Recherche fondamentale
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Développement de nouveaux modèles combinant génétique et facteur environnemental pour l’étude d’une maladie métabolique du foie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Deux gavages chez la femelle gestante, cinq injections chez les nouveau-nés, un bout de queue de un à deux millimètres prélevé au septième jour pour le génotypage : 884 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes les interventions étant réalisées sur animal vigile. Les souriceaux qui développent la maladie visée présentent une jaunisse et un retard de croissance, la biopsie de queue entraînant selon le porteur une douleur modérée et passagère. L'objet déclaré est de combiner la délétion d'un gène du foie avec des molécules toxiques pour les canaux biliaires, afin d'obtenir une malformation des voies biliaires à un âge plus précoce que dans les travaux publiés. Tous les souriceaux seront tués à vingt et un jours et les adultes des croisements à la fin de la procédure, sans autre raison donnée que le fait qu'ils sont "nécessaires pour notre étude".
Objectifs
L’objectif de ce projet est l'étude de souris dans des modèles environnementaux de la malformation des voies biliaires lors du développement embryonnaire en utilisant des molécules potentiellement toxiques pour les canaux bilaires couplé à la délétion d'un gène impliqué dans le fonctionnement hépatique. Cela permettra d’étudier le développement de la maladie à des âges plus précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement d’un modèle combinant la délétion génétique avec un facteur environnemental pouvant expliquer la cause de la maladie, c'est à dire des molécules pharmacologiques dans ce contexte. Il permettra également d’étudier les mécanismes métaboliques et inflammatoires menant aux symptômes précoces de la maladie et pourront être utilisés à l'avenir pour la découverte de nouveaux traitements.
Procédures
Toutes les interventions sont réalisées sur animal vigile. 5 injections de 10sec chez les nouveaux nés. 2 gavage de 30sec chez la femelle gestante. Prélèvement d'un bout de queue 1 à 2 mm le 7ème jour post natal.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances seront les injections sur les nouveaux nés et les gavages chez les femelles gestantes. Elles entrainent une douleur légère et passagère. Dans le cas où les animaux développent la maladie, les symptômes seront une jaunisse et un retard de croissance (poids moins élevés). Pour le génotypage un prélèvement d'un à deux millimètres de queue sera prélevé entre 7 jours après la naissance ce qui entraîne une douleur modérée et passagère.
Devenir
Tous les nouveaux nés seront mis à mort à 21 jours d'âge car ils sont nécessaires pour notre étude et tous les animaux adultes des croisements seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Cette étude permettra de valider les mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Les cultures cellulaires ne peuvent pas complétement remplacer les études in vivo pour l'étude de la mise en place de la fibrose et l'étude du développement de l'arbre biliaire lors de l'embryogénèse.
Réduction
Dans un souci de réduction des animaux les deux sexes seront utilisés car les études précédentes n’ont pas montré de différence en fonction des sexes pour le développement de cette maladie. De multiples paramètres seront analysés pour chaque souris. Afin de vérifier que les résultats sont statistiquements significatifs des tests adaptés seront utilisés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Afin de limiter le stress des animaux seul l’expérimentateur du projet sera amené à manipuler les animaux durant la période de croissance des nouveaux nés. Les manipulations seront effectuées le plus rapidement et calmement possible. Pour les nouveaux nés l’utilisation d’une table chauffante durant les pesées permettra de limiter la perte de chaleur des animaux. Des aiguilles adaptées à la taille et au poids (volumes adaptés) de l’animal seront utilisés pour les injections. Pendant toutes les procédures une grille de score avec des points limites spécifiques ont été établis. Notamment l’expérimentateur fait un suivi journalier pour les nouveaux nés.
Choix des espèces
Le choix de la souris est lié à la conservation des mécanismes de l'homéostasie métabolique physiologiques et physiopathologiques dans le foie entre l'humain et la souris. Elle a été confirmée par de nombreuses études. En particulier, le développement de l’arbre biliaire est similaire entre espèces. Les souris néonatales (P1 à P21) pour étudier le développement du foie et de l’arbre biliaire ainsi que des souris adultes gestantes (de 6 semaines minimum).
Étude chez la souris de l’influence conjointe des variants du gène de l’apolipoprotéine E, du sexe et d’une alimentation riche en graisses sur des changements biologiques liés à la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois tests comportementaux répétés deux fois, un prélèvement sanguin précédé d'un jeûne de trois heures et huit pesées hebdomadaires : 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leur sang et leurs structures cérébrales. Une partie d'entre elles reçoit un régime riche en graisses, avec une prise de poids attendue sous les 30 %, pour observer comment l'alimentation et les variants du gène de l'apolipoprotéine E modifient les membranes des cellules du cerveau. Le porteur affirme que l'étude de l'impact des régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un "organisme entier" et écrit que cette étude in vivo est "indispensable et irremplaçable". Il annonce trois tests comportementaux qu'il décrit comme indolores, sans préciser lesquels, tout en signalant un stress de manipulation lors de deux d'entre eux.
Objectifs
Les cellules de notre cerveau sont entourées d’une membrane composée de graisses nécessaires pour leur permettre de fonctionner correctement. Mais avec l'âge, sous l’influence d’une mauvaise alimentation ou de certains gènes, la composition en graisses des membranes devient déséquilibrée, occasionnant des dommages pouvant déclencher (bien avant l'apparition des premiers symptômes) une cascade de problèmes et d’anomalies menant à la mort des neurones et à la maladie d’Alzheimer (MA). Notre projet veut élucider, chez les individus de sexe masculin ou féminin, comment l’alimentation riche en graisses et certains gènes (dont un qui est un facteur de risque majeur) perturbent le fonctionnement des cellules nerveuses et favorisent la production de produits hautement neurotoxiques capables d’initier les lésions cérébrales liées à la MA. Notre objectif est de comprendre comment un régime alimentaire trop gras peut perturber les membranes des cellules du cerveau et favoriser les troubles liés à la MA, dans le but ultime de proposer de nouvelles stratégies de prévention.
Bénéfices attendus
Ce projet doit créer des modèles fiables pour étudier l’influence de la génétique, de régimes gras et du sexe sur l’apparition de la maladie d’Alzheimer, dans le but de découvrir des marqueurs biologiques pour identifier les personnes à risque et leur proposer une prévention appropriée.
Procédures
1. Tests comportementaux indolores (3, réalisés 2 fois), d’une durée de 10 à 15 minutes par test 2. Prélèvement unique d’un très faible volume sanguin, d’une durée inférieure à 30 sec 3. Mesure du poids corporel (hebdomadaire sur 8 semaines), d’une durée maximale de 1 min par pesée
Impact sur les animaux
- Stress légers de manipulation et de situation induits lors de deux des trois tests comportementaux - Un jeûne de 3 h préalable au prélèvement sanguin - Stress léger de manipulation lors de la pesée hebdomadaire - Une prise de poids (attendue à moins de 30 %) des animaux sous régime gras
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue de l'étude afin de prélever le sang et les structures cérébrales requises pour l’analyse des marqueurs biologiques d’intérêt.
Remplacement
L'étude de l’impact de régimes alimentaires sur le cerveau ne peut s'effectuer que sur un organisme entier. Cette étude in vivo est indispensable et irremplaçable, mais elle s'appuie sur une étude préalable menée sur des cellules en culture et dont les résultats permettent de limiter au strict minimum le nombre d’expérimentations animales.
Réduction
Nous avons minimisé les effectifs de souris en nous appuyant sur l’expérience cumulée par l’équipe lors de diverses études conduites lors des 15 dernières années. Les simulations opérées pour réduire les effectifs au strict nécessaire recommandent un minimum de 9 souris par groupe expérimental, sachant qu’il est indispensable d’évaluer l’impact du sexe. À ceux-ci s’ajoutent 5 animaux par groupe pour les études des tissus cérébraux et 4 animaux par groupe pour l’étude des lipides cérébraux à la moitié du régime.
Raffinement
Toutes les étapes du protocole seront assurées par des expérimentateurs qualifiés et en parfaite maîtrise des gestes techniques et dans le respect scrupuleux des réglementations en vigueur. Les animaux seront hébergés dans des espaces conçus pour minimiser le stress. Ils seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de santé et détecter d’éventuels signes de détresse (par exemple la posture, l’activité et le poids). Tous les prélèvements seront menés sous anesthésie et les tests sont courts et sans douleur.
Choix des espèces
Ce projet utilise des souris adultes mâles et femelles, couramment utilisées pour la sensibilité aux régimes gras qui en fait de bons modèles afin d’étudier comment la génétique et l’alimentation peuvent augmenter le risque de maladie d'Alzheimer.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un agoniste ocytocinergique dans des modèles de douleur neuropathique et de dépression induite par le stress chronique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux cent quatre-vingts souris subissent une chirurgie de la cuisse sous anesthésie pour léser un nerf, cent quarante reçoivent dix injections de vincristine, un anticancéreux qui provoque des douleurs nerveuses, et deux cent dix sont soumises à des stresseurs quotidiens d'une heure pendant vingt et un jours. 780 souris sont utilisées au total, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère, toutes tuées pour analyser leurs tissus nerveux. Le porteur écrit que ces douleurs "peuvent durer plusieurs semaines", et écrit aussi : "Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs." Le traitement est bu au bout d'une micropipette par 490 souris et administré par gavage à 240 autres, et l'évaluation passe par quatre tests comportementaux sur quatre jours consécutifs, que le résumé ne nomme pas.
Objectifs
Ce projet de recherche préclinique vise à caractériser les effets thérapeutiques d’un nouveau composé ciblant les récepteurs de l’ocytocine dans des contextes pathologiques pertinents. Plus précisément, il s’agit d’évaluer son potentiel analgésique dans deux modèles murins de douleur neuropathique (chimio-induite et lésionnelle), ainsi que son potentiel antidépresseur dans un modèle de dépression induite par un stress chronique variable. Les effets de ce composé seront comparés à ceux de traitements de référence déjà utilisés en clinique (duloxétine, prégabaline, fluoxétine). L’effet de la molécule améliorée présentée sous forme de suspension pour faciliter la translation en clinique sera ensuite évalué dans le modèle de douleur neuropathique lésionnelle et dans une évaluation des comportementaux sociaux afin de déceler tout effets indésirables potentiels.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’un nouveau candidat thérapeutique dans des pathologies à fort impact clinique et sociétal : les douleurs neuropathiques chroniques et la dépression. Il pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de nouvelles approches pharmacologiques ciblant le système de l’ocytocine comme alternative ou complément aux traitements actuels.
