Recherche fondamentale

La barrière qui protège le cerveau est ouverte par ultrasons focalisés, geste qui peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème visibles à l'imagerie. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après la dernière séance d'imagerie. Elles font l'aller-retour entre leur animalerie et une plateforme d'imagerie, reçoivent une molécule radioactive par voie intraveineuse et passent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie, d'une heure au maximum chacune, l'enjeu étant de mettre au point un traceur pour diagnostiquer plus tôt la maladie d'Alzheimer chez l'être humain. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque les souris sont anesthésiées pendant l'imagerie, et annonce des points limites "adaptés aux modèles" sans dire lesquels.

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Opérées pour provoquer un lymphœdème d'une patte, 360 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et celles qui passent en fin de protocole une lymphographie sous anesthésie générale sont tuées sans réveil. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans la fibrose qui suit le lymphœdème après un cancer du sein, et dans la dissémination des métastases, sur des souris privées de cette enzyme dans certains tissus. Un score de douleur et de stress égal ou supérieur à 10 sur 12 entraîne la mise à mort immédiate. Le porteur présente un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée comme le "seul effet indésirable attendu", dans un protocole qui prévoit aussi un gavage et une injection de cellules tumorales.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal) Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Comme l'hormone recombinante testée n'a pas d'autorisation de mise sur le marché, les brebis qui la reçoivent seront tuées et envoyées à l'équarrissage, tandis que les 25 brebis traitées avec l'hormone extraite du sang de juments gestantes retourneront dans l'élevage. 75 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 50 d'entre elles seront donc tuées. Chacune passe par trois séries d'expériences, avec à chaque fois la pose d'une éponge dans le vagin, une injection d'hormone dans le muscle et, selon les lots, quinze jours de prises de sang quotidiennes à la jugulaire ou une prise unique. Le porteur affirme répondre aux attentes sociétales concernant "le bien-être animal" des juments, prélevées en grands volumes de sang puis souvent avortées, et fixe comme objectif final le "dépôt d'une demande de brevet" pour protéger la propriété intellectuelle.

Objectifs

La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.

Bénéfices attendus

Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.

Devenir

Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.

Remplacement

La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci

Réduction

Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).

Raffinement

Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.

Choix des espèces

La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Tuées sans réveil à la fin des mesures de contraction musculaire, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un vecteur viral injecté dans le muscle tibial d'une seule patte y fait progressivement disparaître la contraction, ce qui affecte la mobilité de l'animal pendant une durée que le porteur dit ne pouvoir fixer qu'après la première phase du projet. S'ajoutent deux à cinq prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, une injection du peptide testé par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, puis une chirurgie pour atteindre le muscle et en mesurer les propriétés contractiles. Le porteur affirme que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire", les modèles cellulaires ne donnant pas selon lui de cellules musculaires assez matures.

Objectifs

La contraction des muscles squelettiques nécessite une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium qui est contrôlée par l’interaction de deux protéines, A et B. L’interaction de ces deux protéines permet le déclenchement de la contraction musculaire et le dérèglement de cette interaction entraine des troubles graves de la contraction musculaire. L’objectif de ce projet est de tester la capacité d’un peptide d’intérêt à restaurer la contraction lorsque l’interaction entre ces deux protéines est perturbée par l’absence de l’une d’entre elles. L’absence dans tous les muscles de l’une ou l’autre de ces deux protéines entrainant la mort de l’animal, nous supprimerons l’expression de la protéine A dans un seul muscle de la patte. Une fois constatée une diminution significative de la contraction de ce muscle nous injecterons le peptide d’intérêt dans le muscle et observerons le retour de la contraction. Cette étude permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Différentes myopathies humaines ont pour origine un dérèglement des mécanismes de contrôle du déclenchement de la contraction. La caractérisation de molécules permettant de contrôler les différentes étapes de ce processus revêt donc une importance majeure non seulement au niveau fondamental mais également dans la mise au point de traitement de ces pathologies. Cette étude représente la première preuve de concept de l’utilisation « in vivo » de peptides capables de moduler au niveau intracellulaire les acteurs du déclenchement de la contraction.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet. Ce projet devrait permettre : 1) De démontrer in vivo la capacité du peptide d’intérêt à rétablir le couplage entre l’excitation et la contraction des cellules musculaire squelettiques lorsque la protéine située à la surface de la cellule fait défaut. 2) D’établir la preuve de concept que le peptide d’intérêt est capable in vivo d’interagir avec sa cible et d’en contrôler l’activité. Cette démonstration ouvrirait la possibilité d’utiliser ce peptide dans différentes situations pathologiques causées par une déstabilisation de l’interaction entre les protéines A et B (RYR1 et CACNA1S).

