Recherche fondamentale

Placés en hypoxie huit heures par jour pendant trois semaines, au moment où ils dorment, 490 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont tous tués par prélèvement du cœur. Le porteur décrit une gêne respiratoire, une perte de poids, un stress et une baisse d'activité les trois premiers jours, puis une adaptation. Chaque semaine, les rats portent une à trois heures un collier ou un gilet de télémétrie, subissent une mesure de pression à la queue et, pour une partie, un test de tolérance au glucose avec six gouttes de sang prélevées après six heures de jeûne. L'effectif annoncé repose sur douze animaux par groupe, le porteur ajoutant que cinq mâles et cinq femelles par groupe suffiraient si les résultats se recoupent, sans que le passage à 490 rats soit expliqué.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. La sévérité des apnées modifie la quantité d’hypoxie qui a pour conséquence une grande valabilité de réponse entre les patients. Dans l’objectif de mieux comprendre la variabilité de réponse chez le patient et améliorer la prise en charge. L’objectif de cette étude et d’évaluer l’impact de différentes quantités d’hypoxie sur l’aggravation de la taille de l’infarctus du myocarde chez le rat.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. La prise en charge des apnées du sommeil est complexe et le profil des patients hétérogène. L’étude de la charge hypoxique (quantité d’hypoxie) chez le rongeur permettra de mieux comprendre les mécanismes qui aggravent les pathologies cardiaques et mieux phénotyper les patients afin proposer des thérapies alternatives ou complémentaires aux traitements actuels.

Procédures

Tous les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie (contrôle) pendant 3 semaines en modulant la quantité d’hypoxie. Chaque semaine, pendant 1 à 3 h les animaux seront équipés vigile d’équipement de télémétrie (colliers/gilets) afin d’évaluer les paramètres cardiorespiratoires et soumis à une mesure de la pression artérielle à la queue. A la fin de cette procédure, les animaux seront anesthésiés et analgésiés, une mesure de pression artérielle sera réalisée et les rats seront mis à mort par prélèvement cardiaque afin d’évaluer ex-vivo la taille de l’infarctus du myocarde. Dans la deuxième partie du projet, les rats subiront un test de tolérance à l’insuline ou au glucose. Ce test consiste à injecter de l’insuline ou de glucose chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injection ou prélèvement). A la fin de cette procédure, les rats seront anesthésiés et analgésiés, et mis à mort par prélèvement cardiaque puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des rats dans l’animalerie conventionnelle entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement du dispositif d’exposition à l’hypoxie. L’exposition à l’hypoxie induit une dyspnée, une perte de poids, un stress et une diminution de l’activité chez le rat, qui interviennent exclusivement pendant la phase d’hypoxie (8h/j), qui correspond à la phase de sommeil des animaux. Ces atteintes sont transitoires, la perte de poids et la dyspnée sont observées au cours des 3 premiers jours d’exposition, puis les animaux s’adaptent et les courbes de prise de poids sont ensuite parallèles à celles des animaux contrôles exposés aux mêmes flux d’air sans l’hypoxie (normoxie). Le test de tolérance à l’insuline et au glucose chez l’animal éveillé nécessite une mise à jeun de 6 heures et une injection intrapéritonéale d’insuline ou de glucose, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort. En effet, l’objectif de ce projet impliquant la réalisation d’une ischémie reperfusion ex-vivo le prélèvement du cœur est indispensable.

Remplacement

Le présent projet ne peut pas être réalisé en remplaçant l’animal par des méthodes alternatives puisqu’il s’agit ici d’une étude systémique. En effet, un des objectifs de cette étude est de corréler des marqueurs cliniques de dysautonomie (ECG, pression artérielle…) à la quantité d’hypoxie et à la taille de l’infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin que l’effectif par groupe permette d’observer d’éventuelles différences significatives mais en tenant compte d’éventuels problèmes au moment de la cannulation du cœur et de l’absence de réponse de certains animaux lors de la réalisation des tests métaboliques (+20 % => n=12 par groupe). Les gilets de télémétrie nous permettent d'effectuer des mesures longitudinales de la fonction cardiorespiratoire, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous réaliserons ce projet sur des animaux mâles et femelles, si les résultats observés entre les mâles et les femelles n’est pas différents les résultats seront groupés et il ne sera pas nécessaire d’effectuer la totalité des animaux 5 mâles et 5 femelles par groupes seront suffisant.