Procédures
Les animaux de ce projet participeront à différentes interventions : • Douleur neuropathique pour 280 d'entre eux: une petite chirurgie est réalisée sur la cuisse de l’animal sous anesthésie (environ 30 minutes) pour provoquer une légère douleur similaire à celle observée après certaines atteintes nerveuses. Après une semaine de récupération, les animaux sont suivis régulièrement avec des tests simples et non invasifs • Douleur liée à la chimiothérapie pour 140 animaux : les animaux reçoivent un traitement par vincristine, un médicament anticancéreux connu pour causer des douleurs nerveuses. Dix injections sont administrées sur deux semaines (deux séries de 5 jours, séparées par une pause de 2 jours). Les réactions nociceptives sont mesurées chaque jour avec des tests courts (5 à 20 minutes). • Stress chronique pour les 210 autres: pendant 21 jours, les souris sont soumises à différents petits stresseurs, chacun durant environ une heure. À la fin, leur comportement est évalué avec 4 tests, réalisés sur 4 jours consécutifs. Les traitements sont donnés chaque jour sous forme liquide, que les animaux apprennent à boire spontanément au bout d’une micropipette pour 490 d’entre eux MODIFICATION : ou par gavage (1 fois/j pendant 21 jours) pour 240 d’entre eux. Enfin, à la fin de l’étude, certains animaux sont profondément anesthésiés pour un prélèvement de tissus (système nerveux) afin de réaliser des analyses scientifiques.
Impact sur les animaux
Les souris pourront ressentir des douleurs nerveuses, provoquées soit par une petite chirurgie sous anesthésie, soit par l’administration répétée d’un médicament anticancéreux (vincristine). Ces douleurs peuvent durer plusieurs semaines. Dans un autre modèle, les animaux seront exposés à des situations de stress pendant 21 jours afin de reproduire des symptômes de type anxieux ou dépressif. Pour évaluer ces symptômes, les souris seront soumises à des tests comportementaux courts (3 à 20 minutes), réalisés une ou deux fois par jour au maximum, sur plusieurs semaines selon le modèle. Des limites précises sont établies pour arrêter immédiatement la procédure si un animal présente des signes persistants de souffrance. MODIFICATION : L’administration du produit par gavage oral nécessite de manipuler les animaux chaque jour, ce qui peut entraîner un léger stress temporaire. Cette technique est couramment utilisée et maîtrisée. Dans de rares cas, une irritation de la gorge peut apparaître, et très exceptionnellement une complication respiratoire. Ces risques restent très faibles lorsque la procédure est réalisée par du personnel formé et avec des précautions adaptées.L’objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement qui pourrait soulager à la fois la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs. Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs. Enfin, la molécule testée cible un des systèmes impliqués dans la régulation des comportements sociaux, ainsi des modifications comportementales non souhaitées (altération des interactions sociales, augmentation ou diminution de la sociabilité, comportements d’évitement ou d’agitation) pourraient apparaître au cours du traitement.
Devenir
Toutes les procédures : Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus nerveux.
Remplacement
Le remplacement par des méthodes in vitro ou in silico n’est pas envisageable dans ce projet. Les comportements de douleur, anxiété ou dépression nécessitent l’observation de l’animal vivant et vigile dans un contexte environnemental contrôlé.
Réduction
Toutes les expériences seront menées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire pour garantir la fiabilité scientifique des résultats. Pour cela, des calculs ont été réalisés à partir de données déjà obtenues afin de déterminer combien d’animaux sont indispensables, sans excès. Chaque souris sera testée sur plusieurs comportements, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations avec un même individu. Dans les modèles de douleur et pour l’évaluation des comportementaux sociaux, 10 animaux par groupe et par sexe suffisent pour obtenir des résultats fiables. Dans le modèle de stress chronique, où tous les animaux ne développent pas les mêmes symptômes, il est nécessaire d’avoir jusqu’à 15 animaux par groupe et par sexe afin d’assurer une analyse statistique robuste. MODIFICATION : Pour l’évaluation des comportements sociaux, des animaux “interacteurs” seront inclus afin de permettre la réalisation des tests, selon un ratio de 1 interacteur pour 2 animaux testés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux afin de respecter leurs besoins éthologiques. Leur environnement sera enrichi par l’ajout de carrés de coton pour la nidation et de bâtonnets de bois à ronger, afin de limiter le stress et les comportements agressifs. Avant les expérimentations, les animaux seront habitués aux manipulations, aux dispositifs expérimentaux ainsi qu’à la prise volontaire de solutions par micropipette, afin de réduire les réactions de peur et d’évitement. Les tests comportementaux seront limités à deux par jour maximum, espacés d’au moins 4 heures pour éviter fatigue et stress. Une observation quotidienne attentive permettra de détecter tout signe de stress, de douleur ou de comportement anormal. Un suivi renforcé sera assuré après toute intervention chirurgicale. Lors des chirurgies, les animaux seront anesthésiés et placés sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle. Un gel ophtalmique sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Les procédures seront réalisées en conditions stériles. Après l’intervention, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine pour récupérer dans un environnement familier, avec un accès facilité à la nourriture et à l’eau (y compris sous forme gélifiée si nécessaire). MODIFICATION : Lorsque cela est possible, l’administration par micropipette, reposant sur une prise volontaire d’une solution appétente, constitue une mesure de raffinement en évitant la contention. Des points limites précoces sont définis : tout animal présentant des signes persistants de souffrance ou une altération importante de son état sera retiré de l’étude et, si nécessaire, euthanasié. Des améliorations méthodologiques pourront être intégrées en cours de projet en concertation avec la SBEA. MODIFICATION : En cas de gavage, celui-ci sera réalisé par du personnel formé, avec du matériel adapté au poids des animaux. Une manipulation douce et une habituation à la contention seront mises en place. Une surveillance quotidienne (poids, comportement, respiration) permettra de détecter rapidement toute complication. Des critères d’arrêt anticipé seront appliqués en cas de signes de détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé en neurosciences et dans l’étude de la douleur. Ses systèmes biologiques sont proches de ceux de l’humain, ce qui permet de tirer des conclusions transposables aux maladies étudiées. Elle présente aussi l’avantage de disposer de nombreuses données de référence et de lignées bien caractérisées, ce qui facilite la comparaison avec d’autres travaux scientifiques. Les animaux utilisés seront des adultes (8 semaines, > 20 g), stade nécessaire à la maturité comportementale.
Rôle de la PKA et du contrôle traductionnel dans la régulation du cycle cellulaire lors des divisions embryonnaires précoces chez Xenopus laevis.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Vingt des 110 femelles de Xénope utilisées viennent déjà d'un projet antérieur, où elles ont subi des cycles d'ovulation similaires. Toutes reçoivent une injection hormonale destinée à induire l'ovulation, jusqu'à quatre fois sur la durée du projet et à six mois d'intervalle, et sont isolées la nuit le temps de la ponte, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit que cet isolement ne constitue pas une nuisance significative, "le Xénope étant considéré comme un animal non social à mode de vie solitaire", tout en indiquant que les femelles retournent en aquarium collectif après 48 heures. Cent d'entre elles seront tuées quand leur ponte baissera durablement en quantité ou en qualité, les dix autres restant en vie pour être réutilisées dans un futur projet autorisé.
Objectifs
Tous les organismes se développent grâce aux divisions de leurs cellules : chaque cellule copie son matériel génétique puis le répartit entre deux cellules filles. Le projet vise à comprendre comment les premières divisions cellulaires sont contrôlées au début du développement embryonnaire. Le développement précoce est largement conservé chez les Vertébrés et peut être facilement étudié chez le Xénope, car la fécondation et le développement de l’embryon ont lieu à l’extérieur de la femelle. Chez les Vertébrés, les toutes premières divisions de l’embryon sont très rapides et bien coordonnées. Elles reposent surtout sur les réserves déjà accumulées dans l’ovocyte par la mère, avant que le génome de l’embryon ne devienne pleinement actif. La réussite de ces premières divisions est essentielle, car elle permet à l’embryon de s’organiser correctement et de mettre en place ses axes, qui définiront progressivement les futures régions du corps, comme la tête, le dos, le ventre et les membres.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet concernent d’abord une meilleure compréhension des premières divisions de l’embryon. Après la fécondation, l’embryon se divise très rapidement et de façon très coordonnée, alors même que son propre génome est encore peu actif. Ce projet permettra d’identifier les mécanismes moléculaires qui organisent ces premières divisions, notamment les voies de signalisation et les protéines qui contrôlent le cycle cellulaire. Le projet pourra ensuite aider à mieux comprendre certains échecs précoces du développement et certaines formes d’infertilité. Les études sur l’embryon humain sont très limitées, et le modèle souris ne reproduit pas toujours fidèlement tous les mécanismes précoces présents chez les autres vertébrés. Le Xénope permet d’étudier facilement ces étapes et d’identifier des gènes conservés chez l’Homme, qui pourraient être impliqués dans des défauts de fécondation, de premières divisions ou d’arrêt précoce du développement. Un autre bénéfice concerne la compréhension du cancer. Les premières divisions embryonnaires utilisent des régulateurs fondamentaux de la division cellulaire. Ces mêmes régulateurs peuvent, lorsqu’ils sont dérégulés dans d’autres cellules, contribuer à une prolifération incontrôlée. Le projet pourrait donc révéler de nouveaux acteurs importants du contrôle de la division cellulaire. Enfin, le projet permettra de mieux comprendre comment l’embryon s’organise au tout début du développement. Certaines molécules étudiées sont déjà présentes dans l’ovocyte avant la fécondation et sont nécessaires pour organiser correctement l’embryon. Leur caractérisation aidera à mieux comprendre les causes possibles d’arrêts précoces du développement ou d’anomalies dans la mise en place des axes de l’embryon, comme le futur dos, le ventre, la tête et les membres.
Procédures
Les femelles de Xénope sont soumises, à l’état vigile, à une stimulation hormonale par injection afin d’obtenir des œufs destinés aux fécondations in vitro. Il s’agit d’une intervention légère, car elle ne comporte aucun geste chirurgical et la manipulation est très courte. La contention dure moins d’une minute, uniquement le temps de réaliser l’injection avec une seringue munie d’une aiguille fine de faible diamètre. Chaque femelle peut être stimulée au maximum quatre fois sur la durée du projet, avec un intervalle d’au moins six mois entre deux stimulations.
Impact sur les animaux
Des nuisances minimales sont attendues, principalement liées à un stress transitoire associé à la contention et à l’injection destinée à induire l’ovulation chez les femelles. Les femelles reçoivent uniquement une injection afin d’induire l’ovulation. Elles sont ensuite maintenues en hébergement individuel pendant la nuit afin de permettre l’ovulation. Cet hébergement individuel temporaire, limité à la période de ponte, ne constitue pas une nuisance significative, le Xénope étant considéré comme un animal non social à mode de vie solitaire.
Devenir
À l’issue des procédures de stimulation hormonale, il est estimé qu’environ 100 femelles arriveront en fin de période de production d’œufs de qualité suffisante pour les besoins du projet, avec une baisse durable de la capacité à pondre ou de la qualité des œufs. Elles seront donc euthanasiées conformément aux points limites définis. Environ 10 autres femelles continueront à produire des œufs de bonne qualité et seront maintenues en vie afin de pouvoir être réutilisées dans le cadre d’un futur projet autorisé.
