Recherche fondamentale

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses colorectales sous la peau, puis deux injections d'immunothérapie directement dans la tumeur, dont le porteur indique qu'elles peuvent provoquer irritation, nécrose et saignement de la tumeur. La masse tumorale peut gêner leurs déplacements dans la cage, et l'objectif déclaré est de finaliser et publier des travaux menés les quatre années précédentes sur le rôle d'une protéine de l'autophagie dans les lymphocytes T. Les souris qui ne développent pas de tumeur ne sont pas épargnées pour autant, le porteur prévoyant de les affecter à des prélèvements d'organes et à l'apprentissage des gestes de base par les nouveaux expérimentateurs.

Objectifs

Elément important de l’arsenal thérapeutique contre les cancers, les immunothérapies visent, par différentes stratégies, à stimuler le système immunitaire pour l’aider à détruire les cellules cancéreuses. Notre programme a pour objectif de finaliser et publier des travaux réalisés par l’équipe au cours des 4 années précédentes qui étudient les fonctions de protéines de l’autophagie, un processus de dégradation des constituants intracellulaire, dans les réponses immunitaires antitumorales et l’efficacité d’immunothérapies anticancéreuses. Nous nous intéresserons en particulier au rôle de la protéine de l’autophagie dénommée FIP200 dans un type de cellules immunitaires, les lymphocytes T (des globules blancs), qui sont capable de détruire des cellules cancéreuses. Nous testerons si l’absence de FIP200 dans les lymphocytes T module leurs capacités anti-tumorales suite à l’administration d’une immunothérapie anticancéreuse basée sur l’activation de la protéine STING (Stimulatory of Interferon Genes) connue pour activer les réponses immunitaires antitumorales assurées par les lymphocytes T et actuellement en cours d’évaluation chez l’homme pour le traitement de cancers.

Bénéfices attendus

Nos travaux suggèrent que certaines protéines impliquées dans l’autophagie limitent les réponses immunitaires anticancéreuses, en particulier lors de la stimulation de la protéine STING par ses activateurs. Les expériences que nous proposons de réaliser à l’aide de souris exprimant ou non la protéine FIP200 dans leurs lymphocytes T, les rendant ainsi capables ou non d’autophagie, permettront de déterminer le rôle de l’autophagie des lymphocytes T dans leurs capacité antitumorales et dans l’efficacité des immunothérapies basées sur l’activation de STING. Pour cela, nous suivrons la croissance de tumeurs chez les souris dont les lymphocytes T sont capables ou non d’autophagie suite au traitement par immunothérapies et nous étudierons plus précisément les capacités de ces lymphocytes T infiltrant les tumeurs à produire des médiateurs immunitaires aux fonctions antitumorales

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée afin leur greffer une tumeur et à deux injections intratumorales d’immunothérapie basée sur l’activation de STING. Ces injections, de durée inférieure à 10 secondes seront réalisées sous anesthésie générale à l’aide d’isofluorane afin de limiter les nuisances

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales ont été définies de manière à minimiser les dommages, douleurs, de souffrance et d’angoisse. La croissance et la masse tumorale peuvent entrainer une potentielle gêne au mouvement pour l’animal au cours du temps, pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage. Bien que nos précédents travaux n’aient pas mis en évidence d’effets secondaires fréquents (Benoit-Lizon et al, JITC, 2022), nous pourrons observer des signes de fatigue ou une perte de poids. Des signes d’irritation ou de nécrose, amenant au saignement de la tumeur, peuvent potentiellement apparaitre suite au traitement par voie intratumorale.

Devenir

A l’issue des procédures expérimentales, les animaux porteurs de tumeurs seront mis à mort soit pour nous permettre de collecter les tumeurs et les cellules immunitaires qui les infiltrent à un temps adapté à nos analyses, soit suivant les points limites définis de façon à limiter les nuisances (gênes, souffrance) qui peuvent survenir. Même si des régressions tumorales peuvent être observées suite au traitement, une reprise de la croissance tumorale après l’arrêt du traitement est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris. Bien que les procédures expérimentales permettent un développement tumoral chez la quasi-totalité des animaux, les animaux ne développant pas de tumeur resteront sous surveillance hebdomadaire pour s’assurer de l’absence d’un développement tumoral tardif et pourront être dédiés à des prélèvements d’organes et expériences menées ex vivo ainsi qu’à l’apprentissage des gestes de base pour les nouveaux expérimentateurs.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe dont la progression implique des interactions entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral dont la reconstitution la plus fidèle est possible seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouvelles thérapies anticancéreuses doivent être réalisées sur des organismes vivants. En outre, nous testons l’efficacité d’une stratégie d’immunothérapie, l’activation de la protéine STING, à l’action anticancéreuse connue mais qui semble apporter des résultats variables en pratique clinique. Il apparaît donc important de revenir au modèle murin pour identifier à l’échelle moléculaire les freins au succès de cette immunothérapie, en particulier ceux qui implique des interactions entre cellules immunitaires et cellules cancéreuses. Les données obtenues seront complétées d’expériences menées in vitro pour une approche globale.