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages, même pendant l’HI et la N (enrichissement adapté ne modifiant pas les flux d’air et ne permettant pas aux animaux de se cacher). Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de stabulation dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. L’utilisation de gilets de télémétrie permettent le suivi cardiorespiratoire des animaux sans nécessiter une quelconque chirurgie ou une anesthésie pour acquérir un ECG, ce qui participe au raffinement, de plus, il est très bien toléré par les rats. Compte tenu des multiples conditions de charge hypoxique, nous avons choisi de réaliser l’épisode d’ischémie-reperfusion ex-vivo plutôt qu’in-vivo, ce qui permet de réduire la contrainte et la souffrance potentielle pour les animaux. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront des antalgiques pré et post-opératoires selon nos protocoles normalisés Une fois endormis, les rats seront transférés sur tapis chauffants pour maintenir leur température corporelle leur température sera également contrôlée par un thermomètre rectal raccordé à une plaque chauffante pour ajuster les variations de température. L’anesthésie sera vérifiée tout au long de la chirurgie (pincement de la patte postérieure ou de la queue). Tous les gestes et soins effectués sur les animaux seront réalisés par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiopathologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est un modèle de référence dans les publications. Les animaux seront commandés à l’âge adultes 5-10 semaines (≈ 200 g et 300 g pour les femelles et mâles respectivement) et utilisés après 1 semaine de stabulation.

Les souris qui dépassent les points limites fixés après l'opération sont tuées par dislocation cervicale. 62 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie crânienne de vingt minutes pour recevoir une injection de thrombine qui bouche l'artère cérébrale moyenne, puis quatre heures seule en cage sous argon ou sous air, puis deux passages en IRM à un et cinq jours. Le porteur écrit qu'"aucune douleur n'est à prévoir" pendant ces examens et juge "indispensable" de trouver de nouvelles stratégies, moins d'un patient sur dix pouvant aujourd'hui recevoir le traitement existant.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester les effets d’un gaz, l’argon sur les volumes lésionnels post AVC. L’argon est susceptible d’agir sur la diminution de l’activation des macrophages et donc d’induire une neuro protection. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thromboembolique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Les effets seront observés par IRM à J1 et J5 post AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. Les animaux traités à l'argon seront placé en cage individuelle afin de recevoir de l'argon pendant 4 heures post AVC. A J+1 et +5, la moitié de ces animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes. La seconde moitié seront aussi passés à l’IRM dans les mêmes condtions pour une durée totale de 26 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme. Les animaux seront sous anesthésie générale pour les examens IRM, aucune douleur n’est à prévoir.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 26 souris par groupe (+ 20%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle pendant 4 heures sous 100% Air ou 70% argon / 30% O2 ; avant d’être remis dans leur cage. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil (4 heures). Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

4 332 souris vont être utilisées, chacune subissant selon la procédure jusqu'à douze prélèvements d'urine sous contention manuelle, cinq prises de sang, quatre injections, puis une injection létale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et durent dix à douze semaines par animal. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour vieillir plus vite, ce qui les fait mourir plus tôt, et le projet leur inflige une maladie auto-immune du rein pour observer comment l'âge en accélère l'installation. Le porteur écrit que le développement de cette glomérulonéphrite "n'est pas douloureux pour l'animal", tout en déclarant l'ensemble des procédures en gravité modérée.

Objectifs

L’altération progressive et irréversible du rein est une caractéristique du vieillissement chez l’homme conduisant à terme à l’insuffisance rénale chronique (IRC) puis à l’insuffisance rénale terminale nécessitant la mise en place de dialyse ou de greffe rénale Tandis que les fonctions immunitaires déclinent avec l’âge, le vieillissement est aussi caractérisé par une une augmentation du risque d’être atteint de maladies auto-immunes. Dans ces maladies, notre propre système immunitaire se retourne contre nous et produit des anticorps attaquant nos propre cellules. Parmi elles, la glomérulonéphrite extra-membraneuse (GEM) est une maladie auto-immune où des anticorps cible des cellules du rein. Bien que des avancées significatives aient été réalisées dans la compréhension de cette maladie, les facteurs favorisant son initiation restent peu compris, que ce soit du point de vue de l’induction de l’auto-immunité ou de la progression de la maladie. De plus, malgré un pic d’incidence de la GEM autour des 55-60 ans, l’influence du vieillissement sur la physiopathologie de la maladie n’a jamais été étudiée. Notre projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le vieillissement, au niveau rénal mais aussi immunologique, favorise l’induction et la progression de cette maladie rénale.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra une meilleure compréhension de l’impact du vieillissement sur l’induction et la progression de la GEM. Ceci permettra à terme de proposer de nouveaux outils diagnostiques ou pronostiques en identifiant des marqueurs de prédisposition à la GEM mais aussi d’ouvrir de nouvelles perspectives de voies thérapeutiques pour les patients atteints de cette maladie.

