Recherche fondamentale

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 439 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des bactéries productrices d'acides gras par la bouche et par voie rectale, cette seconde voie sous anesthésie légère, et subissent un test de tolérance au glucose qui commence par une coupure d'un millimètre au bout de la queue, décrite par le porteur comme une douleur modérée à cicatrisation rapide. L'objet est de comprendre comment ces bactéries agissent sur l'axe intestin-cerveau, avec pour horizon des thérapies probiotiques contre l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire, que le porteur range parmi les applications potentielles.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'identifier et de caractériser les mécanismes moléculaires par lesquels les souches bactériennes productrices d'acides gras polyinsaturés influencent l'axe intestin-cerveau et régulent l'équilibre énergétique chez la souris. Cette recherche vise à élucider comment ces interactions microbiennes peuvent moduler les fonctions intestinales et neurologiques, ainsi que leur impact sur le métabolisme énergétique global. Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les bases biologiques sous-jacentes des effets du microbiote intestinal sur la santé métabolique et neurologique, ouvrant ainsi la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter des conditions telles que l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension des interactions microbiote-intestin-cerveau, l'identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des maladies métaboliques et neurologiques. Les applications potentielles incluent le développement de nouvelles thérapies probiotiques et l'amélioration des stratégies de santé publique.

Procédures

Les souris seront soumises à la technique de l'enrichissement de flore, une technique de classe modérée consistant à inoculer des bactéries dans le microbiote intestinal des souris, par voie orale et/ou rectale. C'est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Impact sur les animaux

Au vu de l'expérience dans le type de procédures mises en œuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, il n'y pas de nuisances ou effets indésirables prévues qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "d'enrichissement de flore", l'inoculation des bactéries productrices d'acides gras polyinsaturés par gavage chez l’animal est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux énergétiques en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bactéries, non virulentes et qui peuvent croître dans des conditions préférable à la souris, grâce à des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette sélection a abouti à ne retenir que les bactéries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront testées in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les échantillons prélevés chez chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires. De plus, nous avons estimé la taille des échantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace grâce aux données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénaires dans les milieux enrichis avec les morceaux de bois, une maison et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Les souris seront également observés quotidiennement et un suivi de poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte supérieure à 15% la souris sera euthanasiée. Pour réduire le stress infligé aux animaux, l'enrichissement de flore par voie rectale sera effectué sous anesthésie légère après passage dans une chambre d'induction à l'isoflurane, et le diamètre de la sonde est adaptée à la taille de l'animal. Les sondes sont en plastique ce qui ne causera pas de blessure à l'animal. L'inoculation par voie orale sur animal vigile est préférée car à la fois plus simple pour l'expérimentateur et mieux tolérée par l'animal. Pendant le test de tolérance au glucose, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline (nécessitant 5ul de plasma).

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physioplogiques, en particulier le contrôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Les souris nous seront livrées à l'âge 3 semaines et nous commencerons nos expérimentations à 4 semaines (après une semaine d'acclimatation), car leur flore intestinale est encore immature, et cela permettra à nos bactéries de s'implanter plus facilement, sauf pour la procédure 1, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines, car c'est une étude pilote.

316 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 36 seulement subiront la lésion musculaire et la greffe de cellules satellites qui font l'objet du projet. Les 280 autres sont gavées de tamoxifène et analysées au repos. Le porteur écrit qu'aucun phénotype dommageable n'est attendu, tout en reconnaissant qu'une paralysie ou une nécrose de la patte lésée reste possible. Toutes sont tuées au plus tard 28 jours après la lésion, pour prélever les muscles et comparer la capacité de régénération de deux sous-populations de cellules souches.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, faisant de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Il a été démontré qu’une partie d’entre elles a une capacité de se différencier plus rapidement que d’autres, ce qui suggère des mécanismes cellulaires sous-jacents conférant cette disparité. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique. Comme notre projet s’intéresse à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Avec ce projet nous voulons comparer dans le contexte du vivant les greffes de ces cellules dans un muscle en régénération et identifier s’il y a une sous-population avec une capacité régénérative plus importante. Ces expériences nous permettront d’analyser la capacité des sous-populations des cellules satellites à régénérer un muscle lésé, comme c’est le cas dans un contexte de maladie musculaire. Notre étude nécessitera un total de 316 souris réparties sur 2 procédures expérimentales, dont seulement 36 animaux seront soumis aux lésions et greffes musculaires.

