Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Maintien de ressources génétiques pour l’étude de caractères de fitness et de variants morphologiques chez la poule
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
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- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Maintenir sur pied des lignées de poules pour de futures expériences et pour l'expertise utile aux sélectionneurs commerciaux : 3 640 poules vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, réutilisées ensuite comme reproductrices ou dans d'autres protocoles. Chaque animal subit une ou deux prises de sang de moins d'une minute, parfois au sinus occipital, geste dont le porteur reconnaît qu'il peut provoquer des lésions cérébrales. Le passage en cage collective ouvre des épisodes de picage pouvant aller jusqu'à des plaies cutanées profondes et des atteintes de l'appareil locomoteur, et les élevages de longue durée entraînent des dégradations d'état général dont la cause reste parfois indéterminée avant autopsie. Le porteur situe l'intérêt de ces lignées dans la coloration du plumage, caractère servant à distinguer les poulets commerciaux sur les marchés à l'export, et dans un déterminisme d'ovulations multiples encore inconnu.
Objectifs
Pour la lignée d'origine égyptienne , le présent projet vise à maintenir son originalité en limitant l'évolution de la consanguinité, inévitable dans une population fermée, et à caractériser son génome de manière approfondie. Pour les génotypes modèles, le projet consiste à produire des animaux de phénotypes contrastés au sein de familles informatives afin d'identifier la base moléculaire de ces phénotypes. Pour tous les caractères morphologiques, le déterminisme monogénique est déjà établi, mais la nature du gène responsable reste à identifier par séquençage du génome et analyses histologiques. Pour la lignée à ovulations multiples, un projet de séquençage est en cours pour identifier les régions du génome contrôlant ce caractère par différence avec les données de séquençage d’autres lignées de race identiques qui ne présentent pas ce phénotype.
Bénéfices attendus
La lignée d'origine égyptienne a déjà été étudiée pour l'étude des mécanismes de résistance à la coccidiose, à la maladie de Marek et a montré un effet d'hétérosis important en croisement avec une lignée commerciale de poules pondeuses à oeufs bruns. C'est un génotype de référence à garder disponible sur pied pour de futures expériences sur l'adaptation à des conditions d'élevage diversifiées ou sub-optimales. Les modèles génétiques donnent lieu à des publications de haut niveau présentant le mode d'action de gènes importants pour le développement ou pour la pigmentation. La coloration est un caractère utilisé pour distinguer différents types de poulets commerciaux et se révèle importante pour les sélectionneurs visant des marchés à l’export. Le maintien de ces modèles permet de conserver une expertise utile pour des collaborations avec les sélectionneurs commerciaux. Le déterminisme des ovulations multiples est encore inconnu, en particulier dans les lignées légères comme la race Leghorn blanche. Le maintien de cette lignée nous permet d’appliquer une approche de génétique inverse pour identifier ce déterminisme et de pouvoir ensuite réaliser des prélèvements pour valider des gènes candidats suggérés par l’approche génétique.
Procédures
Une à 2 prises de sang d'une durée de moins d'une minute
Impact sur les animaux
Le passage en cage collective ou en parquets au sol de groupes de coqs modifie la structure sociale du groupe, entraînant des comportements de dominance-dominé qui peuvent être observés jusqu'à ce que la structure sociale se rétablisse. Le passage à la cage collective comporte intrinsèquement des risques de picage entre les animaux, pouvant entraîner des plaies cutanées plus ou moins profondes et étendues, ainsi que des atteintes à l'appareil locomoteur. Au cours des élevages de longue durée comme celui-ci, une dégradation de l'état général d'un individu peut également être observée, les causes étant parfois indéfinies avant une autopsie. La réalisation d'une prise de sang est susceptible de conduire à la formation d'un hématome. Si elle est effectuée au niveau du sinus occipital, des lésions cérébrales peuvent survenir. La contention au moment de la prise de sang peut également générer un stress chez l'animal, qui est momentanément privé de ses mouvements (maximum 1 minute).
Devenir
Nous utilisons les individus pour permettre la production d'une descendance. Les animaux n'ayant pas subi d'intervention majeure, nous envisageons de pouvoir les réutiliser dans des protocoles de recherche nécessitant des individus en bonne santé et de génotype connu.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de maintenir une population d'animaux vivants présentant des phénotypes d’intérêt. Cette démarche ne serait pas réalisable sans leur utilisation. Toutefois, il est possible de réaliser de la congélation de semence pour les animaux porteurs de mutations identifiées. Le taux d’éclosion en semence décongelée reste très variable et toujours inférieur à 50%, donc on ne peut utiliser cette solution de remplacement que pour conserver des coqs porteurs d’une mutation déjà identifiée, facile à suivre dans leur descendance. En revanche, pour la lignée Fayoumi, des essais antérieurs de congélation de semence ont montré une faible fertilité après décongélation, donc cette solution est un appoint pour sécuriser la lignée ou reconstituer des familles perdues, mais en aucun cas une solution de remplacement total.
Réduction
Nous avons déjà réduit au maximum les effectifs de reproducteurs pour les génotypes modèles et pour la lignée d'origine égyptienne. Toutefois, au fur et à mesure de l'identification des mutations causales et de leur publication, nous prévoyons de diminuer le nombre d'animaux porteurs, et d’augmenter le recours à la congélation de semence si la qualité de la semence des coqs le permet, afin d’espérer une fertilité suffisante après décongélation.
Raffinement
Hébergement : Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au long de l’élevage. Les animaux en comportement collectif auront à leur disposition divers enrichissements, tels que des perchoirs, des blocs à picorer, des chaînettes métalliques, des bandelettes de tissus pour stimuler le jeu, et des isolateurs seront inclus dans certaines cages pour offrir aux animaux des zones de refuge. Pour prévenir le picage, des répulsifs anti-picage pourront être appliqués sur les animaux concernés. Une surveillance soutenue sera assurée plusieurs fois par jour pour détecter précocement toute détérioration du bien-être. Un arbre de décision destiné à faciliter la gestion quotidienne des animaux (en cas d'atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux zootechniciens en charge du suivi des animaux. Procédure : Dans le cas de la prise de sang au sinus occipital, afin de réduire les risques de lésion cérébrale associés à cette procédure, le préleveur utilisera une garde qu'il positionnera sur son aiguille pour éviter toute enfoncée excessive. La facilité de visualisation de ce site d'injection évitera l'arrachage douloureux de plumes pour les animaux. Un point de compression de 30 à 60 secondes sera effectué pour limiter la formation d'hématome. Deux expérimentateurs seront mobilisés pour assurer une contention appropriée pendant la prise de sang, permettant ainsi de limiter les mouvements erratiques des animaux susceptibles d'entraver le prélèvement. Tout le personnel affecté à cette tâche sera formé à la contention et à la prise de sang sur la volaille. Les personnes en charge du prélèvement de sang au sinus occipital recevront une formation spécifique à cette procédure et auront l'habitude de la réaliser régulièrement pour assurer la fluidité des gestes. Dans le cas de la prise de sang effectuée à la veine alaire ou jugulaire, de l'alcool à 70°C sera appliqué pour désinfecter la zone de prélèvement et profiter des capacités de vasodilatation de ce produit, rendant ainsi la ponction plus aisée. De plus, un point de compression sera réalisé et deux expérimentateurs seront mobilisés.