Procédures

Au cours de la procédure 1, par animal sur tous les animaux du projet (12 semaines) : - 4 injections sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 12 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection lethale. Au cours de la procédure 2, par animal sur tous les animaux du projet (10 semaines) : - 1 injection sur animaux vigiles. 10 secondes par injection. - 5 prélèvements sanguins sur animaux vigiles. 30 secondes par prélèvement. - 10 prélèvements d’urine à partir de miction spontanée pendant une contention manuelle. 20 secondes par prélèvement. - 1 injection léthale.

Impact sur les animaux

Certaines des souris utilisées sont génétiquement modifiées pour avoir une accélération du vieillissement, ce qui entraine une mortalité à des âges plus précoces. Lors des expériences, les souris pourraient être sujettes à un stress et angoisse liées à leur manipulation voire des douleurs liées aux injections, prélèvements d’urine et de sang effectuées sur ces souris. Des complications éventuelles peuvent survenir suite à l’utilisation de seringue notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement, une infection du site de l'injection/prélèvement. Le développement de la glomérulonéphrite extra-membraneuse n'est pas douloureux pour l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d'effectuer une cinétique d'induction ou de progression de la maladie.

Remplacement

L’analyse des altérations au cours du vieillissement peut être étudiée in vitro sur modèles de cellules en 3D. La mise au point dans notre équipe de ce protocole in vitro, est à un stade précoce. De plus, bien que ces modèles cellulaires aient un potentiel important pour remplacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La GEM étant une pathologie où le système immunitaire produit des anticorps ciblant les cellules du rein, seul un modèle animal permettra de caractériser et surtout d'établir une cinétique permettant de mieux comprendre les mécanismes favorisant au cours du vieillissement l’induction et la progression de la maladie.

Réduction

Les souris disposant de deux reins, nous optimiserons l’utilisation de ces souris en effectuant différentes méthodes d’analyses sur chaque rein. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet en prenant en compte les effets attendus et le type de tests statistiques effectués.

Raffinement

Pour limiter la douleur modérée que notre procédure expérimentale pourrait induire, nous avons établi une grille d’observation visant à définir les points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et qui indique les mesures, tels que les traitements, que nous prendrons à l’apparition des premiers signes de douleur, de complications ou de perte de poids. D'autre part, en plus du personnel de l’animalerie, un suivi sanitaire une fois par semaine sera réalisé par les membres de l’équipe (expérimentateurs) à l’aide d’une feuille de suivi adaptée au modèle.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix en raison de similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, ce qui nous permettra d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser de nombreuses analyses nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, des études au sein de nombreuses équipes, dont la nôtre, montrent que les méthodes d’induction de la maladie utilisées reproduit l’ensemble des symptômes observés chez les patients GEM. Ceci permet d’établir ce modèle de souris comme un bon modèle de la maladie humaine. Enfin, les souris génétiquement modiiées pour avoir un vieillissement prématuré sont un modèle qui est déjà disponible et nous avons les expertises nécessaires pour diriger un modèle murin.

Choisis pour la proximité de leur système immunitaire avec celui de l'humain, deux jeunes macaques crabiers de deux ans et demi sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis tués. Chacun subit une prise de sang sous anesthésie dans le mois précédant l'essai, un traitement immunosuppresseur la veille sous anesthésie d'une heure, l'injection intraveineuse du produit sous anesthésie de trois heures, enfin une dernière prise de sang avant la mise à mort, sept jours plus tard. Le porteur affirme que la complexité des réactions immunitaires exclut toute méthode substitutive, et désigne l'humain, dans son texte, comme le "Primate Humain". L'essai consiste à injecter un mélange de trois bibliothèques de capsides virales fabriquées au laboratoire, pour repérer en une seule fois lesquelles s'accumulent dans le cœur et le muscle plutôt que dans le foie.