Remplacement
Notre objet d’étude est l’embryon précoce de Xenopus laevis. À ce stade, l’embryon se développe grâce aux molécules déjà présentes dans l’œuf, qui contrôlent les premières divisions cellulaires et l’organisation progressive de l’embryon. Ces étapes ne peuvent pas être reproduites correctement avec des cellules cultivées en laboratoire, car elles dépendent de l’embryon entier, de sa forme, de son organisation dans l’espace, des échanges entre ses différentes cellules, ainsi que des composants fournis par la mère au cours de la croissance de l’ovocyte. Il n’est donc pas possible de remplacer entièrement ce modèle par des cellules isolées, des systèmes artificiels ou une modélisation informatique. Nous devons donc utiliser des embryons intacts, obtenus par fécondation in vitro à partir de gamètes de Xénopes adultes, puis les cultiver in vitro uniquement aux stades précoces nécessaires au projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous profitons du fait qu’une femelle de Xénope peut pondre environ 1000 œufs dans le milieu extérieur après une seule stimulation hormonale. Cela constitue un avantage par rapport aux modèles mammifères, où le nombre d’ovocytes est beaucoup plus faible, environ 20 chez la souris, et où les ovocytes sont ovulés dans l’oviducte. Les œufs pondus puis fécondés issus d’une même ponte peuvent donc être répartis entre plusieurs expériences réalisées en parallèle, ce qui évite de stimuler de nouvelles femelles pour chaque expérience. Les embryons sont étudiés seulement au tout début de leur développement, avant le stade 47, c’est-à-dire avant qu’ils ne soient considérés comme des animaux dans le cadre de cette réglementation. Pour chaque condition expérimentale, nous utilisons le plus petit nombre d’embryons permettant d’obtenir des résultats interprétables, généralement 5 embryons par condition et par répétition expérimentale. Les expériences sont discutées chaque semaine au sein de l’équipe afin d’éviter les doublons et les répétitions inutiles. Au total, 110 femelles sont utilisées dans cette procédure, dont 20 proviennent d’un projet précédent, où elles ont suivi des cycles d’ovulation similaires et ont reçu moins de quatre stimulations hormonales. Les stimulations sont espacées d’environ six mois, et une même femelle peut être stimulée jusqu’à quatre fois, ce qui permet de réduire fortement le nombre de femelles nécessaires.
Raffinement
Les animaux nouvellement commandés sont placés en quarantaine puis acclimatés à leur nouvel environnement pendant quatre semaines. Les femelles sont maintenues dans des aquariums adaptés, avec une eau déchlorée, filtrée et maintenue à 20 degrés. Leur environnement est enrichi par des plantes en plastique et des objets adaptés à leur taille. Les animaux sont nourris régulièrement avec une alimentation variée, comprenant des granulés, des vers de vase et, si nécessaire, du cœur de bœuf. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et sont limitées au strict nécessaire. Lors des changements d’aquarium, les animaux sont attrapés doucement, à la main ou avec une épuisette, afin de réduire le stress. La stimulation hormonale consiste en une simple injection sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. La contention est douce et très brève, limitée au temps nécessaire à l’injection (moins d’une minute). Les Xénopes sont surveillés quotidiennement par le personnel animalier. Après la ponte, les femelles sont placées pendant 48 h en aquarium individuel afin de prévenir les infections et de vérifier leur bon état général, notamment leur mobilité et leur comportement. Elles sont ensuite replacées en aquarium collectif. Le point limite correspond à l’atteinte de quatre cycles de stimulation hormonale ou, indépendamment du nombre de cycles réalisés, à une détérioration de l’état général de l’animal constatée lors du suivi des signes cliniques et confirmée par le vétérinaire. Dans les deux cas, l’animal est euthanasié selon la méthode réglementaire.
Choix des espèces
L’embryon précoce de Xénope est un modèle très utile pour étudier les premières étapes du développement. Après une stimulation hormonale, une femelle peut pondre un grand nombre d’œufs dans le milieu extérieur, qui sont facilement fécondés in vitro. Cela constitue un avantage par rapport à la souris, chez laquelle le nombre d’ovocytes obtenus est beaucoup plus limité et leur récupération nécessite l’euthanasie de la femelle. Chez le Xénope, une seule ponte permet d’obtenir de nombreux embryons qui se développent dans le milieu extérieur, ce qui facilite les expériences et limite le nombre d’animaux nécessaires. Les œufs et les embryons de Xénope sont grands et riches en molécules importantes pour le développement. Ils permettent donc d’étudier facilement les premières divisions de l’embryon et les mécanismes qui contrôlent son organisation. Comme ces mécanismes sont en grande partie conservés chez les Vertébrés, donc le Xénope peut aider à identifier des gènes ou processus impliqués dans des défauts précoces du développement ou certaines formes d’infertilité humaine. Les animaux adultes sont utilisés uniquement pour obtenir les œufs et le sperme nécessaires aux fécondations in vitro. Les femelles utilisées sont âgées d’au moins 18 mois, sans limite d’âge supérieure prédéfinie. Elles peuvent recevoir au maximum quatre stimulations hormonales et sont identifiées individuellement par puce afin d’assurer leur suivi.
Etude de l’impact des dermatites sur la réactivité gliale et les conséquences sur la démangeaison et les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Tuées à la fin de chaque procédure pour des prélèvements de tissus, 3 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur la peau des applications répétées de substances qui provoquent une inflammation ou abîment la barrière cutanée, jusqu'à dix applications en cinq jours pour la peau sèche, et jusqu'à neuf applications sur trois semaines pour un autre protocole d'induction. Le porteur indique que ces souris peuvent présenter des lésions cutanées, des rougeurs, un épaississement de la peau et des grattages répétés, avec un inconfort transitoire ou persistant, et qu'elles passent jusqu'à six séances de tests de grattage, de stimulation cutanée légère et d'exploration, de dix à quarante-cinq minutes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures et les tissus isolés ne reproduisent pas ensemble l'inflammation, l'activation des nerfs et le grattage, et qu'il est donc "nécessaire d'utiliser des modèles animaux permettant d'étudier la démangeaison dans un organisme entier".
Objectifs
La démangeaison est une sensation très fréquente dans les maladies de peau. Elle pousse à se gratter et peut devenir difficile à supporter lorsqu’elle dure longtemps. Dans ce cas, elle peut gêner le sommeil, augmenter le stress et modifier le comportement. Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi la peau démange et pourquoi cette sensation peut devenir chronique. Nous allons étudier le rôle des nerfs qui transmettent le signal de démangeaison depuis la peau, ainsi que celui de cellules de soutien présentes dans le système nerveux. Ces cellules peuvent influencer la façon dont le signal de démangeaison est traité. L’objectif est de comprendre comment ces différents acteurs participent à l’apparition, au maintien et aux conséquences de la démangeaison.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes neurobiologiques du prurit et sur la manière dont les signaux provenant de la peau sont traités par le système nerveux. Il apportera également des informations nouvelles sur l’impact du prurit chronique sur le comportement et l’état émotionnel. À moyen et long terme, ces connaissances pourront contribuer à orienter la recherche dans le domaine du prurit chronique et des maladies cutanées associées, sans constituer une évaluation directe de traitements chez l’animal.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. Injections Les animaux recevront des injections répétées selon les procédures La durée de chaque injection est d’environ 5 à 10 secondes. Selon la nature de l’injection, les gestes sont réalisés sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse brève. Le nombre maximal d’injections pour un même animal est de 6 injections au total, réparties sur une période pouvant aller jusqu’à environ 4 semaines, dans le cas d’une injection initiale suivie, après un délai nécessaire à son action, d’injections répétées d’un produit permettant de moduler l’activité de cellules ciblées. Dans les autres procédures, le nombre d’injections est inférieur ou égal à 4, réparties sur 3 jours à 2 semaines selon le protocole. 2. Applications cutanées répétées Dans les modèles de dermatite chronique, les animaux sont soumis à des applications cutanées répétées de substances induisant une inflammation ou une altération de la barrière cutanée. Chaque application a une durée d’environ 10 à 30 secondes et est réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin de limiter le stress lié à la contention. Le nombre maximal d’applications cutanées est de 10 applications sur 5 jours pour le modèle de peau sèche, réalisé deux fois par jour. Pour les modèles de dermatite induits par des agents inflammatoires ou allergènes, le schéma le plus long correspond au modèle HDM, avec 9 applications réparties sur 3 cycles, soit environ 3 semaines. 3. Manipulations comportementales et observations Les animaux sont soumis à des tests comportementaux non invasifs, incluant l’observation du comportement de grattage, des stimulations cutanées légères et des tests d’exploration. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles et ont une durée comprise entre 10 et 45 minutes par session, selon le test. Le nombre maximal de sessions comportementales pour un même animal est de 6 sessions. Ces sessions sont réparties sur la durée de la procédure, jusqu’à environ 3 semaines pour les modèles les plus longs, avec habituation préalable lorsque nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont principalement liées à l’induction des modèles de prurit, aux administrations de produits par différentes voies d’administration, aux manipulations expérimentales associées et aux évaluations comportementales répétées. Dans les modèles de prurit chronique associés à une inflammation cutanée, les animaux peuvent présenter des lésions cutanées locales, des rougeurs, un épaississement de la peau et des comportements de grattage répétés, associés à un inconfort transitoire ou persistant dont l’intensité dépend du modèle utilisé et de la durée d’exposition. Les modèles de prurit aigu peuvent entraîner une réponse transitoire de grattage et un inconfort de courte durée, sans inflammation chronique. Les administrations de produits peuvent entraîner un inconfort transitoire lié à la contention, au geste d’administration ou à l’effet attendu du produit administré. Des réactions locales au point d’administration peuvent également survenir, incluant une rougeur, un gonflement, une irritation, une inflammation locale ou, plus rarement, une infection ou une ulcération. Certaines interventions expérimentales visant à moduler l’activité neuronale et/ou gliale peuvent entraîner une modification transitoire de l’activité des cellules ciblées, pouvant s’accompagner d’un inconfort ou d’une douleur de courte durée selon la population cellulaire concernée et la modalité utilisée. Les évaluations comportementales peuvent générer un stress modéré lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel environnement ou à la répétition des tests. Elles sont réalisées sur des durées limitées, avec des méthodes non invasives et non nociceptives.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines démangeaisons apparaissent, pourquoi elles peuvent devenir chroniques, et comment elles peuvent modifier le comportement des animaux, par exemple en augmentant le stress ou en altérant l’humeur. La démangeaison ne dépend pas seulement de la peau : elle implique aussi les nerfs qui transmettent le signal depuis la peau, la moelle épinière, des cellules de soutien du système nerveux et des cellules immunitaires. Ces différents éléments interagissent entre eux, ce qui rend le phénomène difficile à reproduire avec des méthodes uniquement réalisées en boîte de culture ou sur des tissus isolés. Ces approches alternatives peuvent apporter des informations utiles, mais elles ne permettent pas de reproduire en même temps une inflammation de la peau, l’activation des nerfs responsables de la démangeaison, l’intervention des cellules de soutien du système nerveux, et l’apparition de comportements comme le grattage ou les changements liés à l’état émotionnel. Pour répondre aux objectifs du projet, il est donc nécessaire d’utiliser des modèles animaux permettant d’étudier la démangeaison dans un organisme entier, depuis la peau jusqu’aux comportements observables.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été défini de manière à obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Une veille bibliographique sera réalisée tout au long du projet afin d’éviter la duplication d’expériences déjà publiées et d’adapter les choix expérimentaux aux connaissances disponibles. La stratégie de réduction repose d’abord sur l’utilisation d’un modèle de référence. Ce modèle permettra de valider les approches expérimentales nécessitant des groupes contrôles complets et de vérifier que les effets observés sont interprétables. Une fois ces validations réalisées, les autres modèles seront étudiés avec des plans expérimentaux allégés, limités aux comparaisons nécessaires, afin d’éviter la répétition de groupes contrôles redondants. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes contrôles seront mutualisés au sein d’une même procédure, en particulier lorsque les conditions expérimentales sont comparables. Cette organisation permet de réduire le nombre total de groupes tout en conservant des comparaisons valides. Pour les lignées génétiques, les croisements seront planifiés afin de maximiser l’utilisation des animaux produits. Les animaux présentant un génotype compatible avec les groupes expérimentaux ou contrôles prévus seront utilisés autant que possible, ce qui limite la production d’animaux excédentaires et le nombre de reproducteurs nécessaires. Lorsque plusieurs approches indépendantes répondent à une même question scientifique, elles seront d’abord limitées au modèle de référence. Leur extension à d’autres modèles ne sera réalisée que si les premiers résultats le justifient. Les effectifs reposent sur un minimum de 12 animaux par condition expérimentale, répartis en 3 répétitions indépendantes de 4 animaux par groupe. Les données seront analysées en regroupant ces répétitions, tout en vérifiant la cohérence des effets observés. Ce dimensionnement tient compte de l’expérience de l’équipe, de la variabilité attendue et de la nécessité de détecter des différences biologiquement pertinentes. Enfin, chaque animal sera inclus dans une seule procédure expérimentale et suivra une trajectoire complète au sein d’un modèle donné, afin d’éviter toute exposition cumulative inutile.