Choix des espèces
Les applications attendues de nos travaux concernent la sélection et la gestion de la diversité génétique des volailles. La poule est l’espèce de volaille la plus utilisée en recherche et en production. C’est aussi celle dont le génome est le mieux connu parmi tous les oiseaux domestiques. Enfin certains phénotypes ne s’expriment que dans cette espèce. Pour toutes ces raisons nous avons choisi l’espèce Gallus gallus. Les animaux sont utilisés au stade jeune, pour l’observation des variants morphologiques, et au stade adulte pour les performances de ponte et de production de semence.
Mise en place et caractérisation phénotypique d’un modèle murin d’encéphalopathie du prématuré.
- Recherche fondamentale
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- Système immunitaire
- Système nerveux
Des souriceaux reçoivent dès leurs premiers jours de vie une injection intrapéritonéale d'extrait bactérien destinée à reproduire l'encéphalopathie du prématuré, puis subissent deux chirurgies de quarante-cinq minutes pour la pose de prothèses de contention de la tête. 2 160 souris sont concernées, 1 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 040 d'un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur annonce des déficits fonctionnels et cognitifs parmi les effets attendus, et décrit par ailleurs les nuisances de l'imagerie et des tests comportementaux comme un simple stress lié à la manipulation, à l'isolement et à la nouveauté, sans préciser lesquels de ces tests seront pratiqués. Il affirme que ces modèles inflammatoires reproduisent "parfaitement" les caractéristiques de la pathologie humaine.
Objectifs
Une naissance est considérée comme prématurée lorsqu’elle intervient avant 37 semaines et se positionne comme un véritable problème de santé mondiale avec une incidence de 15 millions de cas par an. La prématurité est notamment associée à un large spectre d’altérations globales du développement se manifestant sous la forme de troubles moteurs, sensitif (e.g. vision), d’une altération des fonctions cognitives ou encore de troubles de l’attention et de l’hyperactivité. Ces déficits neurologiques qui peuvent demeurer observables jusqu’à l’âge adulte sont caractérisés au niveau morphologique par un ensemble d’anomalies cérébrales qui sont regroupées sous le nom d’encéphalopathie du prématuré.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre différentes pathologies neurodéveloppementales humaines. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de l’encéphalpathie du prématuré doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes ex vivo de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser les processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Procédures
L’ensemble des souriceaux recevront une injection intra péritonéale d'un extrait de proteine bactérienne afin de reproduire l’encéphalopathie du prématuré (N =2160). Aux jours post-nataux (P) 3, 5, 7, 10, 15, 30 et 60 une imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 420) et une imagerie fonctionnelle échographique (1 heure maximum, n = 420) seront réalisées avec une injection intraveineuse de l'agent de contraste au préalable. La méthode la plus efficiente pour cette administration sera évaluée dans une procédure de mise au point (40 souriceaux seront concernés par cette procédure de mise au point). Deux procédures chirurgicales d’une durée de 45 minutes seront réalisées afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts de mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie fonctionnelle échographique (n = 420) et en microscopie (n = 280). Les tests comportementaux seront réalisées de manière longitudinale à P3, P5, P7, P10, P15, P30 et P60 (n = 240).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement ainsi qu’à la nouveauté. Durant les examens d’imagerie, les animaux peuvent subirent un stress dû à la manipulation. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié notamment grâce à la prise journalière du poids des animaux, leur observation dans la cage en s’assurant de leur bien-être (prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations sur des coupes de tissu.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (encéphalopathie du prématuré, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, les analyses comportementales et les analyses morphologiques ne seront pas réalisées chez les mêmes animaux pour éviter la récupération fonctionnelle et donc le biaisement des résultats. Aussi, le projet comporte deux procédures de mise au point qui permet de s’assurer que les suivantes seront réalisées de la meilleure façon. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale (pose du support de tête pour limiter les mouvements de la tête lors des examens d'imagerie), les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil chauffée. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. De plus, la souche utilisé dans ce projet est également utilisée comme fond génétique de plusieurs lignées génétiquement modifiées utilisées au laboratoire et qui pourront, plus tard, être éventuellement utilisées dans le cadre de ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, les modèles d’encéphalopathie du prématurés induits par des stimuli inflammatoires sont très souvent utilisés car ils reproduisent parfaitement les caractéristiques de la pathologie humaine, ce qui en fait un modèle d’étude robuste. De même, il est admis que l’inflammation systémique induit des changements au sein du compartiment vasculaire comme dans ses interactions avec les cellules qui l’entourent. Cet ensemble de connaissances et les acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur un stimulus inflammatoire à partir du premier jour post natal. Il est donc nécessaire de se procurer des femelles gestantes en amont afin de limiter le stress du voyage aux nouveau-nés. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. La procédure de mise au point engendrera une évaluation comportementale au 7ème jour post natal chez les souriceaux. A ce même stade, une mise au point du protocole d’injection de l’agent de contraste pour les examens d'imagerie sera réalisée. En effet, cet agent de contraste nécessite d’être injecté en intraveineuse mais la voie habituellement utilisée (dans la veine caudale de la queue) n’est pas réalisable à ce stade de développement précoce. Une analyse microscopique sur coupes de tissus prélevés au 15e jour post natal permettra de voir si le modèle récapitule bien l’atteinte la plus décrite dans l’encéphalopathie du prématuré. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (jours poast nataux 3 / 5 / 7 / 10 / 15 / 30 / 60) est nécessaire afin d’identifier des différences dans le développement des différents groupes.
Mécanismes et thérapeutiques de l’anémie autoimmune
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Onze prélèvements sanguins en une quinzaine de jours et l'implantation d'une pompe osmotique sous la peau : 2 604 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des injections répétées d'auto-anticorps dirigés contre leurs globules rouges, pour identifier les récepteurs responsables de leur destruction dans l'anémie auto-immune. Le porteur écrit que ce modèle n'induit pas de nuisances remarquables, tout en décrivant des souris aux pattes blanchies, immobiles et ne réagissant plus quand on les saisit, et fixe la mise à mort à 70 % de globules rouges détruits. Il indique que le recours à des lignées consanguines réduit le nombre d'animaux par groupe et que les souris ne sont pas utilisées au-delà de quinze semaines pour que leur masse n'exige pas de doses d'anticorps plus fortes.
