurs dites douleurs neuropathies induites par la chimiothérapie. De telles douleurs imposent des réductions de dose et des interruptions de traitement qui affectent inévitablement la survie. Il a été montré qu'un composé modulant le récepteur GPER (pour "G protein-coupled estrogen receptor") était doté d'une action anticancéreuse sur des cancers triple négatif chez la souris. Plus récemment, il a été montré chez l’animal que ce composé exerçait une action antalgique et anti-inflammatoire. Cela suggère qu'il serait possible de contrôler en même temps et chez un même sujet la croissance tumorale et la douleur en ciblant ce récepteur GPER. Ce projet s’intègre dans une collaboration avec une équipe de chimiste qui réalise la synthèse et la sélection de molécules modulatrices du GPER. Les meilleurs composés sont testés in vitro sur la croissance tumorale. Ainsi, nous souhaitons, chez des souris, évaluer l’action des meilleurs molécules précédemment identifiées sur la douleur neuropathique induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant non seulement de lutter contre la progression du cancer mais aussi les douleurs neuropathiques induite par la chimiothérapie. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, diffusion sanguine et système immunitaire. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
L’ensemble des animaux (552 souris) subiront des injections pour administrer l’anticancéreux et des composés à tester. Une injection dure quelques secondes sur animal vigil. L’évaluation de la douleur sera réalisée par l’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal. La douleur chez certains animaux (64 animaux) sera évaluée par le test d’immersion de la patte. Ce test consiste à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Ces deux tests sont susceptibles d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. 16 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux du projet présenterons une douleur neuropathique induite par la chimiothérapie à l’exception des animaux contrôles. L’induction de cette douleur neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera induite par administrations répétées d’anticancéreux. Elle peut être associée à une diminution du gain de poids des animaux. La douleur est modérée et sera ressentie de la mise en place du modèle jusqu’à sa mise à mort, c’est-à-dire 2 semaines. Les animaux de l’ensemble du projet subiront des injections pour administrer les composés testés. La piqure d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal ou l’immersion de la patte de l’animal dans un bain thermostaté est susceptible d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. Après la chirurgie de certains animaux, ils seront isolés pendant environ 30 minutes pour la vérification du bon déroulement de l’étape de réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal ne peut être supprimée.
Remplacement
Les composés synthétisés seront, avant tout passage sur modèle animal, testé in silico pour leur capacité à interagir avec le récepteur GPER, ainsi que in vitro sur culture cellulaire pour évaluer et comparer leur effet avec le peptide de référence. Seuls les composés possédant une meilleure activité pharmacologique que le peptide de référence seront étudiés chez l’animal. S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Si les résultats de la 1ère procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour les animaux subissant une chirurgie, une anesthésie adaptée sera mise en place ainsi qu’une analgésie post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. Afin de limiter la souffrance liée au prélèvement de queue et de phalangectomie des animaux issus de croisement génétiques, l’identification de l’animal se fera par tatouage à l’âge d’une semaine et l’évaluation du génotype se fera sur prélèvements de follicules pileux. Une grille de score adaptée au modèle utilisé a été réalisée et fournie en pièce jointe. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Gavées et pesées chaque jour pendant six semaines, après une biopsie de la queue, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Quarante d'entre elles seulement passent l'analyse des vaisseaux sanguins, les autres étant mises à mort faute de porter la mutation recherchée. Le projet porte sur l'atteinte des vaisseaux au cours du diabète, avec l'espoir déclaré d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le produit administré 42 fois par gavage n'est pas nommé, pas plus que le modèle de diabète et d'obésité auquel le porteur attribue une cardiopathie et une irritation cutanée.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Les animaux sont utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Raffinement de la chirurgie cardiaque chez le poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Mettre au point un protocole de chirurgie cardiaque que la communauté scientifique pourra réutiliser suppose d'abord de blesser des cœurs. 610 poissons-zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie l'ablation ou la brûlure par le froid d'environ 20 % de l'extrémité du muscle cardiaque, reste deux minutes hors de l'eau, puis récupère six heures en isolement, une partie passant cinq séances d'échographie sous anesthésie jusqu'à soixante jours. Le porteur affirme qu'aucune alternative au poisson-zèbre n'existe pour ce travail, dont le produit final est un protocole standardisé mis à disposition des laboratoires.