Objectifs

Les troubles neuromusculaires et musculo-squelettiques sont parmi les principales causes d’handicap en Europe. Les thérapies géniques représentent la seule approche permettant de développer un traitement curatif pour ces affections, qui résultent d'un défaut génétique ou d'une mutation. Toutefois, pour que les gènes thérapeutiques soient efficacement transférés, il est crucial de disposer d'outils de transfert de gènes qui soient à la fois sûrs, efficaces et spécifiques aux cellules ou organes visés. Dans cette étude, nous nous concentrons sur les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV). Ces vecteurs sont les plus utilisés en thérapie génique. Les vecteurs AAV de première génération, présentent une affinité pour différents types de cellules et nécessitent des doses élevées pour atteindre des niveaux thérapeutiques. Au sein de notre Laboratoire, nous optimisons ces vecteurs pour améliorer leur affinité envers des cellules cibles, réduisant ainsi la dose de vecteur, la charge antigénique et le risque d'effets secondaires. Nous visons aussi à limiter les effets sur les cellules non-ciblées, augmentant ainsi la sécurité de la thérapie génique. Nous avons créé trois nouvelles bibliothèques d’enveloppes protectrices (capsides) de ces AAV. Ces bibliothèques seront injectées en tant que mélange 1:1:1 par voie intraveineuse et analysées ensuite pour identifier les variantes s'accumulant dans les cellules cibles souhaités (cellules cardiaques, cellules musculaires) ainsi que les cellules hors cibles (cellules hépatiques). La combinaison des trois bibliothèques de capsides AAV avec une analyse des tissus cible et hors cible, nous permettra de révéler des capsides optimisées et identifier ainsi des nouvelles variantes prometteuses en un seul essai.

Bénéfices attendus

En général, les vecteurs AAV présentent une affinité pour différents types de cellules et nécessitent des doses élevées pour atteindre des niveaux thérapeutiques. Toutefois, l'optimisation de ces vecteurs grâce aux nouvelles stratégies développées permettra d'augmenter l'efficacité du traitement au niveau des cellules et organes cibles. Cette optimisation permettra de : - Réduire la dose de vecteur nécessaire. - Diminuer les risques d'effets secondaires pour les patients. - Réduire, voire éviter, les effets sur les cellules non ciblées. - Améliorer la sécurité des thérapies géniques de manière générale.

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis aux interventions suivantes : - Dans le mois avant l’injection, les 2 animaux auront 1 prélèvement sanguin, sous anesthésie de courte durée (15-20 min) afin d’obtenir des valeurs de base concernant leur suivi médical et leur sérologie. - La veille de l’injection (J-1) et en fonction de la sérologie ; un traitement immunosuppresseur et antihistaminique par voie intraveineuse. Le tout sous anesthésie (maximum 1 heure) - Le jour de l’injection (J0) : une injection par voie intraveineuse lente du vecteur testé. Le tout sous anesthésie (maximum 3 heures) - A 7 jours post-injection (J7) : un prélèvement sanguin sous anesthésie (entre 15 et 30 min), avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’administration intraveineuse de vecteurs AAV chez le macaque entraîne les effets indésirables suivants : La piqûre d'aiguille pour l’injection et les prélèvements sanguins entraîne une douleur légère de courte durée. L'anesthésie avant les manipulations peut provoquer une nausée légère de courte durée. Le jeûne préalable à l’anesthésie peut entraîner une sensation de faim légère de durée limitée (maximum 12 heures). La contention nécessaire pendant les manipulations peut provoquer un stress léger de courte durée. Ces interventions sont effectuées en accord avec la classe de gravité des procédures, et les effets indésirables sont réduits au minimum grâce aux raffinements apportés.

Devenir

Les 2 animaux concernés par cette procédure seront suivis pendant 7 jours après l’injection du vecteur thérapeutique puis euthanasiés pour des prélèvements de tissus en post-mortem. L’euthanasie des 2 animaux est nécessaire pour obtenir ces prélèvements sur lesquels s’appuieront plusieurs types d’analyse essentielles pour le projet.

Remplacement

Les études réalisées chez le Primate Non Humain apportent les meilleures connaissances transposables à l’homme en termes de toxicité, d’efficacité et d’immunogénicité (capacité de déclencher un réponse immunitaire) de l’AAV. La complexité des réactions en jeu ne permet pas le recours à des méthodes substitutives et justifie donc notre recours à des animaux. Les résultats obtenus sont transposables en terme de biodistribution et tolérance et permettent d'envisager de futurs essais cliniques chez l'homme (Primate Humain).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit à son minimum tout en assurant une exploitation possible et des résultats significatifs et fiables. Ce nombre d’animaux est basé sur des études précédentes en thérapie génique et sur ce sujet spécifiquement. Ce nombre réduit nous permettra d’identifier des nouvelles variantes de capsides d’AAV de grandes valeurs transgéniques, grâce à un seul essai sur des organismes vivants.