Objectifs
Identifier les sous-classes d’immunoglobulines humaines et leurs récepteurs humains responsables de la déplétion des globules rouges dans un modèle murin d’anémie autoimmune. Dans ce modèle, les souris sont injectées par des autoanticorps anti-globules rouges de différentes sous-classes d’immunoglobulines de manière répétée. Si une anémie est avérée, des souris sont injectées avec des anticorps antagonistes d’un récepteur pour certains anticorps pour identifier le récepteur responsable.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer le rôle des sous-classes d’anticorps et de récepteurs d’anticorps, dans l’anémie autoimmune afin de mieux en comprendre la physiopathologie et, à terme, pouvoir proposer des nouvelles approches thérapeutiques, ciblant les récepteurs d’anticorps par exemple.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : Procédure 1 : 7 prélèvements sanguins, durée : quelques secondes, fréquence : une première fois, puis 10 jours plus tard tous les jours pendant 6 jours. Procédure 2 : 6 prélèvements sanguins, durée : quelques secondes, fréquence : une première fois, puis 11 jours plus tard tous les jours pendant 5 jours. Procédure 3 : une implantation d’une pompe osmotique en sous-cutané et 11 prélèvements sanguins, durée : environ 5-7 minutes, fréquence : une première fois, puis 11 jours plus tard tous les jours pendant 5 jours, une pause de 2 jours puis tous les jours pendant 5 jours.
Impact sur les animaux
Du fait de l’anémie on peut observer au niveau macroscopique le blanchiment des extrémités des pattes, peu ou pas de mouvement, peu ou pas de réaction quand la souris est attrapée. En revanche on n’observe pas de perte de poids ni de signe de détresse. En cas de froideur des pattes un enrichissement en coton, igloo, gel hydrique, chauffage de la cage avec des chaufferettes est prévu.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires de l’anémie autoimmune sont difficiles, voire impossible, à étudier chez l’homme, vu la rareté et la localisation des cellules impliquées (macrophages de la rate et du foie). Se déployant dans la rate et le foie dont les fonctions, la structure et la vascularisation sont uniques, les pathologies et les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Ce modèle d’anémie n’induit pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables. Du fait de l’anémie on peut observer au niveau macroscopique le blanchiment des extrémités des pattes, peu ou pas de mouvement, peu ou pas de réaction quand la souris est attrapée. En revanche on n’observe pas de perte de poids ni de signe de détresse. Aucune augmentation du volume de la rate ou du foie n’est rapportée dans la littérature avec notre modèle d’induction d’anémie. Celui-ci est basé sur la capacité des auto-anticorps à interagir avec certains récepteurs, qui induisent la phagocytose des globules rouges. Dans notre modèle il n’y a pas d’accumulation ni de séquestration de globules rouges dans le foie ou la rate, qui sont les conséquences d’un autre mécanisme de déplétion des globules rouges, liés à certains anticorps qui agglutinent les globules rouges entre eux. Les manipulations d’animaux sont restreintes aux injections intraveineuses, et aux prélèvements sanguins, afin de minimiser le stress des animaux durant les 8 à 15 jours de la durée de l’expérience. L’implantation sous-cutanée entre les omoplates d’une pompe osmotique sera réalisée sou anesthésie et analgésie. Dès l’apparition d’un signe clinique indiquant que les souris ont froid, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes. La pose de dietgel dans la cage est également prévue si nécessaire. Les animaux seront mis à mort si la perte de globules rouges dépasse 70% et que des symptômes comme le blanchissement de l’extrémité des pattes, le manque de mouvement dans la cage, le manque de réaction lors de sa saisie sont visibles.
Choix des espèces
L’anémie autoimmune est une réaction qui se déploie par destruction des globules rouges dans la rate et le foie, la pathologie et les thérapies étudiées ici, ne peuvent pas encore être modélisées pertinemment et donc remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 8 et 15 semaines). Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
Evaluation du remodelage et restructuration cardio-vasculaire du rat lésé médullaire (T4) et traitement sérotoninergique (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués pour prélever leurs tissus et mesurer le remodelage de l'innervation du cœur, 36 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Trente d'entre eux sont opérés deux fois, la seconde intervention lésant la moelle épinière au niveau thoracique, ce qui provoque une paralysie du train arrière, une tachycardie et une hypotension orthostatique, avant un test de marche sur tapis roulant chaque semaine. Vingt rats sont isolés la semaine qui suit l'opération, la vessie vidée à la main une à quatre fois par jour, reçoivent une injection sous-cutanée quotidienne pendant vingt-huit jours et sont anesthésiés une heure trente pour une imagerie. Le porteur justifie la mise à mort par le "besoin" des tissus et annonce que les résultats pourraient servir à de prochaines études cliniques.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LM) sont un problème de santé important dans le monde, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Outre les déficits sensoriels et moteurs bien connus et identifiés, les sujets présentent une altération majeure du contrôle du système nerveux autonome. Les symptômes comprennent des troubles cardiovasculaires, une thermorégulation dysfonctionnelle et la présence de dysréflexie autonome (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie pouvant mettre en jeu le pronostic vital). Ces troubles sévères contribuent à 40 % des décès chez les patients. Les conséquences sur la qualité et l’espérance de vie sont extrêmement préjudiciables, impliquant une réelle prise en charge. Chez les rats spinaux, l'administration quotidienne pendant 28 jrs d'un agoniste sérotoninergique (5-HT) favorise la récupération motrice. Outre ce rôle démontré, la 5-HT joue également un rôle omniprésent dans le système cardiovasculaire puisqu'elle module, entre-autre, le tonus des vaisseaux sanguins ou la rythmicité cardiaque. Le précédent projet montre des données préliminaires très encourageantes et met en évidence une amélioration importante des fonctions cardiovasculaires. Si les résultats sont prometteurs et pourraient être utilisés dans de prochaines études cliniques, il nous faut maintenant compléter ces données sur des données physiologiques. Nous savons (bibliographie) que les rats ayant subi une lésion de moelle en T5 présentent un remodelage des neurones sympathiques post-ganglionnaires innervant le cœur. Nous comparerons donc des individus contrôles, traités avec du NaCl et traités avec notre molécule sérotoninergique à l’aide de système d’imagerie médicale type IRM afin de savoir l’impact de notre traitement sur ce remodelage.
Bénéfices attendus
Les lésions hautes de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Outre les déficits sensori-moteurs, des troubles cardio-vasculaires importants sont présents chez ces individus. Certains troubles comme les dysreflexies autonomes (épisodes soudains d'hypertension et de bradycardie réflexive) peuvent mettre en jeu le pronostic vital du patient. Une précédente étude de notre équipe a montré l'implication de molécules agissant sur le système sérotoninergique et leur capacité à restaurer en partie l’impact de ces troubles. Notre projet pourra permettre une avancée dans le traitement des patients.