Raffinement
Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation d’au moins cinq jours dans une pièce dédiée, sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, séparés par sexe, à un maximum de cinq par cage de 500 cm², dans un environnement contrôlé. Les groupes seront maintenus aussi stables que possible afin de limiter le stress lié aux remaniements. Une attention particulière sera portée aux interactions sociales, notamment chez les mâles, afin de détecter précocement toute agressivité ou blessure. Un enrichissement systématique sera mis en place, comprenant une maison et du matériel de nidification. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour par le personnel de zootechnie ou par le personnel impliqué dans le projet. Le poids sera suivi régulièrement au cours des manipulations, notamment lors des phases de traitement ou d’induction des modèles. Les grilles de suivi clinique et les points limites spécifiques sont définis dans chaque procédure afin d’encadrer la surveillance, les mesures de soutien éventuelles et le retrait anticipé des animaux si nécessaire. Les manipulations expérimentales sont réalisées de manière à limiter le stress, la durée de contention et l’inconfort. Les gestes susceptibles d’induire une gêne transitoire ou nécessitant une contention prolongée sont réalisés sous anesthésie gazeuse brève lorsque cela est compatible avec les objectifs expérimentaux. Les volumes administrés sont limités au strict nécessaire et adaptés à la voie utilisée. Le matériel est choisi de manière appropriée afin de réduire au maximum les lésions tissulaires. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et aux gestes techniques mis en œuvre. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont encadrés et consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Enfin, une analyse rétrospective sera réalisée à l’issue des expériences afin d’identifier d’éventuelles possibilités d’amélioration des procédures et de réduction supplémentaire de la souffrance animale pour les études ultérieures.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie pour ce projet en raison de sa pertinence pour l’étude des mécanismes du prurit aigu et chronique et de ses conséquences comportementales. Des modèles murins validés permettent de reproduire différents contextes de prurit cutané, inflammatoire ou non inflammatoire, et d’étudier de manière intégrée les interactions entre la peau, les neurones sensoriels, les cellules gliales et la moelle épinière. La souris offre également l’accès à de nombreuses lignées transgéniques et conditionnelles permettant le ciblage spécifique de populations neuronales et gliales impliquées dans le prurit, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, des protocoles comportementaux standardisés et largement utilisés permettent d’évaluer de façon fiable le prurit et ses conséquences comportementales. Les animaux utilisés dans ce projet sont exclusivement des souris adultes (Mus musculus). Les procédures expérimentales sont réalisées à des stades de développement compatibles avec la maturité des systèmes nerveux, immunitaire et comportemental. De manière générale, les souris sont utilisées à partir de 6 semaines d’âge. Certaines manipulations préalables (approches génétiques, virales ou inductibles) peuvent être réalisées chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines, suivies d’un délai suffisant avant l’induction des modèles expérimentaux et les évaluations comportementales, afin de garantir une expression ou une recombinaison stable. Les modèles de prurit aigu et chronique ainsi que l’ensemble des évaluations comportementales sont réalisés chez des souris adultes, typiquement âgées de 6 à 12 semaines au moment des tests. Aucune procédure n’est réalisée chez des animaux en phase juvénile précoce ou néonatale.
Injection de vésicules liposomales et d’inhibiteur de checkpoint pour le traitement d’un model murin du cancer du sein
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des cellules cancéreuses sont injectées dans la glande mammaire de souris femelles, qui reçoivent ensuite trois injections d'immunoliposomes et trois injections d'un anticorps d'immunothérapie. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tissus. La tumeur est mesurée au pied à coulisse, et le porteur indique que son développement métastatique peut entraîner une altération progressive de l'état général, une perte de poids et une gêne respiratoire, moins de 5 % des souris pouvant aussi développer une nécrose partielle de la tumeur. La description des procédures place ces injections "sur animaux vigiles", alors que la description des effets indésirables les dit réalisées "sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l'inconfort".
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde, avec environ 1,8 million de nouveaux cas par an en 2016, dont 50 000 en France. Une femme sur huit recevra un diagnostic au cours de sa vie. Bien que les avancées thérapeutiques aient amélioré la prise en charge, les rechutes restent fréquentes. Les traitements actuels, bien que plus efficaces, montrent encore des limites, en particulier chez les patients en rechute. Afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques, nous avons développé et validé des immunoliposomes. L’objectif de ce projet est d’évaluer leur efficacité dans un modèle préclinique de cancer du sein connu pour être résistant à l’immunothérapie. Nous utiliserons des souris, greffées avec une lignée cellulaire cancéreuse murine très utilisé dans la recherche préclinique et reproduisant ainsi un cancer du sein de stade IV. Les animaux recevront un traitement à base d’immunoliposomes et d’un anticorps d’immunothérapie utilisé dans le domaine clinique afin d’évaluer leur impact sur l’activation de l’immunité antitumorale et la croissance tumorale. Nous prévoyons aussi d’étudier des transplantations de cellules spécifiques que nous avons identifiées dans les ganglions drainant la tumeur des souris dans des souris receveuses. Cette étude préclinique s’inscrit dans la continuité de nos travaux précédents et vise à améliorer les approches thérapeutiques existantes pour les cancers résistants aux traitements standards.
Bénéfices attendus
Nos premiers essais sur le modèle murin de cancer du sein ont montré que l’administration d’immunoliposomes permettait une diminution significative de la croissance tumorale, voire une régression complète des tumeurs dans certains cas. Ces résultats prometteurs suggèrent un fort potentiel thérapeutique de notre approche. Dans cette nouvelle étude, nous souhaitons approfondir nos investigations afin d’évaluer l’impact des immunoliposomes sur la formation et la progression des métastases. L’objectif est de déterminer si notre traitement peut limiter efficacement la dissémination tumorale, un enjeu majeur dans la prise en charge des cancers avancés. Par ailleurs, nous comparerons l’efficacité des immunoliposomes avec celle d’une immunothérapie, actuellement utilisée en clinique. Si nos immunoliposomes s’avèrent plus efficaces ou permettent une meilleure activation du système immunitaire, ils pourraient représenter une alternative innovante aux traitements existants, réduisant potentiellement les effets secondaires liés aux immunothérapies classiques. A terme, ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers du sein, en particulier ceux en rechutes ou résistants aux traitements actuels.
Procédures
L’injection des cellules cancéreuses se fera sur animaux vigiles au début des expérimentations, la durée sera de moins de 5 secondes. Une seconde injection sera effectuée au jour 40 uniquement chez les souris présentant une régression tumorale. Les injections des immunoliposomes se feront sur animaux vigiles trois fois, la durée des injections sera de moins de 5 secondes. L’injection d’un anticorps d’immunothérapie se fera trois fois sur animaux vigiles, la durée sera de moins de 5 secondes.
Impact sur les animaux
L’injection sera réalisée dans la glande mammaire (voie orthotopique) chez des souris femelles. Cette injection entraîne un stress modéré et une douleur locale. L’intervention est réalisée sous anesthésie légère (isoflurane) pour minimiser l’inconfort. Les injections par voie intra péritonéale peuvent causer un inconfort temporaire. Le risque de réactions locales ou de difficulté d’injection est limité par une manipulation soigneuse. Une surveillance post-injection est assurée. L’évolution tumorale sera suivie par la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Le développement tumoral métastatique peut induire une altération progressive de l’état général, une perte de poids et une dyspnée. Lors de l’expérimentation sur la mémoire immunitaire, la première exposition tumorale pourrait avoir induit une mémoire immunitaire, limitant la croissance tumorale et entraînant une réponse inflammatoire locale et un inconfort transitoire. Parfois certaines souris (dans moins de 5% des cas) peuvent développer une nécrose partielle de la tumeur, celle-ci sera traitée par une suspension cutanée commerciale destinée au traitement protecteur des plaies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie à l’issue des expériences afin de permettre l’analyse des effets du traitement sur les tissus et cellules d’intérêt dans différents organes.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler in vitro, sur des cellules ou des tissus. Les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives. Ceci nous permet d’être sûrs que les composés qui vont être étudiés in vivo ciblent bien les cellules du système immunitaire. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche. L'efficacité thérapeutique des immunoliposomes repose sur l'implication du système immunitaire. Il est donc essentiel, à ce stade de nos recherches scientifiques, d'évaluer leur efficacité in vivo sur un organisme entier, en utilisant des modèles murins porteurs de cancers.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour le modèle du cancer du sein, nous testerons lors d’une première expérimentation, la capacité des immunoliposomes à diminuer le nombre de cellules immunitaires favorisant le développement des tumeurs. Si nous obtenons une bonne efficacité, l’effet des immunoliposomes sur le ralentissement de la croissance tumorale sera alors réalisé, dans une seconde expérimentation.