Réduction

Le modèle cellulaire de cancer colorectal (MC38) utilisé pour ce projet chez des souris immunocompétentes est parfaitement maitrisé par les expérimentateurs de notre équipe tout comme les modalités de traitement, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point et réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus pour le suivi de croissance tumorale (expérience répétée 2 fois) et n=3 individus (expérience répétée 3 fois) pour l’analyse détaillée des capacités antitumorales des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Nous disposerons ainsi d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des effets de nos traitements et du rôle de l’autophagie dans leur efficacité grâce aux tests statistiques adéquats. Autant que possible, des expériences permettant de répondre à nos questions scientifiques seront réalisées in vitro à partir de lignées cellulaires et ex vivo à partir de cellules immunitaires isolées après mise à mort des animaux décrite dans le paragraphe dédié

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement adapté et enrichi. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser les contacts sociaux et éviter le stress et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nids (ex : coton) ou leur permettant de se cacher (contenant ou tube opaque) et de développer leur répertoire comportemental sera fourni. Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et trois fois par semaine par les expérimentateurs lors de leurs interventions (injections, pesées, mesures du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront mises à mort selon la méthode décrite ci-dessus.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, il est nécessaire de fixer des paramètres génétiques (délétion de Fip200 dans les lymphocytes), ce qui n’est faisable qu’à partir d’un animal génétiquement modifié. La souris dont la génétique est bien connue, est quantitativement la plus représentée des espèces d’animaux transgéniques, il s’agit donc d’une espèce pertinente. En outre, l’étude des interactions entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires du microenvironnement tumoral chez la souris est une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine de recherche. Ce modèle animal est le plus utilisé pour l’évaluation préclinique de l’efficacité anticancéreuse de nouvelles thérapies. D’un point de vue technique, les coûts limités de maintenance, et le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines), âge auquel les animaux possèdent un système immunitaire mature permettant une meilleure stabilité et meilleure reproductibilité des expériences.

Un score de douleur supérieur à quinze déclenche la mise à mort du rat concerné. 96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever des tissus du système nerveux. Ils reçoivent des administrations répétées d'un anticancéreux jusqu'à développer une neuropathie, puis subissent chaque semaine un test d'allodynie tactile d'une heure au maximum par animal et un test d'allodynie au froid, avant une mesure de la conduction du nerf sciatique sous anesthésie. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée mais "indispensable", et retient le rat parce que son activité et son comportement spontanés conviennent à l'étude de la douleur par tests comportementaux.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à la mise à mort de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

Biopsiées de la queue vers six jours de vie pour le génotypage, 1 512 souris génétiquement modifiées subissent ensuite une chirurgie pouvant durer quatre heures sous anesthésie, puis une chirurgie terminale de dix minutes pour le prélèvement des tissus. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. L'objet annoncé est de cartographier les connexions d'une structure cérébrale qui contrôle les neurones dopaminergiques, avec des retombées renvoyées aux "futures recherches" sur la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction. Ni le titre, "Identification de circuits anatomiques", ni le texte ne nomment cette structure, et l'effectif de 1 512 souris est dit "calculé mathématiquement" sans autre précision.

Objectifs

Les neurones dopaminergiques sont le point de départ du système de récompense du cerveau. Ces neurones ont des rôles multiples, allant de l'évaluation de la valeur gratifiante, aversive et motivationnelle d'un stimulus à la locomotion, et sont donc impliqués dans des pathologies telles que la dépression, la douleur chronique et la maladie de Parkinson. Il y a une quinzaine d'années, on a découvert une structure qui est aujourd'hui considérée comme le principal contrôle inhibiteur des neurones dopaminergiques. Cette structure a été initialement caractérisée chez le rat et, jusqu'à présent, son étude est restée non spécifique et limitée à cette espèce. Cette situation a maintenant changé : un marqueur sélectif de la structure a été identifié, ce qui a permis de localiser la structure chez la souris et de créer une colonie de souris transgéniques pour son étude spécifique. Ce projet vise à identifier spécifiquement les connexions anatomiques de la structure avec les régions cérébrales connues pour être impliquées dans le traitement des informations motrices, douloureuses et gratifiantes / aversives.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est fondamental. Identifier et mieux comprendre la place de la structure dans les circuits impliqués dans les fonctions pour lesquelles elle semble avoir un rôle majeur, c'est-à-dire dans la motricité, la douleur, la récompense et l'aversion. Ceci nous permettra d'orienter les futures recherches, vers la compréhension du rôle physiologique de la région et par conséquent des pathologies associées à ses fonctions, telles que la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction.