Procédures
6 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 minutes. 30 animaux subiront deux chirurgies successives (une de 30 minutes puis une 2ème 10 jours après de 45 minutes).20 animaux auront une injection sous-cutanée tous les jours pendant 28 jours (4 semaines) puis seront de nouveau anesthésiés 1h30 environ en deux sessions séparés de 24h pour subir une imagerie (projet éthique 2/2) avant une dernière anesthésie avant euthanasie pour prélèvement. Sauf l’anesthésie avant euthanasie, toutes les anesthésies seront gazeuses (isoflurane). Les 30 animaux subissant les 2 chirurgies, seront soumis à un test de marche sur un tapis roulant de 5 minutes maximum. Ce test aura lieu toutes les semaines de l'expérimentation soit 4 fois (J7, J14,J21 et J28).
Impact sur les animaux
Tous les animaux subiront une chirurgie pouvant induire de la douleur et 30 d'entre eux, en subiront une 2ème. Ces chirurgies peuvent induire de la douleur. De plus, la lésion de la moelle épinière (2ème chirurgie de la procédure 2) va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients ; des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur et des problèmes cardiovasculaires (tachycardie et hypotension orthostatique). 20 animaux seront insolés pendant les 7 jours post-opératoires afin d'assurer leur soins postopératoires dans de bonnes conditions. Les injections quotidiennes ne doivent pas induire de douleurs (fait sous la lésion – absence d’intégration sensorielle) mais induisent un stress limité (duo d’expérimentateurs durant toute la durée). Le test de marche sur le tapis roulant peut induire un stress à l’animal. Enfin, les sessions d’IRM ne devraient pas induire de nuisances, néanmoins, les animaux seront anesthésiés environ 1h30 en 2 sessions de 45 minutes.
Devenir
Nous avons besoin des tissus pour faire des analyses de remodelage de l'innervation d'organes cibles
Remplacement
Ce projet éthique s'inscrit dans un projet scientifique plus vaste où des études préliminaires ont mis en évidence l'implication du système sérotoninergique (5-HT) dans les épisodes cardiovasculaires dysfonctionnels qui apparaissent à la suite d'une lésion haute de la moelle épinière. L’organisation du système sérotoninergique est complexe avec de nombreux types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique. Il n'existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets de la lésion dans notre modèle
Réduction
Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans le précédent projet. Nous ferons une comparaison pour savoir si nous avons un des différences entre les lots. Il va falloir n=7 animaux par lots (avec ce nombre, nous avons été en mesure de faire des statistiques claires lors de notre précédent projet éthique). Toutefois, la complexité de l'expérimentation nous oblige à prévoir une marge d'erreur que nous aimerions ne pas avoir à utiliser (n=10 animaux par sexe).
Raffinement
Les soins post-opératoires (lésion de moelle) sont basés sur notre expérience de cette technique ainsi que sur des publications de raffinement écrites par les quelques équipes travaillant sur des sujets similaires au nôtre. Il a été validé par la structure de bien-être animale et nos vétérinaires. Les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse(isofluorane). Nous utilisons une analgésie multimodale pour les 2 chirurgies pendant 3 jours minimum. Pour la phase post-lésionnel, nous avons adapté les cages qui ont été usinées à façon pour s'adapter à la paralysie des animaux (eau proche du sol, mangeoire basse, tapis souple agrippant dans la cage pour aider à la mobilité, alimentation liquide pendant 4 jours post-opératoires pour pallier aux problèmes gastriques, vidange manuelle de la vessie de 1 à 4 fois par jour en fonction de la récupération des animaux et antibiothérapie post-opératoire pour éviter les infections urinaires. Des points limites stricts ont été mis en place avec l'aide de l'équipe vétérinaire.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points commun entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets éthiques. Les animaux du projet précédent sont implantés (capteur télémétrique) à 225-275gr soit à 7/8 semaines d'âge environ. Afin de rester au plus proche de ce qui est fait sur le premier projet, nous commencerons ce projet avec des animaux du même âge.
Rôle du facteur de transcription Foxk1 dans le mécanisme de tolérance périphérique exercée par les lymphocytes T régulateurs
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées au tamoxifène deux fois par semaine pendant trente jours puis injectées par voie intraveineuse de lymphocytes T modifiés, 805 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère et sont toutes tuées pour analyser leurs organes lymphoïdes. Une partie développe des signes d'auto-immunité, perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité avec ses congénères. L'objectif déclaré est de savoir si l'absence d'un facteur de transcription rompt la tolérance immunitaire et déclenche une auto-immunité. Le porteur cale sa surveillance sur un taux de survie de 10 % à cinquante jours observé dans un modèle voisin, annonce qu'il tuera les souris avant la phase très sévère de la maladie, et écrit qu'il limitera leurs douleurs dans la mesure où celles-ci n'affectent pas les mesures qu'il veut réaliser.
Objectifs
La réponse immunitaire adaptative dépend fortement de l'immunité médiée par les lymphocytes T. Les cellules T conventionnelles (Tconv), peuvent reconnaître le non-soi et éliminer les cellules infectées et les cellules cancéreuses. La sélection thymique garantit que les lymphocytes T qui atteignent les organes lymphoïdes secondaires reconnaissent les pathogènes mais sont tolérés vis-à-vis du soi. Cependant, même si plus de 95 % des lymphocytes T sont supprimés dans le thymus au cours de la maturation, la tolérance centrale reste un processus imparfait, principalement en raison de l'expression incomplète, dans le thymus, de l'ensemble des antigènes du soi. C'est pourquoi il existe des mécanismes de tolérance périphérique, notamment des cellules T régulatrices (Treg), un sous-ensemble de cellules CD4+ exprimant le facteur de transcription FOXP3 qui peut supprimer l'activation des cellules T auto-réactives en périphérie. La tolérance est un processus essentiel à l'équilibre immunitaire normal et, lorsqu'elle est rompue, l'auto-immunité peut se développer. Le facteur de transcription appelé Foxk1 a été identifié comme un acteur clé de la régulation des cellules T, et possiblement des cellules Treg. Dans ce cadre, Le projet vise donc à caractériser le rôle d'un nouveau facteur de transcription dans les cellules Treg, et à déterminer si son absence induit une rupture de tolérance et conduit à de l’auto-immunité.
Bénéfices attendus
Un défi important dans la recherche biomédicale actuelle et son application pharmaceutique en immunologie est d'identifier les points de contrôle et les mécanismes moléculaires qui peuvent être ciblés pour contrôler les cellules T, et modifier leurs fonctions et leur devenir, afin de mieux contrôler les réponses auto-immunes. Dans ce contexte, la reprogrammation du métabolisme des cellules T apparaît comme une voie alternative et prometteuse pour moduler les réponses des cellules T. Ainsi, le projet présenté ici explore cette possibilité en se concentrant sur un nouveau facteur de transcription. Celui-ci constitue un candidat prometteur qui, en contrôlant le métabolisme des cellules T régulatrices pourrait donc faire l'objet d'une intervention pharmaceutique visant à réduire les dommages de pathologies auto-immunes. Par ailleurs et au-delà de ce facteur de transcription, ce projet constitue une preuve de principe pour cibler les effecteurs impliqués dans les programmes métaboliques, offrant de nouvelles opportunités thérapeutiques pour reprogrammer les cellules T auto-réactives.