Raffinement
Pour minimiser la douleur et le stress des animaux, les protocoles expérimentaux sont soigneusement planifiés, avec des critères d’arrêt anticipé définis afin d’éviter toute souffrance excessive. Les souris sont hébergées en groupes de 5 à 10 dans des cages enrichies de structures en carton ou en plastique, leur permettant de se cacher et de se regrouper, favorisant ainsi leur bien-être. Les manipulations, y compris les injections et les mesures de la tumeur, sont réalisées par du personnel formé afin de réduire au maximum la contrainte et le stress. Pour les injections intra veineuses, les animaux sont placés sous une lampe chauffante pour faciliter la dilatation des vaisseaux, ce qui permet une manipulation plus rapide et moins invasive. La contention est limitée au strict nécessaire et ne dépasse pas trois minutes. Pour limiter le stress des injections, nous mettrons en place une habituation à ces gestes avant de les faire. Les souris sont surveillées régulièrement pour détecter tout signe de détresse, de douleur ou de souffrance excessive. Des critères stricts sont mis en place, notamment une perte de poids excessive, une altération du comportement, une détresse respiratoire ou une difficulté à se déplacer, déclenchant l'arrêt anticipé de l’expérimentation pour l’animal concerné. Afin d’assurer un suivi optimal, le personnel de l’animalerie est informé des critères d’arrêt et des signes de détresse à surveiller. Toute anomalie détectée entraîne une prise en charge immédiate, qui peut inclure un soulagement de la douleur ou l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal. En dernier recours, une mise à mort de l’animal est réalisée.
Choix des espèces
Nous utilisons une lignée cellulaire murine établie et reconnue, injectée dans des souris immunocompétentes pour garantir une réponse immunitaire fonctionnelle. Le modèle murin femelle est indispensable pour le cancer du sein, car la tumeur se développe au site d’injection dans la glande mammaire, reproduisant ainsi la progression tumorale observée chez l’humain. Le système immunitaire des souris est similaire à celui de l’homme en termes de réponse antitumorale, rendant ce modèle pertinent pour évaluer l’efficacité des immunoliposomes et leur potentiel en thérapie anticancéreuse. Il est couramment utilisé en recherche préclinique pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules cancéreuses et l’obtention d’un système immunitaire fonctionnel.
Etude des mécanismes impliqués dans l’altération de la masse et du métabolisme musculaire au cours du vieillissement – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des souris âgées de 18 mois et une lignée génétiquement modifiée qui, selon le porteur, n'existe que chez cette espèce : 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont identifiées par poinçon à l'oreille, 40 reçoivent en plus une puce implantée, toutes reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours et passent six mesures de composition corporelle par résonance magnétique. Soixante-douze d'entre elles jeûnent douze heures, ce que le porteur associe à une perte de 10 à 15 % du poids, avant une administration orale de glucose, six prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures et un test de vitesse maximale de trente minutes sur tapis roulant, puis des tests comportementaux dont il ne dit pas lesquels. Les 160 souris sont tuées en fin de projet, le porteur indiquant devoir prélever de nombreux tissus pour ses analyses moléculaires.
Objectifs
Le vieillissement se traduit par atrophie musculaire, c'est à dire une perte de la masse musculaire, conduisant à la perte d’autonomie des personnes et à l’augmentation de leur mortalité. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de ce phénomène est donc d’un intérêt clinique non négligeable. Cette perte musculaire affecte un type particulier de fibres, les fibres à contraction rapide. De plus, le vieillissement est également associé à une perturbation de la régulation du taux de sucre dans le sang avec une résistance à l’insuline. Notre projet à deux objectifs : 1) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perte de muscles induites par traitement aux glucocorticoïdes (médicaments anti-inflammatoires utilisés fréquemment) et au cours du vieillissement 2) identifier les mécanismes cellulaires responsables de la perturbation de la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang et résistance à l’insuline) qui apparait en en cas d’obésité ou au cours du vieillissement
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la perte de la fonction musculaire au cours du vieillissement pour permettre à plus long terme d’augmenter la qualité de vie (favoriser le bien vieillir). De plus, nous nous intéressons à la vulnérabilité des fibres musculaires à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours de différentes pathologies (cancers, infections, sclérose latérale amyotrophique, insuffisance cardiaque et la broncho-pneumopathie chronique obstructive) ainsi qu’en cas de jeûne ou d’hypoxie (manque d’oxygène). Nos résultats pourraient donc être aussi intéressants pour de nombreuses autres pathologies.
Procédures
Tous les 160 animaux seront identifiés par poinçon à l'oreille (1 fois, 2 secondes) ET 40 D’ENTRE EUX AURONT UNE IMPLANTATION D’UNE PUCE RFID (COMME LES PUCES VETERINAIRES). Ils seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 5 jours. Ils seront également soumis à des tests de composition corporelle par Résonance Magnétique Nucléaire (équivalent d'un IRM à l'hopital) (6 répartis sur l'ensemble du protocole, soit 6 x1min30 ). Ensuite, 88 animaux recevront aussi 1 injection par jour (piqure 2 secondes) pendant 7 jours ET PARMI EUX 40 RECEVRONT 1 DERNIERE INJECTION 30 MINUTES AVANT L'EUTHANASIE. Le reste des animaux (SOIT 72) subiront aussi une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte espacés sur 2 heures (5 secondes par prélèvement) ainsi qu'un test de vitesse maximale aérobie sur tapis (1 fois, 30min). 72 ANIMAUX SERONT ISOLES POUR UNE DUREE INFERIEURE A 48H. Ils seront également soumis à des tests comportementaux (3 fois 5 min et 3 fois 10 secondes).
Impact sur les animaux
Tous les animaux POURRONT RESSENTIR UNE DOULEUR LEGERE LORS DE LEUR IDENTIFICATION PAR MARQUAGE A L'OREILLE OU PAR PUCE. Ils subiront des tests non-invasifs pour caractériser leur croissance, leur composition corporelle, leur activité physique et leur métabolisme. Ces tests pourront induire du stress. Les tests de capacités fonctionnelles sur les tapis pourraient engendrer du stress chez les animaux. Les effets indésirables pour le test d’activité sur tapis roulant peuvent être: l’épuisement de l’animal, une blessure à la patte. Les effets indésirables du traitement avec les glucocorticoïdes sont les modifications de poids et de comportement, ces derniers seront vérifiés tous les jours lors du traitement qui sera arrêté si un changement important de comportement est observé. Les animaux subiront un stress léger lié à la manipulation lors des tests de composition corporelle (2 minutes/semaine), de motricité (3 fois 5 min). Lors de la mesure du métabolisme respiratoire (48h) on peut attendre un stress modéré lié à l’individualisation nécessaire pour l’analyse. Pour le test de tolérance au glucose, on peut attendre une perte de poids de 10 à 15% liée au jeûne (12h sur la nuit, de 20h à 08h) et les animaux subiront une administration orale de glucose. Les prélèvements sanguins à la queue et le marquage à l'oreille induisent une douleur légère. Pour l'étude de l'influence d'un régime hypercalorique, qui reprend les mêmes tests mais sur des animaux ayant une nourriture plus riche, on attend les mêmes effets indésirables. Les injections induisent une douleur légère.
Devenir
Pour mener notre une étude et identifier les mécanismes d’interaction liant fonte musculaire, vieillissement, inflammation et obésité, nous devons prélever de nombreux tissus et réaliser des analyses moléculaires à l’issue de la procédure. Cela nécessite d’euthanasier les animaux en fin de projet.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu’avec des animaux car il n’y a pas de modèles cellulaires alternatifs pour l’étude des effets dépendant du type de fibres musculaires. De plus le vieillissement et la résistance à l’insuline sont des problèmes pathologiques impliquant de nombreux facteurs et de nombreux organes ce qui ne permet pas non plus le remplacement par des méthodes in vitro.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel de calculs statistiques pour définir le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous utiliserons un seul groupe contrôle pour plusieurs procédures. L’utilisation des deux sexes nous permettra d’inclure tous les animaux à l’étude et d’éviter les mises à mort inutiles lors de la production des lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord 1 minute sans mouvement, puis 1 minute à vitesse réduite. L’habituation sera répétée 2 fois, espacées de 24h, avant le test. Le tapis roulant utilisé sera un nouveau modèle sur lequel l’utilisation de stimulation électrique pour motiver la souris à courir est remplacée par un système qui envoie de l’air sur l’arrière train de l’animal. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque geste permettant d’éviter une trop grande fatigue, le stress ou la blessure. Par expérience nous n'avons jamais vu de blessure, cependant si c’était le cas, l’animal serait soigné et sorti du protocole. Chez les animaux obèses, la nourriture enrichie en graisse étant plus friable que la nourriture standard, nous ajouterons un bâtonnet de bois à ronger dans la cage afin de prévenir la croissance continue des incisives. Pour le change et la réalisation des tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (2 min environ). Nous utiliserons de la poudre hémostatique pour arrêter les éventuels saignements lors de la mesure de glycémie. Pour la surveillance des animaux et plus particulièrement des souris obèses, nous utiliserons la grille de score adaptée. ENFIN, LES ANIMAUX POURRONT ETRE MAINTENUS EN GROUPE LORS DE L'ANALYSE DE L'ACTIVITE EN VIDEO-TRACKING INFRA-ROUGE GRACE AU SYSTEME DEVELOPPE (4 ANIMAUX ANALYSES EN MEME TEMPS).
Choix des espèces
Les conditions de perte de muscles chez l’humain que nous souhaitons étudier plus précisément sont bien reproductibles dans le modèle souris. De plus, nous utiliserons un modèle génétiquement modifié qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. D'autre part, des souris âgées seront utilisées pour étudier la perte de muscle qui s’installe à partir de 18 mois.
Etude du role des vaisseaux sanguins sur les cancers du sang chez la souris 3/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injection de cellules leucémiques, implantation de tissus sous la peau, prélèvements de sang ou de moelle osseuse chaque semaine jusqu'à la fin, jusqu'à six séances de microscopie pouvant durer deux heures, et jusqu'à vingt et un jours d'isolement en cage individuelle. 4 296 souris, en partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, toutes tuées pour prélèvement. Le porteur indique qu'à un stade avancé de la maladie les souris peuvent perdre leur tonicité, avoir des difficultés de locomotion et voir leur état général s'altérer. Le résumé ne nomme aucun des "différents traitements" administrés, n'avance aucun chiffre à l'appui d'un effectif calculé selon lui "à l'aide d'outils statistiques", et tient l'exposé du devenir de ces 4 296 souris en une seule phrase.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certains cancers du sang, comme les leucémies, interagissent avec les vaisseaux sanguins dans leur tissu. L’objectif est d’identifier les anomalies présentes dans cet environnement lors du développement de la maladie. En utilisant des modèles de souris et des outils d’imagerie avancés, on veut repérer les mécanismes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et tester de nouvelles approches pour les bloquer. Le projet sera réalisé dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet pourraient permettre d’améliorer l’efficacité des traitements contre certaines leucémies, en ciblant l’environnement tumoral. Comprendre comment l'environnement vasculaire influence la progression de la maladie pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées et mieux tolérées par les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de cellules leucémiques (1 fois, duree:
Impact sur les animaux
Les seances d'imagerie répétées peuvent entraîner un stress modéré chez les animaux, notamment en raison des manipulations et du transport associés aux séances d’imagerie. L’implantation des systèmes utilisés pour l’imagerie peut gêner légèrement le comportement de l’animal, sans toutefois compromettre sa mobilité ou son alimentation. L'hébergement individuel pendant une durée maximale de trois semaines peut induire un stress lié à l’isolement. À un stade avancé de la maladie, les animaux peuvent présenter des signes de souffrance (perte de tonicité, difficultés de locomotion, altération de l’état général). Les injections en sous-cutané, intra-vein, intra-peritoné peuvent cause une gene legere aux souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement
Remplacement
Pour « Remplacer », nous avons mis en place un système de culture 3D qui reproduit le tissu leucemique humain et permet certaines expériences sans utiliser d’animaux. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous veillons à ce que toutes les expériences possiblement réalisables in vitro sur système de culture 3D le soient. Cependant, celui-ci ne mimant que les interactions locales et pas systemiques, le développement de modèle in vivo reste nécessaire.