Procédures

Les animaux seront soumis à une biopsie de queue (maximum 1mm) sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie de maximum 4h et une chirurgie terminale en vue de prélèvements de tissus ou organes (durée 10 min).

Impact sur les animaux

L’identification par tatouage et la biopsie de queue nécessaire aux génotypages des animaux (maximum 1mm, autour de 6 jours post natal) induisent une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire modérée et une inflammation locale transitoire.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement

Remplacement

Compte tenu du sujet de notre étude, il est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Il n'existe actuellement aucun modèle qui reproduise la complexité des réseaux de structures cérébrales. Les études neuroanatomiques nécessitent que l'animal entier soit vivant.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique. Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargée du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies favorisant leur comportement naturel.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études anatomiques nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés. Génotypage entre 6 et 8 jours (12 jours maximum), chirurgie à partir de 8 semaines.

Pour tester des nanoparticules activées par laser contre le cancer, 7 200 poissons zèbres sont utilisés au stade larvaire dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque larve reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie à deux jours de développement, puis une injection de nanoparticules dans la veine caudale à quatre jours, avant une heure d'anesthésie pour l'observation au microscope confocal et une irradiation laser. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer des œdèmes et modifier la mobilité. Toutes les larves sont tuées à l'issue, les expériences devant être arrêtées avant le stade de larve autonome capable de s'alimenter, et l'effectif de 7 200 individus n'est rapporté à aucun calcul.

Objectifs

Actuellement, les campagnes de dépistage ainsi que les progrès technologiques permettent de détecter des cancers de petite taille. Cependant, les traitements proposés ne sont pas toujours adaptés. Dans ce contexte, la thérapie focalisée utilisant des nanoparticules biodégradables, ciblées et par un laser infrarouge peut répondre à ce besoin médical. En effet cette stratégie thérapeutique peu invasive peut permettre de visualiser et traiter un cancer solide de petite taille tel que le rétinoblastome ou le cancer de la prostate. Ce projet concerne le développement de nanoparticules pour une thérapie combinée anti-cancéreuse. Ces nanoparticules peuvent être activées par illumination laser et libérer des facteurs permettant d’inhiber l’expression de protéines impliquées dans le développement de cancer. L'efficacité de ces nanoparticules sera testée sur le modèle de poisson-zèbre.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous pourrons rapidement définir, grâce à l'utilisation du modèle du poisson-zèbre, les critères nécessaires pour obtenir la meilleure efficacité de ces nanoparticules permettant à la fois le diagnostic et la thérapie: cibler les cellules du cancer et administrer des médicaments anticancéreux. Notre projet pluridisciplinaire correspond à des approches transversales basées sur la synthèse de matériaux et procédés nouveaux et innovants tels que les nanoparticules capables de réaliser de l'imagerie, la thérapie sous irradiation à deux photons et l’inhibition de gène. A long terme, cette première étape préclinique permet de poser les bases pour une application en thérapie humaine.

Procédures

Tout d’abord, des cellules cancéreuses seront injectées sous anesthésie au stade embryonnaire, durée de l'injection 3 minutes. Par la suite, les nanoparticules seront injectées également sous anesthésie chez les mêmes larves à 4 jours de développement par la veine caudale, durée de l'injection 5 minutes. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules sera observé par microscopie confocale, ce qui implique une anesthésie d'une heure pour la prise d'image et un réveil juste après l'observation. L’efficacité sera évaluée par la résorption des cellules cancéreuses après activation des nanoparticules par rayonnement laser. Bien entendu, l’efficacité de ces nanoparticules sera préalablement établie sur des cellules en culture. Aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux vivants.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont liés à une croissance exagérée des cellules tumorales, ce qui pourrait induire des œdèmes et un changement de mobilité. Cependant, le suivi quotidien des animaux entre 2 et 5 jours de développement permettra de stopper les expériences dans ce cas avant le stade de larves autonomes et la prise alimentaire.

Devenir

A la fin de chaque procédure (irradiation biphotonique et observation au microscope), toutes les larves seront mises à mort et utilisées pour l'analyse des cellules tumorales et des tissus.