Objectifs
Depuis la première démonstration de la capacité de régénération complète du cœur du poisson-zèbre suite à une lésion en 2002, bien que largement utilisé par la communauté scientifique s’intéressant à ce phénomène, le protocole de lésion mis-en œuvre sur le poisson-zèbre n’a que très peu évolué. En parallèle, durant ces 20 dernières années, les connaissances sur la perception de la douleur chez les téléostéens, poissons dits « évolués », ainsi que la prise de conscience éthique de la nécessité de prise en charge de la souffrance animale ont grandement avancé. Il apparaît aujourd’hui impératif d’apporter un protocole robuste, éthiquement compatible avec les obligations réglementaires, apportant une réelle prise en charge de la douleur lors des interventions chirurgicales via l’utilisation systématique d’analgésiques, mais également en apportant un environnement et un contrôle des paramètres post-opératoires efficaces, favorisant une récupération optimale des poissons-zèbres. Il est également essentiel de démontrer que la mise en œuvre de ce protocole amélioré ne rentre pas en interaction avec les mécanismes de la régénération cardiaque déjà démontrés. Enfin, il existe une variabilité potentiellement importante entre les individus d’un même lot expérimental, et également lors de la réalisation des chirurgies, dépendantes du manipulateur. L’utilisation de l’échographie/photo-acoustique à haute résolution, une technique non-invasive de caractérisation de la fonction cardiaque, permettra d’évaluer cette variabilité et d’identifier des individus non-compatibles avec la procédure (par exemple avec un défaut cardiaque), tout en évaluant l’étendue du dommage cardiaque initial. Afin d’avoir accès à un équipement de haute technologie, le projet sera réalisé sur 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Bien que largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre des recherches sur la régénération cardiaque depuis plus de 20 ans, il n’existe pas aujourd’hui de protocole standardisé de chirurgie prenant en compte la gestion de la douleur chez le poisson-zèbre. Notre projet aboutira à la mise à disposition de la communauté d’un protocole standardisé de chirurgie cardiaque, proposant une prise en charge efficace de la douleur via l’utilisation d’un cocktail analgésique / anesthésique, et la mise en place de mesures de raffinement (environnement per- et post-opératoire) adaptée à une récupération optimale des animaux après la chirurgie. En complément, la mise au point du suivi de la régénération cardiaque par échographie permettra de diminuer le nombre de poissons nécessaires dans les protocoles de lésion du myocarde. Chaque poisson pourra être suivi individuellement au cours du temps nécessaire à la régénération et être son propre contrôle, améliorant également la robustesse des résultats.
Procédures
Les interventions chirurgicales seront réalisées dans l'EU1 : une simulation d’infarctus cardiaque sera réalisée chirurgicalement sur les poissons, en effectuant une lésion mécanique ou par le froid d'une petite partie de l'extrémité du muscle cardiaque.; une chirurgie sous anesthésie générale de 2 minutes sera réalisée. Au sein de l'EU2, une partie des poissons-zèbres passera en échographie cardiaque sous anesthésie générale : 5 séances de 5 à 10 minutes maximum maintenus immobiles dans un bain d’anesthésique.
Impact sur les animaux
La chirurgie sera réalisée sous anesthésie, le poissons seront maintenus hors de l’eau pour une durée de 2 minutes. Une ablation de l’extrémité du muscle du cœur de l’ordre de 20% ou bien une lésion par le froid de cette même zone sera réalisée. La zone d’incision présentant une implantation musculaire faible chez le poisson et une absence de plexus osseux, la douleur perçue pendant et après la procédure chirurgicale est estimée modérée. La faible hémorragie consécutive à la résection peut entrainer une légère hypoxie durant les quelques minutes suivant le réveil. Les animaux seront socialement isolés durant la période de récupération (6 heures). Les animaux suivis par échographie seront anesthésiés 5 fois à J-1, J7, J15, J30 et J60 afin suivre la régénération du cœur.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des histologies et evaluer la régénaration cardiaque.
Remplacement
Les mécanismes de régénération du myocarde sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles s’attache aux modèles mammifères qui ne présentent malheureusement pas cette capacité régénérative. Il n’y a pas aujourd’hui à notre connaissance d’alternative à l’utilisation de poisson-zèbre pour la mise en œuvre de ce projet.