Réduction
L’étude directe des tumeurs humaines étant très limitée, nous utilisons des souris immunodéficientes pour mieux comprendre les leucémies humaines. Ce modèle est aujourd’hui le seul qui permette d’étudier ces maladies de manière fiable. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des modèles d’organoïdes de leucémie humaine greffés chez ces souris. Ces greffes sont plus efficaces et plus reproductibles que les méthodes classiques, ce qui permet d’utiliser moins de souris par expérience. Nous utilisons également des techniques d’imagerie qui permettent de suivre l’évolution de la leucémie au cours du temps chez un même animal. Cela évite de devoir euthanasier les souris à chaque étape de l’étude. Les expériences sont réalisées avec des souris mâles et femelles, car le sexe n’influence pas le développement de la leucémie dans nos modèles. Enfin, le nombre de souris nécessaires est calculé à l’avance à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures d’imagerie et l’implantation d’organoïdes se feront sous anesthésie générale et avec administration d’analgésique. De plus, afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, leur état fera l’objet d’une surveillance continue. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées, incluant des éléments d’enrichissement appropriés. Enfin des points limites spécifiques ont été mis en place. Une dérogation à l’hébergement en groupe est demandée pour certains animaux. Cette dérogation est scientifiquement justifiée par la nécessité d’éviter toute blessure ou stress. Des mesures compensatoires seront mises en œuvre pour limiter l’impact de l’isolement sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour les expériences menées pour la recherche en oncologie thérapeutique du cancer. En effet, la connaissance complète du génome de la souris permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt, ainsi qu’un grand nombre de modèles de cancers. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes de 6-12 semaines. Cela représente l’âge permettant une bonne prise de greffe, et qui laisse le temps a la maladie de se développer sans que la souris vieillisse.
Caractérisation de la différence de sensibilité à l’insuffisance rénale aigue de deux fonds génétiques de souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Les deux reins de certaines souris sont privés de circulation sanguine pendant vingt-cinq minutes, sous anesthésie générale, pour provoquer une insuffisance rénale aiguë. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des dosages et des analyses, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent des injections de molécules toxiques pour les reins, qui peuvent entraîner prostration et perte de poids, et toutes passent des mesures de fonction rénale exigeant deux anesthésies générales successives, répétées à plusieurs jours d'intervalle. La question posée est de comprendre pourquoi deux sous-lignées issues de la même souche réagissent différemment, et le porteur y adosse un argument de coût : la dialyse et la transplantation représenteraient "un coût annuel de quatre milliards d'euros", ce qui rend selon lui "urgent et vital" de développer de nouvelles stratégies.
Objectifs
Le projet s'intéresse à deux sous-lignées de souris (appelées B6J et B6N) qui, bien qu’issues de la même souche de base, ne réagissent pas de la même façon à une insuffisance rénale aigue . Par exemple, après une interruption temporaire de la circulation sanguine dans les reins (ischémie), les souris B6J développent une insuffisance rénale aigue sévère, tandis que les B6N sont peu ou pas affectées. Pourtant, ces deux lignées ne diffèrent que par leur patrimoine génétique. Depuis 15 ans, des chercheurs ont identifié des variations génétiques entre B6J et B6N, mais aucune n’explique à elle seule cette différence de sensibilité à l’insuffisance rénale aigue. Notre objectif est de comprendre pourquoi les souris B6J et B6N ne réagissent pas de la même manière à l’insuffisance rénale aigue. En identifiant les gènes responsables, nous pourrions découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’insuffisance rénale aigue chez l’humain. Pour y parvenir, nous explorons trois pistes principales : 1. La sensibilité à l’insuffisance rénale aigue dépend-elle de sa cause ? Est-ce que la différence entre B6J et B6N s’observe uniquement pour les insuffisance rénale aigue causées par une ischémie, ou aussi pour d’autres causes (comme une toxicité médicamenteuse) ? 2. La sensibilité dépend-elle du fournisseur des souris ? Est-ce que cette différence entre B6J et B6N est universelle, ou est-elle liée à des souris provenant d’un éleveur spécifique ? 3. La sensibilité à l’insuffisance rénale aigue se transmet-elle aux descendants ? Si nous croisons des souris B6J (sensibles à l'insuffisance rénale) avec des B6N (résistantes), est-ce que leurs descendants héritent de cette sensibilité ? Cela nous permettrait de localiser plus précisément les gènes impliqués dans la protection ou l’aggravation de l’insuffisance rénale aigue.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. L’insuffisance rénale aiguë est bien plus qu’une simple défaillance passagère des reins. C’est une urgence médicale qui frappe dix à vingt pour cent des patients hospitalisés, et jusqu’à un patient sur deux en réanimation. Si, dans certains cas, les reins parviennent à retrouver une fonction normale, l’insuffisance rénale aigue laisse souvent des séquelles durables. En effet, elle multiplie le risque de développer une maladie rénale chronique, une pathologie lourde, invalidante et coûteuse à long terme. Aujourd’hui, aucune thérapie spécifique n’existe pour traiter l’insuffisance rénale aigue. Les seuls recours disponibles — la dialyse et la transplantation rénale — sont des solutions lourdes, invasives et extrêmement onéreuses. En France, ces traitements représentent un coût annuel de quatre milliards d’euros, ce qui en fait le premier poste de dépense de la Sécurité sociale. Face à ce constat, il devient urgent et vital de développer de nouvelles stratégies pour prévenir l’insuffisance rénale aigue, limiter ses conséquences et éviter son évolution vers des formes chroniques. Notre projet s’inscrit dans cette dynamique. En identifiant les mécanismes génétiques et moléculaires à l’origine de la sensibilité à l’insuffisance rénale aigue, nous espérons ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées pourraient non seulement améliorer la prise en charge des patients, mais aussi réduire le fardeau économique que représente cette maladie pour notre système de santé.
Procédures
(1) Injections : L’induction des modèles expérimentaux nécessite 1-2 injections à l’état vigile (durée : 10 secondes). (2) Chirurgie : Une petite partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie générale. Ce protocole a une durée de 40 minutes. (3) Prélèvements : Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale, sur un plateau chauffant (durée 5 à 10 minutes). (4) Mesure de la fonction rénale : elle sera mesurée chez tous les animaux par une technique qui nécessite une anesthésie générale pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie générale est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances peuvent être générées par : (1) Les injections : Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale et un stress lors de la contention pour la bonne administration. Une infection est possible aux points d’injection mais assez rare cependant. Certaines injections peuvent entrainer un saignement, un œdème ou une irritation oculaire. (2) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins sont celles associées à l’induction d'une insuffisance rénale sévère qui peut entrainer une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (4) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs et des saignements (5) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique).
Devenir
Afin d’effectuer des dosages et analyses spécifiques, tous les animaux du projet (1080) seront euthanasiés à la fin des procédures par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée
Remplacement
Nous cherchons à comprendre pourquoi deux lignées de souris répondent différemment à l'induction d'une insuffisance rénale aigue. Il est donc extrêmement compliqué d'utiliser un autre modèle que la souris. Il faut également souligner que le rein est un tissu complexe, qui comporte des dizaines de types cellulaires. Les cellules inflammatoires circulantes participent également. Etant donné que nous ne savons pas encore quelles cellules sont impliquées dans la sensibilité différentielle, il est compliqué d'utiliser des modèles cellulaires, surtout qu'il n'existe pas de lignée isolée à partir des ces lignées de souris. Une fois que nous aurons identifié le ou les types cellulaires impliqués, nous pourrons utiliser des cultures de ces cellules isolées à partir des reins des deux lignées afin de disséquer plus finement les mécanismes, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux. Les organoïdes rénaux ne sont pas encore optimaux, notamment car il est encore impossible d'y réaliser une circulation sanguine. Il n'est donc pas possible d'y mesurer la fonction rénale, c'est-à-dire la fonction de filtration du sang par le rein qui est le paramètre principal dans notre étude.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle dans nos modèles d'insuffisance rénale. Des lots de 20 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d’un module statistique. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants (2 lots de 10). Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour valider les résultats. Le nombre total d'animaux est de 1080 souris.
Raffinement
Des points limites ont été définis et sont intégrés dans le processus de raffinement. (1) Raffinement hébergement et surveillance : Les animaux sont acclimateés dans l'animalerie une aà deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée régulière pendant toute la durée des protocoles. Le bien-être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de taille différente (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. De la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. En dehors d'une courte période limitée à deux heures pendant une mesure de la fonction rénale, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. (2) Raffinement injections : Les injections sont réalisées avec une aiguille très fine, ce qui limite les risques hémorragique. Si plusieurs injections doivent être réalisées, le site d’injection sera alterné d’une injection à l’autre. Pour certaines injections, les souris reçoivent un collyre anesthésiant et sont placées sous anesthésie générale sur un plateau chauffant. Un gel ophtalmique est appliqué pour limiter l’irritation oculaire. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté. (3) Raffinement Chirurgie : Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les souris seront placées dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. (4) Raffinement anesthésie : Pour limiter les complications liées à l’anesthésie les souris sont placées sur un plateau chauffant.
Choix des espèces
Notre laboratoire travaille depuis de nombreuses annés sur des modèles expérimentaux de maladies rénales chez la souris en raison de l'existence de très nombreuses lignées génétiquement modifiées qui permettent de tester les rôles joués par un gène donné dans ces maladies. Les protocoles expérimentaux décrits ici sont bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire. Enfin, ce projet repose sur une différence de susceptibilité à l'insuffisance rénale de deux lignées de souris. Il n'est donc pas possible d'utiliser un autre modèle. Les souris seront livrées à l'âge de 2 à 3 mois. A cet âge, elles ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système glomérulaire mature, ne présentent pas encore de lésions de vieillissement. De plus, à ce stade, cela permet d’éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule vasculaire rénal, qui peut gêner l'interruption de la circulation pour le modèle d'ischémie reperfusion.