Remplacement

Les premières expérimentations sur des cellules tumorales en culture ont d’ores et déjà été réalisées. Les nanoparticules activées par rayonnement laser ont montré une efficacité intéressante en thérapie ciblée. Cependant, les expériences sur cellules en culture ne permettent pas de de suivre le devenir des nanoparticules (bio-distribution) et l’efficacité de ciblage tumoral. Pour cela l’expérimentation animale in vivo, en l’occurrence le poisson-zèbre, devient une étape indispensable et non remplaçable.

Réduction

Avant toute expérimentation avec les larves de poisson-zèbre, des mises au point des conditions expérimentales seront réalisées sur des cellules en culture afin de choisir les nanoparticules qui ne présentent pas de toxicité et qui ont une meilleure activité. Ainsi, nous pourrons choisir les nanoparticules les plus efficientes et réduire par conséquent le nombre de larves à utiliser.

Raffinement

Un suivi quotidien est réalisé dès le début de la procédure et les points limites surveillés plusieurs fois par jour. Dès l'apparition de ces points limites, l'expérience sera interrompue et les larves seront mises à mort avec une surdose d'anesthésique pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle poisson zèbre présente des avantages en cancérologie ; robustes, reproductibles, faciles d’utilisation et peu coûteux. Il constitue un modèle de choix puisqu’il offre la possibilité de criblage de composés dans un organisme vertébré entier, dont la pertinence est incomparable avec des modèles in vitro de cultures cellulaires. Les animaux utilisés pour ces travaux seront des embryons de poisson-zèbre au cours des premiers stades de leur développement (2 jours post-fécondation) afin de permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans impliquer de phénomène de rejet et suivre la formation des tumeurs et leur traitement après injection des nanoparticules ciblant les cellules tumorales. Ces expérimentations peuvent être menées jusqu'à 15 jours post-fécondation. La procédure décrite implique des stades précoces de larves de poisson-zèbre, permettant ainsi de faire des premières expérimentations précliniques.

Injectées de cellules cancéreuses sous la peau puis laissées sans aucun traitement antalgique, 520 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en plus une injection intraveineuse de lymphocytes et sept injections dans l'abdomen sur trois semaines, sur animal vigile, et sont tuées quand la tumeur atteint le volume limite fixé. L'objet est de savoir si le métabolisme des lipides modifie les propriétés antitumorales de certains lymphocytes. Le porteur détaille par ailleurs le transfert des souris par tunnel plutôt que par la queue et l'enrichissement des cages, tout en écrivant que l'analgésie est écartée pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire.

Objectifs

Le projet vise à déterminer l’importance des lipides dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse conduite par les lymphocytes CD4+. Ces cellules immunitaires ont des singularités permettant de les classer en différents sous-types de lymphocytes CD4+ avec des fonctions favorisant ou prévenant la progression tumorale. Les signaux environnementaux comme la disponibilité de nutriments conditionnent la présence d’un sous-type de lymphocytes plutôt qu’un autre modulant le devenir de la tumeur. Dans ce projet, nous souhaitons caractériser le rôle des lipides dans l’engagement des lymphocytes CD4+ vers un sous-type particulier et dans l’amélioration de ses propriétés anti-tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de comprendre le rôle des lipides dans l’induction d’un sous-type de lymphocytes CD4+ particulier et dans la régulation de la croissance tumorale. La thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T est une approche prometteuse dans la lutte contre le cancer et manipuler le métabolisme des lipides pourrait améliorer les performances anti-tumorales de ces cellules. Par ailleurs, le développement d’agents anti-cancéreux modulant l’action de ces lipides pourrait être également bénéfique aux patients atteints de cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection rapide (moins de 20 secondes) en sous-cutanée de cellules cancéreuses sous anesthésie et une unique injection intraveineuse sur souris vigiles d’une durée inférieure à 20 secondes. Les injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront réalisées tous les 3 jours pendant 3 semaines (7 injections par souris).

Impact sur les animaux

La transplantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sur souris anesthésiée pour prévenir toute douleur. Pour éviter une accumulation d’anesthésie, les injections IP répétées (avec au maximum 7 injections sur 20 jours) et intraveineuse des lymphocytes sont réalisées sur souris vigiles entrainant une douleur modérée de courte durée ; un stress léger chez les souris vigiles peut également apparaître au moment de la contention. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée sans incidence douloureuse.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront et traitées pendant deux semaines. Elles seront suivies quotidiennement et maintenues en cage à l’animalerie. Elles seront ensuite mises à mort car le volume tumoral aura atteint le point limite.