Réduction
L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédents travaux publiés qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d’animaux nécessaires. La procédure « échographie » au cours de laquelle chaque individu sera son propre contrôle permet d’autant plus la réduction du nombre d’animaux nécessaires au projet. Les études longitudinales en échographie vont permettre de s'assurer de la qualité des interventions chirurgicales, la dynamique de régénération de chaque poisson pouvant être évaluée avec des tests paramétriques aux différents étapes des procédures.
Raffinement
L’objectif principal de notre projet est d’apporter des éléments majeurs de raffinement au protocole de chirurgie cardiaque communément mis-en-œuvre chez le poisson-zèbre, et au suivi post-opératoire. Une attention maximale sera portée aux conditions environnementales (maitrise de l’asepsie, des paramètres physico-chimique), à la prise en charge efficace de la douleur post-opératoire, et l’observation des animaux avec la mise en place d’une grille de score étudiée spécifiquement pour ce projet, nous permettant d’estimer l’atteinte d’un point limite de manière précoce, et nous permettant de mettre en œuvre les mesures adaptées à la prise en charge de la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress au maximum, le transport des animaux entre les 2 sites sera réalisé dans une boite en polystyrène afin de maintenir une température optimale pendant les 450m séparant les 2 établissements. Les poissons seront placés individuellement dans des contenants hermétiques et adaptés au transport. Le transport n’excédera pas 10min.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est devenu au cours des dernières décennies l’espèce-modèle aquatique de prédilection en recherche scientifique, représentant désormais plus 5% des animaux utilisés à des fins scientifique en Europe. Le génome du poisson-zèbre présente 70% d’homologie avec le génome humain (estimé à 85% pour les gènes impliqué dans des pathologies), le poisson-zèbre dispose également d’une capacité originale de régénération cardiaque, ces éléments en font un modèle idéal pour la compréhension des mécanismes à l’œuvre dans la régénération cardiaque, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Les poissons utilisés seront tous des adultes matures sexuellement, âgés de 6 à 18 mois. Les mécanismes de régénération ne peuvent être étudiés que sur des animaux ayant terminé leur développement.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Rôle du tissu adipeux périvasculaire dans la pathologie d’anévrisme aortique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Génétiquement modifiées pour rapprocher leur aorte de la pathologie humaine, 960 souris que le porteur décrit comme des "outils spécifiques" vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe délivrant de l'angiotensine II leur est implantée sous la peau sous anesthésie, en quinze minutes, et 192 d'entre elles passent jusqu'à trois échographies. Associé à un régime riche en cholestérol ou en graisse pendant vingt-huit jours, ce traitement provoque des dissections et des ruptures de l'aorte abdominale qui tuent environ 15 % des souris sous régime gras et 40 % sous régime enrichi en cholestérol, mortalité que le porteur présente comme rapide et non douloureuse. Les survivantes sont systématiquement tuées pour récupérer le tissu adipeux périvasculaire et l'aorte.
Objectifs
Les dissections et anévrismes aortiques sont des pathologies qui touchent les gros vaisseaux. Elles touchent principalement l’aorte thoracique pour les dissections et l’aorte abdominale pour les anévrismes. La rupture de l’aorte est le principal risque lié à ces pathologies avec un taux de mortalité de 80%. La seule solution thérapeutique pour pallier ce risque de rupture est une intervention chirurgicale. Cependant, aujourd’hui, le seul paramètre d’anticipation est la taille de l’anévrisme. Mieux comprendre les mécanismes mis en jeu va permettre de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et des facteurs prédictifs. L’anévrisme de l’aorte abdominale est une forme particulière de pathologie aortique hypertensive comme l’athérosclérose avec des caractéristiques similaires. Il est connu que le tissu adipeux périvasculaire influe sur le vaisseau qu’il entoure. En utilisant un modèle murin d’anévrisme aortique abdominal, nous avons montré qu’un régime riche en cholestérol, comparé à un régime riche en graisse, aggravait l’incidence de l’anévrisme aortique en augmentant le nombre de dissections et de ruptures de l’aorte abdominale. Au niveau du tissu adipeux, nos premiers résultats montrent une modulation de sa composition. Nous pensons donc que le tissu adipeux joue un rôle important sur la physiopathologie de l’anévrisme aortique que nous souhaitons approfondir. A partir du même modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale déjà utilisé, nous allons étudier l’implication du tissu adipeux périvasculaire dans cette pathologie afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels il impacte l’aorte et afin de trouver des biomarqueurs.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires laissent penser que le tissu adipeux périvasculaire agit sur l’artère qu’il entoure en exacerbant, lors d’une hypertension associée à un excès de cholestérol, la réponse immunitaire et diminuerait son effet protecteur vis-à-vis du vaisseau. Notre expérimentation vise à approfondir ces données pour identifier précisément les acteurs de ces modifications délétères, acteurs qui peuvent être des cibles thérapeutiques puisqu’à ce jour, aucun traitement curatif n’existe.