Developpement d’approches thérapeutiques pour le Syndrome de Sanfilippo Type B
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La production des données précliniques exigées par la réglementation avant tout essai chez l'humain fait partie de la finalité déclarée de ce projet sur le syndrome de Sanfilippo de type B, aux côtés de l'évaluation d'une thérapie génique et d'un traitement anti-inflammatoire. 2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées par perfusion intracardiaque après anesthésie profonde pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1 320 reçoivent une injection dans la veine de la queue à l'état vigile, 660 subissent une chirurgie cérébrale de quarante minutes avec pose d'une canule guide, et 1 408 passent des tests d'anxiété, d'activité locomotrice et de reconnaissance d'objets. Le porteur affirme que seul un "organisme entier" permet de suivre la biodistribution du vecteur et les réponses immunitaires, et écrit que les données de cette lignée murine sont "indispensable avant tout essai chez l'humain".
Objectifs
Le syndrome de Sanfilippo de type B (ou MPS IIIB) est une maladie pédiatrique génétique rare, touchant environ 0,5 naissance sur 100 000 en Europe. Elle est causée par un déficit d'une enzyme lysosomale qui entraîne l’accumulation de certaines molécules appelées oligosaccharides d’héparane sulfate dans le cerveau et d’autres tissus. Cette accumulation provoque des problèmes cellulaires, notamment un dysfonctionnement lysosomal, un stress oxydatif, une neuroinflammation et l’activation des cellules immunitaires du système nerveux, qui contribuent aux lésions neuronales et à la progression de la maladie. Les patients présentent un déclin intellectuel progressif et des troubles du comportement, avec une espérance de vie moyenne de 17 à 19 ans. Malgré les avancées en thérapie génique et en traitement enzymatique, aucun traitement ne permet aujourd’hui d'arrêter ou de ralentir l’évolution de la maladie. L’objectif de notre projet est de développer une approche thérapeutique pour le syndrome de Sanfilippo de type B, sur un modèle murin approprié, selon deux stratégies complémentaires : - Une thérapie génique, visant à restaurer l’activité enzymatique déficiente chez les enfants asymptomatiques, afin d’évaluer son potentiel curatif à un stade précoce de la maladie. - Un traitement anti-inflammatoire, destiné aux enfants non éligibles à la thérapie génique, visant à réduire la neuroinflammation, ralentir la progression des symptômes et améliorer la qualité de vie. Pour cela nous utiliserons le modèle de souris génétiquement modifiée MPSIIIB développé par le laboratoire Jackson. Il s'agit du seul modèle murin MPSIIIB qui reproduit les principales caractéristiques de la maladie humaine, notamment l'accumulation de HSO, la neuroinflammation, le déclin comportemental et la mort prématurée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de développer et d’évaluer deux stratégies thérapeutiques complémentaires pour le syndrome de Sanfilippo type B. L’utilisation du modèle murin MPSIIIB permettra d’obtenir des données précliniques essentielles pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces approches et indispensable avant tout essai chez l’humain. En effet, les données générées constituent un prérequis réglementaire pour toute application clinique. Au plus long terme, elles contribueront au développement de thérapies innovantes pour une maladie pédiatrique grave et actuellement incurable et à une meilleure compréhension des maladies lysosomales et neuroinflammatoires.
Procédures
Les interventions concerneront: 1) une injection IV dans la veine caudale sur animaux vigiles (1320 souris, chaque injection prend quelques minutes); 2) une injection intracerebroventriculaire un type de chirurgies sous anesthésie générale (660 animaux, 40 minutes); 3) traitement par alimentation pendant 21 jours; 4) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1408), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal); 5) un prélèvement sanguin à la veine caudale ou mandibulaire (sous anesthésie) pour test sérologique (2240 animaux, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Pour l’injection IV, l’injection intraveineuse à la queue est susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans l’appareil de contention et/ou de la douleur chez l'animal sur une durée inférieure à cinq minutes. Pour l’injection ICV, malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Pendant les 48 premières heures post-chirurgie, l’injection intra-cérébrale et l’installation des canules guide peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration, anxiété et perte de poids. L'installation de la canule guide chez l'animal peut également entraîner de légères douleurs post-opératoires les premières 48 heures. Durant l'expérimentation, les animaux seront prélevés une ou deux fois en cours d'étude (prélèvement de sang) à la veine mandibulaire ou caudale, ce qui peut provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
A l'issue des 3 procédures, les 2244 souris seront mises à mort par perfusion intracardique après anesthésie profonde, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires (fibroblastes de patients MPSIIIB et lignée de microglie murine) qui ont démontré l’effet bénéfique des procédures thérapeutiques proposées dans ce projet. La thérapie génique et les traitements anti-inflammatoires agissent sur plusieurs tissus et impliquent des interactions immunitaires complexes. Seul un organisme entier permet de suivre la biodistribution du vecteur ou du traitement, d’évaluer l’efficacité dans le cerveau notamment par des tests de comportement et cognitifs, de mesurer les effets collatéraux ou indésirables, et d’observer les réponses immunitaires et inflammatoires au niveau systémique. Par conséquent, les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Une telle pertinence est essentielle pour garantir la robustesse des résultats et leur transposabilité dans des applications cliniques.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires pour les souris MPSIIIB et de 10 pour le groupe Wild-type. Pour les procédures 1 et 3, nous répéterons les expériences à 3 temps post-traitement différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour la procédure 2, nous répéterons les expériences à 5 temps post-traitement différents. Le calcul de puissance réalisé avec G*Power, basé sur une différence attendue de 20% entre groupes, une variabilité estimée à 15 % et une puissance de 70 %, indique un effectif nécessaire de 10 animaux par groupe. Pour le groupe MPSIIIB, nous prévoyons 12 souris par groupe afin de tenir compte d’une éventuelle mortalité ou exclusion. Ce nombre garantit la détection de l’effet recherché tout en limitant l’utilisation d’animaux au strict minimum et avoir des résultats significatifs. Nous maximiserons également les données par animal : réalisation de multiples analyses (tests comportementaux, histologie, biologie moléculaire, analyses biochimiques...) sur les tissus prélevés afin de limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Comme dans nos études précédentes, l’expérimentateur principal reste systématiquement en aveugle vis-à-vis du génotype et du traitement administré.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée soit par l’expérimentateur soit par le personnel de la zootechnie. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48 heures se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >10 % du poids normal maintenue sur 72 heures ; -hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation de la canule guide malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement. Pour la procédure 2 – chirurgie pour injection intracérébrale et installation de la canule guide- un tapis chauffant sera positionné sous l’animal pendant l’anesthésie ainsi que sous la cage pour le réveil des animaux afin de prévenir l’hypothermie et un gel oculoprotecteur sera appliqué systématiquement aux souris anesthésiées afin de prévenir le dessèchement oculaire. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et par administration d'analgésique ( administrée 1 heure avant la chirurgie et toutes les 24 heures en fonction de l’état des souris dans les 48 heures postopératoires). La pose d'une canule guide va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'elle implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la canule guide sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré-, per- et post-opératoire. Enfin, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés, spécifiquement la souris MPSIIIB. Cette souche mutée pour l’enzyme lysosomale est le seul modèle à reproduire fidèlement les caractéristiques humaines : accumulation d’héparane sulfate, dysfonction lysosomale, neuroinflammation, troubles cognitifs et comportementaux et réduction de l’espérance de vie. De plus, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, une très bonne adaptation aux conditions expérimentales et surtout être un modèle de choix pour les études comportementales. Les animaux seront utilisés à 1 mois, ce qui correspond à l’âge avant l’apparition des symptômes de la maladie pour mimer l’état des patients asymptomatiques qui seront éligibles à ce type de traitement (thérapie génique). De plus, ça permet de laisser 1 semaine entre le sevrage et le début de l’expérimentation pour limiter le stress dû au sevrage. les animaux seront également utilisés à partir de 2 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Et des animaux seront utilisés à partir de 21 jours afin d'étudier l’efficacité de la modulation de l’inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire.
Etude chez la souris de la réponse immunitaire au cours de l’infection par la microsporidie Encephalitozoon cuniculi
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des spores de microsporidie sont injectées dans la peau de l'oreille de souris transgéniques dont les cellules immunitaires sont fluorescentes, après élimination ou non de certains globules blancs par un anticorps injecté deux fois avant l'infection. 290 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 20 d'entre elles subissant en plus quatre jours d'imagerie quotidienne sous anesthésie. Le porteur écrit : "Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l'animal", et écrit ailleurs "Bien que tout stress ne puisse être totalement évité". Les 290 souris sont tuées, les unes à la fin de l'imagerie, les autres à cinq temps échelonnés de deux heures à sept jours après l'infection, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Les cellules dendritiques et les macrophages sont des cellules de l’immunité qui jouent un rôle important dans la réaction de défense contre l’infection par les microsporidies chez l’hôte infecté. En piratant ces cellules, la microsporidie contourne la réponse immunitaire de l’hôte. Cependant, peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies de piratage immunitaire in vivo. Notre projet vise tout d’abord à explorer, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre le parasite et les cellules de l’immunité innée (macrophages, cellules dendritiques). En particulier, le modèle du pavillon de l’oreille de la souris est un des plus utilisés pour analyser, par imagerie en temps réel, chez l’animal anesthésié, la dynamique de la réponse immunitaire innée. L’objectif est ici d’appliquer ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. En parallèle, les interactions entre les microsporidies et les macrophages ou les cellules dendritiques murines seront étudiées in vitro. En améliorant nos connaissances sur la réponse immunitaire dirigée contre la microsporidie E. cuniculi, de nouveaux traitements ciblant le système immunitaire pourront être mis au point pour mieux contrôler ces infections chez l’homme.
Bénéfices attendus
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre l’espèce microsporidienne E. cuniculi, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies de traitement permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Procédures
1. Imagerie de la réponse immunitaire dirigée contre Encephalitozoon cuniculi -Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez des souris transgéniques possédant des cellules immunitaires fluorescentes. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. -Anesthésie générale des animaux traités ou non (avec ou sans polynucléaires neutrophiles) et infectés -Imagerie du tissu de l’oreille sur animal vivant anesthésié, par microscopie (imagerie en temps réel), chaque jour pendant 4 jours. Les animaux anesthésiés sont mis à mort à la fin de l’expérience (jour 4). Nombre total d’animaux concernés : 20 souris (10 souris traitées, 10 souris contrôle) 2. Expériences avec biopsies tissulaires chez les animaux C57BL6 infectés par E. cuniculi. - Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez les souris C57BL6. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. - Mise à mort des souris aux différents temps d’infection (2h, 24h, 48h, 72h et 7 jours). Les tissus d’intérêt sont prélevés très rapidement après vérification de la mort de l’animal. Nombre total d’animaux concernés : 135 animaux pour les études immunologiques et 135 animaux pour les mesures de charge parasitaire.
Impact sur les animaux
Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection intradermique des spores pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. Les expériences sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutanée est généralement minime. Point limite : Pendant toute la durée de l’expérience, toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière mènera à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec mise à mort des animaux.