Remplacement

L’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet du métabolisme des acides gras sur les propriétés anti-tumorales de lymphocytes. Les données in vitro suggèrent des modifications phénotypiques partielles et incertaines sur une action anti-tumorale amplifiée. Ces lymphocytes ont la capacité d’interagir avec différents acteurs cellulaires intra-tumoraux et d’autres tissus pouvant moduler la croissance tumorale. Les modèles actuels d’organoïdes ne miment que partiellement l’ensemble de ces interactions cellulaires et les caractéristiques physico-chimiques du microenvironnement tumoral. L'utilisation de modèles murins de cancer est donc nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal vivant pour suivre la progression tumorale. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer. Enfin, le modèle animal d’invalidation du gène d’intérêt n’est disponible que chez la souris.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages contiennent un enrichissement structural du milieu permettant la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les souris seront soumises à une habituation à la contention pour minimiser le stress lors de l’injection intraveineuse. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui réduit le stress des animaux. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront néanmoins anesthésiées pour la transplantation sous-cutanée des cellules cancéreuses pour éviter toute douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 520 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettra la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Des souris âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

2 304 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection de cellules tumorales dans le crâne, puis deux injections par jour pendant trois jours, une irradiation de la tête de cinq minutes, deux injections par jour pendant cinq jours encore, une résection de tumeur de vingt minutes et un gavage cinq fois par semaine pendant trois semaines. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur cérébrale finit par provoquer une perte de poids et une dégradation de l'état général, et que les gestes sur animal vigile causent du stress. Toutes sont tuées pour le prélèvement du cerveau, le bénéfice annoncé se limitant à "mieux comprendre" comment les cellules tumorales utilisent l'énergie environnante.

Objectifs

Chez l’Homme, le glioblastome est un cancer décelé tardivement et de ce fait nécessite une résection du centre de la tumeur solide, suivie d'une chimiothérapie couplée à de la radiothérapie. Cependant ces traitements induisent une résistance des cellules tumorales restantes, entrainant dans 90 pour cent des cas une récidive du cancer et la mort du patient. Nous cherchons à savoir quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution de cette pathologie afin de développer de nouvelles thérapies qui vont prolonger la vie des patients. Pour celà, nous allons mettre en place une procédure expérimentale à partir des premières cibles identifiées dans nos précédentes études sur modèles cellulaires.

Bénéfices attendus

Ces études vont permettre de mieux comprendre les processus par lesquels les cellules tumorales utilisent l’énergie environnante pour proliférer et ainsi pouvoir agir sur ce levier afin d’inhiber la croissance de la tumeur.

Procédures

- Injection intra-craniale de cellules tumorales : 1 fois, environ 10 minutes. - Traitements par chimio- et radiothérapie : 2 injections par jour pendant 3 jours puis une irradiation de la tête (5 minutes) puis 2 injections par jour pendant 5 jours. - Résection de la tumeur : 1 fois, environ 20 minutes. - Prélèvements sanguins (2 à 3 fois au total) : 10 secondes sur animal endormi. - Gavage : 10 secondes, 5 fois par semaine pendant 3 semaines, -injection du substrat pour imagerie : 1 injection intra-péritonéale sur animal vigile, chaque semaine, 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les actes de chirurgie et les prélèvements induisent du stress et de la douleur pour l’animal. La croissance de la tumeur induit à terme une perte de poids et une dégradation de l’état général de l’animal. Les traitements par gavage ou injection sur souris vigiles induisent du stress.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à l'issue de l'expérience, les cerveaux seront prélevés afin d’étudier les effets des traitements. L’analyse des tissus cérébraux est nécessaire pour étudier l’implication des potentielles cibles thérapeutiques identifiées pendant nos études.

Remplacement

Nos recherches sont basées sur des résultats validés sur modèles cellulaires mais les hypothèses doivent être vérifiées sur l’animal car le cerveau est un organe très complexe et aucun modèle non-animal n’est suffisamment représentatif pour être complet.

Réduction

Des analyses multiples sur les mêmes échantillons seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux. Plusieurs paramètres seront analysés sur le même animal. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale sur l’ensemble des animaux permet également de réduire le nombre total utilisé. Le nombre d’animaux par groupe expérimental est calculé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons un modèle de souris où les tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages collectives avec enrichissement pour améliorer leur bien-être. Une anesthésie et des analgésiques adaptés seront utilisés pour minimiser la douleur (avant, pendant et après des procédures invasives). Les conditions d'hébergement seront vérifiées quotidiennement ; une grille de score et des points limites adaptés sont mis en place pour évaluer la douleur des animaux et les réponses à y apporter.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines (jeunes adultes) pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.