Procédures
- Pose d’une mini-pompe d’angiotensine II en sous-cutanée : ce geste est réalisé une fois par animal, sous anesthésie générale couplée à une analgésie. La durée d’intervention est d’environ 15 minutes. 960 animaux concernés. - Echographie : Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Il n’entraîne aucune douleur. 192 animaux sont concernés et au maximum 3 fois par animal (hebdomadaire).
Impact sur les animaux
La pose des pompes osmotiques en sous-cutanée entraîne une légère douleur et du stress en post-opératoire. Les régimes riches en lipide n’entraînent pas d’effets indésirables autre que la prise de poids et ne dure que 28 jours maximum. Cependant, même si elle ne provoque pas de douleur, l’association des régimes HFD ou HCD au traitement à l’angiotensine II entraîne une mortalité (environ 15% pour HFD et 40% pour HCD) due à une augmentation de l’apparition de dissections aortiques et de ruptures de l’anévrisme aortique induit. Dans ce cas, la mort est très rapide et non douloureuse mais doit être limitée au mieux. C’est pourquoi nous prévoyons de suivre les animaux par échographie afin d’anticiper l’accident vasculaire.
Devenir
Les animaux sont systématiquement mis à mort afin de récupérer les tissus d’intérêts pour analyse.
Remplacement
Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier les mécanismes d’interaction entre 2 tissus (tissu adipeux et Aorte) dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Le modèle prévu est un modèle standard bien documenté dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les expériences envisagées a été précisément défini à l’aide d’un logiciel pour s’assurer de la validation statistique. Des tests statistiques sont utilisés pour analyser les résultats. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser une étude globale de l’expression des gènes qui permet d’observer plus de gènes avec moins d’échantillons et donc moins d’animaux.
Raffinement
La pose des pompes osmotiques est un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour ajuster au mieux l’anesthésie pendant l’intervention chirurgicale. Durant les 28 jours de cinétique, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter une éventuelle réaction cutanée ou une douleur même si elle n’est pas attendue. La douleur de l’animal sera évaluée 2 à 3 fois par semaine selon une grille d’évaluation de la douleur et lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera euthanasié. Une échographie hebdomadaire sera réalisée afin de suivre les anévrismes et dissections aortiques.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifiés pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser le poids de l’animal et la taille des vaisseaux.
Mécanismes l’infection et de la transmission de Plasmodium
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 125
Quinze à trente minutes de piqûres de moustiques sur un animal profondément anesthésié, une ponction cardiaque, ou une perfusion du foie qui tue: 5 025 souris et 125 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 150 d'entre eux anesthésiés et tués avant tout réveil. Infectés par une injection unique, ils subissent ensuite une ponction quotidienne de la queue pendant sept jours au maximum, jusqu'à ce que la parasitémie voulue soit atteinte. L'objet est d'amplifier un parasite du paludisme murin pour étudier ses formes dormantes dans le foie, le porteur écrivant que la souris et le rat servent de "simples flacons de culture cellulaire" à une étape du cycle parasitaire, et reconnaissant que le projet "ne comporte pas de considérations statistiques". Les rats sont retenus pour le volume de sang qu'ils fournissent, et les animaux sont inoculés à trois ou quatre semaines parce qu'ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de comprend la biologie du parasite Plasmodium et de ses interactions avec l'hôte, en particulier dans le foie. Le foie est le premier organe humain ciblé par les parasites du Paludisme dès leur entrée dans le corps par la piqûre de moustiques Anopheles infectés, où une première phase d'amplification massive aura lieu avant que les parasites matures ne soient libérés dans le sang pour causer la maladie. Le foie est également le réservoir des formes dormantes du parasite, qui provoquent des rechutes et maladie chronique. Malgré son importance reconnue pour les stratégies d'éradication, le développement de médicaments antipaludiques ciblant les formes hépatiques du parasite est entravé en raison de l'accès limité aux échantillons de parasites et aux moustiques infectés avec des souches humaines. Le modèle murin de paludisme surmonte ces limitations et permet de recréer l'ensemble du cycle de vie du parasite dans un environnement in vivo. Le projet concerne spécifiquement l'utilisation d'animaux de laboratoire.