Bénéfices attendus

Il a des études qui ont montré qu’il y a une hétérogénéité des cellules souches musculaires, les cellules satellites, associé à l’expression de certaines protéines. Pendant la régénération musculaire, la présence de d’une protéine importante pendant le développement musculaire chez les cellules satellites est associé avec plus de prolifération et différenciation plus rapide. Avec ce projet nous avons comme objective comprendre si dans le contexte de l’in vivo, les cellules satellites qui expriment cette protéine sont capables de mieux régénérer le tissue. La régénération musculaire est perturbée dans le contexte des dystrophies musculaires. Mieux comprendre les mécanismes de régénération par les cellules souches musculaires, les cellules satellites, va permettre d’approfondir sur la possibilité de la réussite de nos cellules candidates dans les thérapies cellulaires pour les maladies musculaires humaines.

Procédures

Dans cette étude 36 de la totalité des animaux (316) seront anesthésiés et soumises à des injections intramusculaire et greffé avec des cellules satellites dans ces muscles. Les 280 autres animaux seront traités avec de la tamoxifène par gavage et analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu un phénotype dommageable. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Nous n’attendons pas de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire. Cependant, nous faisons tous les tests d’optimisation du protocole in vitro et seulement dans un deuxième temps nous ferons les greffes avec un minimum d’animaux nécessaire aux analyses.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires.

Raffinement

Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, pour l'enrichissement du milieu de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours après induction de la régénération musculaire pour améliorer les conditions d’alimentation des animaux. Tout au long du projet, il y aura une surveillance quotidienne du comportement et le poids des souris afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort. Les animaux qui présenteraient des signes anormaux associés à des points limites seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. En plus d'être un mammifère, le fait d'avoir des souris transgéniques et immunodéprimées est essentiel pour permettre l'analyse de cellules greffées tardivement sans avoir une réponse immunitaire. Ce modèle murin étant couramment utilisé, nous permettra d’avoir une idée plus approfondie sur la possibilité de la réussite de nos cellules candidates dans les thérapies cellulaires pour les maladies musculaires humaines. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines. Passé 8 semaines, le muscle adulte est complétement formé et il est donc possible de faire la distinction entre le processus de régénération et la croissance musculaire.

1 100 souris mâles âgées de 18 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quinze minutes pour recevoir le peptide bêta-amyloïde qui déclenche la pathologie, puis un traitement quotidien, des prélèvements sanguins jusqu'à deux fois par mois et des tests de mémoire de trente minutes par jour, du troisième au quinzième jour, en cage individuelle. L'âge des animaux augmente la mortalité attendue, et l'induction de la maladie peut provoquer pertes de mémoire et agressivité. Les bénéfices annoncés se limitent à la possibilité de faire apparaître de nouveaux traitements, sans que les molécules testées soient nommées ni l'étape suivante décrite. Sur le remplacement, le porteur affirme que seuls des tests sur animaux vigiles répondent à la question posée, les approches in vitro et in silico ne permettant pas selon lui de prédire l'effet d'un traitement sur des troubles cognitifs.

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 min sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum deux fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 min maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux peut conduire à un stress transitoire par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Deux chirurgies de dix minutes séparées par trois injections, et entre les deux une douleur neuropathique installée pour deux semaines sans possibilité d'analgésie : 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un récepteur identifié récemment interagit avec le système opioïde dans les réseaux nerveux de la douleur, pour ouvrir la voie à de nouveaux traitements. Le porteur signale une mobilité modifiée, des réactions exagérées ou diminuées et une perte de poids chez les animaux lésés, et indique que les points limites ont été établis de façon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance. Ni les tests employés pour mesurer ces comportements ni le calcul qui aboutit à 360 souris ne sont précisés.

Objectifs

La manière dont la douleur aiguë se transforme en douleur pathologique chronique fait toujours l'objet de recherches approfondies afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Il est bien connu que la chronicisation de la douleur reflète un déséquilibre entre les systèmes sensoriels excitateurs et inhibiteurs en faveur des systèmes excitateurs (sensibilisation à la douleur). Plusieurs données de la littérature démontrent l'importance du système opioïde inhibiteur dans l'adaptation à la douleur après une blessure et sa perte d'effet analgésique dans des situations de douleurs neuropathiques. Un recepteur a recemment ete identifié comme jouant un role important dans la perte d'effet des opioides. Ce recepteur est donc une cnouvelle cible therapeutique prometeuse dans le traitement des douleurs neuropathiques.Le but de ce projet est d'etudier l'interaction de cette nouvelle cible therapeuthique avec le systeme opioide dans les reseaux neuronaux centraux impliqués dans l'integration des informations douloureuses.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la chronicisation des douleurs neuropathiques périphériques et de la perte d'effet analgésique des opioides. Ainsi une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la mise en place et la chronicisation des douleurs devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d'une durée de 10 minutes, 3 injections (1 minute max) puis une autre chirurgie d'une durée de 10 minutes. Les chirurgies sont réalisées sur aninal anesthésié et les injections sur animal vigil préalablement habitué a la manipulation.