Procédures
Les animaux impliqués dans ce projet seront traités au Tamoxifene par gavage (deux fois par semaine pendant 30 jours. temps de procédure: quelques minutes pour chaque souris) ou par l’utilisation de croquettes dédiées. La période d’administration s’étalera sur 50 jours. Des cellules T modifiées seront injectées par voie intraveineuse (1 seule injetion, temps de procedure: quelques secondes) sur souris anesthésiées par anesthésie gazeuse afin de déterminer leur effet in vivo. Une seule injection sera effectuée par souris, la procédure ne durera que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Du fait des protocoles envisagés, des nuisances sont attendues sur les animaux. Certains lots d’animaux pourront développer des signes d’auto-immunité, conduisant à une perte d’appétit, une perte de poids et perte de sociabilité vis-à-vis des congénères.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'analyser l’impact de la délétion du gène Foxk1, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la réponse immunitaire et en particulier des lymphocytes T, objet de l'étude, nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser les processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un auto-immun. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est cruciale.
Réduction
Nous souhaitons étudier des populations cellulaires dont certaines sont rares mais dont la distribution suit une loi normale N ( μ = 15, σ = 3). Sur la base de nos expériences antérieures et des données de littérature, nous savons que des groupes de maximum 6 animaux, analysés avec le test two-tailed student’s test with welch’s correction nous permettent d’obtenir des résultats significatifs et doivent être réalisés en duplicat pour être publiables. La validité statistique des résultats (différence significative entre les groupes) sera évaluée par les tests statistiques suivants : two-tailed student’s test with welch’s correction ANOVA et/ou Mann Whitney.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les souris afin d'obtenir des données fiables. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. Les animaux sont hébergés dans des cages dont la surface est de 500 cm2. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. Nous évaluerons la survie des souris en nous basant sur un taux de survie de 10% à 50 jours observé dans un modèle similaire de maladie auto-immune (Shi et al, 2019 ; Zhenh et al 2013).Tout au long de ces 50 jours (voir également fichier Annexe 1, les souris seront évaluées tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 30 jours suivants ; Le poids, la posture, l’aspect de la peau, l’activité d’exploration et la mobilité, l’aspect du pelage et le comportement avec ses congénères seront évalués. Le score cumulatif obtenu permettra de définir des points limites précoces. En fonction du score, l’animal pourra être isolé, son environnement sera enrichi (nourriture en gel sur la litière, dome/maison) et des analgésiques/antalgiques (Acétaminophène) pourront lui être administrés afin de réduire la douleur jusqu’à sa mise à mort. Nous mettrons donc en place des actions pour limiter les douleurs de l’animal dans la mesure où celles-ci n’impactent pas les mesures expérimentales que nous voulons réaliser (ex : perte de poids, peau irritée, etc..). Pour un score > ou = 5 au cours de 2 observations successives (soit sur 4 jours), l’animal sera euthanasié est décompté comme succombant à la maladie. Les animaux survivants seront euthanasiés à l’issue des 50 jours. Dans la plupart de nos expériences outre la courbe de survie, nous suivrons nos animaux suivant la même grille de score tous les 3 jours pendant les 20 premiers jours puis et tous les 2 jours pendant les 10 jours suivants et mettrons à mort nos souris avant la phase très sévère de la maladie dans les 30-40 premiers jours théoriques du développement de la maladie. Les souris seront également mises sous anesthésie gazeuse lors des procédures de transfert adoptif.
Choix des espèces
Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de lymphocytes B et T en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées les animaux adultes seront utilisés à 8 semaines.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 2/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles des procédures expérimentales tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage maintenues en vie pour la reproduction. Sur chaque animal s'enchaînent la pose chirurgicale d'un implant d'œstrogène, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant trente semaines, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et une ligature vasculaire, avec des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Le porteur indique que les tumeurs peuvent devenir douloureuses au-delà d'un certain volume et gêner l'alimentation, et que le gavage risque de perforer l'œsophage ou d'envoyer la solution dans les poumons, tandis que l'identification de nouveaux traitements des syndromes d'hypercroissance reste annoncée comme une possibilité. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'environnement complexe de ces cellules et que la souris est le seul mammifère chez lequel la protéine visée a été mutée.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.
Essai d’une thérapie tissulaire complexe pour le remplacement de photorécepteurs chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Quinze anesthésies et dix-huit injections d'analgésiques par animal sur six mois, plus sept électrorétinogrammes et sept séries de tests visuels : 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyser leur œil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dans un œil, sous anesthésie, une greffe de tissu rétinien fabriqué à partir de cellules souches humaines, l'autre œil servant de témoin, avec un risque de décollement de la rétine et de petites hémorragies oculaires, pour vérifier si cette greffe rétablit une part de vision dans la rétinite pigmentaire. Ces rats portent deux mutations, l'une qui les rend aveugles dès trois semaines, l'autre qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui les expose aux infections opportunistes et leur fait perdre leurs poils, lesquels s'accumulent sous leurs paupières. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que sa taille rend le geste chirurgical moins difficile, donc l'échec moins probable.
Objectifs
Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Ce projet a pour objectif de vérifier que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire. Ce morceau de rétine est fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations sont réalisées dans un modèle de rats porteur d’une mutation génétique entrainant la perte de la vue et également d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Le potentiel thérapeutique des greffons est évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière). Par ailleurs, lors de la greffe, nous évaluerons également si des vésicules extracellulaires (petites subtances produites par des cellules) peuvent facilité la prise des greffes dans la rétine.
Bénéfices attendus
Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette procédure chirurgicale consiste en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes. Cette opération n’est réalisée qu’une seule fois. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Les rats ont un phénotype dommageable : ils sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient. Tous les animaux feront l’objet d’un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique) et d’un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu; ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes; l’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Ces examens seront réalisés une fois par mois (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps) Les animaux réaliseront également des tests comportementaux à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 7 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Ces examens seront réalisés une fois par mois. Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Anesthésies (injections intrapéritonéales d’une durée de quelques secondes): 15 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 6 mois. Analgésies + antidote anesthésie (injections sous cutanées d’une durée de quelques secondes): 18 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 6 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.
Impact sur les animaux
Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). Un stress peut aussi être engendré lors des contentions réalisées pour les injections intraperitoneales et sous cutannées. Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.
Devenir
A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).