Raffinement

L’état général et l’alimentation des animaux seront surveillés quotidiennement tout le long du projet (techniciens animaliers et vétérinaire). Des protocoles anesthésiques seront mis en place selon la procédure à réaliser. Les administrations expérimentales (injections intraveineuses de vecteur AAV associé à une immunosuppression par voie orale et intraveineuse) se dérouleront sous anesthésie générale. Les prélèvements sanguins seront effectués sous protocole anesthésique permettant d'obtenir une anesthésie de courte durée (environ 10 min). Ces actes étant peu ou pas douloureux, le protocole analgésique ne sera pas basé sur des opioïdes mais par contre sur les effets analgésiques des molécules anesthésiques utilisées et/ou des anti-inflammatoires. Afin de favoriser les échanges sociaux et le bien-être des animaux, les deux primates seront hébergés ensemble dans une volière enrichie tout le long du projet. Toutefois, pour des raisons de biosécurités, ils seront hébergés en cages individuelles en post-injection, puis remis en volière dès que possible. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et les animaux disposent de nourriture et d'eau à volonté ainsi qu’un environnement enrichi comprenant des enrichissements alimentaires, physiques, sonores et visuels variés. Cet enrichissement sera renforcé en hébergement individuel. L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Le choix du macaque fascicularis comme espèce animale dans cette étude est justifié par les critères suivants : La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans des organes et tissus pour y exprimer un gène thérapeutique varie en fonction de l’espèce. Ainsi, des vecteurs efficaces chez des rongeurs peuvent ne pas l’être chez l’humain. Le macaque fascicularis est particulièrement pertinent en tant que modèle préclinique en raison de sa proximité phylogénique avec l’homme, de sa morphologie et de sa physiologie similaire, ainsi que de la ressemblance de son système immunitaire avec celui de l’homme. Ces caractéristiques en font un modèle idéal pour évaluer la biodistribution, l'efficacité et la réponse immunitaire aux nouveaux variants de vecteurs AAV, en particulier lorsqu'une injection intraveineuse est nécessaire. En conséquence, l'utilisation du macaque fascicularis permet de maximiser la transposabilité des résultats obtenus vers l’homme, notamment en termes de ciblage cellulaire et tissulaire, ce qui est crucial pour envisager des essais cliniques futurs. 2 primates mâles (âgés de 2.5 ans et pesant entre 3.5 et 4.5 kg) seront inclus dans ce projet. Les animaux utilisés dans cette étude sont des jeunes adultes ayant un système immunitaire mature, indispensable pour notre projet.

De la collagénase bactérienne est injectée dans le striatum de chaque souris pour y provoquer une hémorragie cérébrale, opération de quinze à vingt minutes suivie de la pose d'un cathéter dans la veine de la queue. 1 232 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune passe jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie et une batterie de tests sensorimoteurs répartis sur trois semaines, le porteur précisant que les déficits provoqués restent "légers" et que l'animal peut "aisément" continuer à s'alimenter et à se fabriquer un nid. La mise à mort passe par une ouverture de l'abdomen et du thorax pour ponctionner le cœur, puis par une perfusion transcardiaque qui fixe le cerveau avant son prélèvement.