Impact sur les animaux

Modèle neuropathique : -douleur sans possibilité d'analgésie -comportements et stress associés à la douleur. Ces comportements associés à l'état douloureux sont notammant: augmentation ou diminution de la mobilité (comportement spontané), hyporéaction ou hyperréaction (comportement provoqué). Le tout d'une d’une durée de 2 semaines. -perte de poids -irritation et inflammation au niveau de l'intervention Traitement par voie i;p : le stress de contention et l'inflammation du aux injections répétées

Devenir

mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes spinaux responsables du développement des douleurs inflammatoires et du développement et du maintien des douleurs neuropathiques. Le réseau neuronal spinal est encore mal identifié et n’est pas modélisé à ce jour. Les connaissances actuelles ne permettent donc pas de réaliser des études par modélisation, sans avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été établi en fonction de la dispersion des données mésurées lors des expériences précédemment publiées par l’équipe et afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Le raffinement est assuré en offrant un hébergement approprié aux souris, permettant de respecter leur éthogramme : les animaux sont hébergés dans des cages collectives enrichies avec des barrots de bois, et du matériel de nidification (coton et frisure). Lors des procédures invasives de réalisation du modèle douloureux (opération pour le modèle neuropathique) et lors du prélèvement de moelle épinière, les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde. Les points limites ont été établis de facon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont largement utilisées en recherche sur le système nociceptif et sur la douleur. En effet, le système nociceptif de ces animaux étant evolutivement analogue à celui des humains (ce système est apparu chez l’ancêtre commun des rongeurs et des primates). Les souris représentent donc un bon modèle pour l’étude du système nociceptif. De nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles, et pourrons dans le futur nous permettre de disséquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons ; ce qui justifie l’utilisation du modèle murin. Tous les animaux utilisés seront adultes âgés de 6 à 12 semaines. Nous avons décidé de cet âge afin que toutes les études soient réalisées sur le même stade développemental, correspondant à un système spinal mature. De plus, ceci nous permettra de mettre nos résultats en parallèle avec les études disponibles dans la littérature (études comportementales, études histologiques, etc).

Diabète déclenché par une injection unique d'une molécule toxique pour le pancréas, ou installé sur douze semaines par un régime gras et de l'eau sucrée : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent jusqu'à 24 prélèvements sanguins pour confirmer l'installation de la maladie, puis sept injections intrapéritonéales en quatorze jours, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après cinq heures de jeûne. Le porteur décrit une augmentation de l'émission d'urine, une soif accrue et une perte de poids possible, et qualifie l'induction du diabète de "strictement nécessaire". Les souris sont ensuite tuées pour prélever pancréas, foie, muscles et tissus adipeux, à la recherche de facteurs musculaires qui pourraient un jour régénérer des cellules productrices d'insuline chez des patients.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang chez la souris diabétique.

Procédures

Une partie des animaux subira une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule toxique pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 5 prélèvements sur la durée de maintien. Une autre parte des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 24 prélèvements sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite soumises à des traitements administrés par injections intrapéritonéales tous les 2 jours. Chaque souris recevra 7 injections sur une période de 14 jours. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent principalement l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur une injection intrapéritonéale tous les 2 jours, pouvant ainsi induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés . La principale contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

150 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du projet pour confirmer les résultats d'imagerie par des coupes histologiques. Cent d'entre elles reçoivent une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau, cinquante une injection intraveineuse, puis une partie est irradiée en une ou plusieurs séances de radiothérapie et toutes passent des IRM répétées sous anesthésie, avec injection d'un produit de contraste à chaque examen et un transfert vers un autre établissement pour le suivi. Le porteur indique que les tumeurs cérébrales peuvent provoquer titubation, léthargie, tête penchée, tremblements et crises d'épilepsie, et qu'une nécrose du tissu cérébral sain pourrait devenir douloureuse. L'objectif est de mettre au point une séquence IRM capable de distinguer une récidive tumorale d'une nécrose due aux rayons, le suivi s'arrêtant quand une souris a perdu 15 % de son poids.

Objectifs

Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.

Bénéfices attendus

Ces modèles sont représentatifs de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement. L’IRM devrait permettre de détecter la radionécrose, et de la différencier de la pseudo-progression. Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies chirurgicales et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Ces informations sont cruciales pour mieux orienter le traitement du patient.

Procédures

Un premier groupe de 100 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse d'un agent de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d'au minimum 3 jours.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. Il n'existe pas de modélisation suffisamment aboutie pour reconstituer un micro-environnement tumoral, une immunité, et une vascularisation tumorale suffisamment intégrée pour reconstituer un modèle proche de l'homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies et les examens IRM, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).

Choix des espèces

Les souris sont des animaux permettant d'obtenir des modèles oncologiques, proches de ceux rencontrés chez l'homme. De plus, leur variabilité inter-individuelle est faible, permettant d'établir des protocoles IRM reproductibles, avant tout transfert à l'homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.