Remplacement
Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptés aux petits effectifs. Au final, 220 animaux seront utilisés dans le projet.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’oeil entraînera l’euthanasie.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront injectés à 3 semaines avec des vésicules extracellulaires (produites par des cellules) pour tester leur potentiel fonctionnel à moduler l'environnement dégénératif. Pour greffer un morceau de rétine issu de cellules souches, les rats seront greffés à un stade ou la vue est complétement perdue (vers 2/3mois après la naissance). Les différentes analyses seront réalisées dès 30 jours après l’opération. L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation et jusqu’à 6 mois post-greffe, le stade le plus tardif prévu par l’étude.
Injection de vésicules liposomales pour le traitement des cancers du sein et du poumon sur des modèles murins (UE2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les tumeurs mammaires greffées peuvent atteindre 2 000 mm3, chez des souris qui pèsent une vingtaine de grammes. 120 souris vont être utilisées sur ce second site du même projet, toutes tuées à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées vigiles de cellules cancéreuses, puis d'immunoliposomes à trois reprises et d'un anticorps d'immunothérapie, elles font le trajet entre deux bâtiments pour les séances d'imagerie, avec un risque de métastases pulmonaires et de gêne respiratoire. Le nombre de 120 n'est rattaché à aucun calcul, et l'explication censée exposer la réduction des effectifs reprend mot pour mot la description des tumeurs.
Objectifs
Le cancer du sein est un cancer de la glande mammaire. Autrement dit, c'est un cancer qui naît dans les unités cellulaires dont la fonction est de sécréter le lait, les unités ducto-lobulaires du sein, essentiellement chez la femme. Huit cancers du sein sur dix se déclarent après 50 ans. Premier cancer dans le monde, il touche, en 2016, 1,8 million de femmes par an dans le monde, dont 50 000 femmes en France. On s'attend à ce qu'une femme sur huit reçoive un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie. Le traitement s'est considérablement amélioré au fil des ans, et a conduit à davantage de cas de rémission. Le cancer du poumon est la cause de 1,3 million de décès par an dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont le souffle court, la toux (éventuellement les crachements de sang), et l'amaigrissement. Les principaux types de cancers du poumon sont le carcinome à petites cellules et les cancers non à petites cellules. Malgré les améliorations des traitements actuels, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes) que nous avons validés dans un modèle de lymphome murin. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo, sur d’autres modèles de cancers (sein et poumon). Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins, en greffant, en orthotopique, des lignées cellulaires cancéreuses murines déjà établies dans des souris C57BL/6 et BALB/c. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale. Nous étudierons également l’effet d’une combinaison de ces immunoliposomes avec une immunothérapie anti-PD1, connue pour être efficace et utilisée dans les traitements cliniques des cancers humains. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) situés dans deux bâtiments voisins.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié de nouveaux candidats immunoliposomes qui, une fois injecté par i.v. bloquent les populations immunosuppressives du cancer. Ces immunoliposomes se sont montrés efficaces pour ralentir fortement la prolifération des cellules cancéreuses sur un modèle murin de lymphome. Nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur d’autres modèles murins d’étude du cancer. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des cancers du sein et du poumon.
Procédures
L’injection des cellules cancéreuses se fera une seule fois sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 minutes. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera une seule fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 minutes. La majorité des expérimentations seront faites dans l’établissement utilisateur EU1. Seules les expérimentations qui concernent la prise d’images de bioluminescence sur appareil IVIS seront faites dans l’établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, jusqu’à 2000 mm3 pour le modèle du cancer du sein, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).
Devenir
Tous les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire et qu’il y aura donc une efficacité thérapeutique. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.
Réduction
Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles. Nous avons aussi planifié et établi les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Pour le transport entre les deux établissements utilisateurs, les animaux seront placés dans une cage munie d’un couvercle à filtre. Le transport durera moins de 30 minutes car les établissements sont situés à quelques minutes à pied l’un de l’autre, et les cages seront remplacées à l’arrivée dans le second établissement utilisateur.
Choix des espèces
Nous disposons de modèles de cellules cancéreuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées qui seront injectées à des souris dont le système immunitaire est fonctionnel. Après l’injection, les cellules murines forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection dans la glande mammaire. Ces études ne peuvent se réaliser que sur le modèle murin femelle. L’injection des cellules cancéreuses murines du poumon dans la littérature se fait sur modèle murin, par injection dans le sang, les cellules vont alors se nicher dans les poumons et conduire au développement du cancer. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est préférentiellement choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur le cancer du sein et du poumon. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.
Effet de la survenue d’hémorragies cérébrales dans un contexte de troubles de l’hémostase chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir si un trouble de la coagulation aggrave une hémorragie cérébrale, 450 souris vont subir une chirurgie de trente minutes qui provoque un saignement dans leur cerveau. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une hémophilie ou une maladie de von Willebrand par modification génétique, et chaque animal passe deux IRM sous anesthésie, à quatre heures et à sept jours de l'induction. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner une perte d'appétit, une perte de motivation et une anxiété accrue à plus ou moins long terme, et prévoit, selon les points limites atteints, d'isoler l'animal, de le soigner ou de le mettre à mort.
Objectifs
Notre projet repose sur l'utilisation d'un modèle pré-clinique d'hémorragie intracérébrale (HIC) chez le rongeur, caractérisée par un saignement occasionné par la rupture de vaisseaux cérébraux. Cet accident vasculaire cérébral est l’un des plus dévastateurs, avec en 2018 un taux de mortalité de 50% la première année. Environ 30% des survivants deviennent dépendants 4 ans plus tard. Il n'y a actuellement pas de traitement. Des recherches précliniques et cliniques sont en cours. Mais dans les essais cliniques, les personnes atteintes d'anomalies de l'hémostase (hémophilie, maladie de Von Willebrand...) sont exclues d'emblée, du fait de risque accru de saignement. Ce modèle a été validé chez le rat (projet APAFIS numéro #14066-2018031312529642v3) mais nécessite d'être validé chez la souris pour pouvoir bénéficier de modèles hémophiles dans cette espèce. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelle mesure les troubles hémostatiques influencent la taille et les mécanismes inhérents à la survenue d'une HIC. de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu'à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris (APAFIS n°19866-2019030701722644). Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d'une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l'incidence des MHC et leur transformation en HIC. L'existence d'un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l'hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l'HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l'utilsation de lignées murines d'hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l'influence de troubles de l'hémostase (défaut de coagulation ou de l'hémostase primaire) sur la taille des HIC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur évolution, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L'identification des facteurs prédictifs d'une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d'HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d'un scénario plutôt caricatural d'une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d'autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).
Procédures
Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d'induire les HIC (environ 30 min par intervention), ainsi qu'une IRM à 4h et à 7j de l'injection (chaque IRM dure 30 min).
Impact sur les animaux
L'induction des HIC MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.