Bénéfices attendus
En utilisant les parasites produits dans ce projet, nous espérons : 1) identifier les mécanismes moléculaires codés par les parasites impliqués dans l'induction et le maintien de la dormance, de l'activation et de la conversion sexuelle dans le foie, et 2) établir les relations bidirectionnelles entre le métabolisme de l'hôte et les développements cellulaires distincts du parasite et leur impact sur les résultats des traitements. Ce projet révélera les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dormance, aux rechutes et à la transmission des parasites du paludisme, et posera les bases du développement futur de biomarqueurs et nouvelles thérapies ciblant les réservoirs d'infection hépatique.
Procédures
Les animaux vigiles sont infectés par une injection unique. Une goutte de sang est prélevée à l'extrémité de la queue par ponction avec une aiguille à usage unique. Ce prélèvement est effectué quotidiennement, sur animal vigile, généralement à partir du troisième jour après l’injection et pour une durée maximale de 7 jours et nécessite moins d’une minute pour être réalisé. Lorsque la parasitémie désirée est atteinte, les animaux pour des prélèvements sanguins (par les moustiques pendant 15 à 30 minutes ou par ponction cardiaque). Les animaux non infectés utilisés pour la perfusion de foie sont profondément anesthésiés avant de procéder à la perfusion qui est létale.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences, les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à des injections ou à des prélèvements sanguins. Ces effets indésirables sont de sévérité légère de courte durée. Le rongeur vigile ne souffrira que de l'inconfort causé par des injections (intrapéritonéale, sous-cutané et intraveineuse), ainsi que par le prélèvement d'échantillons de sang à la queue. Ces effets seront limités par l’utilisation d’aiguilles à la taille adaptée et à usage unique pour chaque animal. De plus, des analgésiques et un anesthésique local seront utilisés pour réduire les effets indésirables liés à l’injections. Les animaux infectés par le parasite seront mis à mort par des méthodes validées par le CEEA avant que l'infection palustre ne devienne symptomatique. Un prélèvement de sang sans réveil par piqûre des moustiques ou par ponction cardiaque sera réalisé dans l’animal profondément anesthésié. La perfusion hépatique sera réalisée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés et constitue une classe sans réveil.
Devenir
Les animaux injectés avec le parasite ne peuvent pas être réutilisés. Les animaux utilisés pour le repas sanguin des moustiques sont anesthésiés puis mises à mort par dislocation cervicale avant leur réveil. Les animaux non infectés utilisés pour fournir des hépatocytes sous mis sous analgésie et profondément anesthésiés avant d’être perfusés ce qui est un acte létal.
Remplacement
Le modèle animal ne sera utilisé qu'à trois fins : 1) démontrer la transmission précoce des formes parasitaires sexuelles issues du foie, 2) générer des lignées de parasites transgéniques exprimant les régulateurs de la dormance ou de l'activation, et 3) produire des cellules hépatiques sauvages et transgéniques exprimant des biosenseurs métaboliques. Dans le cas où une nouvelle méthodologie est établie et devient disponible pour produire des lignées de parasites transgéniques dans le parasite du paludisme humain causant des rechutes (Plasmodium vivax), le modèle animal sera remplacé par des modèles de foie humain in vitro infectés par les lignées de parasites transgéniques humaines.