Objectifs

En clinique, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS) ou AVC hémorragiques, non traumatiques, résultent d'une irruption plus ou moins importante de sang dans le tissu cérébral faisant suite à la rupture d'un vaisseau cérébral. À ce jour, aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d'un hématome sur le parenchyme cérébral n'est disponible. L'objectif de ce projet préclinique longitudinal est de tester des stratégies thérapeutiques innovantes dans un modèle d'AVC hémorragique chez la souris afin d'étudier leur impact sur les volumes hémorragiques et lésionnels observables à différents temps grâce à l’IRM, ainsi que sur la récupération fonctionnelle au fil du temps. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d'AVC hémorragique consistant en l'injection latéralisée de collagénase bactérienne dans le striatum cérébral. Cette chirurgie, bien documentée, reproduit fidèlement la physiopathologie de l'AVC hémorragique, permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. L'AVC sera induit sur des souris âgées de 10 à 12 semaines, chez des individus femelles et mâles, afin de reproduire la diversité clinique.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie ne repose sur aucun traitement pharmacologique. Ainsi, il est indispensable depuis des décennies de développer des stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de l’AVC hémorragique. C’est l’objectif fondamental de ce projet qui consiste en l'exploration de diverses approches thérapeutiques, en employant différents modes d'administration distincts, sur des animaux de sexes et de souches différentes, afin d'évaluer leur incidence sur les aspects cruciaux de l’AVC explicités dans les paragraphes précédents. En cas de résultats défavorables, les différents tests thérapeutiques auront contribué à élargir le champ des connaissances scientifiques dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral hémorragique, offrant des enseignements précieux pour orienter de futures recherches et guider le développement de stratégies thérapeutiques novatrices. En présence de résultats encourageants, les molécules fournies par les partenaires industriels seront soumises à des essais cliniques, avec pour objectif ultime la mise sur le marché dans les années à venir. Ces résultats auront également un impact sur la communauté scientifique, stimulant la collaboration entre le secteur public et privé. Les résultats bénéfiques permettront non seulement d'offrir un nouvel espoir aux patients victimes d'AVC, mais également d'encourager la poursuite des travaux de recherche sur des axes thérapeutiques spécifiques. Cette collaboration renforcée entre public et privé favorisera un échange continu d'idées et d'expertise, créant ainsi un environnement propice à l'innovation et à la progression des connaissances dans le domaine. Pour finir, en obtenant l'approbation réglementaire, certaines des thérapies que nous souhaitons tester pourront donc bénéficier à un grand nombre de patients, marquant ainsi une avancée importante dans la prise en charge de l'AVC hémorragique.

Procédures

Les 1232 animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin d’injecter de la collagénase dans le striatum cérébral droit des souris dans le but d’obtenir un AVC ischémique. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 30 minutes. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un traitement en intraveineux. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 20 minutes. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux ayant pour but de contrôler les déficits sensorimoteurs après AVC et la récupération fonctionnelle au cours du temps. Ces tests se dérouleront jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition et à l’ensemble des tests. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales due à l’hématome et à l’œdème au niveau cortical et striatal. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Les tests comportementaux réalisés par du personnel entraîné ne sont pas destinés à induire de la souffrance animale, mais leur répétition fréquente au fil du temps peut engendrer du stress chez les animaux. Un animal trop stressé et incapable de réaliser un test particulier sera exclu de celui-ci. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale conduisant à l’AVC hémorragique, l’animal sera anesthésié (3 minutes à 5% d’isoflurane, 30% d’O2 et 70% de N2O) et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine (0.05 mg/kg) administrée en sous-cutanée 15 minutes avant la première incision expérimentale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil à hauteur de 2 % d’isoflurane (30% d’O2 et 70% de N2O). Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles proches du conduit auditif de la souris, une anesthésie locale sera appliquée avec de la lidocaïne à appliquer en spray. De plus, chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage et d’une désinfection à la chlorhexidine. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris qui limite les pertes de chaleur. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC hémorragique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de entre 25g et 35g selon les souches. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Des souris porteuses de mutations qui leur causent des douleurs, des difficultés à se déplacer et parfois la mort avant terme sont élevées ici pour d'autres projets. 7 500 d'entre elles sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la seule intervention décrite étant une biopsie de quelques secondes pour le génotypage. Le porteur affirme que l'élevage de ces lignées ne peut pas être remplacé, ces animaux constituant selon lui "le cœur même" des projets des utilisateurs. Celles dont le génotype n'intéresse aucun projet sont transférées vers un autre établissement quand c'est possible, tuées sinon, tandis que les autres partent en expérimentation ailleurs ou servent de reproducteurs.

Objectifs

Dans le cadre de la production de modèles murins génétiquement modifiés, l'objectif du projet est de décrire la prise en charge des pathologies induites par les mutations de ces modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de raffiner la production de souris génétiquement modifiées et de gérer l'apparition de pathologies induites par ces modèles en anticipant leur prise en charge et en permettant ainsi une réaction immédiate et adaptée. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines.

Procédures

Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. La biopsie pour génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable induisent en général et à des degrés divers des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures epxérimentales dans d'autres établissements utilisateurs (utilisation continue) ou peuvent servir en tant que reproducteurs. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt pour les projets expérimentaux initiaux peuvent être soit utilisés pour d'autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs si c'est possible, soit euthanasiés s'l n'y a pas de possibilité de les utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur même des projets des utilisateurs.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des points limite attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (par exemple : batonnets de coton, maison en carton si besoin, frisottiss si besoin,mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions environnementales sont très élevées afin de protéger les animaux d'infections.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.