Analyse du métabolisme cellulaire du NAD dans un modèle de cardiomyopathie dilatée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quatre injections en quinze jours, dont une sous anesthésie générale pour introduire des biosenseurs fluorescents dans le cœur, puis une échographie sous anesthésie : 432 souris subissent ce protocole, classé au niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées à l'issue pour dissocier leur cœur en cellules isolées et y mesurer le métabolisme du NAD. Le projet prolonge des travaux antérieurs de l'équipe sur une vitamine B3 comme traitement de la cardiomyopathie dilatée, avec une translation vers la clinique renvoyée au futur. Le porteur écrit que l'insuffisance cardiaque "n'est pas un syndrome qui entraîne en soi des douleurs", tout en décrivant des souris en phase avancée qui respirent avec inconfort, ne supportent plus l'effort et peinent à accéder à la nourriture.
Objectifs
La cardiomyopathie dilatée (CMD) est une forme de pathologie cardiaque caractérisée par une augmentation de la taille du coeur et une chute de la capacité du coeur à expulser le sang dans les autres organes qui aggrave fortement le risque de développer une insuffisance cardiaque. Les patients souffrant de CMD ont peu d’options thérapeutiques à part la greffe cardiaque en phase terminale de la maladie. Dans des résultats précédemment publiés, l’équipe d'accueil a observé dans un modèle de souris une chute du niveau d'une enzyme clé du métabolisme dans le cœur. L’équipe a montré que l’administration d’une vitamine B3, le nicotinamide riboside (NR), permet de restaurer les taux de cette enzyme dans le cœur malade et ainsi restaurer partiellement son activité. L’objectif du présent projet est d’analyser plus finement les atteintes du métabolisme de cette enzyme dans le cœur de souris développant une CMD en utilisant des biosenseurs fluorescents. Ces biosenseurs permettent de mesurer sur des cellules cardiaques isolées des souris les différentes formes de l'enzyme dans différents compartiments cellulaires.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront d’avoir une compréhension fine du métabolisme de l'enzyme clé du métabolisme dans les cardiomyocytes encore jamais étudié au degré de précision qu’on peut obtenir avec des biosenseurs fluorescents, aussi bien à l’état physiologique que pathologique et nous permettra de mieux comprendre les effets du traitement à la vitamine et de l’optimiser en vue d’une translation vers la clinique dans le futur.
Procédures
La totalité des animaux recevra quatre injections en début de procédure (J-15 et J1-2-3). L'une permettant l'injection de nos sensors sera réalisée sous anesthésie générale et durera 5 min et les 3 autres permettant l'inactivation de notre gène cible sous anesthésie locale dureront 30 sec. Puis les souris subiront une échographie sous anesthésie générale d'environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’insuffisance cardiaque n’est pas un syndrome qui entraîne en soit des douleurs mais elle se manifeste surtout par une sensation de respiration inconfortable en phase avancée et une incapacité́ à̀ l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale. De ce fait, les souris peuvent avoir une difficulté à̀ accéder à̀ la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure fin de permettre la dissociation du coeur en cellules cardiques. Ceci nous permettra de réaliser des analyses de biochimie, d'imagerie et de biologie moléculaire.
Remplacement
Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque. Les cardiomyocytes adultes primaires isolés de ces modèles ne sont pas totalement reproduits par les modèles in vitro y compris les modèles dérivés de patients humains qui au stade d’aujourd’hui ne reproduisent qu’un stade de différenciation foetal des cardiomyocytes, très loin du modèle adulte.
Réduction
Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude. Les analyses statistiques seront la comparaison de moyennes par un test ANOVA à 2 facteurs en accord avec notre design expérimental.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours (aucun phénotype délétère n’a jamais été détecté avant ce stade). Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état du poil (manque d’hygiène) et un critère propre à l’étude de l’insuffisance cardiaque qui est la manifestation d’une sensation de respiration inconfortable en phase avancée et une incapacité́ à̀ l’effort. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Pour l’échographie, le gel échographique utilisé est chauffé. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre sous lampe chauffante. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage.
Choix des espèces
Le recours à des souris se justifie par la disponibilité des modèles transgéniques spécifiques que nous utilisons par nos études. La souris est un des modèles les plus utilisé́s en recherche biomé́dicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études ont été réaliseées chez la souris ce qui nous permettra de discuter nos résultats par rapport à nos études précédentes et d’autres études publiées. Des animaux adultes âgés de 2 à 3 mois sont utilisés car les maladies cardiovasculaires se déclarent essentiellement à l’âge adulte. Le vieillissement est toutefois un facteur de risque aggravant pour le développement d’une insuffisance cardiaque.
Injection de vésicules liposomales pour le traitement des cancers du sein et du poumon sur des modèles murins EU1
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées sur animal vigile, dans la glande mammaire pour les femelles du modèle mammaire, dans la veine de la queue pour le modèle pulmonaire, l'animal maintenu dans un tube de contention pendant deux minutes. Les tumeurs qui poussent peuvent gêner leurs déplacements, les métastases pulmonaires provoquer une gêne respiratoire, et les souris font le trajet entre deux bâtiments pour les séances d'imagerie de bioluminescence. Le porteur affirme que les immunoliposomes testés ont déjà fait la preuve de leur ciblage in vitro, et que le remplacement "n'est plus possible à ce stade", l'efficacité devant être jugée sur un "organisme entier".
Objectifs
Le cancer du sein est un cancer de la glande mammaire. Autrement dit, c'est un cancer qui naît dans les unités cellulaires dont la fonction est de sécréter le lait, les unités ducto-lobulaires du sein, essentiellement chez la femme. Huit cancers du sein sur dix se déclarent après 50 ans. Premier cancer dans le monde, il touche, en 2016, 1,8 million de femmes par an dans le monde, dont 50 000 femmes en France. On s'attend à ce qu'une femme sur huit reçoive un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie. Le traitement s'est considérablement amélioré au fil des ans, et a conduit à davantage de cas de rémission. Le cancer du poumon est la cause de 1,3 million de décès par an dans le monde. Les symptômes les plus fréquents sont le souffle court, la toux (éventuellement les crachements de sang), et l'amaigrissement. Les principaux types de cancers du poumon sont le carcinome à petites cellules et les cancers non à petites cellules. Malgré les améliorations des traitements actuels, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes) que nous avons validés dans un modèle de lymphome murin. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo, sur d’autres modèles de cancers (sein et poumon). Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins, en greffant, en orthotopique, des lignées cellulaires cancéreuses murines déjà établies dans des souris C57BL/6 et BALB/c. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale. Nous étudierons également l’effet d’une combinaison de ces immunoliposomes avec une immunothérapie anti-PD1, connue pour être efficace et utilisée dans les traitements cliniques des cancers humains. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) situés dans deux bâtiments voisins.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié de nouveaux candidats immunoliposomes qui, une fois injectés dans le sang bloquent les populations immunosuppressives du cancer. Ces immunoliposomes se sont montré efficace pour ralentir fortement la prolifération des cellules cancéreuses sur un modèle murin du lymphome. Nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur d’autres modèles murins d’étude du cancer. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des cancers du sein et du poumon.