Procédures

Les souris recevront une injection unique dans le muscle tibial crânial avec 30 µl de PBS ou d’un vecteur viral de type AAV (Adeno Associated Virus). La durée totale d’intervention est d’environ 10 mn.Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit de 2 à 5 préléments maximum selon les groupes et leurs durée de suivi. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Selon les groupes, les souris recevront une injection unique du peptide soit en Intra Veineuse, qui sera réalisée au niveau de la veine caudale sous anesthésie gazeuse (environ 5 mn) soit en IP qui sera réalisée sous contention en moins d’une minute. Pour les mesures de contraction du muscle, les animaux seront anesthésiés. Après une petite chirurgie pour atteindre le muscle squelettique EDL, celui-ci sera soumis à un protocole de contraction musculaire afin d'évaluer les propriétés contractiles de ce muscle d'intérêt. À la fin de ces mesures et afin de réaliser des analyses post mortem, les animaux seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les injections en intramusculaire (IM) et en intraveineuse (IV) ainsi ques les prélèvements sanguins, les souris seront sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de ponction pourrait être ressenti après le réveil. L’injection en intra péritonéale (IP) sera réalisée sur animaux vigiles. Elle engendre une légère douleur au moment de la piqure. Une fois le muscle tibial crânial injecté avec le vecteur, les animaux subiront de façon progressive une diminution puis la disparition de la contraction de ce muscle. La mobilité en sera donc affectée, et cela, dans un temps qui sera défini lors de la Phase 1 du projet. C’est sur la base de cette nuisance que le choix d’injecté qu’un seul membre a été décidé. Pour les mesures contractiles du muscle, les animaux seront anesthésiés puis mis à mort (acte expérimental sans réveil).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.

Remplacement

La capacité du peptide d’intérêt à rétablir la contraction du muscle a été testé sur des cellules musculaires en culture. Cependant les modèles cellulaires ne permettent pas d’obtenir des cellules musculaires totalement matures et donc d’approcher la complexité des interactions entre protéines en place dans la cellule musculaire adulte. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer ces différents paramètres physiologiques de la contraction musculaire et l’effet du peptide d’intérêt sur ces différents paramètres.

Réduction

Dans le contexte de cette étude, et en se basant sur notre expérience des données d’expression après injection d’un vecteur AAV dans le muscle chez la souris, le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Ainsi, un maximum de 200 souris réparties sur 3 phases sera utilisé afin d’avoir suffisamment de données pour déterminer dans un premier temps, la fenêtre d’injection possible du peptide, dans un second temps la voie d’administration et le temps de pénétration dans le muscle de ce peptide et dans un dernier temps, son efficacité ou non, in vivo. Selon les paramètres analysés, des tests statistiques de type non paramétriques (Mann & Whitney) pourront être utilisés pour comparer les souris traitées et non traitées.

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.) En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Ainsi, sera observé l’aspect physique global (poil, morphologie général, pertes de poids), l’aspect physique du facies (Paupières, Aspect des larmes, colorations des muqueuses/oreilles), l’aspect comportemental (agressivité, comportement, activité) et la respiration. Pour ce projet, l’observation se portera également sur les capacités motrices de l’animal ainsi que sa capacité à pouvoir se nourrir. Cette grille d’évaluation décisionnaire est générique et mis à disposition par notre SBEA. Selon le score enregistré, certaines actions seront mises en place selon le schéma suivant : score de 0, aucune action ; de 1 à 6, signes cliniques légers, réflexion sur l’environnement (milieu, social). Si un animal présente 3 signes associés, utilisation d'AINS ou analgésique faible ou anesthésique local ou opioïdes dose faible; de 7 à 13, signes cliniques modérés, utilisation d’opioïdes dose faible à moyenne, réflexion sur l’environnement (milieu, social…) et observation régulière (min 1f/j) ; de 14-20 signes cliniques sévère, observation (min 2f/j) et utilisation d’opioïde de dose moyenne à forte, s’il n’y a pas d’évolution dans les 24h malgré la prise en charge de la douleur, alors l’animal sera euthanasié ; ≥ 21, euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. En effets, les modèles « in vitro » ne peuvent reproduire la complexité du mécanisme qui commande le couplage excitation-contraction du muscle squelettique. Les vecteurs AAV sont fréquemment utilisés avec succès chez la souris. Ainsi nous allons utiliser ce modèle afin de pouvoir mimer grâce au vecteur AAV le dérèglement du couplage excitation-contraction et faire preuve de concept de la capacité d’un peptide à rétablir le déclenchement de la contraction « in vivo ». Afin de pouvoir réaliser notre étude sur des muscles tibiaux et EDL homogènes et de tailles adultes, des souris adultes d’environ 14 semaines seront utilisées.