Devenir
Procédure 1 : mise à mort à la fin de l’expérience de microscopie confocale. Le suivi des souris infectées s’effectue sur une durée de 4 jours. Au-delà, les animaux sont sacrifiés afin d’éviter les complications liées à la dissémination tissulaire des parasites. De plus, les animaux étant infectés, ils ne sont pas réutilisables pour d’autres expérimentations. Procédure 2 : mise à mort pour prélèvement de tissus
Remplacement
Notre projet inclut des expérimentations réalisées avec des cellules immunitaires en culture, mais elle reste largement insuffisante pour étudier en détail les interactions entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire à l'échelle tissulaire chez un animal. Le recours à l’approche d’imagerie en temps réel chez l’animal vivant anesthésié permet d’étudier la mise en place de cette réponse immunitaire au sein du tissu cutané.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Pour les expériences de microscopie en temps réel chez l’animal vivant, le nombre d'animaux requis sera faible (20 au total sur une année : 10 animaux avec ou sans polynucléaires neutrophiles) car cette approche permet d'étudier la réponse immunitaire chez un même animal en fonction du temps, après anesthésie. Pour les expériences étudiant la réponse immunitaire, ainsi que pour les mesures de charge parasitaire dans les tissus, le nombre total d'animaux utilisés est réduit au minimum et fixé à 135 (3 animaux par point de cinétique, 5 points de cinétique, 3 conditions expérimentales, 3 expériences). Ce chiffre a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Total des animaux utilisés sur 3 ans : 20+135+135= 290 animaux
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont hébergés par groupes de 5 individus au maximum pour permettre le maintien d’un bien-être social. Ils sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis sont établis et les expériences sont arrêtées en conséquence. Bien que tout stress ne puisse être totalement évité, les procédures et mesures de raffinement mises en œuvre visent à en limiter l’intensité et la durée. En particulier, toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection des parasites dans la peau pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’infection, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. A chaque temps de l’expérimentation de microscopie, une couverture chauffante thermorégulée est placée sur l’animal anesthésié pour éviter l’hypothermie. Après l’expérimentation et pendant la phase de réveil, l'animal est maintenu sur le tapis chauffant et gardé en observation pendant 2 heures, puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les expériences de microscopie sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutané est généralement minime. Point limite : Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de la parasitologie et de l’immunologie. Le recours à une lignée de souris transgénique qui possède des cellules immunitaires fluorescentes nous permet de visualiser en temps réel chez l’animal anesthésié la mise en place de la réponse immunitaire innée lors d’une infection microsporidienne. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines (âge adulte), ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.
Exploration de la vascularisation utérine par imagerie ultrasonore ultrarapide chez la brebis, site 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
Pose d'une éponge intravaginale, cinq injections, puis un à neuf prélèvements sanguins selon le groupe, tout cela sur des brebis vigiles maintenues à la main : 20 brebis sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Cinq brebis sont affectées à chacune des phases du cycle hormonal comparées. L'imagerie, elle, ne se fait pas sur elles : le porteur indique que l'étude est menée ex vivo, sur utérus perfusé, pour s'affranchir de la respiration et des battements cardiaques. Les 20 brebis sont donc tuées à l'issue du protocole, afin que leurs utérus soient prélevés dans des conditions que le porteur qualifie de standardisées et reproductibles.
Objectifs
Chez la femme, au cours du cycle hormonal, les vaisseaux sanguins de l’utérus subissent de très forts changements pour accompagner les besoins physiologiques du corps. C’est particulièrement vrai pour les petits vaisseaux de l’endomètre – la muqueuse utérine, qui prolifère tout au long du cycle, puis dégénère au moment des règles. Ces très petits vaisseaux sont extrêmement importants, notamment pour la bonne implantation de l’embryon, en cas de grossesse. A l’heure actuelle, ils sont cependant complètement invisibles par toutes les méthodes d’imagerie clinique, et leur rôle dans de nombreuses pathologies gynécologiques et obstétricales est donc assez mal connu. Le premier objectif de ce projet est d’adapter une méthode très récente d’imagerie échographique, afin de pouvoir visualiser les petits vaisseaux de la muqueuse utérine. Le second objectif est d’étudier l’évolution de ces petits vaisseaux au cours d’un cycle hormonal normal, pour mieux comprendre les modifications profondes qu’ils subissent. Dans le cadre d’une expérimentation préclinique, nous imagerons des utérus de brebis. La brebis est en effet un modèle bien établi pour de nombreuses pathologies gynécologiques et obstétricales, en raison de similarités morphologiques avec les femmes. Cette étude sera réalisée ex vivo, pour s’affranchir des mouvements naturels (respiration, battements cardiaques), et permettre l’étude la plus détaillée possible des petits vaisseaux. Nous établirons les premières cartes des petits vaisseaux de l’utérus au cours d’un cycle hormonal, et étudierons finement leurs caractéristiques, en termes de dimensions, morphologie et flux sanguins associés. Combinées à des méthodes d’analyse d’image permettant de compenser les mouvements naturels, les solutions développées dans ce projet seront donc directement utilisables chez la femme, permettant un transfert rapide vers la pratique clinique. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les petits vaisseaux sanguins de l’utérus sont impliqués dans de nombreux mécanismes physiologiques liés à la reproduction. On soupçonne également leur rôle dans certaines pathologies, comme l’endométriose, une maladie gynécologique chronique pouvant provoquer douleurs et infertilité, ou la pré-éclampsie, une complication grave de la grossesse caractérisée par une hypertension artérielle. Ce projet doit nous apporter une meilleure connaissance ces petits vaisseaux et de leur évolution au cours d’un cycle hormonal normal. A plus long terme, cela nous permettra de mieux comprendre ses altérations dans les cas pathologiques. Par ailleurs, les technologies développées dans ce projet constituent une première étape cruciale pour pouvoir appliquer notre méthode d’imagerie chez la femme.
Procédures
Les 20 brebis seront soumises : A une pose d’éponge intravaginale d’une durée de 1 à 2 minutes A 5 injections d’une durée de quelques secondes chacunes. En cas de nécessité, à 2 injections supplémentaires d’une durée de 1 à 2 minutes, espacées de 3 à 5 minutes. A des prélèvements sanguins, selon les groupes expérimentaux, 5 brebis seront soumises à 1 prélèvement sanguin, 5 brebis à 3 prélèvements sanguins, 5 brebis à 6 prélèvements et 5 brebis à 9 prélèvements. Chaque prélèvement dure 1 à 2 minutes. Toutes les interventions décrites seront réalisées sur des animaux vigiles, sous contention manuelle douce et en présence des congénères.
Impact sur les animaux
Les procédures mises en place dans ce projet peuvent induire un stress ou un inconfort léger et de courte durée chez les animaux au moment de la contention pour la pose des éponges intravaginales, les injections, et les prélèvements sanguins. Elles peuvent également induire une douleur légère et de courte durée suite aux injections et prélèvements sanguins. Les prélèvements sanguins pourraient donner lieu à un hématome, un saignement ou une légère réaction locale (irritation).
Devenir
A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort par une méthode réglementaire, afin de permettre le prélèvement des utérus dans des conditions standardisées et reproductibles.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet se fait après de nombreuses études in vitro pour le développement et l’optimisation de notre méthode d’imagerie. Nous avons notamment utilisé des dispositifs expérimentaux reproduisant les caractéristiques du corps humains (« fantôme d’imagerie »). Ces dispositifs permettent d’étudier des cas simples, faisant intervenir un très petit nombre de vaisseaux, de calibre relativement gros. La physiologie du cycle menstruel chez la femme fait cependant intervenir beaucoup de paramètres hormonaux et structurels (taille et nombre des vaisseaux, flux sanguins, …). Il n’existe pas aujourd’hui de dispositif expérimental permettant de mimer tous ces paramètres in vitro, et en particulier la complexité des petits vaisseaux sanguins de l’utérus. Par ailleurs, afin d’optimiser nos méthodes, et d’imager le plus précisément possible les très petits vaisseaux, nous avons besoin de limiter les mouvements au maximum pendant toute la durée de l’acquisition ultrasonore. Pour cela, nous avons besoin de mettre en place une approche ex vivo d’utérus perfusé, et le recours à des animaux est donc indispensable. Les méthodes d’imagerie et d’analyse de données qui pourront ainsi être développées dans un cas idéal seront toutefois utilisables in vivo chez la femme, en les combinant à d’autres techniques développées par l’équipe. L’utérus étant un organe abdominal, sujet à ses contractions intrinsèques mais également aux mouvements cardiaques et respiratoires, la mise en œuvre de notre méthode chez la femme nécessitera notamment l’utilisation de méthodes de compensation de mouvement. Bien que les variations hormonales de la brebis soient différentes de celles de la femme, elles impliquent également des modifications des vaisseaux sanguins de l’utérus. Morphologiquement, l’utérus de la brebis et en particulier ses vaisseaux sont de dimensions similaires à celle de la femme. C’est également un modèle animal établi pour plusieurs pathologies gynécologiques et obstétricales. Ce modèle animal est donc essentiel pour obtenir des résultats scientifiques exploitables et pertinents pour la physiologie humaine.
Réduction
Afin de limiter le nombre de séquences d’imagerie ultrasonore à tester, et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés, nos paramètres d’imagerie seront développés et optimisés in vitro dans des dispositifs expérimentaux modélisant les vaisseaux sanguins de manière simplifiée (fantômes d’imagerie). Pour cette étude, une comparaison entre les différentes phases du cycle hormonal sera effectuée par des tests statistiques. Les paramètres comparés seront la densité, la tortuosité et le diamètre des vaisseaux, ainsi que les flux sanguins observés dans les petits vaisseaux. Sur la base des données de la littérature se rapprochant le plus de notre méthode, à savoir de l’imagerie Doppler, nous avons effectué des tests statistiques pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires. Nous évaluons que nous avons besoin de 5 animaux par phase du cycle soit un total de 20 animaux. Pour chaque animal, nous imagerons l’utérus perfusé aussi longtemps que possible (tant que le tissu reste viable) afin de collecter autant de données que possible, afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés, n’induisant pas de stress. Un enrichissement adapté leur sera proposé. Afin de limiter le stress et l’inconfort des animaux, toutes les procédures du projet seront réalisées sous contention manuelle, douce et de courte durée, par du personnel formé. Pour les prélèvements sanguins à la veine du cou, une attention particulière sera portée à l’alternance des sites de ponction lorsque cela est possible, afin de prévenir toute irritation locale. Après chaque prélèvement, le site de ponction sera inspecté afin de vérifier l’absence de saignement prolongé, d’hématome ou de réaction locale. Les brebis seront surveillées quotidiennement tout au long du protocole pour détecter tout signe de douleur, de stress ou d’altération de l’état général. Des points limites ont été définis et seront appliqués.
Choix des espèces
Notre étude vise à explorer les vaisseaux sanguins de l’utérus au cours du cycle hormonal, mais également à développer des outils d’imagerie qui pourront être utilisés chez la femme dans le futur. Nous avons donc besoin d’un modèle animal dont l’utérus est morphologiquement proche de celui de la femme, et qui présente une variation vasculaire due au cycle hormonal. L’utérus de la brebis est de taille similaire à celui de la femme. Il présente une variation cyclique due aux variations hormonales. C’est également un modèle bien établi pour plusieurs pathologies reproductives. Nous voulons étudier le système reproducteur féminin mature. Nous utiliserons donc des brebis adultes.