Procédures
L’injection des cellules cancéreuses se fera une seule fois sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 minutes. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 minutes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera une seule fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 minutes. La majorité des expérimentations seront faites dans l’établissement utilisateur EU1. Seules les expérimentations qui concernent la prise d’images de bioluminescence sur appareil IVIS seront faites dans l’établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Les nuisances indésirables légère attendues sont au moment de l’injection des cellules cancéreuses, dans la glande mammaire des souris femelles pour le modèle du cancer du sein, ainsi que l’injection intraveineuse, dans la veine caudale dilatée, des cellules cancéreuses du poumon qui se fait dans un tube de contention, qui ne durera pas plus que deux minutes. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules cancéreuses au niveau de la zone d’injection du sein des animaux, ce qui peut occasionner une gêne au déplacement (nuisance modérée). Il y a aussi un risque de formation de métastases pulmonaires avec ce modèle. Pour le modèle du cancer du poumon, le développement du cancer se fait dans les poumons, avec l’apparition de métastases (foci). Ce développement tumoral peut engendrer une détresse chez certains animaux, comme une gêne à la respiration (nuisance modérée).
Devenir
Tous les animaux seront sous anesthésie mis à mort à l’issue des expériences
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leurs efficacités in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour chaque modèle de cancers (sein et poumon), nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles. Nous avons aussi planifié et établi les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Pour le transport entre les deux établissements utilisateurs, les animaux seront placés dans une cage munie d’un couvercle à filtre. Le transport durera moins de 30 minutes car les établissements sont situés à quelques minutes à pied l’un de l’autre, et les cages seront remplacées à l’arrivée dans le second établissement utilisateur.
Choix des espèces
Nous disposons de modèles de cellules cancéreuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées qui seront injectées à des souris dont le système immunitaire est fonctionnel. Après l’injection, les cellules murines forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection dans la glande mammaire. Ces études ne peuvent se réaliser que sur le modèle murin femelle. L’injection des cellules cancéreuses murines du poumon dans la littérature se fait sur modèle murin, par injection dans le sang, les cellules vont alors se nicher dans les poumons et conduire au développement du cancer. L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est préférentiellement choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur le cancer du sein et du poumon. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.
Titre du projetExploration de nouveaux agents thérapeutiques pour la maladie de Niemann-Pick type C avec un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 070 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever des tissus, et chacune passe d'abord par une biopsie de la queue à six jours, un génotypage que le porteur qualifie lui-même d'invasif. 1 150 sont soumises à des procédures d'un niveau de souffrance léger, 340 modéré, 580 sévère. Un groupe reçoit une injection dans les deux yeux sous anesthésie, avec un risque de lésions oculaires, un autre une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre semaines, pouvant provoquer inflammations et lésions locales. Les souris atteintes de la maladie de Niemann-Pick perdent l'équilibre et la coordination, tremblent et maigrissent à partir de six semaines, et le porteur revendique d'avoir choisi la lignée aux symptômes les plus précoces pour que les animaux "souffrent moins" en étant gardés moins longtemps.
Objectifs
La maladie génétique rare étudiée se manifeste par des symptômes métaboliques et neurologiques très variés. Elle est difficile à diagnostiquer et d’évolution fatale. Actuellement, il n'y a pas de traitement curatif. Le but principal de ce projet est de mieux comprendre l'effet de molécules potentiellement thérapeutiques sur l'accumulation pathologique de cholestérol dans cette maladie en utilisant des souris comme modèle expérimental. Deuxièment, l'objectif est de décrire plus précisément les changements pathologiques de ce modèle murin, à l'âge de 10 semaine, stade tardif de la maladie.
Bénéfices attendus
Il s'agit de valider in vivo l'effet de candidat médicament dans un modèle murin de maladie génétique d'accumulations pathologiques de lipides, et à la fois d'obtenir des connaissances approfondies du modèle à 10 semaines.
Procédures
Un groupe d'animaux anesthésiés 10 minutes recevra une injection unique dans l'oeil qui permet de cibler et délivrer une molécule aux neurones de la rétine par une voie modérement invasive. Le deuxième groupe d'animaux vigiles recevra une injection une fois par jour d'une molécule thérapeutique pendant 4 semaines. Pour constituer les groupes expérimentaux, tous les animaux seront génotypés par un génotypage de type "invasif", en biopsiant la queue des souris vers l'âge de 6 jours.
Impact sur les animaux
Les injections intraoculaires bilatérales sous anesthésie générale peuvent générer un inconfort passager, et potentiellement un risque de lésions oculaires. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent stresser les souris et provoquer des inflammations ou des lésions locales qu'il faudra surveiller Quant aux souris âgées de 10 semaines, elles développent des symptômes neurologiques (pertes d'équilibre et coordination, tremblements) accompagnés d’un amaigrissement à partir de 6 semaines d'âge.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour prélever des tissus.
Remplacement
Nous sommes obligés d'utiliser des animaux pour étudier les effets de molécules comme therapeutiques dans la maladie. Ces mécanismes dépendent d’interactions complexes entre une multitude de types cellulaires hautement spécialisés qui ne peuvent pas être imitées par des modèles alternatifs in vitro.
Réduction
Nous utilisons mâles et femelles pour réduire de moitié le nombre de souris. Et chaque souris est son propre contrôle et permet ainsi de réduire encore de moitié le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des souris seront raffinées : les souris d'une même portée seront gardées ensemble après le sevrage jusqu’au moment de leur mise à mort et les cages sont enrichies avec du matériel de nidation et de barreaux à ronger. Elles seront nourries avec des bouchons ainsi qu’une forme gélifiée (pour faciliter la préhension) du même aliment, placés directement dans la litière pour faciliter l’accès aux souris si elles présentent des troubles locomoteurs. Les souris seront maniées à l'aide d'un tunnel de manipulation. Un suivi clinique quotidien sera assuré (ouverture de la cage pour l’examen du comportement locomoteur), ainsi que celui du poid. Une partie des injections sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Nous avons aussi établi des points-limites permettant de soustaire l'animal à la souffrance.
Choix des espèces
La souris représente un modèle animal bien établi et reconnu pour étudier la rétine des mammifères et ses maladies. Il existe d’autres lignées murines et félines avec des mutations naturelles ou induites dans le même gène. Nous préférons utiliser la lignée choisie car elle développe les symptômes plus tôt et plus rapidement. Par conséquent, les souris souffrent moins que dans les autres modèles, qui ont besoin d'être maintenus plus longtemps. Dans l'étude de candidat médicament, les animaux seront utilisés à 4 semaines, soit après le sevrage et ne présenteront pas encore de symptôme de la maladie. Pour étudier et décrire les changements pathologiques très tardifs de la maladie, nous utiliserons des animaux âgés de 7 et 10 semaines.