Réduction
Les animaux seront utilisés uniquement dans les situations où les expériences sur les animaux sont inévitables. Les protocoles de ce projet sont optimisés pour minimiser l'utilisation d'animaux et réduire au maximum la souffrance pendant les procédures expérimentales. Nous sommes conscients de l'impératif de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la recherche scientifique et la majeure partie de nos activités de recherche est réalisée in vitro. Cependant, certaines étapes nécessitent encore l'utilisation d'animaux, car il n’existe pas actuellement de système qui permette de reproduire le cycle de vie complet de Plasmodium berghei in vitro. Ce projet ne comporte pas de considérations statistiques, car l'utilisation des animaux se justifie principalement par la nécessité d'amplifier les populations de parasites Plasmodium chez les rongeurs. En termes simples, la souris ou le rat sont utilisés comme de simples "flacons de culture cellulaire" pour accomplir une étape très spécifique du cycle de vie du parasite – la réinfection des globules rouges – qui ne peut être réalisée ni in vitro ni ex vivo. Mis à part cette étape, toutes les autres phases du cycle de vie du parasite seront effectuées in vitro, en accord avec le principe de réduction. Des procédures similaires sont approuvées pour d'autres équipes de recherche à l'Institut Pasteur ainsi que dans des laboratoires à travers le monde. Nous adopterons des protocoles expérimentaux issus de publications largement citées et nous travaillerons à les améliorer en réduisant le nombre d'animaux nécessaires grâce à l'utilisation de nouvelles technologies plus efficaces pour éditer le génome du parasite.
Raffinement
La conception des protocoles prendra toutes les mesures appropriées pour éviter ou soulager la souffrance, la douleur, la détresse et l'inconfort. Nos points limites sont établis de manière à éviter la phase symptomatique du paludisme chez les animaux infectés, ainsi les animaux sont mis à mort avant l'apparition des symptômes et des complications physiologiques potentiellement mortelles. De plus, nous surveillons le comportement des animaux tous les jours en utilisant une échelle de détresse pour détecter d'éventuels problèmes de santé non prévus afin d'améliorer rapidement leur bien-être. Si nécessaire, du dietgel ou un enrichissement supplémentaire seront fournis. Enfin, les interventions potentiellement douloureuses sont réalisées sous anesthésie générale profonde et analgésie, et les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort sera utilisée. Le poids sera enregistré une fois avant de démarrer l'expérience et ensuite tous les jours dès qu'un score dans l'Apparence ou le poids corporel est >0. Prises de décision : dès qu'un score est à 2, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les hôtes naturels des parasites P. berghei sont des espèces de rongeurs sauvages telles que Grammomys et Thamnomys, originaires d'Afrique centrale. Des isolats de ces parasites ont été transmis et adaptés aux souris et aux rats de laboratoire depuis de nombreuses années par plusieurs équipes. Il est largement reconnu dans la communauté scientifique que l'infection des rongeurs par ces parasites constitue un modèle biologiquement pertinent pour étudier plusieurs aspects du paludisme chez l'homme. Ainsi, la valeur d'une recherche rigoureuse sur les rongeurs pour éclairer ou orienter la recherche chez l'homme est désormais solidement établie. L’utilisation de rats, tout aussi susceptibles à l’infection que les souris, a essentiellement pour but d’obtenir un volume sanguin important tout en limitant le nombre d’animaux nécessaires pour préparer de grandes quantités d’érythrocytes infectés. Les animaux sont acclimatés pendant une période de 7 jours. Les inoculations de parasites seront effectuées sur des souris et des rats jeunes adultes âgés de 3 à 4 semaines, car ils ne sont pas encore immunocompétents, ce qui favorise l'infection par le parasite.
La sécrétion d’un transgène par le muscle pour traiter l’ensemble de l’organisme
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
366 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une injection intraveineuse ou intramusculaire, puis cinq prélèvements sanguins sous anesthésie à deux, sept, quatorze, vingt-et-un et vingt-huit jours, avant d'être tuée au bout d'un mois pour prélèvement du foie, du cœur, des muscles et du cerveau. L'objet réel est de comparer des peptides de sécrétion pour qu'un médicament développé au laboratoire diffuse mieux depuis le muscle, l'un des transgènes testés étant déjà engagé dans ce développement. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire pour suivre la sécrétion du muscle vers le sang puis l'absorption par les autres tissus, et revendique le "besoin" de mesurer la réponse immunitaire contre le médicament.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de faire sécréter une protéine d’intérêt par le muscle via une approche de thérapie génique. La thérapie génique consiste à introduire du matériel génétique dans un tissu ciblé afin de restaurer une protéine manquante ou non fonctionnelle. Le traitement des maladies musculaires est souvent complexe, car il nécessite des doses élevées de médicaments pour cibler efficacement l’ensemble des muscles, ce qui conduit généralement à une réponse immunitaire élevée ou à des complications cardiaques ou hépatiques. Pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique ciblant les muscles, nous souhaitons développer un médicament qui sera exprimé et produit dans un tissu, puis fortement sécrété vers la circulation sanguine pour être réabsorbé par des tissus plus difficiles à atteindre. Cette approche permettra d’améliorer l’efficacité du médicament tout en réduisant les doses injectées. Pour augmenter la robustesse des résultats générés, nous évaluerons les peptides de sécrétion couplés à deux transgènes sécrétés utilisés dans notre laboratoire, dont un médicament est actuellement en cours de développement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de sélectionner un ou plusieurs peptides de sécrétion efficaces dans le muscle cardiaque ou squelettique afin d’augmenter la sécrétion de notre médicament par le muscle et, par conséquent, d’accroître sa disponibilité pour l’ensemble de l’organisme. Une protéine-médicament plus disponible permettra d’augmenter l’efficacité de notre traitement et de réduire les doses nécessaires ainsi que les effets indésirables potentiels. Dans un cadre plus large, ces peptides de sécrétion seront utilisés pour développer un traitement pour des pathologies étudiées dans notre laboratoire.
Procédures
Pour les deux procédures, chaque animal sera soumis à une injection (intraveineuse ou intramusculaire, en moins de 30 secondes). Chaque animal subira 5 prélèvements sanguins (J2, J7, J14, J21, J28 après l'injection) après anesthésie (en moins de 30 secondes). Chaque animal sera euthanasié après anesthésie, à la fin de l'étude (1 mois).
Impact sur les animaux
Les souris subiront une injection, ce qui induira un stress (contention ou anesthésie) et une douleur due à la piqûre liée à l’injection. Les souris subiront également des prélèvements sanguins répétés (J2, J7, J14, J21 et J28), ce qui induira un stress lié à la contention et une douleur due à la piqûre ; un minimun de sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude (1 mois), et elles subiront un stress lié à la contention et à l’anesthésie.
Devenir
Après chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que nous puissions prélever différents tissus (foie, cœur, muscles, cerveau, etc.) pour mesurer la présence du médicament en fonction de la sécrétion.
Remplacement
Le nombre de peptides de sécrétions musculaires a été préalablement été réduit grâce à des tests in vitro, permettant d’éliminer les candidats non fonctionnels. Néanmoins, le modèle animal ne peut être remplacé, car le muscle est un tissu complexe, difficile à reproduire en laboratoire. De plus, nous avons besoin d'un organisme entier pour étudier certains paramètres, tels que la sécrétion du muscle dans la circulation sanguine, puis l’absorption du médicament dans les tissus périphériques. Il est également nécessaire de suivre la réponse immunitaire contre le médicament, ce qui n’est pas possible in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera le minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement et statistiquement fiables. Les souris témoins seront mutualisées pour les différentes études.
Raffinement
Les deux procédures seront réalisées uniquement sur des mâles afin de limiter la variabilité des résultats et d’obtenir des données plus robustes. Une période d'acclimatation d’environ une semaine avant de débuter l'étude sera mise en place pour permettre aux souris de s'adapter à leur nouvel environnement. Les prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine faciale sur des souris préalablement anesthésiées, afin de réduire leur stress. Le nombre de mâles par cage sera limité à 5 souris pour éviter les bagarres et les éventuelles blessures. Si des bagarres sont tout de même observées, les mâles agressifs seront séparés. Raffinements prévus pour l'hébergement : Afin de garantir le bien-être des animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures seront mises en place pour optimiser leurs conditions d'hébergement. Les souris seront logées dans des cages équipées de litière et de matériel d'enrichissement (roues, tunnels, abris) pour encourager les comportements naturels et réduire le stress. Un accès libre à la nourriture et à l'eau sera assuré en permanence. L'environnement sera contrôlé en termes de température, avec un cycle lumière/obscurité respectant les besoins physiologiques des animaux (12h/12h). De plus, une surveillance régulière permettra de s'assurer du bon état de santé et du confort des animaux tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin pour étudier l’efficacité de nos peptides de sécrétion car c’est un modèle facile d’accès et pour lequel nous avons déjà démontré la capacité de sécrétion de notre médicament en utilisant une approche par le foie. En utilisant le même modèle, nous pourrons comparer l’efficacité de la sécrétion par le muscle versus le foie en utilisant nos données internes. Les animaux seront injectés à l’âge de jeune adulte (environ 6 semaines).
Etude du rôle d’une hormone sur la gestion du fer lors de la gestation chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Évaluer une hormone comme "possible médicament" dans les pathologies de grossesse, tout en entretenant une colonie de souris génétiquement modifiées: 2 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont tatouées, subissent un prélèvement de queue pour le génotypage, trois prises de sang submandibulaires sur animal vigile et de neuf à treize injections intrapéritonéales chacune. Le régime enrichi en fer, peu apprécié des souris, peut provoquer un trouble de l'alimentation et une perte de poids, et l'isolement des mâles reproducteurs est reconnu comme un facteur de stress. Les souris soumises à une expérimentation sont tuées à l'issue de chaque procédure, sans que le texte suive le sort de celles que mobilise l'entretien de la colonie, et le porteur justifie l'espèce par le nombre d'organes qu'implique l'étude de la gestation, du duodénum au placenta.
Objectifs
Nous étudions le rôle d'une hormone dans un contexte de gestation. Si cette hormone est bien connue dans de nombreuses fonctions de notre organisme, son rôle lors d'une grossesse est encore mal connue. Ce projet a pour but de préciser son rôle au niveau du développement de l'embryon et du placenta ainsi que d'évaluer son rôle comme un possible médicament dans diverses pathologies de grossesse.
Bénéfices attendus
L’étude permettra de comprendre le rôle d'une hormone dans la gestation, et d’évaluer l’intérêt thérapeutique de cette molécule dans un contexte de gestation chez des femmes dont le taux de fer est perturbé.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tatouages pour identification et subiront un prélèvement de queue pour être génotypés. Sur animaux vigiles il sera effectué trois prélèvements sanguins, temps estimé par souris : 1 minute (contention et prélèvement) Injection : temps estimé : 15s par souris (contention et injection) avec entre 9 et 13 injections intra-péritonéale par souris.
Impact sur les animaux
Il peut exister un stress lors de la contention de la souris ou de l’injection du produit. Le prélèvement sanguin réalisé en état d’éveil au niveau submandibulaire est aussi inducteur d’un stress et de douleur légère pour la souris. La modification du régime alimentaire de la souris altère l'état général de la souris. Notamment le régime riche en fer qui est peu apprécié des souris et peut engendrer, au début du régime, un trouble de l’alimentation associé à une perte de poids. Enfin l’isolement des mâles reproducteurs sera également facteur de stress pour ces derniers.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux soumis à une expérimentation seront mis à mort à la fin de cette dernière
Remplacement
L’altération de la gestion du fer par la modification du taux de l'hormone d'intérêt a déjà été étudiée sur des modèles cellulaires in vitro. Nous continuerons en parallèle des expériences sur modèle murin, nos études in vitro, notamment pour préciser le mécanisme d’action sur des modèles cellulaires de placenta. Le principe actif testé a été choisi parmi un panel de molécules testé in vitro.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée.
Raffinement
Les souris vivront en groupes sociaux. Elles seront élevées dans le respect des règles du bien-être animal en limitant au maximum leur douleur et leur stress. Nous effectuerons toutes nos manipulations de l’animal en s’efforçant de maximiser notre efficacité et réduire le risque d’induire stress et douleur à l’animal. Des scores ont été établis pour surveiller au mieux les animaux et entraîner la fin de l’expérimentation plus précoce si nécessaire.
Choix des espèces
Nous utilisons un modèle de souris car l’étude de la gestation implique de nombreux organes clefs (duodénum, foie, placenta…). Ce modèle murin nous permettra de modéliser une gestation en situation de déficience dans notre hormone d'intérêt dans tous les organes de l’organisme. Les souris seront utilisées autour de 3 mois au stade adulte, une fois arrivée à maturité sexuelle.